Експериментальне обгрунтування використання ліпосом та мазевих препаратів з левоміцетином для профілактики і лікування синьогнійної опікової інфекції

Размещено на http://www.allbest.ru/

Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова

АМН України

УДК 616.0-02-001.17-084-085.33

03.00.07 - мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Експериментальне обгрунтування використання ліпосом та мазевих препаратів з левоміцетином для профілактики і лікування

синьогнійної опікової інфекції

Ткаченко Вікторія Леонідівна

Харків-2000

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському державному медичному університеті МОЗ України.

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор Циганенко Анатолій Якович, Харківський державний медичний університет, ректор, завідувач кафедрою мікробіології, вірусології та імунології.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Дикий Ігор Леонідович, Українська фармацевтична академія, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології.

доктор медичних наук, професор Кременчуцький Геннадій Миколайович, Дніпропетровська державна медична академія, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології .

Провідна установа - Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця, кафедра мікробіології, МОЗ України, м. Київ.

Захист відбудеться "25" січня 2001 року о 1100 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 02.41.01. при Інституті мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України за адресою: 61057, м. Харків, МСП, вул. Пушкінська, 14.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України (61057, м. Харків, МСП, вул. Пушкінська, 14).

Автореферат розісланий "25" грудня 2000 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради І.Ю. Кучма

Анотації

Ткаченко В.Л. Експериментальне обгрунтування використання ліпосом та мазевих препаратів з левоміцетином для профілактики і лікування синьогнійної опікової інфекції. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеню кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України. Харків, 2001.

З метою профілактики синьогнійної інфекції у хворих з опіками рекомендується застосування ліпосомальної форми синьогнійного анатоксину. Показано, що використання фосфатидилетаноламінових ліпосом та ліпосомальної форми синьогнійного анатоксину активізує імунні реакції в організмі експериментальних тварин.

Вивчено можливість застосування гелю та крему левоміцетину 1% для місцевого лікування експериментальної синьогнійної опікової інфекції.

В дослідах in vivo було доведено, що гель та крем левоміцетину 1% справляють виражений терапевтичний ефект, сприяють звільненню ран від синьогнійної палички і зменшують запальну реакцію у вогнищі ураження. Застосування крему та гелю левоміцетину 1% при неінфікованій термічній травмі у лабораторних тварин скорочує на 3-8 діб перехід від фази запалення у фазу репарації і запобігає інфікуванню опікової рани умовно-патогенною мікрофлорою.

Ключові слова: Pseudomonas aeruginosa, опіки, ліпосоми, левоміцетин.

Ткаченко В.Л. Экспериментальное обоснование применения липосом и мазевых препаратов с левомицетином для профилактики и лечения синегнойной ожоговой инфекции. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 03.00.07 - микробиология. Институт микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова АМН Украины. Харьков, 2001.

Цель работы состоит в экспериментальном обосновании применения липосомальной формы синегнойного анатоксина для профилактики ожоговой Pseudomonas-инфекции, а геля и крема левомицетина 1%-го для местного лечения ран и ожогов, инфицированных палочкой сине-зеленого гноя.

Для определения роли и места синегнойной палочки в структуре госпитальных гнойно-септических инфекций (ГГСИ) нами была изучена их этиология у пациентов ожогового отделения многопрофильного стационара г. Харькова. От больных выделили 690 штаммов условно-патогенных микроорганизмов. Анализ микробного пейзажа ожоговых ран пациентов показал незначительное преобладание грамположительной микрофлоры (57,5%) над грамотрицательной (42,5%). Среди грампозитивных микроорганизмов ведущее место занимают стафилококки (42,4%), а среди грамнегативных - синегнойная палочка (28,6%).

В первой серии экспериментов нами было показано, что применение липосомальной формы синегнойного анатоксина активизирует иммунные реакции в организме мышей, что выражается в усилении пролиферативных и гиперпластических процессов в тимусе, селезенке, лимфатических узлах, печени экспериментальных животных, с присоединением макрофагально-плазмоцитарной реакции. Иммунизация лабораторных животных с термической травмой липосомальной формой анатоксина нивелирует супрессивное действие ожога на фагоцитарную способность нейтрофилов крови экспериментальных мышей, способствуя более быстрой нормализации показателей функциональной активности этих клеток.

Применение фосфатидилэтаноламиновых липосом в качестве адъюванта при иммунизации мышей с термической травмой, способствует формированию полноценного иммунного ответа на введение Т-зависимого антигена (эритроцитов барана), нормализуя гемолизинпродуцирующую и розеткообразующую функции спленоцитов мышей, иммунизированных липосомальной формой синегнойного анатоксина, как по сравнению с ожоговым контролем, так и с анатоксином, сорбированном на гидроокиси алюминия.

Изучена возможность использования геля и крема левомицетина 1% для местного лечения экспериментальной синегнойной ожоговой инфекции.

В опытах in vitro показано, что крем и гель левомицетина 1% обладают широким спектром антибактериального действия. Благодаря включению в составы кремовой и гелевой основ трилона Б (ЭДТА), к препаратам оказались чувствительны бактерии, резистентные к левомицетину.

В опытах in vivo было показано, что гель и крем левомицетина 1% обладают высокой терапевтической активностью. Применение крема и геля левомицетина 1% при неинфицированной термической травме у лабораторных животных на 3-8 суток сокращает переход от фазы воспаления в фазу репарации и предупреждает инфицирование ожоговой раны условно-патогенной микрофлорой.

Применение мазевых форм с левомицетином у животных с экспериментальной синегнойной ожоговой инфекцией способствует быстрому очищению ран от P.aeruginosa и уменьшает воспалительную реакцию в очаге поражения. Лечение экспериментальных животных с термической травмой гелем и кремом левомицетина 1% более эффективно, чем препаратами сравнения - мазью "Левомеколь" и линиментом синтомицина 5%.

На основании полученных результатов, для лечения синегнойной ожоговой инфекции предложены два препарата на гидрофильных основах с левомицетином. Гель левомицетина 1% - для лечения ожогов в фазе воспаления и экссудации, а крем левомицетина 1% - в фазе регенерации или для лечения ран с умеренной гнойной экссудацией. Производство вышеупомянутых препаратов в данное время, в соответствии с Регистрационным удостоверением № Р.02.00/01402 от 02.02.00 МЗ Украины для геля левомицетина 1% и Регистрационным удостоверением № Р.02.00/01494 от 24.02.00 МЗ Украины для крема левомицетина 1%, началось на ЗАО "Фармацевтическая фирма "Дарница" (г. Киев).

Ключевые слова: Pseudomonas aeruginosa, ожоги, липосомы, левомицетин.

Tkachenko V.L. Experimental substantiation for use of liposomes and ointment preparations with chloramphenicol for prevention and treatment of Pseudomonas aeruginosa burn infections. - Manuscript.

The thesis on obtaining of scientific degree of Candidate of Medical Science in speciality No. 03.00.07. - Microbiology. Institute of Microbiology and Immunology named after I.I. Mechnikov AMS Ukraine. Kharkov, 2001.

Liposomal form of Pseudomonas aeruginosa toxoid is recommended for the prophylaxis of Pseudomonas aeruginosa infection in the patients with the burn wounds. It is established, that the use of phosphatidilethanolamine liposomes and liposomal form of Pseudomonas aeruginosa toxoid activate immune reactions in organism of experimental animals.

Application of 1% of chloramphenicol (gel and cream) for local treatment of Pseudomonas aeruginosa burn infection has been studied in experiment.

In vivo, both medical forms show pronounced therapeutic effect; they promote elimination of Pseudomonas aeruginosa from wounds and decrease inflammation. In noninfected thermal trauma in laboratory animals application of gel and cream of chloramphenicol reduces transition from the phase of inflammation to the phase of reparation by 3-8 days and prevents infection of the burn wound by opportunistic microbes.

Key words: Pseudomonas aeruginosa, burns, liposomes, and chloramphenicol.

Загальна характеристика роботи

Вступ. В структурі сучасних госпітальних інфекцій провідне місце посідають гнійно-септичні інфекції (ГГСІ) (В.И. Стручков с соавт., 1991; Е.П. Безуглая с соавт., 1995; Н.Ф. Калиниченко с соавт., 1999). Серед умовно-патогенних збудників ранових опікових інфекцій зростає роль грамнегативних бактерій, особливо Pseudomonas aeruginosa (В.В. Минухин с соавт., 1992; Н.И. Балаклиец, Т.И. Балаклиец, 1999; R.N. Jones et al., 1997; T. Shannon et al., 1997; De Vas D. et al., 1997; M.A. Walton et al., 1997; A.C. Colsky, 1998). Профілактика і лікування синьогнійної опікової інфекції викликає суттєві труднощі із-за наявності у P.aeruginosa різноманітних факторів патогенності; високої природної та придбаної резистентності до багатьох антибактеріальних препаратів; антагоністичної активності по відношенню до інших видів мікроорганізмів - збудників ГГСІ (А.Ф. Мороз с соавт., 1988; И.И. Долгушин, 1989; В.Д. Беляков с соавт., 1990; Т.А. Макаренко с соавт., 1996; H.Y. Chen et al., 1995; C. Jia et al., 1995; I.A. Holder et al., 1995; M.A. Walton et al., 1997; A.C. Colsky, 1998).

Вищесказане свідчить про актуальність та важливість створення високоефективних імунопрепаратів для профілактики синьогнійної опікової інфекції.

З даних літератури відомо, що існує можливість використання ліпосом - штучних фосфоліпідних везикул, як носіїв антигенів і ад'ювантів (C.R. Alving, 1992). Внесення імунопрепаратів до складу ліпосом дозволяє підняти напруження імунітету, а також знизити токсичність і алергенність вищеназваних препаратів (A.S. Janoff, 1999).

В умовах зростання антибіотикорезистентності гноєродної мікрофлори і змінної реактивності організму, коли загальне використання імунологічних і антибактеріальних препаратів не завжди можливе із-за суттєвих побічних ефектів, проблема медикаментозного лікування інфікованих ран і опіків стає все більш складною. Сучасній хірургії, і частково комбустіології, необхідні нові раноживлячі препарати, які мають широкий спектр антимікробної дії (М.И. Кузин с соавт., 1985, 1987, 1990). Одним з напрямків створення таких препаратів є використання традиційних антибіотиків з модифікацією складу допоміжних речовин в мазевих основах, яка враховує механізм виробки резистентності бактерій до цих антибіотиків. (М.О. Ляпунов та ін., 1994; О.І. Тихонов та ін., 1997; Л.В. Яковлєва та ін., 1998, 1999).

Актуальність теми. Профілактика і лікування госпітальної синьогнійної опікової інфекції - серйозна проблема сьогодення. Арсенал антимікробних засобів, що використовуються для профілактики і лікування опікової Pseudomonas-інфекції, не задовольняє щоденні потреби медичних закладів України. Створення і впровадження нових, більш ефективних препаратів для специфічної профілактики й антибактеріальної терапії даної інфекції є актуальним питанням сучасної медицини, особливо мікробіології, і потребує нових підходів для рішення цієї проблеми.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана відповідно до державної комплексної міжвідомчої програми "Профілактика захворювань і формування здорового способу життя населення України на період до 2000 року", плану наукових досліджень кафедри мікробіології, вірусології та імунології Харківського державного медичного університету (№ держреєстрації 01980002613).

Мета роботи. Метою роботи було експериментальне обгрунтування використання ліпосомальної форми анатоксину синьогнійної палички для профілактики опікової Pseudomonas-інфекції, а гелю і крему левоміцетину 1%-го для місцевого лікування опіків, котрі інфіковані паличкою синьо-зеленого гною.

Задачі дослідження. Для досягнення поставленої мети вирішувались такі завдання:

Вивчити етіологічну структуру інфікованих опікових ран і чутливість виділених культур мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів.

Дослідити імунологічний статус здорових мишей і тварин із термічною травмою, яких імунізували ліпосомальною формою анатоксину P.aeruginosa.

Визначити антибактеріальну активність препаратів із левоміцетином у дослідах in vitro у відношенні до стандартних і клінічних штамів P.aeruginosa, а також інших факультативно-анаеробних мікроорганізмів, що інфікують опікову поверхню.

Дослідити терапевтичну ефективність крему і гелю левоміцетину 1% на експериментальній моделі синьогнійної опікової інфекції у тварин.

Об'єкт дослідження. Синьогнійна опікова інфекція.

Предмет дослідження: Фосфатидилетаноламінові ліпосоми та ліпосомальна форма анатоксину P.aeruginosa, які призначені для профілактики синьогнійної опікової інфекції.

Препарати крему й гелю левоміцетину 1% на гідрофільних основах, які призначені для місцевого лікування опіків, інфікованих синьогнійною паличкою.

Методи дослідження. Виділення мікроорганізмів і їх ідентифікацію проводили відповідно до Розпоряджень МОЗ СРСР № 250 від 13.12.75, № 535 від 22.04.85 і методичних рекомендацій (Москва, 1984; Харків 1991).

Чутливість мікроорганізмів до антибіотиків визначали методом дисків відповідно до методичних рекомендацій (Б.М. Даценко с соавт., 1989).

Визначення антибактеріальної активності левоміцетину, крему і гелю левоміцетину 1%, а також основ мазевих форм проводили методом дифузії в агар відповідно до методичних рекомендацій (Н.Ф. Калиниченко с соавт., 1991).

Для одержання ліпосомальної форми синьогнійного анатоксину (ЛФА) використовували нейтральні мультиламелярні фосфатидилетаноламінові ліпосоми (за технологією, розробленою Івановою Н.М. з спіавт., 1984, 1986 на Харківському підприємстві "Біолік") і синьогнійний анатоксин, розроблений у лабораторії опікових інфекцій НДІЕМ ім. М.Ф. Гамалеї АМН Росії (Н.С. Бродинова с соавт., 1987, 1989).

Форму ліпосом вивчали за допомогою трансмісійної електронної мікроскопії (Н.С. Пушкарь, А.С. Капрельянц, 1982; Г. Грегориадис, А. Аллисон, 1983; В.Я. Карупу, 1984). Електронно-мікроскопічні дослідження ліпосом робили за допомогою мікроскопа JEM-7A фірми "JEOL" (Японія).

Для вивчення імуномодулюючих властивостей ліпосомальної форми синьогнійного анатоксину і дослідження терапевтичної активності мазевих препаратів із левоміцетином використовувалася контактна модель термічного опіку за Ц.К. Чантурією (1982) у модифікації В.В. Мінухіна із співавт. (1985) і експериментальна модель синьогнійної опікової інфекції (В.В. Минухин с соавт., 1992). Специфічну дію препаратів левоміцетину в дослідах in vivo вивчали також на експериментальній моделі місцевої раневої інфекції, викликаної стандартним штамом P.aeruginosa АТСС 27853, на кролях породи шиншилла (Б.М. Даценко із співавт., 1989).

Вплив ліпосомальної форми синьогнійного анатоксину на імунологічний статус здорових тварин і мишей із термічною травмою вивчали за їх реакцією на введення Т-залежного антигену - еритроцитів барана (ЕБ) (Иммунологические методы/ Под. ред. М. Фримеля, 1987; H. V. Dijk, N. Bloksma, 1977).

Аналіз функціонального стану нейтрофілів крові тварин оцінювали за спроможністю поглинати частки латексу (В.Н. Федосеева с соавт., 1989).

Матеріал для морфологічного дослідження одержували за М.В. Войно-Ясенецьким, Ю.М. Жаботинським (1970) та Г.А. Меркуловим (1969). Гістохімічне виявлення в гістологічних препаратах рибонуклеїнової кислоти (РНК) проводили за допомогою реакції Браше (В.Г. Елесеева; 1967; Г.А. Меркулов, 1969).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше було визначено широкий спектр імуномодулюючих властивостей фосфатидилетаноламінових ліпосом і ліпосомальної форми анатоксину синьогнійної палички при опіках у мишей.

Вперше у вітчизняній і зарубіжній практиці теоретичними й експериментальними дослідженнями, з мікробіологічної точки зору, обгрунтовано склади двох препаратів: гелю левоміцетину 1% (на гідрофільній водорозчинній основі) і крему левоміцетину 1% (на гідрофільній емульсійній основі) для лікування синьогнійної опікової інфекції.

В дослідах in vitro та in vivo виявлена висока антибактеріальна активність розроблених мазевих препаратів порівняно з існуючими аналогами, особливо у відношенні стійких до левоміцетину клінічних штамів.

Практичне значення одержаних результатів. Для лікування синьогнійної опікової інфекції запропоновано два антибактеріальних препарати на гідрофільних основах із левоміцетином: гель левоміцетину 1% для застосування в фазі запалення та ексудації і крем левоміцетину 1% для використання в фазі регенерації. Виробництво вищезазначених препаратів у даний час, згідно Реєстраційного посвідчення № Р.02.00/01402 від 02.02.00 МОЗ України для гелю левоміцетину 1% та Реєстраційного посвідчення № Р.02.00/01494 від 24.02.00 МОЗ України для крему левоміцетину 1%, почалося на ЗАТ "Фармацевтична фірма "Дарниця" (м. Київ). Перші партії антибактеріального та гіперосмолярного засобу гелю левоміцетину 1% поступили у аптечну мережу України.

Особистий внесок здобувача. Аналіз літератури по темі дисертації, вивчення етіологічної структури ГГСІ, планування і виконання експерименту, статистичне опрацювання матеріалу, аналіз результатів дослідження й оформлення роботи виконані автором самостійно. Усі положення та висновки дисертації належать авторові. Автором написано особисто, або у співавторстві з д. мед. н. А.Я. Циганенко, д. мед. н. В.В. Мінухіним, д.фарм.н. М.О. Ляпуновим, к.мед.н. В.М. Васильченко, к. мед. н. Н.І.К оваленко, к. мед. н. В.І. Кравцовою, к. мед. н. Н.М.І вановою. к. мед. н. О.П. Безуглою, Д.В. Мінухіним усі друковані матеріали, що мають відношення до теми роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні положення і результати дисертації були повідомлені на Всесоюзній конференції "Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций" (Москва, 1991); Першому Російському національному конгресі "Человек и лекарство" (Москва, 1992); 2-й Всеросійській конференції "Влияние антропогенных факторов на структурные преобразования органов, тканей, клеток человека и животных" (Саратов, 1993); Міжнародній науково-практичній конференції "Оптимальные средства и методы иммунокорригирующей, противовоспалительной и противомикробной терапии" (Харків, 1993), Міжнародному симпозіумі "Lipid and Surfactant Dispersed Systems" (Москва, 1999); Fourth International Conference "Liposome Advances: Progress in Drug and Vaccine Delivery" (London, 1999).