Лікування хворих на цукровий діабет з імунними та гематологічними порушеннями гемопоетичними клітинами ембріональної печінки людини

Размещено на http://www.allbest.ru/

Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

14.01.14 - Ендокринологія

Лікування хворих на цукровий діабет з імунними та гематологічними порушеннями гемопоетичними клітинами ембріональної печінки людини

Новицька Алла Володимирівна

Київ 2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Національному медичному університеті ім. акад. О.О. Богомольця МОЗ України

Науковий керівник: кандидат медичних наук, доцент Смікодуб Олександр Іванович, Національний медичний університет ім. акад. О.О. Богомольця, доцент кафедри поліклінічної підготовки та сімейної медицини

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Зак Костянтин Петрович, Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П.Комісаренка АМН України, завідувач лабораторії гормональної регуляції кровотворення

кандидат медичних наук, доцент Щербак Олександр Вікторович, Національний медичний університет ім. акад. О.О.Богомольця, доцент кафедри ендокринології

Провідна установа: Львівський державний медичний університет ім. Данила Галицького, кафедра ендокринології, МОЗ України, м. Львів

Захист відбудеться 28 березня 2000 р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.558.01. з ендокринології в Інституті ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України (04114, м. Київ - 114, вул. Вишгородська, 69).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України (04114, м. Київ - 114, вул. Вишгородська, 69).

Автореферат розісланий 28 лютого 2000 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук Калинська Л.М.

1. Загальна характеристика роботи

цукровий діабет ембріональний трансплантація

Актуальність теми. Цукровий діабет (ЦД) - широко розповсюджене та тяжке хронічне захворювання, що призводить до високої інвалідності та смертності. Зусилля багатьох дослідників спрямовані на вивчення механізмів розвитку цього захворювання, його ускладнень та пошук нових методів лікування (Ефимов А.С., 1998).

Особлива увага в останній час приділяється вивченню стану імунної системи організму та розробці нових методів імунотерапії, в першу чергу при аутоімунному ЦД, що включає інсулінозалежний цукровий діабет (ІЗЦД) (Baker J., 1997, Foster D.W., 1998). До часу клінічної появи ІЗЦД більшість -клітин у підшлунковій залозі зруйновано. В організмі проходить ряд деструктивних аутоімунних процесів, при яких острівці підшлункової залози інфільтруються моноцитами/макрофагами, активованими цитотоксичними Т-клітинами. До гуморальних механізмів пошкодження -клітин можна віднести появу антитіл до різноманітних антигенів інсулінсекретуючих клітин: до інсуліну, проінсуліну, двох форм глутамат-декарбоксилази (GAD 65 та GAD 67), карбокси-пептидази Н, двох гангліозидних антигенів (GT3 та GM2-1), ICA та ICA512 (Atkinson M.A., 1994, Hagopian W.A., 1995). Засоби, що використовуються в теперішній час в якості імунокоригуючої терапії або недостатньо ефективні (продигіозан, нуклеінат натрію, нікотинамід, спленін, левамізол та ін.), або мають значні негативні побічні ефекти (азатіоприн, циклоспорин) (Diem P., 1993, Малыжев В.А., 1998).

В перебігу ЦД можливий розвиток гематологічних порушень, в першу чергу анемій. Особливої уваги вимагають анемії, пов'язані з розвитком діабетичної нефропатії, хронічної ниркової недостатності (ХНН). Серед механізмів провідна роль відводиться порушенню ендокринної функції нирок, зокрема, продукції еритропоетину (Бреннер Б.,1995). Також мають значення дія уремічних токсинів на кістковий мозок, втрати крові при прихованих кровотечах внаслідок порушення згортання, реакції на лікарські препарати, дефіцит заліза, вітаміну В12, фолієвої кислоти, супутні хронічні інфекції. Традиційна гемостимулююча терапія при даних станах мало ефективна (Миллер С.,1995).

У своїй роботі в якості засобу імунотерапії, відновлення гемопоезу ми викорис-товували кріоконсервовані гемопоетичні клітини, які виготовлені з печінки ембріону людини 5 - 12 тижнів гестації. У цей період печінка є кровотворним органом. Тому виготовлені ембріональні клітинні суспензії (ЕКС) містять значну кількість стовбурових клітин ембріонального гемопоезу, що здатні трансформуватись у всі паростки кровотворення, а також коригувати імунологічну реактивність реципієнта. Клітинні суспензії містять також гемопоетичні фактори росту, в тому числі еритропоетин. Вони імунологічно толерантні до антигенів реципієнта, здатні приживлятися внаслідок відсутності або слабкої експресії антигенів HLA - системи.

Ці унікальні властивості використовуються у клінічній практиці для лікування важких комбінованих імунодефіцитів (Touraine J.L., 1985,1995), СНІД (Смикодуб А.И., Пилипчак Е.М., 1993), апластичної анемії (Kelemen E.,1973, Harrouseau J.L.,1980, Смикодуб А.И., 1994), мієлодепресивного синдрому (Kochupillai V., 1985, Gale R.P., 1992, Cнігир Н.В., 1997), для лікування вроджених порушень метаболізму (Touraine J.L., 1991). Застосування ембріональних стовбурових клітин в лікуванні ЦД у вітчизняній та світовій практиці не описане.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема дисертації була складовою частиною теми N169 “Розробка сучасних диференційованих підходів до лікування інсулінозалежного та інсулінонезалежного цукрового діабету та діабетичних ангіопатій” Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України у 1992-1994 роках.

Мета дослідження. Основною метою дослідження є розробка методу лікування хворих на цукровий діабет ембріональними клітинними суспензіями на основі гемопоетичних клітин ембріональної печінки (ГК ЕП) людини, що направлений на відновлення показників імунітету та кровотворення, досягнення стійкої компенсації захворювання.

Задачі дослідження. 1. Дослідити динаміку показників імунологічної реактивності у хворих з вперше виявленим інсулінозалежним цукровим діабетом при лікуванні гемопоетичними клітинами ембріональної печінки людини.

2. Вивчити вплив гемопоетичних клітин ембріональної печінки людини на перебіг вперше виявленого ІЗЦД.

3. Вивчити вплив гемопоетичних клітин ембріональної печінки людини на клінічні, гематологічні, імунологічні, біохімічні показники у хворих з діабетичною нефропатією, анемічним синдромом, хронічною нирковою недостатністю.

4. Розробити показання та протипоказання до проведень трансплантацій гемопоетичних клітин ембріональної печінки людини при цукровому діабеті.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше у вітчизняній та світовій медичній практиці використані гемопоетичні клітини ембріональної печінки людини в лікуванні цукрового діабету, розроблений метод лікування хворих на цукровий діабет з застосуванням цих клітин, показана клінічна ефективність методу, визначені показання до застосування.

Практичне значення одержаних результатів. Проведені дослідження при лікуванні хворих на цукровий діабет дозволили встановити:

ГК ЕП сприяють відновленню показників клітинного імунітету у хворих на цукровий діабет, що призводить до розвитку ремісії у хворих з вперше виявленим ІЗЦД, до зменшення частоти та вираженості інфекційно-запальних процесів;

ГК ЕП відновлюють еритропоез або зменшують ступінь важкості анемії у хворих з діабетичною нефропатією, хронічною нирковою недостатністю I - II ступеня, при цьому поліпшується функціональний стан нирок;

ГК ЕП позитивно впливають на вуглеводний обмін: зменшують рівень глікемії, призводять до стійкої компенсації захворювання при вперше виявленому ІЗЦД, сприяють стабілізації перебігу різних форм захворювання.

Науково-практичні рекомендації та розробки впроваджені в Інституті ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України, в клінічній лікарні №4 м. Києва. Отримані результати використовуються в матеріалах лекцій та практичних занять, що проводяться для студентів Національного медичного університету ім. акад. О.О.Богомольця, а також слухачів факультету вдосконалення викладачів.

Особистий внесок здобувача. Особиста участь проявлена на всіх етапах роботи- від забору ембріонального матеріалу, приготування клітинних суспензій, їх тестування та програмного кріоконсервування. В клініці - самостійне проведення трансплантацій, клінічне обстеження хворих до трансплантації та спостереження у післятрансплантаційному періоді. Організація обстежень хворих на протязі року, в деяких випадках - до 4 років. Проведення статистичної обробки отриманих даних.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались та обговорювались на конгресі молодих вчених з клінічної медицини (Київ, 1992), на V з'їзді ендокринологів України (Івано-Франківськ, 1994), симпозіумі, присвяченому 150-річчю кафедри факультетської терапії Українського державного медичного університету ім. акад. О.О.Богомольця (Київ, 1994), на VIII міжнародному конгресі товариства Мінімальної інвазивної терапії (Мілан, Італія, 1996), на IX міжнародному конгресі товариства Мінімальної інвазивної терапії (Кіото, Японія, 1997), на XIV з'їзді терапевтів України (Київ, 1998), на IV міжнародному конгресі товариства Клітинної трансплантології (Монтро, Швейцарія, 1999).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 18 наукових праць, з яких 3 статті у фахових наукових виданнях, 3 журнальні публікації, 5 матеріалів і тез доповідей з'їздів, конгресів, симпозіумів, 5 заявок на винахід, 2 патенти на винахід.

Серед заявок на винахід подано Національну заявку на винахід “Лiкарський препарат iмунокоригуючої дiї на основi клiтинної суспензiї та спосiб лiкування цукрового дiабету з використанням цього препарату” N 94020324 від 18.10.93 р., опубліковано 29.09.95 р., бюлетень N3. Подано Міжнародну заявку на винахід “Pharmaceutical preparation with immuno-correcting properties based on a cell suspension, and a method of treating sugar diabetes using said preparation” PCT, WO 95/11659, опубліковано 27.05.95. При проведенні міжнародної експертизи Європейським Патентним Відомством у Гаазі визнано новизну поданої заявки як такої, що відповідає рівню “А”, тобто новизну на рівні піонерських робіт. Заявки в 4 країнах (США, Канада, Нідерланди, Іспанія) знаходяться на стадії експертизи по суті. Отримано патент Греції N1002968, опубліковано 9.09.98 р., патент Росії N2126260, опубліковано 20.02.99 р., маємо позитивне рішення за надання патенту України.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, розділу, який характеризує матеріали та методи дослідження, трьох розділів власних досліджень, закінчення, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел, додатків. Основний зміст дисертаційної роботи викладений на 150 сторінках друкованого тексту. Дисертація ілюстрована 23 таблицями та 18 малюнками, має 12 додатків. Список використаних літературних джерел налічує 251 найменування, з них 81 - вітчизняних та 170 - іноземних.

2. Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Ефективність трансплантацій ГК ЕП у хворих на ЦД вивчали на різних етапах захворювання. З 1991 року по 1996 рік методом клітинної терапії проліковано 46 хворих на клінічних базах: діабетологічне відділення Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України - 13 хворих; клініка клітинної терапії Національного медичного університету та Центру ембріональних тканин “EmCell” на базі ЦРКБ Залізничного району м. Києва - 31 хворий; ендокринологічне відділення НПО "Охматдит" - 2 хворих. Загальна невелика кіль-кість хворих є звичайною для робіт з клітинної трансплантології, до якої відноситься дана робота. Усі хворі були розподілені на 3 групи: 1 - з вперше виявленим ІЗЦД; 2 - з анемією, що зумовлена діабетичною нефропатією III стадії, ХНН; 3 - з іншими особливостями перебігу: лабільність, вторинна сульфаніламідорезистентність, прояви вторинного імунодефіциту. Діагноз встановлювали у відповідності з класифікацією, запропонованою Комітетом експертів ВОЗ з цукрового діабету (1987 р.)

В першу групу увійшли 20 пацієнтів з вперше виявленим ІЗЦД (12 чоловіків та 8 жінок), середній вік - 17,12,18 років. Тривалість захворювання після встановлення діагнозу складала 1-6 місяців (у середньому - 2,50,33 місяця). Строк від початку класичних симптомів до встановлення діагнозу - від 1 до 5 місяців (у середньому - 2,21,8 місяця). Усі пацієнти отримували інсулінотерапію в середньодобовій дозі 0,760,06 ОД/кг. Необхідною умовою для проведення трансплантацій було досягнення компенсації вуглеводного обміну. Для трансплантації підбирали ЕКС з наступними характеристиками: вік тканини - від 5 до 9 тижнів гестації (у середньому 6,350,22 тижнів); об'єм - від 1,0 до 3,5 мл (у середньому 2,190,16 мл); кількість клітин в 1 мл - 7,5-36х106. Контрольну групу склали 20 хворих, які подібні за віком, статтю, тривалістю захворювання, вираженістю метаболічних порушень. Тривалість спостереження - від 1 до 4 років.

В другу групу увійшли 11 хворих з тяжкими ускладненнями ІЗЦД: універсальною діабетичною мікро- макроангіопатією, діабетичною нефропатією III стадії з анемією легкого та середнього ступеня важкості, хронічною нирковою недостатністю. У 6 хворих встановлена наявність ХНН I ступеня (креатинін сироватки крові - 0,175 0,019 ммоль/л, сечовина - 10,131,0 ммоль/л, еритроцити периферичної крові - 2,94 0,12х1012/л, гемоглобін - 92,55,4 г/л). У 5 хворих встановлена наявність ХНН II ступеня (креатинін -0,3260,066 ммоль/л, сечовина-15,970,68 ммоль/л, еритроцити периферичної крові - 2,260,10х1012/л, гемоглобін - 75,61,91 г/л). Ступінь ниркової недостатності встановлювали у відповідності з класифікацією, розробленою в Інституті ендокринології та обміну речовин АМН України (Карабун П.М., Романенко С.А.,1984). Чоловіків - 5, жінок - 6, середній вік хворих - 29,82,1 років. Відбір хворих проводили при наявності анемії, яка не піддавалась лікуванню загальноприйнятими гемостимулюючими засобами (препарати заліза, ціанокобаламін, фолієва кислота) впродовж двох місяців. Інші причини анемії, окрім ХНН на фоні ЦД, були виключені. До проведення трансплантації всі хворі знаходились у стані субкомпенсації вуглеводного обміну. Характеристика клітинної суспензії: 1) у групі хворих з ХНН I ст. - вік тканини - 5 - 12 тижнів гестації, об'єм введеної клітинної суспензії -1,3 - 4 мл (у середньому 2,550,41 мл), кількість ядерних клітин в 1 мл - 10,5 - 70,2x106 (у середньому - 21,69,7x106); 2) у хворих з ХНН II ст. - вік тканини - 5 тижнів гестації, об'єм - 1 - 2,5 мл (1,70,25 мл), кількість ядерних клітин в 1 мл - 8 - 25х106 (у середньому 12,523,19х106). Контрольну групу склали 11 хворих, які подібні за віком, статтю, тривалістю захворювання, клініко-лабораторними проявами захворювання. Тривалість спостереження - 1 рік.

В третю групу увійшли хворі з іншими клінічними проявами ЦД. Це поодинокі спостереження. Але зважаючи на важливі клінічні ефекти, отримані при лікуванні ЕКС, а також враховуючи, що це перший досвід, який безперечно потребує подальшого розвитку, ми проаналізували клінічні випадки. Це 6 хворих на ІЗЦД з лабільним перебігом захворювання - 3 чоловіка та 3 жінки у віці від 2 до 51 років з тривалістю захворювання від 9 місяців до 22 років; 3 хворих на ІНЗЦД з вторинною сульфаніламідорезистентністю (чоловіки 46 - 53 років) з тривалістю захворювання від 5 до 15 років; 6 хворих на ІНЗЦД від легкого до важкого ступеня важкості з клінічними проявами вторинного імунодефіциту - наявністю частих інфекційних епізодів, хронічних інфек-ційно-запальних процесів, наявністю трофічних виразок м'яких тканин, що довго не загоюються (3 чоловіків та 3 жінки 45 - 71 років). Тривалість спостереження - 1-3 роки.

План обстеження до та після трансплантації включав: 1. Загальноприйняті клінічні лабораторні дослідження - загальний аналіз крові; біохімічний аналіз крові: рівень білкових фракцій, С-реактивного протеїну, серомукоїду, сіалових кислот, холестерину, бета-ліпопротеїдів, креатиніну, сечовини, електролітів, білірубіну, сироватки крові, активність трансаміназ крові, тимолова проба; глікемічний профіль; глюкозуричний профіль; дослідження добової протеїнурії; аналіз сечі загальний; аналіз сечі за Нечипоренко. 2. Дослідження імунного статусу. 3. Інструментальні методи обстеження: ЕКГ, рентгенографія органів грудної порожнини. Інші інструментальні методи проводились за показаннями (дослідження, що підтверджують основне захворювання). Обстеження включало також визначення еритроцитів, що містять фетальний гемоглобін, в мазках периферичної крові (за Kleinhauer E., Betke K., 1958).

Дослідження субпопуляційного складу лімфоцитів крові у частини хворих (дослідження 1993-1996 рр.) проводились за допомогою непрямого імунофлюоресцентного тесту з панелями моноклональних антитіл серії Leu (BECTON DICINSON), що виявляють поверхневі антигени CD3, CD4, CD8, CD22. Дослідження проводили на лазерному протоковому цитофлюориметрі FACSTAR PLUS (BECTON DICINSON, США). У частини хворих (дослідження 1991-1993 рр.) кількість Т- та В-лімфоцитів в периферичній крові визначали мікрометодом стандартної реакції розеткоутворення, співвідношення лімфоцитів з хелперною та супресорною активністю визначали, використовуючи теофіліновий тест. Вміст імуноглобулінів у сироватці визначали методом радіальної імунодифузії за Mancini (1965). Дані норми надані імунологічними лабораторіями, де дослідження проведені на здорових людях.

План лікування включав внутрішньовенне крапельне введення ГК ЕП.

Приготування клітинних суспензій проводилось на кафедрі госпітальної терапії N 3 Національного медичного університету. Ембріони 5-12 тижнів гестації отримували в ході медичних абортів за соціальними показаннями в гінекологічних стаціонарах м. Києва від здорових жінок. Клітинні суспензії з ембріональної печінки готували в стерильних умовах боксу за стандартною методикою, яка включає наступні етапи: виділення печінки, гомогенізація, фільтрація через фільтри систем для переливання крові, пасаж через ін'єкційні голки чим раз меншого діаметру (Бубнов А.Н., 1982, Грищенко В.И., 1991). В якості кріопротектора використовували 5% ДМСО (диметилсульфоксид). Клітинні суспензії розливали в поліетиленові контейнери об'ємом від 0,5 до 1,5 мл. Контейнери з суспензією заморожували до -196С за програмою в камері програмного заморожувача Kryo10 (Messer Griesheim GmbH). Кріоконсервовані суспензії зберігаються в банку ембріональних тканин у рідкому азоті при температурі -196°С. Після приготування клітинної суспензії визначали кількість ядровміщуючих клітин в 1 мл. Пренатальна діагностика включала дослідження на наявність сифілісу, ВІЛ-інфекції, вірусного гепатиту В та С. Проводили дослідження вмісту контейнерів на бактеріальну стерильність. Фетальна діагностика включала дослідження на наявність ВІЛ-інфекції, вірусного гепатиту В та С, цитомегаловірусу, вірусу краснухи, герпесу та токсоплазмозу. Кров донорів досліджувалась також на ВІЛ-інфекцію через 90 днів після проведеної операції переривання вагітності. Контролі проводились лабораторією Центру ембріональних тканин “EmCell” та Українським центром державного санепіднагляду.

Для трансплантації відбирали клітинні суспензії з кількістю клітин від 5 до 90х 106 в 1 мл, в об'ємі від 1 до 4,5 мл. Розморожували суспензію безпосередньо перед введенням у два етапи: спочатку контейнер з матеріалом вміщували у водяну баню з температурою 40С до появи рідкої фази в контейнері, потім при кімнатній температурі матеріал розморожувався остаточно. Розморожену завись клітин вводили внутрішньовенно крапельно одноразово через систему для переливання крові у 100 мл ізотонічного розчину хлориду натрію з швидкістю 20-40 крапель за хвилину. Попередньо вводили внутрішньовенно струйно димедрол та преднізолон у вікових дозуваннях.

Після трансплантації аналізували зміни суб'єктивного та об'єктивного стану хворих, досліджували динаміку лабораторних показників у строки, що вказані в протоколі трансплантацій. Отримані дані комплексного обстеження оброблені методом вариаційної статистики за допомогою статистичного пакета CSS (Complete Statistical System). Для оцінювання статистичної вірогідності відмінностей використаний t-критерій Ст'юдента. Відмінності вважали вірогідними при P<0,05.

Результати досліджень та їх обговорення

Лікування пацієнтів з вперше виявленим інсулінозалежним цукровим діабетом гемопоетичними клітинами ембріональної печінки людини. Трансфузії ЕКС всі хворі перенесли задовільно, ускладнень не відмічено. У 15 хворих (75 % випадків) спостерігали прояви синдрому раннього післятрансплантаційного поліпшення загального стану: поява бадьорості, збільшення фізичної та розумової працездатності, посилення здатності концентрувати увагу, нормалізація формули сну, посилення апетиту, покращення настрою. Реакція була більш вираженою у перші декілька днів, потім незначно зменшувалась та тривала на протязі 2-4 місяців.

Встановлений позитивний вплив ГК ЕП на стан імунної системи хворих в результаті проведених досліджень до трансплантації, потім у строки від 14 до 28 днів та від 61 до 90 днів після трансплантації. У таблиці 1 відображена динаміка показників, отриманих проточноцитометричним дослідженням з допомогою панелі моноклональних антитіл. До трансплантації в порівнянні з показниками здорових людей були зниженими абсолютна кількість лімфоцитів, p<0,002, абсолютна кількість CD3+-лімфоцитів, p<0,001, CD4+-лімфоцитів, p<0,001, CD8+-лімфоцитів, p<0,001. Імунорегуляторний індекс (CD4+/CD8+) у 7 хворих був вищий або у межах норми (>1,1), у 4 хворих - нижчий, ніж норма (<1,1), в середньому - 1,50,18, p>0,5; виявлені значні відхилення мінімальних та максимальних значень кількості CD4+-лімфоцитів та CD8+-лімфоцитів у групі в цілому: відносний вміст CD4+-лімфоцитів складав від 24,2 до 49,5 % (34,61,9%, p>0,05), відносний вміст CD8+-лімфоцитів був у межах від 15,1% до 38,7% (25,82,4%,p>0,5). Відносний вміст CD22+-лімфоцитів був підвищеним, p<0,001. Через 2-4 тижні після трансплантації ГК ЕП зросла абсолютна кількість лімфоцитів на 41,915,6%, р<0,05, абсолютна кількість CD3+-лімфоцитів - на 58,117,2%, р<0,002, CD4+-лімфоцитів - на 54,924,2%, р<0,05, CD8+-лімфоцитів - на 57,713,1%, р<0,002. Знизився відносний вміст CD22+-лімфоцитів, р<0,001. Коливання величини імунорегуляторного індексу несуттєві, в сторону зменшення (p>0,05). У строки від 2-х до 3-х місяців після трансплантації зберігалось зростання абсолютної кількості CD8+-лімфо-цитів на 56,215,4%, p<0,05. Спостерігалось зниження абсолютної та відносної кіль-кості CD22+-лімфоцитів з перебігом часу, причому, якщо через 2-4 тижні після трансплантації ГК ЕП вірогідно знизився тільки відсотковий вміст В-лімфоцитів (р<0,001), то через 2-3 місяці - також абсолютна їх кількість на 28,413,9%,p<0,05. Спостерігалась тенденція до підвищення кількості CD3+-лімфоцитів на 43,012,7%, р<0,1.

Аналогічні результати були отримані у групі перших 6 пролікованих хворих, у яких показники клітинного імунітету вивчали за допомогою методу стандартної реакції Е- та ЕАС-розеткоутворення: через 2-4 тижня після трансплантації збільшення абсолютної кількості лімфоцитів на 25,010,7%, р<0,05, абсолютної кількості Т-лімфоцитів (Е-РУК)- на 52,510,4%, р<0,05, теофілінчутливих клітин (ТФЧ) - приблизно у 3 рази, р<0,001. Нормалізувалось співвідношення теофілінрезистентні/теофілінчутливі з 5,370,90 до 1,470,14, p<0,05. У строки від 2-х до 3-х місяців після трансплантації зберігались позитивні зміни стосовно кількості Т-лімфоцитів (Е-РУК), кількості клітин з супресорною активністю (ТФЧ). Спостерігалось зниження абсолютної та відносної кількості В-лімфоцитів (ЕАС-РУК) з плином часу, причому, якщо через 2-4 тижні вірогідно знизився тільки відсотковий вміст В-лімфоцитів, то через 2-3 місяці - також абсолютна їх кількість на 30,77,4%, р<0,05. Показники гуморального імунітету до трансплантації в порівнянні з показниками здорових людей були у середньому без змін: імуноглобуліни(Ig) A - 3,140,87 г/л,p>0,5, IgG - 13,051,58 г/л,p>0,25, IgМ -1,190,22 г/л, p>0,5. Після трансплантації ГК ЕП відзначили тенденцію до зниження вмісту IgG через 2-4 тижні (9,730,60 г/л, p<0,1) та через 2-3 місяці (9,120,46 г/л, p<0,1).

У досліджуваній групі спостерігався клінічний ефект - зменшення рівня глікемії з перебігом часу. Ефективність клітинної терапії оцінювали за ступенем зниження дози екзогенного інсуліну, частоті та тривалості ремісії. Критерієм реміссії вважали зниження потреби в інсуліні, що вводиться, < 0,4 ОД на 1 кг маси тіла при задовільному метаболічному контролі (Балаболкин М.И., 1991). У всіх хворих знижувалась доза екзогенного інсуліну у зв'язку із зниженням глікеміїї на протязі доби.

Відбувалось це по-різному: у 12 чоловік (60 %) добову дозу інсуліну почали знижувати вже з перших днів через появу гіпоглікемічних станів або раз на день, або декілька на протязі дня, що не мали вираженого характеру, мали мінімальні прояви, легко розрізнялись хворими та купувались самими хворими їжею; у 8 чоловік (40 %) спостерігали гіперглікемічну реакцію з помірним підвищенням добової дози на протязі першого тижня. В подальшому динаміка зниження добової дози екзогенного інсуліну в обох групах не відрізнялась. Також не спостерігали відмінностей у частоті виникнення та тривалості клінічної ремісії у хворих з різною первинною відповіддю на введення ембріональної тканини. В досліджуваній групі вірогідне зниження дози інсуліну, що вводиться, спостерігали через 4-6 тижнів. Добова доза складала від 0 (відміна інсулінотерапії в одному випадку на протязі 3-х тижнів) до 1,13 ОД/кг (0,530,05 ОД/кг, р<0,05). Максимально доза екзогенного інсуліну знизилась у хворих в строки від 14 до 90 діб після трансплантації, у середньому через 59,04,38 діб, на 20-100% і склала від 0 до 1,07 ОД/кг. В цілому по групі максимальне зниження дози (на 40,8%) відмічено в точці спостереження, що відповідає строку 61-90 діб після трансплантації (0,450,06 ОД/кг/добу, р<0,001). У зв'язку з погіршенням показників вуглеводного обміну у строки від 2 до 13 місяців (у середньому через 9 місяців) 7 хворим проведені повторні трансплантації ГК ЕП, результатом яких було або подовження терміну ремісії, або стійка компенсація захворювання у хворих, що не досягли ремісії. Вірогідним зниження дози інсуліну, що вводиться, в порівнянні з вихідними даними залишалось на протязі 1 року спостереження. В порівнянні з контрольною групою доза екзогенного інсуліну вірогідно нижча, починаючи з 3-го місяця та на протязі всього періоду спостереження (4 роки). Аналогічні зміни виявлені в групі дорослих та в групі дітей.

В процесі спостереження всі пацієнти були розподілені на дві групи: що досягли ремісії та що не досягли ремісії. В першу групу увійшли 13 хворих з досліджуваної групи (65%) та 6 хворих з контрольної групи (30%). Статистично вірогідні відмінності в частоті ремісії (р<0,05), а також в тривалості ремісії, відповідно 9,460,6 місяців (від 5 до 14 місяців) та 3,160,4 місяців (від 2 до 5 місяців), р<0,001.

Ми намагалися виявити фактори, що впливають на досягнення ремісії захворювання. Відбір хворих у групу, що нами спостерігалася, мав випадковий характер. При аналізі частоти розвитку ремісії ми виявили зв'язок з вихідним рівнем метаболічних порушень: у групі без ремісії всі хворі знаходились у стані субкомпенсації вуглеводного обміну, вірогідно вищі вихідні значення глікемії натще (відповідно 8,270,83 ммоль/л та 5,760,44 ммоль/л, р<0,05), дози інсуліну, що вводиться (відповідно 0,99 0,09 ОД/кг/добу та 0,630,04 ОД/кг/добу, р<0,002). У контрольній групі відмінності цих показників були невірогідними. При порівнянні показників хворих, що не досягли ремісії, досліджуваної та контрольної груп в контрольній групі вихідний рівень глікемії натще вірогідно нижчий (відповідно 6,420,28 ммоль/л та 8,270,83 ммоль/л, р< 0,05), а також вихідна доза екзогенного інсуліну виявилась вірогідно нижчою (відповідно 0,670,05 ОД/кг/добу та 0,990,09 ОД/кг/добу, р<0,05), тобто можна говорити про більш тяжкий первинний перебіг ЦД у хворих без ремісії в досліджуваній групі в порівнянні з контрольною.

Певну роль в досягненні ремісії мав фактор часу - строк від виявлення ІЗЦД до проведення трансплантації: в групі з ремісією становив 2,030,26 місяців, в групі без ремісії - 3,50,71 місяців, р<0,05. Не виявлено впливу статі, віку на досягнення ремісії, тривалість ремісії. Ми вважаємо, що при вперше виявленому ІЗЦД лікування ЕКС потрібно проводити якомога раніше після встановлення діагнозу та початку інсулінотерапії.

Лікування хворих на цукровий діабет, ускладнений діабетичною нефропатією, хронічною нирковою недостатністю та анемічним синдромом гемопоетичними клітинами ембріональної печінки людини. Трансплантації ГК ЕП є новим методом лікування анемічного синдрому у хворих на ЦД, а саме при вторинних еритропоетинзалежних станах, зумовлених наявністю діабетичної нефропатії. Комплексне лікування хворих включало дієтотерапію, інсулінотерапію, дезінтоксикаційну терапію, гіпотензивні препарати, сечогінні, вітаміни групи В, препарати заліза, фолієву кислоту. У зв'язку з наявністю стійкого гіпертензивного синдрому звичайно призначали 2-3 гіпотензивних препарати (АПФ-інгібітори, антагоністи кальцію, периферичні адреноблокатори) та сечогінні. Під час лікування стан хворих покращувався, але зберігався анемічний синдром, тому хворим були трансплантовані одноразово ГК ЕП.

Після трансплантації в жодному випадку не відмітили погіршення симптомів. У всіх хворих вже через декілька годин спостерігали прояви синдрому раннього післятрансплантаційного поліпшення загального стану: зменшення слабкості, сонливості, втоми, поява апетиту, зменшення звичної нудоти, спокійнішим став сон. Поступово, на протязі декількох днів змінювався психофізіологічний статус: з'являлась зацікавленість до оточуючого, покращився настрій, зменшилась дратівливість. Подібні зміни мали виражений характер у 9 хворих та у 2 хворих - помірні зміни.

Після трансплантації у всіх хворих спостерігався крововідновлювальний ефект. Вплив лікування ГК ЕП на гематологічні показники (вміст гемоглобіну (Hb)).

В першу добу спостерігали тенденцію до зменшення кількості еритроцитів та гемоглобіну. З початку 5-7 доби ці показники поступово підвищувались з максимумом через 1-1,5 місяці. У групі з ХНН-I ст. кількість еритроцитів у цей час становила 3,840,12х1012/л (р<0,001), вміст гемоглобіну - 118,84,76 г/л (р<0,05). Тривалість ефекту спостерігали від 5 до 11 місяців. У цілому по групі через 6-12 місяців рівень еритроцитів становив 3,380,06х1012/л (р<0,05), гемоглобіну - 108,02,3 г/л (р<0,05). У аналогічній контрольній групі різниця між цими показниками на протязі року була невірогідною, відмітили поступове їх зниження. У групі з ХНН-II ст. вже через тиждень спостерігали вірогідне підвищення цих показників з максимальним збільшенням також через 1-1,5 місяці: еритроцитів до 3,380,21х1012/л (р<0,05), гемоглобіну - до 103,44,4 г/л (р<0,05). В подальшому спостерігали поступове зниження їх рівня, проте і через 6 місяців величини їх були більше початкових: рівень еритроцитів становив 2,650,11х1012/л (р<0,05), гемоглобіну - 84,24,5 г/л (р<0,1). Тривалість ефекту спостерігали від 2 до 5 місяців. У хворих контрольної групи на протязі 6-12 місяців спостереження зростання рівня еритроцитів та гемоглобіну не відмічено, навпаки, маніфестне зниження цих показників.

Відмітили також зміни рівня ретикулоцитів у хворих досліджуваних груп. Так, у групі з ХНН-I ст. на 4-7 добу вірогідно збільшилась кількість ретикулоцитів, з максимумом через 8-14 діб (з 0,310,06% до 1,30,11%, р<0,001). Зміни залишались вірогідними на протязі 6 місяців. Через рік спостереження їх рівень становив 0,460,07% (р>0,1). У групі з ХНН-II ст. також на 4-7 добу збільшилась кількість ретикулоцитів з максимумом через 2-4 тижні (з 0,20,03% до 0,620,05%, р<0,001). Зміни залишались на протязі 1,5 місяців. У аналогічних контрольних групах різниця між показниками вмісту ретикулоцитів на протязі року була невірогідною.

Паралельно з покращенням показників червоної крові спостерігали позитивну динаміку швидкості осідання еритроцитів (ШОЕ). У досліджуваній групі з ХНН-I ст. вірогідне зниження через 2-4 тижня після трансплантації з 39,14,9 мм/годину до 23,1 3,8 мм/годину (р<0,05). До закінчення терміну спостереження ці позитивні зміни залишались вірогідними. У досліджуваній групі з ХНН-II ст. зміни мали менш виражений характер: спостерігали тенденцію до зниження ШОЕ, вірогідне зменшення тільки через 2-4 тижні з 45,84,7 мм/год. до 28,44,6 мм/годину (р<0,05). У аналогічних контрольних групах різниця між показниками ШОЕ на протязі року була невірогідною. Змін рівня лейкоцитів та тромбоцитів периферичної крові, що первинно були у межах норми, не відмічено.

Одним із маркерів фетальної тканини є фетальний гемоглобін, який визначався в мазках периферичної крові. Впродовж всього строку спостереження після трансплантації ГК ЕП в мазках крові хворих досліджуваних груп фетальний гемоглобін виявлявся. Ці клітини не були виявлені в мазках крові хворих контрольних груп під час всього строку спостереження (1 рік), а також у хворих досліджуваних груп до трансплантації.

ГК ЕП сприяють відновленню показників імунологічної реактивності хворих з ХНН-I ст. При дослідженні показників клітинного імунітету до трансплантації ГК ЕП виявлені зрушення, що свідчать про пригнічення імунної системи. Знижені в порівнянні з даними здорових людей абсолютна кількість лімфоцитів - 1,170,10х109/л, p<0,001, абсолютна кількість СD3+-лімфоцитів - 0,700,07х109/л, p<0,001, абсолютна кількість СD4+-лімфоцитів - 0,420,04х109/л, p<0,001, абсолютна кількість СD8+-лімфоцитів - 0,300,05х109/л, p<0,001. Підвищений відносний вміст СD22+-лімфоцитів - 11,50,9%, p<0,05. Співвідношення СD4+/СD8+-лімфоцитів у межах норми - 1,46 0,15, p>0,5. Після трансплантації визначали імунологічні показники через 29-45 діб та 46-90 діб. Зросла абсолютна кількість лімфоцитів при першому дослідженні на 50,7 14,5%, р<0,002, при другому дослідженні цей показник залишався практично на тому ж рівні. В Т-клітинному ланцюгу збільшився відсоток СD3+-лімфоцитів з 59,41,1% до 68,92,8%, p<0,05 при першому дослідженні та до 71,33,5%, p<0,05 при другому дослідженні. За абсолютними показниками збільшились як загальна популяція Т-лімфоцитів (СD3+), так і регуляторні субпопуляції лімфоцитів. Так, кількість СD3+-лімфоцитів при першому дослідженні після трансплантації зросла на 72,311,5%, p<0,001, СD4+-лімфоцитів - на 62,711,9%, p<0,002, СD8+-лімфоцитів - на 84,321,2%, p<0,05. При другому дослідженні вказані зміни збільшились ще від 5 до 12%. Первинно збільшений відсотковий вміст СD22+-лімфоцитів вірогідно знизився при першому дослідженні після трансплантації і становив 6,41,3%, р<0,05, утримувався приблизно на тому ж рівні і при другому дослідженні.

При лікуванні ГК ЕП також спостерігали інші позитивні зміни, а саме, покращення функціонального стану нирок: зниження добової протеїнурії, покращення сечового осаду. Так, у групі хворих з ХНН-I ст. спостерігали тенденцію до зниження добової протеїнурії в перший тиждень з 1,8150,321 г/добу до 0,8720,310 г/добу, р<0,1, через 8-14 днів зміни мали вірогідний характер (0,5360,061 г/добу, р<0,05) та утримувались на протязі 1,5-2 місяців після трансплантації. Змінювався сечовий осад також вже в перший тиждень, що проявлялось зниженням кількості циліндрів гіалінових (р<0,05), через 1-2 тижні - зниженням циліндрів зернистих (р<0,05); також спостерігали тенденцію до зменшення кількості еритроцитів у цей період (р<0,1). В контрольній групі під час лікування відзначили незначну позитивну динаміку в аналізах сечі на протязі 2 тижнів (р>0,1). У групі хворих з ХНН-II ст. також зменшувалась добова протеїнурія з максимумом через 29-45 днів, покращився сечовий осад. Після транс-лантації ГК ЕП у хворих не відмічено змін рівня креатиніну, сечовини сироватки крові. В контрольній групі поступово підвищувався рівень креатиніну, з вірогідними змінами через 6-12 місяців спостереження. У хворих досліджуваних груп покращились показники білкового обміну: збільшився вміст альбумінів з підвищенням білкового коефіцієнту через 8-14 днів, знизився відсоток первинно підвищених альфа2-глобулі-нів. Через 29-45 днів також збільшився рівень загального білка сироватки крові, знизився відсоток гамма-глобулінів. Введення ГК ЕП позитивно вплинуло на вуглеводний обмін: знизились та стабілізувались показники глікемії. Можливе як поступове зниження рівня добової глікемії зразу після трансплантації, так і початкове підвищення на протязі 2-3 днів з подальшим зниженням та аналогічною динамікою. Ми не відмітили впливу гіперглікемічної реакції на результативність трансплантацій. В жодному випадку не відмічено важких гіпоглікемій. На протязі 2-3 місяців після трансплантації в групі хворих з ХНН-I ст. добову дозу екзогенного інсуліну помірно знижували з наступною стабілізацією показників(з 0,790,09ОД/кг до 0,640,09ОД/кг, на 19%, р>0,1). На протязі декількох місяців хворі відмічали відсутність гіпоглікемічних станів.

У хворих контрольної групи величина добової дози інсуліну наприкінці року спостереження була нижче вихідної на 19,8% і при цьому спостерігали погіршення функціонального стану нирок (феномен Дани-Зуброди). У хворих, що отримали клітинну терапію, доза екзогенного інсуліну знижувалась на фоні або покращення функції нирок, або відсутності ознак прогресування ниркової недостатності.

Серед інших клінічних ефектів ГК ЕП спостерігали стабілізацію гемодинамічних показників. Поступово знижувався рівень артеріального тиску спочатку на попередній дозі гіпотензивних препаратів, потім через 2-3-4 тижні знижували дозу препаратів або відміняли один з гіпотензивних препаратів. Тривалість ефекту - від 5 до 9 місяців у групі хворих з ХНН-I ст. та від 2 до 4 місяців у групі хворих з ХНН-II ст.

Досвід лікування хворих на цукровий діабет з іншими клінічними проявами захворювання. Трансплантації ГК ЕП були проведені хворим з іншими особливостями перебігу. Серед них 6 хворих на ІЗЦД, що важко піддавався компенсації, з лабільним перебігом. Ранніх та пізніх ускладнень трансплантації не спостерігали. Через 1 місяць знизились показники середньодобової глікемії з 11,00,48 ммоль/л до 8,310,42 ммоль/л (р<0,05) та добова амплітуда глікемічних коливань з 9,910,52 ммоль/л до 6,280,52 ммоль/л (р<0,002). Середня величина рівня глікемії натще була нижче вихідних даних, але статистично показники не відрізнялись (відповідно 7,350,64 ммоль/л та 9,010,78 ммоль/л, р>0,1). Добова доза екзогенного інсуліну практично не змінилась (з 0,80,11 ОД/кг до 0,710,07 ОД/кг, р>0,5). Перебіг захворювання стабілізувався.

Проведені трансплантації ГК ЕП 3 хворим на ІНЗЦД з вторинною сульфаніламі-дорезистентністю через 9-14 днів від початку інсулінотерапії. У двох хворих на протязі доби спостерігали гіперглікемічну реакцію з подальшим зменшенням рівня глікемії. Максимальне зниження добової дози екзогенного інсуліну відзначили через 3-6 тижнів на 27-35%. В подальшому на протязі року добова доза залишалась стабільною. Відмітили наступні особливості перебігу післятрансплантаційного періоду: строки компенсації вуглеводного обміну були короткими - вже через 3-4 дні знизився рівень глікемії натще з 9-10 ммоль/л до 6-7 ммоль/л, зменшувався рівень середньодобової глікемії спочатку на попередній дозі інсуліну, а з часом на нижчій дозі екзогенного інсуліну. Значно зменшились прояви діабетичної полінейропатії без додаткового медикаментозного навантаження - зменшились болі в ногах, парестезії. Всі хворі вже в першу добу відмітили значне покращення самопочуття. На протязі строку спостереження (1 рік) хворі знаходились в стійкій компенсації захворювання. Ознак прогресування діабетичної ангіопатії не відмітили.

Проліковано ЕКС 5 хворих на ІНЗЦД. Побічних явищ не відмітили. У 2 хворих на протязі перших 2-4 днів помірне підвищення рівня глікемії натще з наступним зниженням. В цілому у групі поступово на протязі 2-3 місяців спостерігали зниження рівня глікемії, у 3 хворих зменшили добову дозу пероральних цукрознижуючих препаратів в 1,5-2 рази. Через 1 рік спостереження хворі відмітили, що стан здоров'я покращився, рідше хворіли на застудні захворювання, не було загострень хронічних захворювань: бронхіту, пієлонефриту, зменшились прояви фурункульозу. Пролікований 1 хворий на ІНЗЦД з наявністю трофічної виразки м'яких тканин стопи, що не загоювалась на протязі 14 місяців. Після трансплантації поступово на протязі 1 місяця виразка загоїлась. Крім того, через 2 місяці при регулярному контролі рівня глікемії була знижена добова доза глібенкламіду з 0,005 г до 0,0025 г.

Висновки