Фотоперіодичний компонент механізмів адаптації до гострої гіпоксії

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

14.03.04 - Патологічна фізіологія

Фотоперіодичний компонент механізмів адаптації до гострої гіпоксії

Заморський Ігор Іванович

Київ

2000

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Буковинській державній медичній академії Міністерства охорони здоров'я України

Науковий консультант: доктор медичних наук, професор Пішак Василь Павлович, Буковинська державна медична академія, завідувач кафедри медичної біології, генетики і паразитології.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Середенко Михайло Михайлович, Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, завідувач відділу по вивченню гіпоксичних станів;

доктор медичних наук, старший науковий співробітник Хомінська Зінаїда Борисівна, Інститут педіатрії, акушерства та гінекології АМН України, завідувач лабораторії ендокринології; член-кореспондент НАН України;

доктор біологічних наук, професор Донченко Георгій Вікторович, Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, завідувач відділу біохімії коферментів.

Провідна установа: Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця Міністерства охорони здоров'я України, кафедра патологічної фізіології, м. Київ.

Захист відбудеться 27 червня 2000 року о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ-24, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Автореферат розісланий 23 травня 2000 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук З.О. Сорокіна-Маріна.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Живі істоти існують у довкіллі із надзвичайною регулярністю змін основних геофізичних параметрів середовища (К. Питтендрих, 1984; Ф.И. Комаров, 1989), тому всім організмам притаманні вроджені запобігаючі програми адаптації до цих ритмічних змін та механізми корекції внутрішніх періодичних коливань із зовнішньою періодикою. Серед всіх геофізичних параметрів найбільшу стабільність та надійність проявляє фотоперіод (В.Б. Чернышев, 1980), через це саме він виконує роль основного зовнішнього часозадавача у гомойотермних тварин (Ю. Ашофф, 1984), корегуючи і синхронізуючи вроджені ритми організму із зовнішніми умовами середовища. Пристосування до змін фотоперіоду є одним з еволюційно закріплених компонентів систем адаптації та забезпечує підвищення здатності організму переносити небезпечні для життя умови середовища (К. Хоффман, 1984). Тому найстійкішими до дії несприятливих умов можна вважати ті організми, у яких власні періодичні програми більш ефективно синхронізуються з фотоперіодом. При цьому в організмі виникають фотоперіодичні реакції (В.П. Тыщенко и др., 1980) із синхронізацією репродуктивної функції (Lincoln G., 1989), формуванням механізмів адаптації до холоду (G. Heldmaier et al., 1981), зміною загальних темпів постнатального розвитку та засвоєння їжі (Н.Р. Деряпа и др., 1985).

З огляду на широке коло органів і систем організму, в яких можуть виникати хронобіологічні реакції, можна припустити, що фотоперіодичні механізми адаптації використовуються організмом для підвищення стійкості або зменшення чутливості й до неперіодичних патологічних впливів, особливо таких, які провокують окисний стрес, зокрема під час гострої гіпоксії. Однак, залишається майже недослідженою взаємодія фотоперіодичної ланки адаптації з іншими механізмами і системами пристосування до кисневої недостатності. Зокрема, лише в окремих роботах показаний дезадаптуючий вплив зміненого фотоперіоду на стрес-реакції з боку кори надниркових залоз (Т.Г. Анищенко и др., 1988), досліджена хроноархітектоніка добової чутливості організму до гострої гіперкапнічної і гіпобаричної гіпоксії при нормальному та порушеному фотоперіоді (М.В. Березкин и др., 1989; М.Л. Хачатурьян, 1999). Проте достатніх пояснень таким змінам не наводиться, залишаються невідомими механізми впливу фотоперіоду на процеси адаптації до гострих стресових ситуацій, хоча розкриттю механізмів антистресового і антигіпоксичного захисту організму та знаходженню нових антигіпоксантних засобів приділена увага деяких дослідників (М.М. Середенко та ін., 1993).

У зв'язку з цим привертають увагу дані про шишкоподібне тіло (пінеальну залозу, епіфіз мозку), яке, з одного боку, є головним хронобіологічним нейроендокринним трансдуктором (J. Axelrod, 1992), що перетворює закодовану у нервових імпульсах довжину фотоперіоду у гормональний сигнал за зміни рівня циркулюючого пінеального мелатоніну, головного внутрішнього часозадавача (V. Cassone, 1990; R. Reiter, 1993), і, таким чином, здійснює синхронізацію ритмів організму. З іншого боку, шишкоподібне тіло здійснює антистресовий захист мозку (Э.Б. Арушанян, 1996) та інших органів за допомогою утворення гормонів індольної (мелатонін) і пептидної природи, які володіють вираженими нейропротекторними (D. Acunacastroviejo et al., 1995) і антиоксидантними властивостями (D. Tan et al., 1993; R. Reiter, 1995; В.Н. Анисимов и др., 1995). Вони здатні модулювати активність основних нейромедіаторних систем головного мозку (G. Trentini et al., 1985) і ендокринних залоз (Э.Б. Арушанян и др., 1993; Л.А. Бондаренко, 1997), що беруть участь у реалізації або в обмеженні стресових впливів. Тому, вірогідно, саме шишкоподібне тіло є тим органом, за допомогою якого фотоперіод може змінювати процес адаптації до гострої гіпоксії.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Напрямок дисертаційної роботи тісно пов'язаний з темою планової науково-дослідної міжкафедральної роботи (кафедр нормальної фізіології, патологічної фізіології, медичної біології і гістології) Буковинської державної медичної академії (№ державної реєстрації 0195U020510).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було встановлення участі фотоперіодичних механізмів у регуляції термінової адаптації щурів до гострої гіпобаричної гіпоксії та місця і ролі в цьому процесі гормонів шишкоподібного тіла. Для досягнення поставленої мети були сформульовані такі основні завдання:

- визначити характер впливу зміненого фотоперіоду на деякі метаболічні і гуморально-месенджерні показники адаптації щурів до гострої гіпобаричної гіпоксії;

- встановити участь індольного гормону шишкоподібного тіла мелатоніну в зміні чутливості щурів до гострої гіпобаричної гіпоксії за різного світлового режиму;

- порівняти вплив пептидних гормонів шишкоподібного тіла у складі препарату епіталаміну з нейропротекторною дією мелатоніну за гострої гіпобаричної гіпоксії при різному світловому режимі;

- довести функціональну участь шишкоподібного тіла в реакції організму на гостру гіпобаричну гіпоксію, дослідити механізми такої участі.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше:

- показана участь компонентів пристосування до змін фотоперіоду в узгодженні механізмів адаптації організму до гострої гіпоксії між собою та зі змінами в оточуючому середовищі. Встановлено, що попередній і поточний стан фотоперіоду, його збільшення або зменшення можуть різноспрямовано змінювати механізми адаптації до окисного стресу, який виникає за гострої гіпоксії: за збільшення фотофази підвищується чутливість до гострої гіпоксії, погіршується антиоксидантний захист ліпідів і білків та збільшується реактивність стрес-реалізуючих нейроендокринних систем; а при збільшенні скотофази посилюється стійкість до гіпоксії і покращується антиоксидантний захист ліпідів, однак погіршується захист від вільнорадикальної атаки білків;

- встановлено збільшення виживання лабораторних щурів за гострої гіпобаричної гіпоксії критичного рівня після застосування мелатоніну, що вказує на наявність у цього гормону антигіпоксантних властивостей. Показано, що мелатонін обмежує прояви стресових реакцій на гостру гіпоксію, нормалізуючи вміст циклічних нуклеотидів і серотоніну в структурах переднього мозку щурів, модулюючи нейроендокринні механізми адаптації до гіпоксії, покращуючи антиоксидантний захист в організмі та попереджаючи вільнорадикальне окиснення ліпідів, однак посилюючи неферментативне окиснення білків. Засвідчено, що вплив мелатоніну на нейроендокринні механізми адаптації до гострої гіпоксії має модуляторний характер і залежить від тривалості фотоперіоду: при збільшенні довжини фотоперіоду мелатонін обмежує активність стрес-реалізуючих механізмів за участю кортикостерону, а при зменшенні - посилює; при цьому вплив мелатоніну на активність стрес-лімітуючих механізмів за участю пролактину має протилежний характер;

- виявлено стимулюючий вплив мелатоніну на активність 5'-нуклеотидази і глюкозо-6-фосфатдегідрогенази та інгібуючий - на активність гем-оксигенази в структурах переднього мозку щурів. Встановлено, що мелатонін попереджає інактивацію Na⁺, K⁺-АТФази нейронів переднього мозку, яка виникає за гострої гіпоксії;

- встановлено, що in vivo епіталамін, на відміну від мелатоніну, захищає від окисного стресу білки в плазмі крові та, частково, в нейронах головного мозку; при цьому створений епіталаміном антиоксидантний захист ліпідів є ефективнішим за захист, обумовлений мелатоніном, особливо за умов темряви;

- доведено функціональну відповідь з боку шишкоподібного тіла щурів на гостру гіпобаричну гіпоксію критичного рівня, розкрито роль неадренергічних механізмів регуляції у функціональній активації пінеалоцитів на гостру кисневу недостатність. Встановлено участь внутрішньоклітинних месенджерних механізмів у відповіді пінеалоцитів на дію епіталаміну.

Практичне значення одержаних результатів. Робота відноситься до теоретичних досліджень з галузі хронопатофізіології. Результати роботи якісно розширюють уявлення про місце фотоперіодичної частини хроноперіодичної системи в організмі, участь структур, які належать до "біологічного годинника" організму, а також індольних і пептидних гормонів шишкоподібного тіла та регуляторного загального мелатонінового континууму у механізмах адаптації до гострих стресових впливів, зокрема гострої гіпоксії. Отримані дані мають значення для розуміння і пояснення ролі зміненого фотоперіоду в патогенезі розвитку тих захворювань, що виникають на основі гіпоксичного синдрому і порушень прооксидантно-антиоксидантної рівноваги, можуть служити для експериментального моделювання окисного стресу за допомогою зміни довжини світлового періоду. В результаті досліджень виявлені нові нейропротекторні властивості епіталаміну.

Проведені дослідження дозволяють рекомендувати використання фототерапії для корекції порушень прооксидантно-антиоксидантної рівноваги, клінічне апробування мелатоніну як антигіпоксичного і нейропротекторного засобу, застосування епіталаміну при гіпоксичному синдромі. Результати роботи можуть бути використані в навчальному процесі при викладанні курсів з нормальної і патологічної фізіології, медичної хімії і біології, ендокринології і реаніматології, нервових і внутрішніх хвороб, фармакології і загальної гігієни; при написанні монографій з відповідних галузей теоретичної і практичної медицини, хронобіології. Результати отримали впровадження у практику наукових досліджень і навчальний процес Науково-дослідного інституту медико-екологічних проблем МОЗ України та кафедр Буковинської державної медичної академії (акти впровадження від 10.06.1998 р., 25.12.1998 р., 25.02.1999 р.).

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проаналізовані актуальність та ступінь дослідженості тематики роботи, розроблені методичні підходи і дослідницька програма роботи, опрацьовані моделі, згідно яких особисто виконані експериментальні дослідження та більша частина біохімічних, імуноферментних і радіоімунологічних досліджень. Частина біохімічних досліджень була виконана за допомогою співробітників центральної біохімічної лабораторії при кафедрі медичної хімії (зав. - проф. І.Ф. Мещишен) та Центру науково-медичних досліджень (дир. - д.м.н. О.Л. Кухарчук), а радіоімунологічних досліджень - за допомогою співробітників радіоімунологічної лабораторії при кафедрі медичної біології і генетики (зав. - проф. В.П. Пішак) Буковинської державної медичної академії, за що автор висловлює їм щиру подяку. Аналіз і узагальнення результатів проведених досліджень, формулювання висновків та науково-практичних рекомендацій проведені автором самостійно.

Апробація результатів дисертації. Основні фрагменти дисертаційної роботи були оприлюднені на секційних і пленарних засіданнях підсумкових наукових конференцій Буковинської державної медичної академії (Чернівці, 1995-1998 рр.); Симпозіумі з міжнародною участю "Хірургічні проблеми і екологія" (Чернівці, 5-6 жовтня 1995 p.); I Російському Конгресі з патофізіології (Москва, 17-19 жовтня 1996 р.); XV з'їзді Українського фізіологічного товариства (Донецьк, 12-15 травня 1998 р.); Пленумі Товариства патофізіологів України "Механізми розвитку патологічних процесів", присвяченому 90-річчю від дня народження М.Н. Зайка (Чернівці, 20-22 травня 1998 р.); Міжнародній конференції "Гіпоксія: деструктивна та конструктивна дія", присвяченій 50-річчю наукової діяльності та 80-річчю з дня народження А.З. Колчинської (Київ, 10-12 червня 1998 р.); III Міжнародному конгресі з патофізіології (Лахті, Фінляндія, 28 червня - 3 липня 1998 р.); ІІ Всеросійській конференції "Гіпоксія: механізми, адаптація, корекція" (Москва, 5-7 жовтня 1999 р.); спільних засіданнях наукової комісії Буковинської державної медичної академії та Чернівецьких відділень наукових Товариств фізіологів і патофізіологів України (Чернівці, 28 квітня 1999 p.), а також Київського відділення наукового Товариства патофізіологів України і сектору фізіології вісцеральних систем Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України (Київ, 14 жовтня 1999 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 46 робіт, з них 31 стаття у фахових наукових журналах, решта у матеріалах конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалу і методів досліджень, п'яти розділів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів, висновків, науково-практичних рекомендацій та списку використаної літератури, що містить 457 джерел. Загальний об'єм дисертації складає 305 сторінок, основний її зміст викладений на 252 сторінках і проілюстрований 54 таблицями та 4 рисунками.

Основний зміст роботи

Матеріал і методи досліджень. Досліди проведені на 997 статевонезрілих самцях безпородних білих щурів масою 65-75 г, які знаходились у досліді 7 діб і досягали на момент евтаназії ювенільного віку 5,5-6,0 тижнів. Експерименти здійснені на самцях статевонезрілих тварин у зв'язку з тим, що головний мозок самців цього віку особливо чутливий до дії окисного стресу за гострої гіпоксії (J. Koudelova, J. Mourek, 1994; Г.Н. Чернобаева, Л.Д. Лукьянова, 1989). Крім того, саме в цей критичний період статевого дозрівання можна досягти протягом невеликого проміжку часу (одного тижня) вірогідних фотоперіодичних змін в організмі щурів (І.І. Заморський, 1994). За тиждень до початку досліджень з моделювання фотоперіодичних змін визначали стійкість щурів до гострої гіпобаричної гіпоксії і в подальшому використовували лише середньостійких тварин (В.А. Березовский и др., 1978). Фотоперіодичні зміни в організмі тварин моделювали протягом одного тижня за допомогою трьох режимів освітлення: 1) природна зміна світлової і темнової фаз доби у весняно-літній період року - звичайне освітлення, при цьому співвідношення світлової і темнової фаз доби в середньому дорівнювало 16 год: 8 год; 2) постійне протягом доби світло; 3) постійна цілодобова темрява. Дослідження здійснені у весняно-літній період року через те, що в цей період року вищі інтенсивність пероксидного окиснення ліпідів (Н.П. Скакун, И.Ю. Высоцкий, 1988) і чутливість організму до гострої гіпоксії (Л.Д. Лукьянова, 1989). Режими освітлення створювались за допомогою "Установки для створення різних світлових режимів" (І.І. Заморський, 1994), яка дозволяє моделювати вірогідні фотоперіодичні зміни в організмі щурів. Доступ до тварин, які знаходились за постійної темряви, здійснювали тільки при слабкому в 2 лк червоному світлі.

Після моделювання фотоперіодичних змін частині тварин за 30 хв до дії гострої гіпоксії внутрішньоочеревинно вводили пінеальні гормони - індольної (мелатонін ("Sigma", США) у 0,1% розчині етанолу, у дозі 1 мг/кг маси тіла) або пептидної (епіталамін ("Самсон", Росія) у 0,9% розчині хлориду натрію, у дозі 2,5 мг/кг маси тіла) природи. Препарати вводили внутрішньоочеревинно завдяки спроможності мелатоніну проходити будь-які гістогематичні бар'єри (R. Reiter, 1994) та здатності епіталаміну стимулювати утворення мелатоніну в шишкоподібному тілі, розташованому поза гематоенцефалічним бар'єром (Л.А. Бондаренко, В.И. Анисимов, 1992). Мелатонін вводили в фармакологічних дозах, які перевищують його фізіологічні концентрації в рідинах організму, однак саме такі дози при внутрішньоочеревинному введенні створюють фізіологічні концентрації мелатоніну в лікворі (Н.К. Малиновская, 1998). З метою вивчення участі неадренергічної регуляції шишкоподібного тіла в його реакції на гостру гіпоксію за звичайного освітлення частині тварин спільно вводили -метил-п-тирозин (інгібітор тирозин-3-монооксигенази - ключового ферменту утворення катехоламінів) та - і -адреноблокатори. Ефірну сполуку -метил-п-тирозину ("Koch-Light", Великобританія), розчинену в 0,9% розчині хлориду натрію, вводили внутрішньоочеревинно щоденно за чотири доби до моделювання гострої гіпоксії в дозі 150 мг/кг маси тіла, причому в перший день здійснювали дві ін'єкції, в подальшому по одній у ранкові години доби. Останню, шосту ін'єкцію, робили за 1 год до моделювання гострої гіпоксії. Після цього цим же тваринам за 30 хв до моделювання гострої гіпоксії вводили -адреноблокатор - дроперидол ("Gedeon Richter", Угорщина) у дозі 0,4 мг/кг маси тіла і -адреноблокатор - обзидан ("Arzneimittelwerk Dresden GmbH", Німеччина) у дозі 1 мг/кг маси тіла. Всі дози препаратів обрані з урахуванням їх фармакологічної активності та чутливості до них тварин (А.Г. Резников, 1982). Контрольним тваринам відповідних серій вводили еквівалентну кількість розчинника.

Гостру гіпоксичну гіпобаричну гіпоксію моделювали в проточній барокамері шляхом розрідження повітря до величин, які еквівалентні висоті 12000 м, зі швидкістю 50 м/с (із парціальним тиском кисню рО₂ у вдихуваному повітрі 30,5 мм рт. ст. (В.Б. Малкин, 1975)). На "висотному плато" щурів витримували до моменту другого агонального вдиху (А.А. Корнеев, И.А. Комиссарова, 1993), після чого здійснювали "спуск" на попередню нульову висоту, одночасно реєструючи показники тривалості виживання щурів за гіпоксії - час втрати пози на "висотному плато", час перебування тварин на "висотному плато" до появи другого агонального вдиху (час життя або резервний час), а також час відновлення пози з моменту початку спуску (час реституції) (В.А. Березовский и др., 1978; Н.А. Агаджанян и др., 1995).

Евтаназію щурів виконували в світловий період доби шляхом декапітації через 30 хв після припинення дії гострої гіпоксії або через 1 год після введення досліджуваних речовин, швидко забирали головний мозок (орган-мішень для гострої кисневої недостатності (Л.Д. Лукьянова, 1996)), надниркові залози, сім'яники (органи, що особливо чутливі до дії окисного стресу (И.С. Челнакова и др., 1990; Peltola V. et al., 1996)) і шишкоподібне тіло. Вилучені органи, окрім шишкоподібних тіл, зберігали в рідкому азоті до подальших досліджень. Шишкоподібні тіла, по два на одне визначення (наважка дорівнювала 1,5-2 мг), гомогенізували у фосфатному буфері (9 мM KH₂PO₄, 30 мМ Na₂HPO₄, рН 7,4); отриманий гомогенат зберігали до моменту проведення досліджень у рідкому азоті. Кров тварин збирали у попередньо оброблені ЕДТА центрифужні пробірки та центрифугували 15 хв при 600 g; отриману плазму заморожували і зберігали при -20С.

У головному мозку, надниркових залозах і сім'яниках біохімічними методами визначали стан прооксидантно-антиоксидантної рівноваги. Для цього використовували як цілий передній мозок, так і його окремі структури - кору великих півкуль (переважно фронтальну ділянку), гіпокамп (переважно поле СА1 його задньої частини) та септальний і габенулярний комплекси, оскільки ці структури найбільш чутливі до дії гострої гіпоксії (N. Sims, E. Zaidan, 1995) та (або) задіяні у реалізації впливу фотоперіоду на організм (M. Raitier, 1992). Виділення окремих структур на зрізах переднього мозку виконували згідно стереотаксичного атласу мозку статевонезрілих щурів (N. Sherwood, P. Timiras, 1970). Крім того, в цілому передньому мозку визначали структурно-функціональний стан плазматичних мембран за активністю їх маркерних ферментів (И.Н. Маньковская и др., 1997) - аденозин-5-трифосфатази, що активується іонами натрію і калію (Na⁺, K⁺-ATФаза), яка є також ключовим ферментом нейронів (В.В. Лелевич, 1996), і 5-нуклеотидази; а в структурах переднього мозку - вміст серотоніну - як показник ступеня функціональної активності серотонінергічної системи, яка задіяна в антигіпоксичному захисті нейронів (N. Nakata, 1995) та в реалізації впливів фотоперіоду і гормонів шишкоподібного тіла на головний мозок (J. Miguez et al., 1995), а також вміст і співвідношення циклічних нуклеотидів, як ступінь чутливості тканин до гострої гіпоксії (Л.А. Кожемякин и др., 1979) та участі в ній нейромедіаторів оксиду азоту (ІІ) NO i оксиду вуглецю (ІІ) CO - за рівнем цГМФ (Х.М. Марков, 1996). За допомогою визначення вмісту циклічних нуклеотидів у гомогенаті шишкоподібного тіла оцінювали функціональну активність пінеалоцитів, оскільки ці внутрішньоклітинні месенджери залучені до синтезу пінеальних гормонів (В.П. Пішак, 1996). У плазмі крові радіоімунологічно визначали рівні кортикостерону і пролактину, які, з одного боку, приймають участь у здійсненні відповідно стрес-реалізуючих і стрес-лімітуючих механізмів (Ф.З. Меерсон, 1991; К.В. Судаков, 1997), а з іншого - забезпечують фотоперіодичні зміни метаболічних процесів (А. Meier, 1976).

Вміст продуктів вільнорадикального окиснення макромолекул і ендогенних антиоксидантів (відновленого глутатіону) та активність ферментів плазматичних мембран і антиоксидантної системи визначали в супернатанті, який одержували після центрифугування при 900 g протягом 15 хв гомогенатів наважок тканин вилучених органів. Наважки органів гомогенізували в охолодженому до 2-4С 0,25 М трис-HCl буфері (pH 7,4). Інтенсивність пероксидного окиснення ліпідів оцінювали за вмістом таких продуктів ліпопероксидації: первинних (сполук з ізольованими подвійними зв'язками і гідропероксидних сполук - дієнових кон'югатів), вторинних або проміжних (карбонільних сполук - кетодієнових і кетотрієнових кон'югатів, в тому числі малонового альдегіду) і третинних або кінцевих (азометинів або шифових основ). Ступінь окиснення ненасичених ліпідів до гідропероксидних, карбонільних і азометинових сполук - "індекси окисненості ліпідів" (М.Л. Хачатурьян и др., 1995), розраховували як відношення оптичної густини зразка ліпідних екстрактів при довжині хвилі відповідно в 232, 278 і 400 нм до оптичної густини цього зразка при довжині хвилі в 220 нм (Е.И. Львовская и др., 1991). Вміст малонового альдегіду визначали за реакцією з 2-тіобарбітуровою кислотою (И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили, 1977). Продукти білкової пероксидації визначали за реакцією з 2,4-динітрофенілгідразином (И.Ф. Мещишен, 1998): аліфатичні альдегіди і кетони нейтрального характеру реєстрували при 370 нм, а основного - при 430 нм. Вміст відновленого глутатіону визначали титриметрично (И.Ф. Мещишен, И.В. Петрова, 1983).

Визначення активності ферментів: активність Na⁺, K⁺-ATФази і 5'-нуклеотидази визначали за збільшенням у ході реакції кількості неорганічного фосфату (P_i) (J. Robinson, 1970; B. Israelsson, I. Tengrup, 1980); глутатіонпероксидази - за кількістю утвореного окисненого глутатіону (І.В. Геруш, І. Ф. Мещишен, 1998); супероксиддисмутази - за її здатністю інгібувати відновлення нітросинього тетразолію (С. Чевари и др., 1985); каталази - за здатністю ферменту розкладати пероксид водню (М.А. Королюк и др., 1988); глутатіонредуктази - за кількістю НАДФН, що був використаний на відновлення окисненого глутатіону (E. Beutler, 1969); глутатіон-S-трансферази - за кількістю утвореного кон'югату відновленого глутатіону із субстратом 1-хлор-2,4-динітробензолом (W. Habic et al., 1974); глюкозо-6-фосфатдегідрогенази - за кількістю утвореного НАДФН (Ю.Л. Захарьин, 1967). Вміст P_i визначали за реакцією з молібдатом амонію (S. Fiske, J. Subbarow, 1925), а білка - за методом Лоурі-Фоліна (O. Lowry et al., 1951).

Визначення вмісту серотоніну у гомогенатах наважок структур переднього мозку, які отримували на фосфатному буфері, здійснювали імуноферментним методом (J. Chauveau et al., 1991) за допомогою набору "Serotonine" ("Immunotech", Франція). Екстракцію циклічних нуклеотидів з гомогенатів шишкоподібних тіл і структур переднього мозку проводили на мініколонках "Amprep SAX" ("Amersham", Великобританія). Елюацію екстрагованих нуклеотидів з сорбенту мініколонок виконували згідно рекомендацій виробника за допомогою розчину 367 мМ трихлороцтової кислоти. Визначення цАМФ і цГМФ в отриманому елюаті виконували радіоімунними наборами "cAMP" i "cGMP" ("Immunotech", Франція). Рівень кортикостерону і пролактину в плазмі крові визначали за допомогою радіоімунних наборів "Corticosterone (For Rats and Mice) " ("ISN", США) та "риа-пролактин-пр" ("ИБОХ", Білорусь). Останній набір виробляється для визначення пролактину в плазмі і сироватці людей, однак його використовували для визначення пролактину у щурів, оскільки імунологічні властивості пролактину у всіх ссавців однакові і, відповідно, антитіла до людського пролактину мають високу перехресну крос-реактивність до пролактину щурів (V. Tavernier et al., 1995). Аналіз проб проводили у відповідності до інструкцій з використання наборів і наявних у літературі рекомендацій (А.Г. Резников, 1980).

Отримані дані обробляли методами варіаційної статистики за допомогою пакету програм "STATISTICA 5.0" ("StatSoft", США) (В.П. Боровиков, 1998) з використанням для оцінки вірогідності різниць окремих груп даних параметричного (t Стьюдента) та непараметричних (Вілкоксона, U Манна-Уітні) критеріїв, а також одностороннього дисперсійного аналізу "ANOVA". Для визначення залежності між показниками даних різних груп використовували кореляційний і регресійний аналізи.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Стан адаптації щурів до гострої гіпоксії за різної довжини фотоперіоду. Встановлено, що у контрольних тварин вміст циклічних нуклеотидів у фронтальній ділянці кори головного мозку змінюється в залежності від довжини фотоперіоду (табл. 1): при постійному протягом тижня світлі порівняно зі звичайним освітленням збільшувався вміст як цАМФ, так і цГМФ зі збереженням відносного співвідношення між ними. За постійної темряви вміст цАМФ залишався на рівні показників у тварин при звичайному освітленні, а цГМФ збільшувався, що викликало зменшення співвідношення цАМФ/ цГМФ. Оскільки відомо, що стимуляція утворення цАМФ у нервовій тканині зменшує резистентність тварин до гіпоксії, крім того, у нестійких до гіпоксії тварин рівень цАМФ у відповідь на гостре кисневе голодування збільшується, а у стійких - зменшується (Болехан Е. А. и др., 1995), то отримане в наших дослідженнях за постійного світла збільшення вмісту цАМФ буде посилювати чутливість нейронів до гострої гіпоксії. А зменшення співвідношення цАМФ/цГМФ за постійної темряви підсилюватиме резистентність до гіпоксії. Такий висновок підтверджується результатами, що отримані після гострої гіпоксії за різних умов освітлення: за звичайного освітлення вміст цАМФ зростав, а цГМФ - не змінювався, що призвело до збільшення співвідношення цАМФ/цГМФ і супроводжувалось гальмуванням активності Na⁺, K⁺-АТФази в цілому передньому мозку та узгоджувалось з даними літератури (Л.А. Кожемякин и др., 1979; И.Н. Маньковская и др., 1997). Водночас дослідження вмісту циклічних нуклеотидів після гіпоксії на фоні постійного освітлення, свідчило про суттєве погіршення резистентності до гіпоксії, оскільки вміст цих нуклеотидів залишався на тих же високих рівнях, що і у контрольних тварин. Це супроводжувалось істотним гальмуванням активності Na⁺, K⁺-АТФази саме за цих умов постійного освітлення. За постійної темряви гостра гіпоксія суттєво не змінювала внутрішньоклітинного пулу циклічних нуклеотидів, що підтверджує висновок про зменшення в темряві чутливості до гострої гіпоксії із одночасною реєстрацією у передньому мозку найбільшого рівня активності 5'-нуклеотидази, яка синтезує ендогенний антиоксидант і антигіпоксант аденозин (В.И. Кулинский и др., 1994; В. Fredholm, 1995).

Отримані зміни супроводжувались при постійному освітленні збільшенням вмісту продуктів пероксидного окиснення, а за постійної темряви їх зменшенням (табл. 2). Так, у корі великих півкуль за постійного світла вірогідно збільшувався вміст первинних продуктів пероксидного окиснення ліпідів (сполук з ізольованими подвійними зв'язками), третинних продуктів (азометинів або шифових основ), а за постійної темряви зменшувався вміст вторинних продуктів (кетодієнових та кетотрієнових кон'югатів).

Таблиця 1. Вплив різної довжини світлового періоду за умов гострої гіпобаричної гіпоксії на вміст циклічних нуклеотидів в корі головного мозку та активність Na⁺, K⁺-ATФази і 5'-нуклеотидази в передньому мозку ювенільних щурів (M±m, n = 6).

Примітки. Тут і далі в наступних таблицях:

* зміни вірогідні щодо показників у контрольних тварин за тих же умов освітлення, p<0,05;

⁺ зміни вірогідні в порівнянні з показниками у контрольних тварин за звичайних умов освітлення, р<0,05;

^# зміни вірогідні порівняно з показниками у контрольних тварин при постійному освітленні, р<0,05;

₊₊ зміни вірогідні відносно показників у тварин після гіпоксії за звичайних умов освітлення, р<0,05;

_## зміни вірогідні щодо даних у тварин після гіпоксії при постійному світлі,р<0,05.

Таблиця 2. Вплив різної довжини світлового періоду за умов гострої гіпобаричної гіпоксії на вміст первинних, вторинних та третинних продуктів пероксидного окиснення ліпідів і ступінь окиснення ненасичених ліпідів у корі головного мозку ювенільних щурів (M±m, n = 7)

Примітка. Умовні позначення такі ж, як і в табл. 1.

Таблиця 3. Вплив різної довжини світлового періоду за умов гострої гіпобаричної гіпоксії на активність детоксикаційних антиоксидантних ферментів в корі головного мозку та вміст малонового альдегіду і стан глутатіонової системи в цілому передньому мозку ювенільних щурів (M±m, n = 7).

Примітка. Умовні позначення такі ж, як і в табл. 1.

В цілому передньому мозку характер змін залишався таким же (табл. 3): вміст малонового альдегіду був найвищим за постійного світла і найнижчим - за постійної темряви. За умов постійного світла зростала відносна ступінь окиснення ліпідів у корі головного мозку до первинних продуктів - гідропероксидних сполук або дієнових кон'югатів, та до третинних продуктів - шифових основ; а за постійної темряви зменшувалося окиснення до карбонільних сполук.

Одержані дані підтвердились відповідними змінами активності основних ланок антиоксидантного захисту клітин головного мозку. Зокрема, за постійної темряви в корі головного мозку активність одного з детоксикаційних ферментів - глутатіонпероксидази - зростала, а каталази і супероксиддисмутази - знижувалась. Одночасно активність супероксиддисмутази за постійного світла зростала. Ці дані вказують на покращання при постійній темряві знешкодження вільних радикалів у нервовій тканині за допомогою глутатіонпероксидази, ферменту, що забезпечує захист клітин від відносно невеликих рівнів пероксиду водню і ліпопероксидів, і внесок якого в антиоксидантний захист нейронів вагоміший, ніж інших детоксикаційних ферментів (О.В. Левадная и др., 1998). Проте активність тих ферментів, які захищають клітини від великих концентрацій пероксиду водню та індукуються великими концентраціями вільних радикалів (Е.Б. Меньщикова, Н.К. Зенков, 1993) - каталази і супероксиддисмутази - знижувалась, імовірно через відсутність високих концентрацій цих радикалів. Активність інших ферментів системи глутатіону - ферменту утилізації токсичних метаболітів пероксидного окиснення ліпідів та репарації макромолекул (глутатіон-S-трансферази) теж зростала за постійної темряви, а ферментів відновлення активності глутатіонової системи - глутатіонредуктази - гальмувалася за постійного світла, та глюкозо-6-фосфатдегідрогенази - зростала за постійної темряви. Подібні зміни були зареєстровані і в інших структурах переднього мозку: гіпокампі, септальному і габенулярному комплексах.

Разом з тим, при визначенні інтенсивності вільнорадикальної окиснювальної модифікації білків у корі головного мозку і гіпокампальній формації встановлено (табл. 4), що як за постійного світла, так і за постійної темряви (на відміну від пероксидного окиснення ліпідів) вміст продуктів такої модифікації (альдегідних і кетонних похідних амінокислот як нейтрального, так і основного характеру) зростав у порівнянні з показниками за звичайних умов освітлення. При цьому встановлений негативний кореляційний зв'язок та регресійна залежність між рівнями серотоніну та вмістом продуктів окиснювальної модифікації білків у гіпокампі: чим менші були рівні серотоніну - тим більше утворювалось продуктів білкової пероксидації нейтрального характеру. Серотонін є гідрофільною молекулою, і він досить потужний знешкоджувач вільних радикалів, зокрема гідроксильного і супероксидного (W. Daniels et al., 1996). За умов постійної темряви може падати активність серотонінергічної системи головного мозку (F. Cagampang, S.-I. Inouye, 1994), що зменшуватиме рівні серотоніну в структурах головного мозку. Тому під час темряви може посилюватись вільнорадикальна окиснювальна модифікація білків у цитоплазмі нейронів окремих структур переднього мозку.

Отже, в передньому мозку ювенільних щурів постійне світло виражено інтенсифікувало процеси вільнорадикального окиснення разом із погіршенням антиоксидантного захисту нейронів. А постійна темрява сприяла антиоксидантному захисту нейронів і зменшувала інтенсивність ліпідної пероксидації, хоча при цьому посилювалось вільнорадикальне окиснення білків у нейронах кори великих півкуль та гіпокампа. Подібні фотоперіодичні зміни прооксидантно-антиоксидантної рівноваги в головному мозку були виявлені в сім'яниках цих тварин, а в плазмі крові у них встановлено зменшення інтенсивності білкової пероксидації після постійної темряви.

Таблиця 4. Вплив різної довжини світлового періоду за умов гострої гіпобаричної гіпоксії на вміст продуктів окиснювальної модифікації білків в корі та гіпокампі головного мозку ювенільних щурів (M±m, n = 7).

Примітка. Умовні позначення такі ж, як і в табл. 1.

За умов окисного стресу, як наслідку гострої гіпоксії, фотоперіодичні зміни в інтенсивності вільнорадикального окиснення та активності антиоксидантного захисту проявлялись ще більш виразно. При цьому накопичувались як продукти пероксидного окиснення ліпідів, так і продукти вільнорадикального окиснення білків, причому найбільші величини зареєстровані за умов постійного світла, найменші - за постійної темряви. Так, у корі великих півкуль головного мозку (табл. 2) за звичайних умов освітлення збільшувався вміст як первинних продуктів пероксидного окиснення ліпідів - сполук з ізольованими подвійними зв'язками і гідропероксидів, так і вторинних - карбонільних сполук, в тому числі продуктів, що реагують з тіобарбітуровою кислотою. За постійного світла залишався високим вміст первинних і третинних продуктів та малонового альдегіду, а також збільшувався загальний вміст вторинних продуктів. За постійної темряви після гострої гіпоксії вміст цих продуктів суттєво не змінювався, хоча збільшувався вміст малонового альдегіду. Ступінь окиснення ліпідів до первинних і вторинних продуктів найбільшим був за постійного світла, а найменшим - за постійної темряви. Продукти вільнорадикального окиснення білків (табл. 4) теж накопичувалися за звичайних умов освітлення, залишаючись високими при постійному освітленні і в темряві.

Аналогічні зміни як ліпідної, так і білкової (табл. 4) пероксидації спостерігались після гострої гіпоксії в гіпокампі, причому за звичайних умов освітлення та при постійному світлі вони були досить вираженими, а в постійній темряві зареєстровано лише збільшення вмісту малонового альдегіду. Нейрони септального і габенулярного комплексів страждали від окисного стресу менше, ніж нейрони кори і гіпокампа.

Активність антиоксидантних ферментів при окисному стресі, викликаному гіпоксією (табл. 3), в основному зменшувалась, особливо різко при постійному світлі, і дещо менше при постійній темряві. Так, активність глутатіонпероксидази в корі головного мозку зменшувалась після гіпоксії за звичайних умов освітлення та за постійної темряви, залишаючись найменшою за постійного світла. Активність каталази досить різко гальмувалася за постійного світла, з одночасним вірогідним зниженням активності супероксиддисмутази, хоча активність останньої при постійному світлі залишалась більшою, ніж при постійній темряві. Активність глутатіон-S-трансферази в цілому передньому мозку зменшувалась за звичайних умов освітлення та постійної темряви і суттєво не змінювалась за постійного світла. Зменшувались також активності глутатіонредуктази за звичайного освітлення, а глюкозо-6-фосфатдегідрогенази на світлі і в темряві, при цьому активності цих ферментів були найменшими при постійному світлі. Зазначені зрушення супроводжувалися виснаженням запасів у передньому мозку відновленого глутатіону саме за умов постійного світла.

У плазмі крові (табл. 5) після гіпоксії за постійного світла спостерігалось значне зростання рівня кортикостерону при найнижчому рівні цього гормону у контрольних тварин, що вказує на посилення активності стрес-реалізуючих механізмів (Ф.З Меерсон, 1991) і, відповідно, пошкоджуючого впливу гіпоксії. Водночас реєструвались низькі рівні пролактину, що вказує на послаблення активності стрес-лімітуючих систем (К.В. Судаков, 1997). Отже, порушення фотоперіодичності, особливо внаслідок подовження світлового періоду доби, зміщують прооксидантно-антиоксидантну рівновагу в бік активації вільнорадикального окиснення макромолекул. Найвиразніше це проявляється при окисному стресі за гострої гіпоксії. Постійна темрява частково компенсує порушення прооксидантно-антиоксидантної рівноваги, які виникають за гострої гіпоксії.

Таблиця 5. Вплив різної довжини світлового періоду на рівень кортикостерону і пролактину в плазмі крові ювенільних щурів за гострої гіпобаричної гіпоксії (M±m, n = 7).

Примітка. Умовні позначення такі ж, як і в табл. 1.

Отримані результати можна пояснити коливаннями вмісту в організмі за різних умов освітлення циркулюючого мелатоніну - "ідеального інгібітора вільних радикалів" (R. Reiter, 1995). При подовженні освітлення рівень ендогенного антиоксиданту мелатоніну падає до мінімальних рівнів (Л.А. Бондаренко, 1997), це і викликає зсув прооксидантно-антиоксидантної рівноваги в бік активації вільними радикалами окиснення макромолекул, погіршення антиоксидантного захисту клітин та посилення чутливості клітин до окисного стресу за гострої гіпоксії. У разі скорочення фотоперіоду і значного зменшення рівня добової освітленості зростає синтез шишкоподібним тілом мелатоніну, який перехоплює вільні радикали, зокрема найбільш небезпечні гідроксильний радикал (D. Tan et al., 1993) та синглетний кисень (C. Cagnoli et al., 1995), а також збільшує активність ферментів глутатіонової системи (L. Barlow-Walden et al., 1995) та зменшує активність ферментних систем, що генерують вільні радикали (I. Antolin et al., 1996). З метою підтвердження участі гормонів шишкоподібного тіла в термінових реакціях організму щурів на дію гострої кисневої недостатності досліджена функціональна активність пінеалоцитів за гострої гіпобаричної гіпоксії.

Функціональна активність шишкоподібного тіла за гострої гіпоксії. Встановлено, що гостра гіпоксія підвищувала вміст циклічних нуклеотидів та серотоніну в шишкоподібному тілі щурів, що вказує на функціональну активацію пінеалоцитів (В.П. Пішак, 1996) і збігається з даними морфологічних досліджень інших авторів (Г.А. Васильев и др., 1974) (табл. 6). Введення за гострої гіпоксії епіталаміну, який містить пептиди епіталамо-епіфізарної ділянки головного мозку, сприяло загальному підвищенню функціональної активності пінеалоцитів за гострої гіпоксії, а також значно збільшувало вміст цГМФ, що демонструє участь цГМФ-залежного шляху в активуючому впливі епіталаміну на утворення пінеальних індолів.

Таблиця 6. Вплив епіталаміну при гострій гіпобаричній гіпоксії за звичайних умов освітлення на вміст циклічних нуклеотидів і серотоніну в шишкоподібному тілі ювенільних щурів (M±m, n = 5).

Примітки: ^* зміни вірогідні відносно контрольних показників, p<0,05;

_** зміни вірогідні порівняно з показниками у тварин після гіпоксії без введення епіталаміну, р<0,05;

^*** зміни вірогідні щодо показників за введення епіталаміну без дії гіпоксії, p<0,05.

Внесок неадренергічної регуляції шишкоподібного тіла у функціональній активації пінеалоцитів за гострої гіпоксії був досліджений за введення антиадренергічних речовин. Антиадренергічні речовини без дії гострої гіпоксії, як і очікувалось згідно даних літератури (R. Zimmermann et al., 1996), зменшували функціональну активність пінеалоцитів із зниженням рівнів циклічних нуклеотидів. Однак результати застосування блокаторів адренергічної іннервації шишкоподібного тіла за гострої гіпоксії виявились на перший погляд дещо несподіваними: при цьому виникало збільшення функціональної активності пінеалоцитів. Такі дані вказують на участь неадренергічної регуляції шишкоподібного тіла у функціональній активації пінеального комплексу та синтезі пінеальних гормонів за гострої гіпоксії. Отже, гостра гіпоксія підвищує функціональну активність пінеалоцитів, що синтезують гормони індольної (мелатонін) і пептидної природи, які регулюють механізми термінової адаптації до гострої гіпоксії. Для перевірки припущення про вирішальну роль гормонів шишкоподібного тіла у фотоперіодичних змінах чутливості організму щурів до гострої гіпоксії були проведені серії експериментів з попереднім введенням мелатоніну та епіталаміну, який містить пінеальні пептидні гормони.

Вплив мелатоніну на чутливість щурів до гострої гіпобаричної гіпоксії за різної довжини світлового періоду. Після введення мелатоніну за звичайного освітлення збільшувались час втрати пози на "висотному плато", час життя тварин до другого агонального вдиху. За постійного світла на фоні введення мелатоніну достовірно збільшувався лише час життя тварин на "висотному плато", а в постійній темряві зростали показники часу втрати пози, життя тварин та відновлення пози. При цьому проявились фотоперіодичні зміни чутливості тварин до гострої гіпоксії: час втрати пози при постійній темряві на фоні введення мелатоніну був більшим аналогічного показника у тварин за постійного світла. Отже, введення мелатоніну збільшує терміни життя тварин за умов гострої гіпоксії, особливо при постійній темряві, що вказує на антигіпоксантні властивості мелатоніну.

У передньому мозку мелатонін усував негативний вплив гіпоксії на активність Na⁺, K⁺-АТФази при звичайному та постійному освітленнях (табл. 7), що вказує на покращання функціонування нейронів за кисневого голодування під дією мелатоніну. За звичайних умов активність Na⁺, K⁺-АТФази реєструвалась на рівні навіть вищому, аніж у контрольних тварин. Крім того, однократне введення цього пінеального гормону підвищувало активність 5-нуклеотидази. Характерно, що найвищі рівні активності цього ферменту були зареєстровані після введення мелатоніну за постійної темряви, тобто при максимальній активності шишкоподібного тіла.