Лазерна кореляційна спектроскопія крові як метод фармакологічного скринінгу

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

УДК 616 - 073.584 - 08:615

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

ЛАЗЕРНА КОРЕЛЯЦІЙНА СПЕКТРОСКОПІЯ КРОВІ ЯК МЕТОД ФАРМАКОЛОГІЧНОГО СКРИНІНГУ

14.03.05 - фармакологія

Андронов Дмитро Юрійович

Одеса - 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Одеському державному медичному університеті Міністерства охорони здоров'я України

Науковий керівник - доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України КРЕСЮН Валентин Йосипович, Одеський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри загальної та клінічної фармакології

Офіційні опоненти - доктор медичних наук, професор ЛУК'ЯНЧУК Віктор Дмитрович, Луганський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри фармакології

- доктор медичних наук, професор МОЙСЕЄВ Ігор Миколайович, Одеський державний медичний університет МОЗ України, провідний науковий співробітник ЦНДЛ

Провідна установа - Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця МОЗ України, кафедра фармакології, м. Київ

Захист відбудеться “ 11 ” травня 2001 р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01 при Одеському державному медичному університеті МОЗ України

Адреса: 65026, м. Одеса, пров. Валіховський, 2.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Одеського державного медичного університету за адресою: 65026, м. Одеса, пров. Валіховський, 3.

Автореферат розісланий “ 07 ” квітня 2001 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради, доктор медичних наук,

професор Годлевський Л.С.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

лазерний спектроскопія гепатит плазма

Актуальність теми. Сучасний етап розвитку медичної науки характеризується інтенсивним пошуком та створенням нових біологічно активних речовин (БАР), вивчення яких потребує постійного моніторингу стану життєво важливих систем організму (М. Д. Машковский, 2000; Ф. И. Комаров, Б. Ф. Коровкин, 1999). Найбільш інтегральною, високо чутливою, точно реагуючою системою на всі зміни в організмі є його гомеостаз (В. А. Барабой, Д. А. Сутковой, 1997).

Система гомеостазу плазми (сироватки) крові характеризується визначеним субфракційним складом альбулярних, глобулярних білків, ліпо-глікопротеїнів, імунних комплексів тощо. Склад кожної субфракції, а також характер їх міжмолекулярних взаємовідносин змінюється за умов патології, а також при її фармакотерапії (И. С. Чекман і співавт., 1992; B. Ballermann, B. Brenner, 1996). Головні недоліки більшості методів фармакологічного скринінгу, які використовуються сьогодні, полягають в їх трудоємкості, довготривалості та, підчас, не уніфікованості. Більшість з них передбачають попередні стадії препаративного виділення окремих субфракцій макромолекул із подальшим їх вивченням, що призводить до порушення нативності досліджуваної системи та ускладненню самої процедури аналізу (В. А. Шаповалова і співавт., 1995). Кожне вивчення фармакологічного препарату пов'язано зі значними трудовитратами, використанням значної кількості коштовних реактивів, тварин та складностями при статистичній обробці різних кінетичних параметрів фармакологічного ефекту, його співставлення та оцінки. Стикаючись з подібними проблемами, до сьогодні залишаються не до кінця вивченими патогенетичні аспекти фармакотерапії багатьох захворювань (Ю. Б. Белоусов і співавт., 1997; С. Н. Лапач, А. В. Чубенко, 1998).

Лазерна кореляційна спектроскопія (ЛКС) у значній мірі задовольняє вимогам, що висуваються до скринінгових методів, оскільки забезпечує одномоментну багатопараметрову детекцію гомеостазу плазми крові в автоматичному режимі, що відповідає сучасним вимогам експрес-діагностики (Ю. И. Бажора і співавт., 1996; К. С. Терновой і співавт., 1998).

Зв'язок роботи із науковими програмами, планами, темами. Матеріали дисертаційної роботи є фрагментом двох науково-дослідних програм в рамках цільового завдання МОЗ України: “Методи ранньої діагностики інфекційних і запальних захворювань на основі використання молекулярно-генетичних та біофізичних технологій” (№ держреєстрації 0196U001839) і “Розробка методів діагностики і оцінки ефективності фармакотерапії специфічних і неспецифічних інфекційно-запальних захворювань на основі молекулярно-генетичних та біофізичних технологій” (№ держреєстрації 0199U000262). Дисертант був співвиконавцем указаних тем.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи явилося вивчення скринінгових можливостей лазерної кореляційної спектроскопії крові для визначення профілю активності нових БАР, а також ефективності фармакотерапії. Для досягнення зазначеної мети вирішувалися слідуючі основні задачі:

розробити алгоритм та провести ЛКС-дослідження плазми крові щурів за умов токсичного гепатиту та стресу, а також на фоні їх фармакологічної корекції з урахуванням фізіологічних коливань гомеостазу;

визначити можливості ЛКС крові у вивченні профілю активності, а також ефективності фармакотерапії за експериментальних умов при використанні відомих препаратів (есенціале, феназепам, літоніт) та знову синтезованих БАР (МІГУ-1, 2);

провести порівняльну оцінку експериментальних даних ЛКС плазми крові із результатами традиційних методів дослідження;

визначити можливості ЛКС крові за умов моніторингу активності гепатопротекторів та антибіотиків на клінічному матеріалі.

Об'єкт дослідження: субфракційний склад плазми крові при застосуванні нових БАР та відомих фармакологічних препаратів.

Предмет дослідження: субфракційний склад крові при стресі, гепатиті та бронхопневмонії в динаміці їх фармакотерапії.

Методи дослідження: В роботі використовували моделі токсичного гепатиту та стресу, методи експериментальної фармакотерапії, біохімічні методи дослідження активності ферментів та вмісту аденілових нуклеотидів (АН). Для оцінки субфракційного складу крові використовували біофізичний метод дослідження - лазерну кореляційну спектроскопію. Статистичну обробку результатів досліджень здійснювали з використанням методів варіаційної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше розроблено та обґрунтовано методику підготовки зразків плазми крові до дослідження методом ЛКС у щурів. Вперше вивчено фізіологічні коливання субфракційного складу плазми крові інтактних щурів в залежності від сезону дослідження та статі тварин на основі аналізу ЛК-спектрів. Вперше, за допомогою ЛКС, проведено комплексну оцінку стану гомеостазу в динаміці розвитку токсичного гепатиту та стресу у щурів за даними субфракційного складу крові. Вперше проведено аналіз профілю активності та співставлення ефективності відомих фармакологічних препаратів та нових БАР на підставі даних ЛКС крові. Отримали подальший розвиток діагностичні та прогностичні критерії оцінки гомеостазу людини в залежності від детермінуючих факторів та запровадженої фармакологічної корекції.

Практичне значення одержаних результатів. Запропоновано новий оригінальний метод фармакологічного скринінгу - ЛКС крові. ЛКС, реєструючи направленість та ступінь вираженості зсувів у субфракційному складі плазми крові, дозволяє оцінити профіль фармакологічної активності, а також ефективність використаних препаратів та нових БАР. Аналіз динаміки ЛК-спектрів крові дозволяє провести порівняльну оцінку дії використаних лікарських засобів. ЛКС крові надає можливість проведення моніторингу стану гомеостазу в динаміці фармакотерапії в експресному режимі та, за необхідністю, вчасно її корегувати. Розроблено методичні рекомендації по використанню ЛКС крові як методу експрес-діагностики в практичній медицині. Науково-практичні результати досліджень були впроваджені до навчального процесу на кафедрах загальної та клінічної фармакології і нормальної фізіології Одеського державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Автором було виконано патентно-інформаційний пошук, визначено мету та задачі дослідження, методичні підходи, відпрацьовано моделі, розроблено алгоритм, згідно якого виконано дослідження на експериментальному та клінічному матеріалі. Виконано статистичну обробку отриманих результатів, оформлено таблиці та рисунки, сформульовано висновки роботи, опубліковано основні положення дисертації.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи було викладено на II Міжнародному конгресі студентів і молодих медиків ”Asklepiada” (м. Катовіце, Польща, 1996); IV науково-практичній конференції “Современные достижения валеологии и спортивной медицины” (м. Одеса-Київ, 1997); 65 і 67-й підсумкових наукових конференціях ОДМУ (м. Одеса, 1996, 1998); XIV Міжнародній школі-семінарі “Spectroscopy of molecules and crystals” (м. Одеса, 1999); VIII конгресі СФУЛТ (м. Львів, 2000).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 12 наукових робіт, із яких 1 монографія у співавторстві, 5 статей у фахових наукових журналах, 1 методичні рекомендації МОЗ України, 1 інформаційний лист Одеського ЦНТЕІ, 4 тези доповідей у матеріалах конференцій та конгресів.

Обсяг та структура дисертації. Дисертаційну роботу викладено на 177 сторінках машинопису. Вона складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, чотирьох розділів власних досліджень, аналізу й узагальнення результатів досліджень, висновків. Роботу ілюстровано 25 таблицями і 45 рисунками, котрі займають 20 повних сторінок. Список використаної літератури містить 234 джерела, з яких 167 вітчизняних та 67 іноземних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Дослідження проведені на 353 щурах лінії Вістар статевозрілого віку, вагою від 180 г до 230 г. Тварини знаходилися на стандартному раціоні віварію ОДМУ. Вивчення скринінгових можливостей ЛКС у клініці проведено в дослідах in vitro, використовуючи кров від 39 хворих з верифікованим діагнозом вірусний гепатит В та гостра осередкова бронхопневмонія в динаміці їх лікування. В контрольних спостереженнях використовували кров від 194 здорових людей, надану обласною станцією переливання крові, дитячою поліклінікою № 5, пологовим будинком № 5 м. Одеси. В контрольних групах тварин та людей вивчено рівень фізіологічних коливань субфракційного складу плазми крові залежно від різних факторів.

Для скринінгу в експерименті використані дві різні за патогенезом моделі патологічних станів: 1) токсичний гепатит; 2) стрес. Токсичний гепатит відтворювали методом одноразового внутрішньочеревного введення 50,0 % масляного розчину чотирихлористого вуглецю в дозі 5 мл/кг ваги тварини (A. Watanabe et al., 1976). Стрес створювали за допомогою методу тривалої (4 доби) депривації парадоксальної фази сну (D. Jouvet et al., 1964). Характер багатопараметрових зсувів гомеостазу в динаміці модельованих патологічних процесів вивчали за даними ЛКС плазми крові щурів в терміни, коли за результатами традиційних досліджень спостерігався розвиток типових стадій (Н. П. Скакун і співавт., 1989; E. Johnson et al., 1992).

Апробацію методу ЛКС як скринінгового у фармакологічних дослідженнях здійснювали за умов вищевказаних моделей, із застосуванням як відомих фармакологічних препаратів, так і нових БАР. Дози використаних препаратів та БАР установлені на підставі літературних даних відносно їх фармакологічних характеристик (Я. Б. Рожковский, 1990; В. В. Годован, 1998).

При токсичному гепатиті використовували стандартний гепатопротектор (есенціале) і знову синтезовані БАР (МІГУ-1, 2). Синтез МІГУ-1 та МІГУ-2 було здійснено на кафедрі загальної хімії та полімерів в Одеському національному університеті ім. І. І. Мечнікова під керівництвом проф. І. Й. Сейфуліної. Тварини були розподілені на 3 групи, яким попередньо протягом 6-и діб внутрішньочеревно вводили есенціале (5 мг/кг), МІГУ-1 (11 мг/кг), МІГУ-2 (16 мг/кг), а на 7-му добу робили затравку CCl4, та продовжували курсове введення лікарських засобів ще протягом 7-и діб. Забір крові для досліджень здійснювали на 1, 3, 5 та 7-му добу після введення гепатотоксину. Забір зразків печінки здійснювали в ці ж терміни.

На моделі стресу вивчали ефект транквілізаторів у двох групах щурів-самців, яким з першого дня стресування щодня протягом 4-х діб одноразово внутрішньочеревно вводили літоніт (літієва сіль піридин-3-карбонової кислоти) та феназепам (похідний 1,4-бензодиазепину) в дозах 10 мг/кг та 0,05 мг/кг, відповідно. Забір крові для ЛКС-досліджень робили на 2, 3 та 4-ту добу експерименту.

Ефекти, які впливають на субфракційний склад плазми крові інтактних щурів після одноразового внутрішньочеревного введення вищевказаних транквілізаторів вивчалися за допомогою ЛКС. Транквілізатори вводили в середньотерапевтичних і трикратно перевищуючих середньотерапевтичні дозах. Забір крові для досліджень здійснювали через 1 год після введення транквілізаторів, що відповідало часу накопичення препаратів у крові в терапевтичній концентрації
(В. И. Кресюн, 1984). Забір зразків головного мозку здійснювали в ці ж терміни.

В дослідах in vitro за допомогою ЛКС досліджували сироватку хворих на вірусний гепатит В, у яких як основний гепатопротектор використовували есенціале-форте (по 2 капсули, 3 рази на день, курс - 2-3 місяці). Дослідження проводили в динаміці лікувального процесу: 1) при надходженні в стаціонар; 2) через 1 тиждень; 3) через 2 тижні; 4) через 2 місяці. На підставі даних ЛКС плазми крові хворих на гостру осередкову бронхопневмонію проведена порівняльна оцінка ефективності двох антибактеріальних препаратів: натрієвої солі бензилпеніциліну (добова доза (ДД) - 4,0-6,0 млн. ОД, інтервал введення (ІВ) - 4 год, курс - 7-10 днів) та натрієвої солі цефазоліну (ДД - 2,0-4,0 г, ІВ - 8-12 год, курс - 5-7 днів). Обидва антибіотики вводилися внутрім'язово. ЛКС крові проводили в динаміці лікування: при надходженні, на 5 та 10-ту добу перебування в стаціонарі.

Дослідження субфракційного складу крові здійснювали з використанням методу лазерної кореляційної спектроскопії на приборі ЛКС-03 (“ИНТОКС”, Росія) за методикою Ю. І. Бажори і співавт. (1995). ЛКС дозволяє провести аналіз змін у макромолекулярних субфракціях біологічних рідин при різних станах, а також оцінити значимість цих змін (К. С. Терновой і співавт., 1998).

Визначення активності ферментів цитолізу і холестазу (АЛТ, АСТ, ГГТ, ЛФ) в сироватці крові та гомогенаті печінки щурів робили за допомогою наборів хімічних реактивів “Био-Ла-Тест” (“Lachema”, Чехія) за стандартними методиками (В. В. Меньшиков, 1999). Кількісне визначення вмісту аденілових нуклеотидів у гомогенатах головного мозку щурів проводили з використанням стандартних наборів “Test-Combination” (“Boehringer Mannheim”, Німеччина) за методом
D. Jaworek (1974). Концентрації ферментів та АН контролювали за допомогою спектрофотометра СФ-46 (“ЛОМО”, Росія).

Обробку результатів досліджень виконували методами варіаційної статистики за допомогою програми "Primer Biostatistics" (США, 1994) з використанням критерію Ст'юдента. Зміни вважали статистично достовірними при Р < 0.05.

Результати досліджень та їх обговорення

Контрольній групі нами приділялася особлива увага, оскільки відносно цієї групи надалі інтерпретувалася природа тих чи інших гомеостатичних зрушень. Тому, першорядним завданням досліджень було вивчення особливостей ЛК-спектрів крові щурів інтактної групи в залежності від статі та сезону, коли проводилися дослідження. Результати цих досліджень наведені в таблиці 1.

Ураховуючи отриманий результат, надалі, за умов моделювання патологічного процесу як контроль використовувалися ЛК-спектри відповідної інтактної групи, з урахуванням сезону, коли проводився експеримент. По відтворюваності показників субфракційного складу плазми вивчених груп інтактних тварин найбільш стабільними були результати в літній та зимовий сезони. Статеві розходження ЛК-спектрів щурів мали достовірний характер тільки навесні та восени, ступінь їх диференціації перевищував 66,7 %. При цьому, у щурів-самців рівень індивідуальних коливань спектрів був менш виражений, ніж у самок. В останніх у плазмі виявлялися високомолекулярні комплекси, розмір яких перевищував 1000 нм, а їх внесок у світлорозсіювання досягав 12,4 %. У зв'язку з цим, надалі для досліджень ми використовували тільки щурів-самців.

Таблиця 1

Аналіз дисперсії внесків у світлорозсіювання часток окремих субфракцій ЛК-спектрів плазми крові інтактних щурів в залежності від сезону проведення досліджень

Проведені ЛКС-дослідження крові в контрольній групі донорів показали, що рівень фізіологічних коливань субфракційного складу плазми крові не мав виражений характер. Однак, в групах, сформованих за віком та резус-приналежністю, такі відмінності були достовірними, а ступінь їх диференціації досягав 85,7 %. Отримані результати свідчать про необхідність урахування цих фізіологічних відмінностей при формуванні банку даних ЛК-спектрів крові та їхнього обліку при проведенні масових скринінгових досліджень, тим більше, що вік та резус-приналежність індивідуумів відомі практично для всього населення в межах України. Також були виявлені достовірні розходження субфракційного складу сироватки донорів з різних географічних регіонів, які відрізняються за кліматичними та екологічними умовами. Рівень диференціації ЛК-спектрів сироватки крові донорів з Одеси та С.-Петербургу коливався від 75,6 % до 82,3 %, що свідчило про неможливість використання уніфікованого для всіх регіонів банку даних ЛК-спектрів крові донорів.

При токсичному гепатиті у щурів характерні зміни в ЛК-спектрах плазми крові зводилися до швидкого зростання сумарних внесків часток з наднизько- (2-11 нм) та низькомолекулярної (12-37 нм) субфракцій, які досягали свого максимуму на 3-ю добу з моменту введення CCl4 (282,9 % і 196,7 % щодо контрольних значень, відповідно). На цьому фоні зменшувався внесок у світлорозсіювання часток середньо- (38-95 нм) та високомолекулярної (96-264 нм) субфракцій (до 58,1 % і 34,8 %, відповідно). Характерні зміни ЛК-спектрів свідчили про інтенсивні процеси цитолізу, виражену інтоксикацію та пригнічення функції імунокомплексоутворення (К. С. Терновой і співавт, 1998). Отримані результати узгоджуються з літературними даними про максимальні зміни морфологічної картини печінки та пригнічення імунітету саме на 3-ю добу експериментального гепатиту (Н. П. Скакун і співавт., 1989; С. Б. Стречень, 1992). На 5-ту добу відзначалося зниження внесків дрібнодисперсних часток (2-37 нм), рівень яких досягав значень у тварин контрольної групи на 14-ту добу з моменту введення CCl4.

В серіях біохімічних досліджень активності ферментів цитолізу і холестазу через 24 год після введення ССl4 встановлено, що у сироватці крові активність АЛТ підвищувалася на 197,9 %, а АСТ - на 124,0 % в порівнянні з контрольними показниками. В печінці активність даних ферментів різко пригнічувалася (АЛТ - у 5,5 разів, АСТ - у 6 разів). Зміна активності ЛФ і ГГТ відбувалася направлено як у сироватці крові, так і в печінці та полягала в їх різкому підвищенні. На 3-ю добу токсичного гепатиту виявлялася тенденція до нормалізації активності ферментів цитолізу і ГГТ, але їх відхилення від контрольних значень все ще залишалося значним. На 5-ту добу спостереження активність трансаміназ мимовільно досягала контрольних величин. Активність ГГТ нормалізувалася на 7-у добу. Активність ЛФ на 5-ту добу токсичного гепатиту у нелікованих тварин досягала максимуму (5,600,30 нмоль/л·с, p<0,05), а потім поступово знижувалася, нормалізуючись на 14 добу. Таким чином, за даними біохімічних досліджень встановлено, що зміни активності ферментів цитолізу і холестазу в сироватці крові та печінці нелікованих щурів були найбільш виражені через 24 год після введення ССl4.

Оцінку профілю дії БАР проводили на підставі зіставлення їх ефекту з есенціале - лікарським препаратом, який є одним з еталонних гепатопротекторів.

Усі використані фармакологічні сполуки значно підвищували життєздатність тварин за умов дії гепатотоксину: есенціале - на 35 %, МІГУ-1 - на 44 %, МІГУ-2 - на 39 %. МІГУ-1 і МІГУ-2 запобігали змінам активності ферментів цитолізу і холестазу, які були викликані ССl4: знижували активність істотно підвищених АЛТ, АСТ, ЛФ, ГГТ сироватки і відновлювали їх активність у печінці в більш ранні строки в порівнянні з нелікованими тваринами, що свідчить про їх гепатопротекторну активність. Аналізуючи вплив використаних сполук на активність ферментів цитолізу і холестазу при експериментальному гепатиті, а також наявні дані про динаміку морфологічної структури печінки за цих умов (В. В. Годован, 1998), за силою гепатопротекторного ефекту їх можна розташувати в слідуючому порядку: есенціале < МІГУ-2 < МІГУ-1.

Дослідження ЛК-характеристик плазми крові при використанні есенціале свідчить, що збільшення інтенсивності світлорозсіювання часток у складі наднизько- і низькомолекулярної субфракцій на піку процесу не перевищувало 44,8 % і 39,8 %, відповідно до контрольних значень. На 7-му добу експерименту, у більшості випадків, відбувалося відновлення параметрів ЛК-спектрів плазми крові лікованих щурів до рівня значень в контрольній групі. Таким чином, за даними ЛКС, есенціале істотно знижував виразність зрушень у субфракційному складі плазми щурів, зумовлених гепатотоксичним ефектом.

При введенні МІГУ-1 зверхнизькомолекулярна субфракція ЛК-спектрів протягом всіх етапів експерименту відрізнялася від контрольних значень не більше ніж на 16,2 %. Цей факт свідчив про те, що при використанні МІГУ-1 введення гепатотоксину не призводило до інтенсивного цитолізу, який спостерігався в групі нелікованих тварин. На 5-ту добу характер розподілу в ЛК-спектрах щурів з даної групи відповідав контрольному рівню. При курсовому введенні МІГУ-2 на 3-ю добу спостерігали максимальні збільшення внеску дрібнодисперсних часток (на 98,1 % по відношенню до контрольних значень). Однак, він у 1,4 рази був меншим, ніж в групі нелікованих тварин. На 7-му добу експерименту сумарний внесок часток зверхнизькомолекулярної субфракції знижувався до контрольного рівню. При цьому, нормалізація низькомолекулярної субфракції реєструвалася раніше (на 5-ту добу).

Таким чином, отримані дані свідчать, що при застосуванні досліджуваних БАР, динаміка змін субфракційного складу плазми щурів була аналогічною такій при використанні есенціале, що вказує на їх гепатопротекторну дію. Виходячи з термінів відновлення субфракційного складу плазми крові щурів до рівня контрольних значень, МІГУ-1 виявився найефективнішим з порівнюваних сполук; МІГУ-2 був аналогічний есенціале, однак, при його введенні інтоксикаційні зрушення зникали раніше.

Аналіз ЛК-спектрів плазми крові стресованих щурів виявив у субфракційному складі особливості, характерні для кожної стадії стресу. Ступінь їх диференціації перевищував 65,0 %. Класифікаційний аналіз спектрів плазми крові щурів на початкових етапах стресу наведений на рис. 1. Дані свідчать про різні гомогенність, а також характер розподілу у відповідних групах на етапі з 2-ї по 4-ту добу стресу. Більш висока дисперсія варіантів ЛК-спектрів в групі тварин на 2-гу добу експерименту вказувала на виражені індивідуальні особливості механізмів адаптації у кожного щура. Дисперсія ЛК-спектрів на 3 і 4-ту добу була менш вираженою, що підтверджувало наявні дані про однонаправлений характер процесів, які забезпечують розвиток стадій резистентності та виснаження при стресі (G. Chrousos, 1992; Я. В. Рожковський, 1998).

Таким чином, ЛКС плазми крові щурів при стресі, дозволила вірогідно диференціювати стадії розвитку стрес-реакції. Крім того, за характером субфракційних зрушень на визначених стадіях стресу можна було реєструвати участь різних компонентів плазми в зміні інтегрального показника гомеостазу, що дозволило інтерпретувати деякі механізми порушень системи гомеостазу та його стабільності при стресі. Дослідження ЛК-спектрів плазми стресованих щурів свідчили, що відновлення субфракційного її складу до рівня інтактних відбувається на 14-ту добу експерименту. Проте відомо, що повне відновлення структурно-функціональних порушень гомеостазу організму після стресу відбувається до 7-10-ї доби (Я. Б. Рожковский і співавт., 1994; G. Chrousos, P. Gold, 1992).

При оцінці фармакологічної ефективності та токсичності лікарських засобів принципове значення має вибір дози. Нами вивчені можливості ЛКС у вирішенні цієї проблеми. Одноразове внутрішньочеревне введення літоніту в дозі 10 мг/кг не викликало грубих змін в ЛК-спектрах інтактних тварин: інтенсивність світлорозсіювання часток низькомолекулярної субфракції знижувалася на 30,3 %; всередині крупнодисперсної фракції реєструвався перерозподіл внесків вбік збільшення високомолекулярних компонентів плазми (на 20,5 %). Отримані результати свідчили про активуючий вплив літоніту в дозі 10 мг/кг на анаболічні та імунокомпенсаторні процеси в організмі. Одноразове внутрішньочеревне введення щурам феназепаму в дозі 0,05 мг/кг призводило до більш вираженої зміни структури ЛК-спектрів за рахунок появи в них надкрупних комплексів (більше 1000 нм). При цьому, напрямок зрушень стосовно усередненої гістограми інтактних щурів був протилежним тому, що реєстрували при введенні літоніту. А саме, сумарний внесок у світлорозсіювання часток низькомолекулярної субфракції навпаки збільшувався (на 34,9 % в порівнянні з контролем), а високомолекулярної - знижувався на 74,6 %. Характерна динаміка свідчила про зменшення в плазмі крові щурів імунних комплексів (К. С. Терновой і співавт, 1998), що вказувало на можливий імуносупресорний ефект феназепаму. Триразове збільшення дози транквілізаторів призводило до більш вагомих змін в ЛК-спектрах плазми крові тварин обох груп. Різнонаправленість дії літоніту і феназепаму підтверджено паралельно проведеними біохімічними дослідженнями концентрації АН в корі головного мозку (табл. 2).

Таблиця 2

Динаміка зміни нуклеотидного пулу кори головного мозку інтактних щурів за умов введення середньотерапевтичних доз транквілізаторів, мкмоль/г тканини

Отримані результати також узгоджуються з наявними в літературі даними про вплив літоніту і феназепаму на процеси тканинного дихання та окисного фосфорилювання в утвореннях головного мозку (В. И. Кресюн, 1984; В. А. Барабой, Д. А. Сутковой, 1997).

Розходження механізмів дії літоніту та феназепаму відбилося на характері змін субфракційного складу плазми щурів на етапах стрес-реакції. А саме, ефект від введення літоніту у стресованих щурів виявлявся на 3-ю добу депривації сну. Він полягав у збереженні відсоткового вкладу середньомолекулярної субфракції (21,5 %), характерного для стадії резистентності, на фоні зниження сумарного внеску низькомолекулярних субфракцій та збільшення високомолекулярної. Таким чином, літоніт підсилював зміни в гомеостазі, характерні для стадії резистентності за рахунок активації анаболізму.

При введенні феназепаму субфракційний склад плазми крові стресованих щурів протягом 2 і 3-ї доби відповідав стану, який реєстрували на стадії тривоги у нелікованих тварин. На 4-ту добу в ЛК-спектрах діагностували значне зниження сумарного внеску часток зверхвисокомолекулярної субфракції, яке було більш виражене, ніж при введенні літоніту. Таким чином, феназепам пролонгував стадію тривоги, а потім підсилював процеси, характерні для стадії резистентності за рахунок зниження інтенсивності імунокомплексоутворення. При цьому, обидва препарати затримували розвиток стадії виснаження.

Оцінка скринінгових можливостей ЛКС у вивченні ефективності медикаментозної терапії в клініці проведена в дослідах in vitro із кров'ю хворих на вірусний гепатит В. Аналіз ЛК-спектрів сироватки хворих в динаміці лікувального процесу виявив позитивну тенденцію, яка полягала у відновленні гістограм розподілу часток сироватки крові до вигляду, зареєстрованого в донорів. Ефективність терапії оцінювали за рівнем зниження внеску у світлорозсіювання дрібнодисперсних компонентів сироватки, збільшення якого виявили у хворих при надходженні в стаціонар. Збільшений внесок часток зверхнизькомолекулярної субфракції пов'язували із цитолізом (К. С. Терновой, 1998), який має місце при вірусному гепатиті. До кінця 1 тижня під впливом есенціале він знижувався в 1,5 рази і потім утримувався на цьому рівні протягом усього періоду лікування в стаціонарі. Повна регресія зрушень, викликаних цитолізом при гепатиті, за даними ЛКС, реєструвалася тільки через 2 місяці після початку терапії. Відзначалося навіть зменшення внеску цієї субфракції (на 10,9 %), що могло свідчити про гіпоальбумінемію, пов'язану зі зниженням білоксинтезуючої функції печінки в ранньому реабілітаційному періоді після перенесеного гепатиту (С. Д. Подымова, 1993). Антиінтоксикаційний ефект за умов проведеної терапії, який виявлявся за темпами регресії внеску низькомолекулярної субфракції мав більш тривалий характер, оскільки через 2 тижні інтенсивність світлорозсіювання цієї фракції часток перевищувала контрольні значення на 59,1 %. Спостерігалося також поступове збільшення внеску часток з високомолекулярної субфракції сироватки, що свідчило про відновлення імунокомпенсаторної функції.

Порівняльну оцінку ефективності бензилпеніциліну та цефазоліну у хворих на гостру осередкову бронхопневмонію проводили при зіставленні термінів відновлення субфракційного складу плазми крові, а саме, збільшення інтенсивності світлорозсіювання високомолекулярної субфракції. Характерні зміни в ЛК-спектрах хворих під впливом антибіотикотерапії свідчили про зниження виразності катаболізму (відповідно й інтоксикації) та активацію імунокомплексоутворення (К. С. Терновой і співавт, 1998). На 5-ту добу від початку терапії бензилпеніциліном реєстрували триразове збільшення внеску високомолекулярної субфракції, при використанні цефазоліну внесок цієї субфракції збільшувався в 3,8 рази. На 10-ту добу даний ефект у плазмі крові так само був більш виражений при застосуванні цефазоліну.

Таким чином, у даній роботі вирішена важлива науково-технічна задача - розробка методу скринінгу активності БАР, а також оцінки ефективності фармакотерапії. Це дозволить на ранньому етапі створення фармакологічних препаратів здійснювати ефективний добір найбільш перспективних сполук, одержувати кількісну оцінку можливого спектру їх фармакологічної активності. Проведені дослідження показують високу інформативність ЛКС крові в процесі фармакотерапії, що дозволить проводити своєчасну її корекцію та забезпечити досягнення оптимального клінічного результату.

ВИСНОВКИ

Запропоновано новий метод фармакологічного скринінгу, заснований на реєстрації змін субфракційного складу плазми (сироватки) крові в динаміці лікування. Оцінка характеру і виразності зрушень субфракційного складу крові, за даними ЛКС, дозволяє об'єктивно оцінити профіль дії, а також ефективність використаних фармакологічних препаратів і БАР. Застосування ЛКС сприяє виявленню ефекту фармакотерапії в більш ранній термін та істотно знижує собівартість досліджень.

Встановлені вірогідні відмінності субфракційного складу крові інтактних тварин в залежності від сезону дослідження, що полягають у перерозподілі співвідношення дрібнодисперсних (2-37 нм) і високомолекулярних (96-264 нм) компонентів плазми вбік збільшення внеску останніх на етапі літо - зима і наступним різким його зниженням навесні. Протягом усіх сезонів рівень індивідуальних коливань спектрів крові у щурів-самців був менш виражений, ніж у самок. Статеві відмінності в ЛК-спектрах щурів мали вірогідний характер тільки навесні і восени за рахунок виявлення в сироватці крові самок високомолекулярних комплексів (більш 1000 нм).

За даними ЛКС фізіологічні коливання субфракційного складу крові здорових донорів були виражені тільки в групах, які відрізнялися за віком, резус-приналежністю та регіоном проживання, оскільки ступінь диференціації спектрів перевищував 65 %. Отримані результати свідчать про необхідність урахування цих показників при формуванні банку даних ЛК-спектрів крові і проведені скринінгових досліджень.

При токсичному гепатиті курсове введення есенціале призводило до нормалізації ЛК-спектрів плазми крові щурів на 7-му добу експерименту. Динаміка ефектів, яка спостерігалася при введенні МІГУ-1 і МІГУ-2, відповідала такій при застосуванні ессенціале, що свідчило про гепатопротекторну активність досліджуваних БАР. При цьому, найбільш ефективним було застосування МІГУ-1, що підтверджено також традиційними методами дослідження.

Аналіз спектральних характеристик плазми крові щурів на фоні введення літоніту і феназепаму виявив різні ефекти їх стрес-протекторної дії. За даними ЛКС ефект літоніту реєструвався на 3-ю добу депривації сну і полягав у посиленні анаболізму на стадії резистентності. Ефект феназепаму виявлявся на 4-ту добу стресу в зниженні інтенсивності імунокомплексоутворення. При цьому обидва препарати затримували розвиток стадії виснаження.

Виявлено, що застосування есенціале хворим на вірусний гепатит В наприкінці 1-го тижня лікування призводило до зниження в ЛК-спектрах крові внеску часток зверхнизькомолекулярної субфракції в 1,5 рази. Характерна динаміка свідчить про ефективне усунення препаратом цитолізу гепатоцитів, а її відсутність дозволяє зробити висновок про неефективність фармакотерапії та вчасно її корегувати.

Встановлено, що збільшення сумарного внеску високомолекулярної субфракції в ЛК-спектрах крові хворих на гостру осередкову бронхопневмонію пов'язано зі зниженням виразності катаболізму та активацією імунокомплексоутворення, що може свідчити про ефективність антибіотикотерапії. На 5-ту добу терапії із застосуванням бензилпеніциліну за цих умов спостерігалося збільшення внеску зазначеної субфракції в 3,1 рази, а при використанні цефазоліну - в 3,8 рази, що вказувало на більшу ефективність цефазоліну.

Встановлено високу інформативність ЛКС крові в процесі фармакотерапії, що дозволить здійснювати своєчасну її корекцію і забезпечить досягнення оптимального клінічного результату. Простота, експресність та об'єктивність методу відкривають нові можливості вивчення лікарських речовин як в експериментальних, так і клінічних дослідженнях.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Молекулярно-генетические и биофизические методы исследования в медицине / Бажора Ю.И., Кресюн В.И., Запорожан В.Н., Носкин Л.А., Соколовский В.С., Гешелин С.А.,
Карповский Е.Я., Андронов Д.Ю., Николаевский В.В., Сервецкий К.Л. / Под ред. Ю.И. Бажоры, В.И. Кресюна, В.Н. Запорожана. - К.: Здоров'я, 1996. - 207с.

Лазерная корреляционная спектроскопия в изучении гомеостаза: ее возможности и перспективы применения в медицине (Сообщение 1) / Бажора Ю.И., Карповский Е.Я., Запорожан В.Н., Кресюн В.И., Носкин Л.А., Соколовский В.С., Андронов Д.Ю., Прокуда О.Ф. // Медицинская реабилитация, курортология, физиотерапия. - 1996. - № 4. - С. 41-46.

Лазерная корреляционная спектроскопия в изучении гомеостаза: ее возможности и перспективы применения в медицине (Сообщение 2) / Бажора Ю.И., Кресюн В.И., Соколовский В.С., Запорожан В.Н., Носкин Л.А., Андронов Д.Ю. // Медицинская реабилитация, курортология, физиотерапия. - 1997. - № 1. - С. 42-48.

Лазерная корреляционная спектроскопия - новый метод мониторинга в токсикологии / Бажора Ю.И., Кресюн В.И., Носкин Л.А., Годован В.В., Андронов Д.Ю., Волошенков Б.А. // Современные проблемы токсикологии. - 1998. - № 2. - С. 7-11.

Лазерная корреляционная спектроскопия в диагностике плазменного гомеостаза при остром воспалении / Зубаренко А.В., Бажора Ю.И., Коваленко Н.Б., Андронов Д.Ю., Романчук А.П. // Медицинская реабилитация, курортология, физиотерапия. - 1998. - № 3. - С. 49-50.

Можливості лазерної кореляційної спектроскопії у фармакологічних дослідженнях / Бажора Ю.І., Кресюн В.Й., Андронов Д.Ю., Годован В.В., Волошенков Б.О., Шевченко І.М., Констянтинова А.А. // Ліки. - 1999. - № 2. - С. 76-82.

Лазерная корреляционная спектроскопия крови: Метод. рекомендации / Сост. Бажора Ю.И., Соколовский В.С., Кресюн В.И., Носкин Л.А., Андронов Д.Ю. - Одесса, 1995. - 26 с.

Лазерная корреляционная спектроскопия при экспериментальной патологии печени: Информ. листок № 287-96 / Ю.И. Бажора, В.И. Кресюн, В.В. Годован, Д.Ю. Андронов. - Одесса: ЦНТЭИ, 1996. - 2 с.

Андронов Д.Ю., Годован В.В. Использование лазерной корреляционной спектроскопии при экспериментальной патологии печени // Труды IV науч. -практ. конф. “Современные достижения валеологии и спортивной медицины”. - К., 1997. - С. 6.

Андронов Д.Ю. Можливості ЛКС-метрії в фармакології // Праці 67 підсумк. наук. конф. ОДМУ. - Одеса, 1998. - С. 82.

Andronov D., Shevchenko I., Voloshenkov B. Usage of the laser correlation spectroscopy for an estimation of a rat's homeostasis at an experimental pathology and its correction by drugs // Proc. ХІV Intern. School-Seminar “Spectroscopy of Molecules and Crystals”. - Odessa (Ukraine), 1999. - P. 134.

Сезонні коливання субфракційного складу плазми інтактних щурів за показниками лазерної кореляційної спектроскопії / В.Й. Кресюн, Д.Ю. Андронов, В.В. Годован, О.Є. Щерба // Праці VIII Конгресу СФУЛТ. - Львів-Трускавець, 2000. - С. 451.

АНОТАЦІЯ

Андронов Д.Ю. Лазерна кореляційна спектроскопія крові як метод фармакологічного скринінгу. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.05 - фармакологія. - Одеський державний медичний університет МОЗ України, Одеса, 2001.

Дисертація присвячена вивченню скринінгових можливостей лазерної кореляційної спектроскопії крові при визначенні ефективності фармакотерапії. Використані дві різні за патогенезом моделі (токсичний гепатит, стрес) із застосуванням відомих лікарських засобів (есенціале, феназепам, літоніт) та нових БАР (МІГУ-1, 2). Оцінка динаміки субфракційного складу плазми крові щурів за умов даних моделей на фоні їх фармакологічної корекції при зіставленні з даними традиційних методів показало, що ЛКС дозволяє об'єктивно оцінити профіль дії та ефективність використаних БАР. Вивчення скринінгових можливостей ЛКС в клініці проведено в дослідах in vitro із кров'ю від хворих з верифікованим діагнозом вірусний гепатит В та гостра осередкова бронхопневмонія в динаміці їх лікування. Виявлено високу інформативність ЛКС крові в процесі фармакотерапії, що дозволить проводити своєчасну її корекцію і забезпечить досягнення оптимального клінічного результату.

Ключові слова: скринінг, фармакотерапія, лазерна кореляційна спектроскопія, ефективність.

АННОТАЦИЯ

Андронов Д.Ю. Лазерная корреляционная спектроскопия крови как метод фармакологического скрининга. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.05 - фармакология. - Одесский государственный медицинский университет МЗ Украины, Одесса, 2001.

Диссертация посвящена изучению скрининговых возможностей лазерной корреляционной спектроскопии крови в определении профиля активности новых БАВ, а также оценки эффективности фармакотерапии. Предложенный метод фармакологического скрининга, основан на регистрации изменений субфракционного состава плазмы крови в динамике лечения.

Для скрининга в эксперименте использовали две, различающихся по патогенезу, модели патологических состояний (токсический гепатит, стресс) с применением известных лекарственных средств (эссенциале, феназепам, литонит) и новых БАВ (МИГУ-1, МИГУ-2). Установлено, что курсовое введение эссенциале при токсическом гепатите способствовало восстановлению субфракционного состава плазмы крови крыс к уровню, зарегистрированному в контрольной группе, на 7-е сутки эксперимента. При введении МИГУ-1 и МИГУ-2 была выявлена аналогичная динамика, что свидетельствовало об их гепатопротекторной активности. Исходя из сроков восстановления субфракционного состава плазмы крови крыс до уровня контрольных значений, МИГУ-1 оказался самым эффективным из сравниваемых соединений; МИГУ-2 - аналогичен эссенциале, однако при его введении интоксикационные сдвиги исчезали раньше. Полученные результаты ЛКС подтверждены традиционными методами исследования.

Анализ спектральных характеристик плазмы крови крыс на фоне введения литонита и феназепама выявил различия в их действии, что отразилось на стресс-протекторном эффекте данных транквилизаторов. По результатам ЛКС эффект литонита регистрировался на 3-и сутки депривации сна и заключался в усилении выраженности анаболизма на стадии резистентности. Эффект феназепама проявлялся на 4-е сутки стресса и выражался в снижении интенсивности иммунокомплексообразования.

Оценка динамики субфракционного состава плазмы крови крыс в условиях вышеописанных моделей на фоне их фармакологической коррекции при сопоставлении с данными традиционных методов показала, что ЛКС позволяет объективно оценить профиль действия, а также эффективность используемых БАВ. Это позволит на раннем этапе создания фармакологических препаратов осуществлять эффективный отбор наиболее перспективных соединений, получать количественную оценку возможного спектра их фармакологической активности. Кроме того, применение ЛКС способствует выявлению эффекта фармакокоррекции в более ранние сроки, чем при использовании традиционных методов фармакологического скрининга, что существенно снижает себестоимость исследований.

Диагностические и прогностические критерии, предоставляемые ЛКС, получили дальнейшее развитие в клинике для оценки гомеостаза человека в зависимости от проводимой фармакокоррекции. Изучение скрининговых возможностей

ЛКС в клинике проведено в опытах in vitro с кровью от больных с верифицированным диагнозом вирусный гепатит В и острая очаговая бронхопневмония в динамике их лечения. Анализ ЛК-спектров крови больных в динамике лечебного процесса выявил положительную тенденцию, заключающуюся в восстановлении гистограмм распределения частиц сыворотки крови к виду, зарегистрированному у доноров, что свидетельствовало об эффективности терапии. Эффективность гепатопротектора (эссенциале) у больных вирусным гепатитом В оценивали по уровню снижения вклада в светорассеяние мелкодисперсных компонентов сыворотки (2-11 нм), увеличение которого связано с цитолизом. Сравнительную оценку эффективности бензилпенициллина и цефазолина у больных острой очаговой бронхопневмонией проводили на основании сопоставления сроков восстановления субфракционного состава плазмы крови. По данным ЛКС, цефазолин эффективнее чем пенициллин нормализовал параметры плазменного гомеостаза. Проведенные исследования выявили высокую информативность ЛКС крови в процессе фармакотерапии, что позволит проводить своевременную ее коррекцию и обеспечит достижение оптимального клинического результата. Простота, экспрессность и объективность метода открывают новые возможности изучения лекарственных веществ как в экспериментальных, так и клинических исследованиях.

Ключевые слова: скрининг, фармакотерапия, лазерная корреляционная спектроскопия, эффективность.

SUMMARY

Andronov D.Yu. Laser correlation spectroscopy of the blood as a method of the pharmacological screening. - Manuscript.

Thesis for academic degree of candidate of medical sciences on the speciality 14.03.05 - pharmacology. - Odessa State Medical University of Ministry of Public Health of Ukraine, Odessa, 2001.

The dissertation is devoted to study of screening opportunities of laser correlation spectroscopy (LCS) of the blood in definition of pharmacotherapy efficacy. Two different by pathogenesis models (toxic hepatitis, stress) with application of known pharmaceuticals (essentiale, phenazepam, litonit) and new biologically active compounds - BAC (MIGU - 1, 2) were used. The evaluation of dynamic changes of subfractional composition of the blood plasma in rats at the mentioned models with their pharmacological correction by comparison to the data of traditional methods shown LCS as objective method in estimation of the action profile and efficacy of used BAC. To study of screening opportunities of the LCS method in clinic in vitro experiences were carried out. The blood from the patients with significantly confirmed diagnosis of viral hepatitis B and acute local bronchopneumony in dynamics of their treatment were used. It was revealed high informative value of the blood LCS method during pharmacotherapy, that will allow to make proper corrections for achievement of the optimal treatment result.

Key words: screening, pharmacotherapy, laser correlation spectroscopy, efficacy.

Размещено на Allbest.ru