Біохімічні механізми підвищеної чутливості тромбоцитів до дії тромбіну при інсулінозалежному цукровому діабеті

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут біохімії імені О.В. Палладіна

УДК 577.158.1+661.729:616.379-008.64

Біохімічні механізми підвищеної чутливості тромбоцитів до дії тромбіну при інсулінозалежному цукровому діабеті

03.00.04- біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Махневич Тарас Романович

Київ 2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі біохімії Львівського національного університету ім. Івана Франка. інсулінзалежний біохімічний діабет

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор ВЕЛИКИЙ Микола Миколайович, завідувач кафедри біохімії Львівського національного університету ім. Івана Франка.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник ЛЕВИЦЬКИЙ Євген Леонідович, головний науковий співробітник Інституту фармакології та токсикології АМН України;

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник КУЧМЕРОВСЬКА Тамара Муратівна, старший науковий співробітник Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Провідна установа - Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України (лабораторія молекулярних механізмів імунітету).

Захист відбудеться 20 червня 2000 року о 14 год на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (01601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9).

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

Автореферат розісланий 18 травня 2000 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Кірсенко О.В. кандидат біологічних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Інсулінзалежний цукровий діабет (ІЗЦД) супроводжується порушеннями вуглеводного, ліпідного та білкового обмінів, що призводить до формування ряду ускладнень, зокрема інтенсифікації процесів зсідання крові при одночасному гальмуванні фібринолізу. Посилення коагуляції крові обумовлено збільшенням кількості фібриногену, фактора Віллєбранда, зростанням в'язкості крові та активації тромбоцитів (Єфімов А.С., 1994; Грабарчук О.І., 1998).

Підвищена агрегаційна здатність кров'яних пластинок при цукровому діабеті є наслідком дії різних факторів. Так, зниження активності аденілатциклази, яке спостерігається при високій активності фосфоліпази А2, індукує перетворення арахідонової кислоти по циклооксигеназному шляху з утворенням тромбоксану В2. Сповільнення швидкості метаболізму NO, інгібування активності основних ферментів антиоксидантного захисту та пов'язана з цим інтенсифікація процесів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) призводить до зниження плинності плазматичної мембрани (Winocour P.D., 1994). Збільшення кількості глікопротеїнових рецепторів на поверхні тромбоцитів, інтенсифікація обміну фосфоінозитидів, зростання внутрішньоклітинної концентрації Са2+ спричиняє активацію внутрішньоклітинних сигнальних шляхів, ключовими ланками яких є протеїнкінази та ліпідкінази (Winocour P.D., 1994). З'ясування механізмів активації та функціонування протеїнкінази с-Src та фосфатидилінозит 3'-кінази (РІ 3'-кіназа) дозволить розширити наші уявлення про механізми розвитку гіперчутливості тромбоцитів при ІЗЦД.

Дослідження останніх років показали здатність нікотинаміду (НАм) попереджувати або гальмувати розвиток ІЗЦД у дітей та знижувати ймовірність виникнення діабету у мишей без ожиріння (Okamoto H. 1993; Шишко П.И., 1993). Постульовано декілька можливих біохімічних механізмів захисної дії НАм при ІЗЦД у людей та експериментальному стрептозотоцин- або алоксан-індукованому діабеті у щурів і мишей. Згідно з одним із них центральна роль в опосередковуванні дії нікотинаміду належить цикло-ADP-рибозі, метаболіту NAD+, яка є вторинним посередником внутрішньоклітинного вивільнення Са2+ з ендоплазматичного ретикулуму і глюкозо-індукованій секреції інсуліну в-клітинами. НАм, інгібуючи полі-ADP-рибозосинтетазу та знижуючи використання NAD+ у синтезі полі-ADP-рибози, відновлює функції ще не зруйнованих -клітин (Великий Н.Н. и др., 1995). Важливим наслідком введення НАм є зниження інтенсивності процесів ПОЛ, в основі якого лежить здатність НАм безпосередньо взаємодіяти з гідроперекисами ліпідів із утворенням N-оксиду нікотинаміду (Pociot E., 1993).

Оскільки вільнорадикальні процеси та реакції ПОЛ впливають на функцію тромбоцитів і є тісно пов'язані з NAD- i NADP-залежними окисно-відновними процесами в клітинах (Simplico P. 1995), актуальним було з'ясувати вплив НАм на тромбін-індуковану агрегацію, вміст продуктів ПОЛ та активність ферментів антиоксидантного захисту в тромбоцитах хворих на ІЗЦД та щурів із експериментальним стрептозотоциновим діабетом.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є частиною фундаментальних досліджень науково - дослідної лабораторії “Радіаційної та молекулярної біології” Львівського державного університету ім. Івана Франка за темами: “Діагностика та розробка засобів корекції метаболічних порушень при цукровому діабеті” (№ держ. реєстрації 0193V024092), “Інтегративна роль нікотинамідних коферментів в регуляції клітинного метаболізму в нормі та при дії екстремальних факторів” (№ держ. реєстрації 0194V022438); Відділу біохімії клітинної диференціації, Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за темою: “Дослідження каскадних процесів фосфорилювання-дефосфорилювання при індукції диференціації клітин” (2.2.1.1). Дослідження ефективності нікотинаміду в терапії та профілактиці діабету в групах ризику проводиться в рамках “Європейської програми дослідження впливу нікотинаміду при діабеті” (European Nicotinamide Diabetes Intervention Trial).

Мета та завдання роботи. Метою даної роботи було дослідити cтупінь тромбін-індукованого, тирозинспецифічного фосфорилювання внутрішньо-клітинних сигнальних білків, інтенсивність процесу ПОЛ і активність ферментів антиоксидантного захисту у тромбоцитах хворих на ІЗЦД та щурів із експериментальним стрептозотоциновим діабетом. Оцінити вплив нікотинаміду на агрегаційну здатність кров'яних пластинок при даній патології.

Відповідно до поставленої мети були сформульовані наступні завдання:

Охарактеризувати особливості протікання тромбін-індукованої агрегації тромбоцитів, у хворих на ІЗЦД.

Дослідити роль внутрішньоклітинних сигнальних білків в активації тромбоцитів при ІЗЦД:

- охарактеризувати процес фосфорилювання білків по залишках тирозину у тромбоцитах хворих на ІЗЦД, після активації їх тромбіном;

- вивчити динаміку і механізм транслокації протеїнкінази с-Src та регуляторної субодиниці РІ 3'-кінази у цитоскелетну фракцію під час агрегації тромбоцитів, стимульованої тромбіном у хворих на ІЗЦД.

Оцінити інтенсивність процесів перекисного окислення ліпідів та активності ферментів антиоксидантного захисту у тромбоцитах хворих на ІЗЦД, а також у тромбоцитах щурів із стрептозотоциновим діабетом.

Дослідити вплив нікотинаміду на тромбін-індуковану агрегацію, інтенсивність процесів ПОЛ та функціонування системи антиоксидантного захисту у тромбоцитах хворих на ІЗЦД, та у тромбоцитах щурів із стрептозотоциновим діабетом.

Наукова новизна одержаних результатів. В результаті проведених досліджень встановлено підвищення рівня фосфорилювання по тирозину ряду специфічних білків тромбоцитів у хворих на ІЗЦД та проаналізовано динаміку його зміни в процесі агрегації, індукованої тромбіном. Виявлені закономірності фосфорилювання білків кров'яних пластинок при даній патології свідчать про активацію внутрішньоклітинних сигнальних шляхів, які залучені у процес агрегації тромбоцитів.

Вперше продемонстровано динаміку перерозподілу внутрішньо-клітинного пулу ключових сигнальних білків с-Src-кінази та РІ 3'-кінази у тромбоцитах хворих на ІЗЦД між цитоплазматичною і цитоскелетною фракціями. З'ясовано роль їх SH3-доменів у тромбін-індукованій транслокації у цитоскелет. Встановлено, що процес транслокації с-Src кінази у цитоскелетну фракцію діабетичних тромбоцитів опосередковується SH3-доменом молекули ферменту. Посилення включення протеїнкінази с-Src у цитоскелетну фракцію у кров'яних пластинках при ІЗЦД свідчить про її активацію.

Вперше продемонстровано коригуючий вплив нікотинаміду на тромбін-індуковану агрегацію, активність ферментів системи антиоксидантного захисту та інтенсивність процесів ПОЛ у тромбоцитах людей хворих на ІЗЦД і у тромбоцитах щурів із експериментальним стрептозотоциновим діабетом.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані у роботі дані дозволяють охарактеризувати механізми розвитку гіперактивності тромбоцитів при ІЗЦД як результат сукупної дії різних факторів. Порушення процесів фосфорилювання/дефосфорилювання сигнальних білків, зміни у функціонуванні с-Src протеїнкінази та обміні 3'-фосфоінозитидів, інтенсифікація процесів ПОЛ, що проходить на фоні інгібування ключових ферментів антиоксидантного захисту, сприяють розвитку гіперчутливості тромбоцитів до дії тромбіну при цій патології. Оскільки введення нікотинаміду спричиняло зниження ступеня та швидкості тромбін-індукованої агрегації, викликало зниження вмісту продуктів ПОЛ та нормалізувало активність ферментів системи антиоксидантного захисту у тромбоцитах при цукровому діабеті, доцільно рекомендувати його застосування з метою попередження розвитку судинних ангіопатій при ІЗЦД та на його основі вести пошук і розробку нових хіміотерапевтичних засобів, скерованих на нормалізацію функціональної активності кров'яних пластинок.

Матеріали дисертаційної роботи використовуються на кафедрі біохімії Львівського національного університету ім. Івана Франка та у Відділенні регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України при читанні спецкурсів: “Молекулярні механізми інтеграції клітинного метаболізму” та “Сигнальні механізми клітини”.

Особистий внесок здобувача. Експериментальна частина роботи виконана здобувачем самостійно. Автор особисто відібрав і критично проаналізував великий обсяг сучасної вітчизняної та зарубіжної літератури за темою проведеного наукового дослідження. Дисертантом розроблено програму вирішення поставлених завдань, інтерпретовано отримані результати. Аналіз та обговорення результатів досліджень проведено спільно з науковим керівником - зав. кафедрою біохімії Львівського національного університету ім. Івана Франка, д.б.н., проф. Великим М.М., та зав. відділом біохімії клітинної диференціації Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, к.б.н. Дробот Л.Б.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертації були представлені на IV Міжнародній студентській науковій конференції (м. Гданськ, Польща, 1996); Міжнародній науково-практичній конференції “Сучасні проблеми біології, ветеринарної медицини, зооінженерії та технологій продуктів тваринництва” (м. Львів, 1997); VII Українському біохімічному з'їзді (м. Київ, 1997); IV Міжнародній конференції з клінічної ендокринології Європейської Федерації Ендокринологічних досліджень (м. Пултуськ, Польща, 1997); ІІ Міжнародному з'їзді з молекулярної і клітинної ендокринології (м. Турку, Фінляндія 1998); I Міжнародній конференції по вивченню шляхів трансдукції сигналу (м. Дубровнік, Хорватія 1998); V Міжнародній конференції “Біоантиоксидант” (м. Москва, Росія 1998); ІІ конференції ім. Парнаса (м. Гданськ, Польща, 1998); VII Науковій конференції Польського діабетологічного товариства (м. Вроцлав, Польща, 1999).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 наукових праць, з яких 4 статті у фахових наукових журналах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів, результатів та їх обговорення, висновків і списку використаних джерел, який містить 190 найменувань. Обсяг роботи становить 133 сторінки. Дисертація проілюстрована 7 таблицями та 19 рисунками.

Основний зміст роботи

Огляд літератури. Розглянуто механізми виникнення і розвитку ІЗЦД та експериментального стрептозотоцинового діабету. Охарактеризовано фактори, що впливають на агрегаційну здатність тромбоцитів. Описані сучасні уявлення про молекулярні механізми активації кров'яних пластинок, функціонування антиоксидантної системи захисту та її роль у розвитку гіперчутливості до дії індукторів агрегації.

Матеріали і методи досліджень. Об'єктом досліджень були:

1) тромбоцити людей, хворих на важку форму ІЗЦД, ускладнену судинними ангiопатiями;

2) тромбоцити щурiв-самцiв із експериментальним стрептозотоциновим діабетом, масою 120-150 г, яких утримували в умовах віварію.

Експериментальний цукровий діабет у щурів викликали введенням стрептозотоцину фірми “Sigma” в дозі 70 мг на кг маси тіла внутрішньочеревно. Розвиток діабету контролювали за рівнем глюкози, який визначали глюкозооксидазним методом (Гончар М.В., 1998). Вплив нікотинаміду досліджували під керівництвом і за участю завідувача кафедри клінічної ендокринології Львівського державного медичного університету доктора мед. наук Сергієнка О.О. 5% розчин нікотинаміду вводили внутрішньом'язево по 1 мл двічі на добу людям хворим на ІЗЦД протягом 14 діб (Обросова И.Г., 1987). Щурам з розвиненою гіперглікемією (14-16 ммоль/л) внутрішньом'язево вводили нікотинамід “Sigma” в дозі 200 мг на кг маси щодобово протягом 14 діб.

Агрегаційну здатність тромбоцитів досліджували на автоматичному аналізаторі (НПФ “Биола”, Москва). Індуктор агрегації (тромбін) додавали до суспензії тромбоцитів у концентрації 0.7 од/мл. Визначення активності супероксиддисмутази (СОД, КФ 1.15.1.11) проводили за допомогою реакції відновлення нітротетразолію синього до нітроформазану (Чевари С., 1991). Вміст ТБК - позитивних продуктів визначали за інтенсивністю забарвлення комплексу малонового дiальдегіду з тіобарбітуровою кислотою (Тимирбулатов Р.А., 1981). Рівень дієнових кон'югатів визначали за інтенсивністю поглинання кон'югованих дієнових структур гідроперекисів ліпідів при 233 нм (Гаврилов Б.В, 1983). Глутатіонпероксидазну (ГПО, КФ 1.11.1.9) активність визначали за зменшенням концентрації відновленого глутатіону (GSH) (Моин В.И., 1986). Активність глутатіонредуктази (ГР, КФ 1.6.4.2) оцінювали за зменшенням вмісту NADPH (Прохорова М.И. 1982). Активність каталази (КФ 1.11.1.6) еритроцитів та печінки визначали за інтенсивністю забарвлення комплексу Н2О2 з молібдатом амонію (Королюк М.А. 1988).

Преципітацію білків лізатів тромбоцитів антитілами та рекомбінантними формами SH3-доменів сигнальних білків, кон'югованих з глутатіон-S-трансферазою (GST) проводили згідно (Frederic M. Ausubel et al. 1992). Білок-білкові взаємодії вивчали in vitro з використанням GST-кон'югованих форм SH3-доменів с-Src кінази та р85б - регуляторної субодиниці РІ 3'-кінази. Білки, що специфічно зв'язались з глутатіон-сефарозою, розділяли в градієнтному (5-18%) поліакриламідному гелі (ПААГ) і фарбували сріблом за стандартною методикою.

Вестерн блотинг та Фа-Вестерн блотинг білків проводили згідно методичних рекомендацій (Frederic M. Ausubel et al. 1992).

Результати та їх обговорення

1. Індукована агрегація тромбоцитів при ІЗЦД. Агрегацію тромбоцитів аналізували за змінами середнього радіусу агрегатів, що дає більш повну інформацію про поведінку клітин у розчині. На рис. 1.1 представлено типові двохфазні криві агрегації тромбоцитів, індукованої тромбіном. При порівнянні параметрів агрегації тромбоцитів у контролі та при ІЗЦД (табл. 1.1) ми бачимо, що у останніх зростав ступінь агрегації, який визначався як максимальне значення середнього розміру агрегатів після додавання тромбіну, зростала також швидкість агрегації у першій фазі процесу. Більше того, у 8% пацієнтів у наших експериментах спостерігалась спонтанна агрегація. Агрегація кров'яних пластинок у другій фазі є значно посиленою, внаслідок зростання інтенсивності метаболізму арахідонової кислоти (Єфімов А.С., Сергієнко О.О., 1994). Підвищена чутливість тромбоцитів до дії тромбіну може пояснюватись, як підвищеною афінністю рецепторів тромбоцитів до агоністів, так і збільшеною концентрацією самих агоністів у плазмі крові (Winocour P.D., 1994). Відомо, що глікозильовані білки та модифіковані активними метаболітами кисню ліпопротеїни низької густини, концентрація яких у плазмі крові при цукровому діабеті зростає (Галенок В.А., 1989), взаємодіють з рецепторами макрофагів, стимулюють синтез і секрецію специфічних цитокінів (ФНП, ІЛ-1, ІФР-1) (Балаболкин М.М., 1997).

Таблиця 1.1. Основні показники агрегації тромбоцитів крові людей хворих на ІЗЦД (n= 15-18)

* - різниця вірогідна порівняно із контролем, р < 0,05

** - різниця вірогідна порівняно із ІЗЦД, р < 0,05

Ці біологічно активні поліпептиди при взаємодії з рецепторами ендотеліальних клітин сприяють підвищеному синтезу позаклітинних сигнальних сполук, таких як ендотелін-1, який є потужним вазоконстрикторним фактором і може

призводити до локального тромбозу. В ендотеліальних клітинах знижується синтез простацикліну І2. У той же час підвищений рівень глікозилювання білків у тромбоцитах сприяє зростанню синтезу тромбоксану А2 (Балаболкин М.М., 1997). Зміна співвідношення простацикліну І2 і тромбоксану А2 у бік збільшення останнього є однією з причин підвищення функції тромбоцитів при цукровому діабеті (Єфімов А.С., 1994).

2. Дослідження молекулярних механізмів активації тромбоцитів у пацієнтів з діабетичними ангіопатіями

2.1 Аналіз загального спектру фосфотирозинвмісних білків у тромбоцитах при ІЗЦД. Адгезія тромбоцитів у місцях пошкодження судинної стінки, чи стимуляція агрегації розчинними агоністами плазми крові спричиняє реорганізацію внутрішньої будови клітини. При цьому відбувається полімеризація актинового цитоскелету, ініціюється процес скорочення міозинових волокон, що супроводжується зміною форми тромбоцитів, секрецією вмісту внутрішньоклітинних гранул та агрегацією. Процеси фосфорилювання і дефосфорилювання сигнальних молекул відіграють ключову роль у регуляції механізмів активації тромбоцитів.

Порівнюючи інтенсивність процесів фосфорилювання у нестимульованих нормальних і діабетичних кров'яних пластинках ми показали, що останні володіють вищим конститутивним рівнем фосфорилювання білків навіть за умов відсутності стимуляції тромбіном (трек 5). Особливо це стосується білків з мол. масою 120, 95 та 68 кДа, що може бути пояснене підвищенням концентрації як розчинних, так і нерозчинних лігандів інтегринів (фібриногену, фактору фон-Віллєбранда, колагену) у плазмі крові діабетичних пацієнтів (Ефимов А.С., 1989), а також збільшенням афінності та кількості самих рецепторів на поверхні клітин (Winocour P.D., 1994). Стимуляція тромбіном викликала швидку індукцію фосфорилювання багатьох білків по залишках тирозину. Зокрема, білки з мол. масою 125/120, 95, 68, 35 кДа формували першу “хвилю”, фосфорилювання яких по тирозину значно зростає вже після 0.5 хв стимуляції. Друга фаза фосфорилювання наставала після 1 хв стимуляції. Відбувалось зростання рівня фосфорилювання білків з мол. масою 185/180, 125/120, 85, 56 кДа. В експериментах час появи другої фази фосфорилювання міг дещо відрізнятися (на 1 - 1.5 хв), однак завжди співпадав у часі з найбільшою інтенсивністю агрегації. Отримані результати свідчать про активацію тромбін-залежних сигнальних механізмів тромбоцитів, асоційованих з тирозиновими протеїнкіназами при ІЗЦД. Однією з найбільш широко представлених фосфотирозинових протеїнкіназ у кров'яних пластинках є с-Src кіназа.

2.2. Дослідження змін у функціонуванні с-Src кінази та регуляторної субодиниці РІ 3'-кінази у тромбоцитах при ІЗЦД. Відомо, що під час стимуляції тромбоцитів тромбіном відбувається швидка активація с-Src кінази з наступною транслокацією ферменту у цитоскелет (Clark E.A., 1993; Fox J.B., 1996).

Результати імуноблотингу с-Src кінази за допомогою поліклональних антитіл у тритон X-100 розчинній фракції тромбоцитів здорових донорів (треки 1-4) та хворих на ІЗЦД (треки 5-8) показали (рис. 2.2.1), що у нестимульованих тромбоцитах ізольованих з крові здорових донорів, основна кількість ферменту зосереджена у тритон Х-100 розчинній фракції (трек 1). Після додавання тромбіну, зменшення кількості протеїнкінази у детергент-розчинній фракції кров'яних пластинок (треки 2-4), відбувається поступово, пропорційно часу інкубації з тромбіном, що свідчить про транслокацію с-Src кінази у цитоскелет. При ІЗЦД рівень с-Src кінази у детергент-розчинній фракції нестимульованих тромбоцитів був нижчим (трек 5) ніж у контролі, що свідчить про активацію ферменту і, як наслідок, перерозподіл пулу с-Src між цитоплазматичною і цитоскелетною фракціями. Динаміка рівня с-Src кінази у детергент-розчинній фракції діабетичних тромбоцитів при дії тромбіну має чітко виражений фазний характером: зниження на 30 сек і 4 хв та підвищення на 1 хв стимуляції у порівнянні з контролем.

Відомо, що SH3-домени сигнальних молекул, взаємодіючи з пролін-багатими ділянками білків, залучені у процес транспортування молекул до специфічних компартментів у середині клітини, в тому числі і до цитоскелету (Malarkey K., 1995). Використання рекомбінантної, кон'югованої з GST, форми SH3-домену с-Src кінази для дослідження зв'язування білків лізатів тромбоцитів in vitro, стимульованих тромбіном, дозволило нам показати, що основна роль в інтеграції протеїнкінази с-Src у цитоскелет належить SH3-домену молекули.

Більш детальну інформацію про взаємодію SH3-домену с-Src-кінази із білками тромбоцитів нам вдалось отримати методом Фа-Вестерн блотингу. Нами встановлено, що SH3-домен вказаної протеїнкінази специфічно взаємодіяв з білками з мол. масою 125 та 70 кДа (рис.2.2.3а). Рівень звўязування SH3-домену з цими білками у контролі поступово знижувався пропорційно часу інкубації з тромбіном, а у тромбоцитах хворих на ІЗЦД динаміка зв?язування також мала фазний характер з максимумом на 1 хв стимуляції (рис.2.2.3б).

Виявлені зміни у взаємодії SH3-домену с-Src кінази з ефекторними білками можуть свідчити про порушення процесів полімеризації та реполімеризації актину у тромбоцитах людей із ІЗЦД, стимульованих тромбіном. Причиною цього може бути зростання внутрішньоклітинної концентрації Ca2+, які відіграють провідну роль у регуляції цього процесу (Tschoepe D., 1991).

Беручи до уваги, що D3-фосфоінозитиди ініціюють перехід G-актину у F форму, ми використали високоспецифічні антитіла до р85б - регуляторної

субодиниці РІ 3?-кінази для дослідження динаміки транслокації вказаного сигнального білка у цитоскелет методом імуноблотингу.

Нами показано, що рівень р85 у тритон Х-100 розчинній фракції тромбоцитів хворих на ІЗЦД протягом 4 хв стимуляції тромбіном, відрізнявся від аналогічних даних для контрольних клітин у кожній дослідній точці. Значне зменшення кількості p85 у детергент-розчинній фракції спостерігалось на 1 і 4 хв стимуляції тромбіном у порівнянні з контролем.

Посилення інтеграції сигнальних молекул - c-Src кінази та р85б у цитоскелет тромбоцитів при ІЗЦД після активації тромбіном можна пояснити змінами у тригерних механізмах запуску процесу полімеризації актину і/чи модифікацією сигнальних молекул глюкозою або активними кисневими метаболітами (Mazzanti L. 1997). Беручи до уваги дані, що глікозилювання білків-ферментів посилює процес їх окисної модифікації (Takata I., 1996), ми провели дослідження активності ферментів антиоксидантного захисту та інтенсивності процесів ПОЛ у тромбоцитах людей з ІЗЦД та щурів з експериментальним стрептозотоциновим діабетом.

3. Дослідження процесів перекисного окислення ліпідів та активності ферментів антиоксидантного захисту у тромбоцитах при ІЗЦД та експериментальному стрептозотоциновому діабеті.

Продемонстровано зростання вмісту продуктів ПОЛ - дієнових кон'югатів та ТБК-позитивних продуктів у тромбоцитах хворих на важку форму ІЗЦД, ускладнену судинними ангіопатіями, та щурів з експериментальним стрептозотоциновим діабетом (табл. 3.1). Отримані дані свідчать про інтенсифікацію перекисних процесів у кров'яних пластинках при діабеті. Відомо, що зростання інтенсивності ПОЛ у тромбоцитах є однією із основних причин порушення структури плазматичної мембрани. Це відбувається, в першу чергу, за рахунок зростання впорядкованості мембранних фосфоліпідів і збагачення їх холестерином, що сприяє зменшенню плинності останньої і, як наслідок, підвищує чутливість тромбоцитів до дії агоністів (Шатилина Л.В., 1993).

Таблиця 3.1. Вміст продуктів ПОЛ у тромбоцитах людей із ІЗЦД та щурів з експериментальним стрептозотоциновим діабетом (n = 8-15)

* - різниця вірогідна порівняно із контролем, р < 0,05

** - різниця вірогідна порівняно із ІЗЦД, р < 0,05

Причини активації процесів ПОЛ при діабеті можуть бути різними в залежності від типу клітин. В інсуліннечутливих клітинах, зокрема в тромбоцитах, це може бути пов'язано із модифікацією антиоксидантних ферментів як активним киснем, так і глюкозою, що призводить до інгібування активності останніх. Так, в еритроцитах здорових людей СОД присутня у неглікозильованій і глікозильованій формах у співвідношенні 4:1. При цукровому діабеті це співвідношення порушується за рахунок зростання концентрації глікозильованої форми ферменту (Литвиненко Л.А., 1991). Отримані результати свідчать про зниження активності СОД та каталази у тромбоцитах людей із ІЗЦД у важкій формі, ускладненій судинними.

Таблиця 3.2. Вплив нікотинаміду на активність ферментів антиоксидантного захисту у тромбоцитах людей хворих на ІЗЦД (n = 8-18)

* - різниця вірогідна порівняно із контролем, р < 0,05

** - різниця вірогідна порівняно із ІЗЦД, р < 0,05

Ангіопатіями та щурів із експериментальним стрептозотоциновим діабетом (табл. 3.2, 3.3). За цих же умов ми спостерігали зниження активності ГПО, яка окислює глутатіон, відновлюючи гідроперекиси ліпідів та інших органічних сполук. Ці дані можна пояснити алостеричним інгібуванням NADPH, зниженням концентрації відновленого глутатіону та глікозилюванням ферменту.

Таблиця 3.3. Вплив нікотинаміду на активність ферментів антиоксидантного захисту у тромбоцитах щурів з експериментальним стрептозотоциновим діабетом (n = 8-10)

* - різниця вірогідна порівняно із контролем, р < 0,05

** - різниця вірогідна порівняно із ІЗЦД, р < 0,05

у тромбоцитах при даній патології (Mazzanti L., 1997). Функціонування ГПО тісно спряжене з функціонуванням глутатіонредуктази, яка регенерує GSH з GSSG форми, що накопичується при активації тромбоцитів. Зростання активності ГР у тромбоцитах хворих на ІЗЦД, спричинене збільшенням вмісту GSSG та NADPH при діабеті (Великий М.М., 1995). Накопичення продуктів ПОЛ при ІЗЦД та експериментальному стрептозотоциновому діабеті, що відбувається на фоні зниження активності ферментів антиоксидантного захисту в інсуліннечутливих тканинах, зокрема в тромбоцитах, є одним з провідних факторів, які впливають на активацію останніх, таким чином прискорюючи розвиток судинних ангіопатій, характерних для даної патології. Це відбувається внаслідок порушення стуктури плазматичної мембрани та активації біосинтезу тромбоксану В2 (Шатилина Л.В. 1993; Winocour P.D. 1994).

4. Дослідження впливу нікотинаміду на агрегацію тромбоцитів, вміст продуктів ПОЛ та активність ферментів антиоксидантного захисту при діабеті. У хворих після курсу терапії нікотинамідом спостерігали нормалізацію процесу агрегації тромбоцитів, під дією тромбіну. Зокрема знижувалися ступінь агрегації на 20%, та швидкість агрегації у першій фазі процесу на 16% у порівнянні з даними, отриманими при тестуванні діабетичних тромбоцитів (рис. 1.1, табл. 1.1). Однак, введення нікотинаміду суттєво не впливало на агрегацію кров'яних пластинок у другій фазі процесу, а, отже, на метаболізм арахідонової кислоти та секрецію тромбоцитарних гранул.

Ці дані частково можуть пояснюватись гіполіпідемічним та антиоксидантним ефектом нікотинаміду, бо вже після двотижневого курсу його введення, відбувається зниження рівня атерогенних ліпопротеїнів, триацилгліцеринів і холестерину плазми крові (Ido Y., 1997).

У наших експериментах введення нікотинаміду спричиняло зменшення вмісту дієнових кон'югатів та ТБК-позитивних продуктів на 31% і 30%, відповідно у тромбоцитах хворих ІЗЦД. У щурів із експериментальним стрептозотоциновим діабетом вміст дієнових кон'югатів знижувався на 19% (табл. 3.1). Отримані дані свідчать про сповільнення вільнорадикальних процесів у кров'яних пластинках за цих умов.

Введення нікотинаміду викликає в тромбоцитах людей та щурів достовірне зростання активнoсті важливого ферменту антиоксидантного захисту - СОД (табл. 3.2, 3.3), що може бути пов'язане із зниженням ступеня модифікації ферменту глюкозою та вільними радикалами кисню (Takata І., 1996). Особливо це стосується молодих тромбоцитів, частка яких при цукровому діабеті зростає (Грабарчук О.І., 1998). Активність каталази за цих умов зростає не суттєво.

Нікотинамід, як попередник біосинтезу нікотинамідних коферментів, є фактором, що селективно впливає на систему піридинових нуклеотидів, викликаючи, значне, в 4-5 разів, підвищення рівня їх окислених форм і в значно меншій мірі відновлених (Великий М.М. і ін., 1992), знімаючи таким чином алостеричне інгібування ГПО NADPH. Поряд з цим, нікотинамід володіє гіпоглікемічним ефектом, що призводить до сповільнення процесів неферментативного глікозилювання та окисної модифікації білків (Великий Н.Н. и др., 1995). За цих умов активність ГПО у тромбоцитах людей та щурів зростала на 10% та 19% (рис. 3,2, 3.3). Одночасно спостерігалась нормалізація активності ГР у кров'яних пластинках людей при цій патології (рис. 3.2).

Отже, отримані результати свідчать, що введення нікотинаміду сприяє нормалізації процесу тромбін-індукованої агрегації, активності ферментів антиоксидантного захисту, сприяє зниженню інтенсивності ПОЛ у тромбоцитах при ІЗЦД.

Висновки

Підвищена чутливість тромбоцитів до дії тромбіну при ІЗЦД зумовлена активацією процесів фосфорилювання, інтенсифікацією процесів ПОЛ та зниженням активності основних ферментів антиоксидантного захисту.

У тромбоцитах людей при ІЗЦД зростає рівень фосфорилювання по залишках тирозину ряду специфічних білків, які приймають участь у передачі внутрішньоклітинного сигналу. Отримані результати свідчать про активацію тирозинових протеїнкіназ у кров'яних пластинках за цих умов.

Стимуляція тромбоцитів тромбіном супроводжується активацією і транслокацією протеїнкінази с-Src у цитоскелетну фракцію. При ІЗЦД у тромбоцитах людей включення с-Src кінази у детергент-нерозчинну фракцію відбувається інтенсивніше, а динаміка процесу має чітко виражений фазний характер. Показано, що основна роль у інтеграції протеїнкінази с-Src у цитоскелет належить SH3-домену молекули ферменту, що специфічно зв'язується з білками з мол. масою 70 та 125 кДа.

Посилення зв'язування регуляторної субодиниці р85 з цитоскелетом у стимульованих тромбіном кров'яних пластинок вказує на активацію РІ 3-кінази при ІЗЦД.

Тромбоцити хворих на ІЗЦД та щурів із експериментальним стрептозотоциновим діабетом характеризуються посиленням процесів ПОЛ (зростання вмісту дієнових кон'югатів та ТБК-позитивних продуктів), зниженням активності основних ферментів антиоксидантного захисту (СОД, ГПО та каталази).

Введення нікотинаміду людям, хворим на ІЗЦД та щурам з стрептозотоциновим діабетом викликає зниження ступеня та швидкості агрегації тромбоцитів, гальмування процесів ПОЛ (зниження вмісту дієнових кон'югатів і ТБК-позитивних продуктів) та зростання активності ферментів антиоксидантного захисту, при ІЗЦД.

Список опублікованих праць здобувача

Махневич Т.Р., Дробот Л.Б., Великий М.М., Сергієнко О.О., Токарєва Л.В., Урбанович А.М. Агрегаційна та антиоксидантна активність тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті // Експериментальна і клінічна біохімія та фізіологія. - 1998. - № 3-4. - С. 85-89.

Т.Р. Махневич, Л.Б. Дробот, А.М. Урбанович, Ю.А. Кривко, О.О. Сергієнко, М.М. Великий. Вплив нікотинаміду на агрегаційну та антиоксидантну активність тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті // Ендокринологія. - 2000. - 5, №1. - С. 40-46.

Великий М.М., Бурда В.А., Сергієнко О.О., Оліярник О.Д., Махневич Т.Р., Козицький З.Я. Вплив нікотинаміду на стан киснево-транспортної системи периферичної крові при цукровому діабеті // Ліки. - 1997. - №5. - С.17-23

Оліярник О.Д., Великий М.М., Махневич Т.Р. Особливості гальмування активності каталази 3-аміно-1,2,4-триазолом в еритроцитах і печінці щурів зі стрептозотоциновим діабетом // Укр. біохім. журн. - 1999. - 71, № 1. - P. 77-82.

Makhnevych T., Drobot L., Serhiyenko A., Koval'chuk R., Fedyk M., Veliky M. Increased platelet agregation and pp60c-SRC phosphorylation in diabetes mellitus // Diabetologia Polska. - Wroclaw (Poland). - 1999. - vol.6 supl. 1. - P.110.

Makhnevych T., Veliky M., Drbot L. Increased platelet agregation and protein phosphorylation in diabetes mellitus // 1st International Conference on Signal transduction. - Dubrovnic (Croatia). - 1998. - P. 101-102.

Velikiy M., Oliyarnyk O., Makhnevych T. Nicotinamide prevents the oxidative stress in streptozotocin induced diabetic rats // 2-Parnas Conference. - Gdansk (Poland). - 1998. - P. 45-46.

Великий Н.Н., Бурда В.А., Махневич Т.Р. Олиярник Е.Д. Антиоксидантные свойства никотинамида при диабете // Труды V Междунар. конференции “Биоантиоксидант”. - Москва (Россия). - 1998. - C. 34.

Махневич Т.Р., Гамазіна Н.В., Великий М.М. Застосування нікотинаміду в корекції метаболічних порушень при експериментальному цукровому діабеті // Збірник статей міжнародної науково-практичної конференції “Сучасні проблеми біології ветеринарної медицини, зооінженерії та технологій продуктів тваринництва”. - Львів (Україна). - 1997. - C. 12.

Fedyk M.Y., Oliyarnyk O.D., Makhnevych T.R. Effect of nicotinamide on hemoglobine glicosylation and antioxidant defensive enzymes in erythrocytes of streptozotocine diabetic rats // Fourth international student's scientific conference. - Gdansk (Poland). - 1996. - P. 5.

Махневич Т.Р. Біохімічні механізми підвищеної чутливості тромбоцитів до дії тромбіну при інсулінзалежному цукровому діабеті. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ, 2000.

Дисертацію присвячено дослідженню біохімічних механізмів активації тромбоцитів при інсулінзалежному цукровому діабеті (ІЗЦД), що є однією із причин розвитку діабетичних ангіопатій. В роботі використано ряд сучасних методів біохімії і молекулярної клітинної біології для з'ясування причин підвищеної чутливості тромбоцитів до дії природного агоністу - тромбіну при ІЗЦД.

Виявлено інтенсифікацію процесів фосфорилювання сигнальних білків, зміни у функціонуванні протеїнкінази с-Src, регуляторної субодиниці РІ 3'-кінази, після стимуляції тромбоцитів тромбіном при ІЗЦД у людей, що свідчить про активацію внутрішньоклітинних сигнальних шляхів, які регулюють адгезивні властивості та агрегацію кров'яних пластинок. Продемонстровано зростання інтенсивності процесів ПОЛ у тромбоцитах, ізольованих із крові щурів із експериментальним стрептозотоциновим діабетом та хворих на ІЗЦД, що відбувається на фоні зниження активності ферментів антиоксидантного захисту. Введення нікотинаміду сприяло зниженню ступеня і швидкості тромбін-індукованої агрегації, інтенсивності процесів ПОЛ та нормалізації активності ферментів антиоксидантного захисту у тромбоцитах хворих на ІЗЦД та щурів із експериментальним стрептозотоциновим діабетом. Результати роботи дозволяють зробити висновок про доцільність використання нікотинаміду в комплексній терапії з метою попередження розвитку судинних ускладнень при цукровому діабеті.

Ключові слова: агрегація тромбоцитів, с-Src кіназа, РІ 3'-кіназа, тромбін, перекисне окислення ліпідів, система антиоксидантного захисту, нікотинамід.

Махневич Т.Р. Биохимические механизмы повышенной чувствительности тромбоцитов к действию тромбина при инсулинзависимом сахарном диабете. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Институт биохимии им. О.В.Палладина НАН Украины, Киев, 2000.

Диссертация посвящена изучению биохимических механизмов активации тромбоцитов при инсулиннезависимом сахарном диабете (ИЗСД), что является одной из причин развития диабетических ангиопатий. В работе использован ряд современных методов биохимии и молекулярной клеточной биологии для выяснения причин повышенной чувствительности тромбоцитов к действию естественного агониста - тромбина при ИЗСД.

Обнаружена интенсификация процессов фосфорилирования белков, изменения в функционировании протеинкиназы с-Src, регуляторной субъединицы РI 3-киназы, после стимуляции тромбоцитов тромбином при ИЗСД у людей, что свидетельствует об активации внутриклеточных сигнальных путей, регулирующих адгезивные свойства и агрегацию тромбоцитов. Продемонстрировано увеличение интенсивности процессов ПОЛ в тромбоцитах, выделенных из крови крыс с экспериментальным стрептозотоциновым диабетом, а также больных с ИЗСД, которое происходит на фоне уменьшения активности ферментов антиоксидантной защиты. Введение никотинамида приводило к уменьшению степени и скорости тромбин-индуцированной агрегации, интенсивности ПОЛ и нормализации активности ферментов антиоксидантной защиты в тромбоцитах больных ИЗСД и крыс с экспериментальным стрептозотоциновым диабетом. Результаты диссертации позволяют сделать вывод о целесообразности использования никотинамида в комплексной терапии сахарного диабета с целью предупреждения развития сосудистых осложнений.

Ключевые слова: агрегация тромбоцитов, c-Src киназа, РI 3'-киназа, тромбин, перекисное окисление липидов, система антиоксидантной защиты, никотинамид.

Makhnevych T.R. The biochemical mechanisms of increased platelet sensitivity towards thrombin under insulin dependent diabetes mellitus. - Manuscript.

Thesis for a scientific degree of candidate of biological sciences by specialty 03.00.04 - biochemistry. - A.V. Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2000.

The thesis is devoted to the investigation of the biochemical mechanisms of increased platelet sensitivity towards thrombin which appears to be one of the important causes of vascular complications development in the patients suffering from insulin dependent diabetes mellitus (IDDM). We have undertaken a complex approach in order to clarify the mechanisms of increased platelet sensitivity towards its natural agonist thrombin as well as investigation of nicotinamide influence on platelet aggregation in IDDM patients and rats with experimental streptozotocin-induced diabetes mellitus.

Using laser aggregometer we have demonstrated that thrombin stimulated diabetic platelets aggregate with higher velocity and stage than control one. It is known that protein phosphorylation processes play an important role in the mechanisms of platelet activation. We have shown an increased level of protein phosphorylation on tyrosine residues in the resting IDDM platelets. Especially this can be referred to proteins with molecular weight 125 and 95 kDa. Stimulation with thrombin triggered protein phosphorylation of numerous proteins in both control and IDDM platelets. Although in the last case the level of phosphorylation on tyrosine was higher. We suggest that there may be activation of protein kinases in IDDM platelets.

Both protein kinase c-Src (one of the best represented phosphotyrosine kinase in platelets) and phosphtidilinosit 3' kinase (PI3'K) translocate to the cytoskeleton when platelets become activated. We have observed that in IDDM platelets translocation of c-Src kinase and regulatory subunit of PI3'K - p85б occurs extensively than in the control experiments. It was demonstrated that SH3-domain of c-Src kinase plays the main role in the process of translocation and specifically interacts with 70 and 125 kDa proteins. Although these interactions are significantly impaired in diabetic platelets. Obtained results indicate that such alterations in the mechanisms of c-Src and PI3'K activation can fully contribute to the increased platelet sensitivity towards thrombin in the IDDM platelets.

We consider that the intensification of the lipidperoxidation processes in the platelets isolated from people suffering from IDDM and rats with experimental streptozotocine induced diabetes mellitus is one of the major causes that effects platelet membrane fluidity, agonist receptor affinity and may modulate platelet hypersensitivity towards agonists. Increased content of diene conjugates and thiobarbituric acid (TBA) reactive substrates in the diabetic platelets may occur partly due to the decrease of the antioxidant enzymes activities. Decrease in the activity of superoxide dissmutase (SOD), glutathione peroxidase (Gpx) and katalase may occur as a result of their modification by the oxygen radicals or / and glucose. Low antioxidant enzyme activity may intensify structure damages of the cell proteins and lipids by reactive oxygen metabolites.

Nicotinamide treatment was performed during 14 days by intramuscle injection with dose of 200 mg per kg of rats weigh with experimental streptozotocine induced diabetes mellitus and 1 ml of 5 % solutions of nicotinamide twice a day for patients with IDDM.

Nicotinamide therapy had positive effects on the process of IDDM platelet aggregation. We have observed the decrease of velocity and stage of diabetic platelet aggregation. Along with the improvement of curve aggregation parameters we have demonstrated a considerable decrease in the content of lipidperoxidation products - diene conjugates and TBA - positive reagents as well as normalization of the activity of main antioxidant enzymes - SOD and Gpx in both platelets of IDDM patients and rats with experimental streptozotocin-induced diabetes mellitus. Making conclusions based on the obtained results we can suggest application of the nicotinamide treatment in the complex therapy of the diabetes mellitus with the goal to prevent development of vascular complications.

Key words: platelet aggregation, c-Src kinase, PI3-kinase, thrombin, lipidperoxidation, antioxidant defense systems.

Размещено на Allbest.ru