Імунофенотипування бластних клітин з мінімальними ознаками диференціювання при гострих лейкеміях

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна Академія наук України

Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

14.01.07 - онкологія

Імунофенотипування бластних клітин з мінімальними ознаками диференціювання при гострих лейкеміях

Хруб Кахер Юсеф

Київ-2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України та в Інституті експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України

Науковий керівник - доктор медичних наук Абраменко Ірина Вікторівна, провідний науковий співробітник відділу імуноцитохімії Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Шляховенко Володимир Олексійович, завідувач відділу ензимології Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України

доктор медичних наук, професор Клименко Віктор Іванович, завідувач відділу гематології Науково-дослідного інституту клінічної радіології НЦРМ АМН України

Провідна установа - Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України, кафедра онкології та кафедра гематології, м. Київ

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат медичних наук Н.В. Бородай

Анотація

ХРУБ Кахер Юсеф. Імунофенотипування бластних клітин з мінімальними ознаками диференціювання при гострих лейкеміях. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.07 - онкологія. - Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, Київ, 2000.

Дисертація присвячена проблемі діагностики гострих лейкемій (ГЛ) з мінімальними ознаками диференціації бластних клітин. В цю гетерогенну групу захворювань включено ГЛ мієлоїдного похождення М0, М5а, М6 та М7 за ФАБ-класифікацією; лімфобластні ГЛ (ГЛЛ) з атиповою експресією мієлоїдних антигенів, присутністю поодиноких пероксидазопозитивних бластів; асинхронною експресією антигенів лімфобластів. Запропоновано маркери, які дозволяють встановити походження злоякісно трансформованих клітин в діагностично складних випадках. Обґрунтовано принципи диференційної діагностики. Охарактеризовано нові варіанти захворювання - ГЛ з клітин-попередників натуральних кілерів, ГЛЛ Т-клітинного походження з t(2;11).

Ключові слова: гостра лейкемія, імунофенотипування, антигени диференціювання, гемопоез, кровотворні клітини-попередники.

Аннотация

Хруб Кахер Юсеф. Иммунофенотипирование бластных клеток с минимальными признаками дифференцировки при острых лейкозах. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.07 - онкология. - Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины, Киев, 2000.

Диссертация посвящена проблеме диагностики острых лейкозов (ОЛ) с минимальными признаками дифференцировки бластных клеток. В эту гетерогенную группу заболеваний включены ОЛ миелоидного происхождения (ОМЛ) - М0, М5а, М6 и М7 варианты по ФАБ-классификации; лимфобластные ОЛ (ОЛЛ) с атипичной экспрессией миелоидных антигенов, наличием единичных пероксидазоположительных бластов; асинхронной экспрессией антигенов лимфобластов. Обследовано 438 больных с ОЛ, среди которых 98 больных ОЛЛ и 340 - ОМЛ. Использовались методы морфологического окрашивания мазков периферической крови и пунктатов костного мозга, проводилось цитохимическое определение активности ферментов и наличия PAS-положительных веществ, иммуноцитохимическое определение экспресии антигенов поверхностных мембран и цитоплазмы клеток с помощью моноклональных антител. Определены маркерные признаки, которые позволяют установить происхождение злокачественно трансформованных клеток в диагностически сложных случаях. Обоснованы принципы дифференциальной диагностики. В частности, для диагностики М0 ОМЛ предложено использовать выявление экспрессии триады антигенов (CD34, CD13, CD33) и миелопероксидазы с помощью моноклональных антител; для верификации М6 ОМЛ наиболее важными признаками является экспрессия антигенов CD71, CD33, гликофорина А; идентификация М7 ОМЛ возможна при наличии на поверхностных мембранах бластных клеток антигенов CD61, CD41, CD42. Охарактеризованы новые варианты заболевания - ОЛ из клеток-предшественников естественных киллеров (CD34⁺CD33⁺CD13⁺CD56⁺CD7⁺), ОЛЛ Т-клеточного происхождения с t(2;11) (CD3⁺CD5⁺CD7⁺CD4⁺CD8⁺HLA-DR⁺CD14⁺), подвариант М5а ОМЛ с минимальными признаками дифференцировки бластов (CD34^+/-CD45RA⁺cyHLA-DR⁺cyCD7⁺CD15⁺). Дана иммунологическая и цитохимическая характеристика ОЛ с фенотипом гемопоэтической стволовой клетки (CD34⁺HLA-DR⁺CD38⁺CD45⁺), ОЛЛ Т-клеточного происхождения с Т-клеточным рецептором для антигена.

Ключевые слова: острый лейкоз, иммунофенотипирование, дифференцировочные антигены, гемопоэз, кроветворные клетки-предшественники.

Annotation

Hroub Qaher Yousef. The blast cell's immunophenotyping in acute leukemias with minimal differentiation sings. - Manuscript.

Thesis for a candidate's degree by speciality 14.01.07 - oncology. - Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2000.

The dissertation is devoted to problem of diagnostics of acute leukemias (AL) with minimal differentiation sings. This heterogenic category of diseases includes myelogenous AL - M0, M5a, M6 and M7 according FAB-classification; lymphoblastic AL (ALL) with atypical expression of myeloid antigens, the presence of single peroxidase-positive blast cells; asynchronic expression of lymphoid antigens. Specific markers which allow to lay origin of malignant transformed cells in diagnostically complicated cases are defined. The principles of differentiative diagnosis are justified. Some new variants of diseases - AL from cell-precursors of natural killer, ALL of T-cell origin with t(2;11), are characterized.

Key words: acute leukemia, immunophenotyping, differentiation antigens, hemopoiesis, hematopoietic cells-precursors.

1. Загальна характеристика роботи

лейкемія баластний злоякісний

Актуальність проблеми. Сучасна протокольна терапія хворих гострими лейкеміями (ГЛ) неможлива без уточнення діагнозу захворювання, визначення його варіанту згідно загальноприйнятої франко-американо-британської (ФАБ) класифікації. Розроблено окремі схеми поліхіміотерапії для кожного з варіантів захворювання (Мінаков В.Н. і співавт, 1991; Байдун Л.В., 1996, 1997; Brunning R., McKenna R., 1993; Copelan E.A., McGuire E.A., 1995; Lichtman M., 1995)

ФАБ-класифікація запропонована у 1976 р., вона дозволяє ідентифікувати 3 варіанти гострих лімфобластних лейкемій (ГЛЛ) і 8 - гострих лейкемій мієлоїдного походження (ГМЛ), а її доповнення методами імунофенотипування - виділити серед ГЛЛ 4 варіанти ГЛЛ Т-клітинного і 4 варіанти ГЛЛ В-клітинного походження в залежності від ступеня зрілості бластних клітин, а також, як самостійні імунологічні підтипи, - ГЛЛ з експресією мієлоїдних маркерів, біфенотипові гострі лейкемії, недиференційовані гострі лейкемії (Логінський В.Е. і співавт, 1996; Френкель М.А. і співавт., 1998; Bain B., 1990, 1998). При ГМЛ визначення імунологічного фенотипу бластних клітин сприяє диференціації окремих варіантів захворювання, розпізнавання яких є неможливим при застосуванні тільки морфологічних та цитохімічних методів (Bene M. et al., 1998). Запропоновані для вирішення цієї мети панелі моноклональних антитіл (мкАТ) та типові зразки їх реактивності сумовані у пропозиціях першої Європейської групи з імунологічної класифікації лейкемій (EGIL) (Garand R. et al., 1994).

Незважаючи на це, остаточно нез`ясованими залишились деякі аспекти діагностики. Це стосується, в першу чергу, диференційної діагностики ГМЛ з пероксидазонегативними бластними клітинами і ГЛЛ; ГЛЛ з експресією мієлоїдних антигенів і ГМЛ; діагностики М0, М6 і М7 ГМЛ, тобто ГЛ, які традиційно відносять до категорії лейкемій з мінімальними ознаками диференціювання бластних клітин. Не увійшли в імунологічну класифікацію і випадки ГЛ з клітин-попередників натуральних кілерів. Достатньо часто імунологічний фенотип бластних клітин не співпадає з тим, що пропонує група EGIL. Насамперед це пов`язано з біологічною гетерогенністю ГЛ, можливістю злоякісної трансформації на різних етапах ранньої комітації та диференційовки гемопоетичних клітин-попередників. З поглибленнях знань і розширенням набору маркерів, що застосовуються для дослідження, з`являються все нові можливості для ідентифікації раніш невідомих субпопуляцій поліпотентних стовбурових клітин, яким можуть відповідати бластні клітини при ГЛ. Детальний антигенний аналіз бластів при ГЛ, в свою чергу, дозволяє передбачити існування таких клітин-попередників. Особливо перспективним у цьому зв`язку є дослідження випадків ГЛ з мінімальними ознаками диференціювання бластних клітин. Такі випадки найбільш складні і в плані діагностики, оскільки на ранніх етапах розвитку кровотворних стовбурових клітин, при збереженні ними олігопотентних властивостей, можлива коекспресія диференційовочних антигенів різних паростків гемопоезу.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було поліпшення діагностики гострих лейкемій з мінімальними ознаками диференціювання бластних клітин на основі комплексного вивчення морфологічних, цитохімічних і антигенних ознак злоякісно трансформованих кровотворних клітин. Для її досягнення були поставлені такі задачі:

вивчення цитохімічних властивостей і антигенного профілю бластних клітин при окремих варіантах ГЛЛ і ГМЛ;

характеристика групи хворих на ГЛЛ, яка потребує проведення диференційної діагностики з ГМЛ;

характеристика рідкісних імунологічних підтипів гострої лімфобластної лейкемії і співставлення фенотипових ознак бластних клітин з вірогідними клітинними аналогами;

виділення і характеристика ГМЛ з мінімальними ознаками диференціювання бластних клітин і диференційна діагностика з окремими цитологічними варіантами ГЛЛ.

Наукова новизна. Проведене вивчення фенотипових характеристик бластних клітин при ГЛ дозволило ідентифікувати нові імунологічні підтипи, а саме: ГЛЛ Т-клітинного походження з транслокацією t(2;11) і експресією мієлоїдних антигенів; М5 ГМЛ з мінімальними ознаками диференціювання бластних клітин; ГЛ з біпотентних попередників НК-клітин і мієлоїдних клітин; ГЛ з вірогідних попередників НК-клітин і Т-лімфоцитів; ГЛЛ В-клітинного походження з ізольованою експресією антигену CD10. Дана імунологічна і цитохімічна характеристика ГЛ з фенотипом стовбурової гемопоетичної клітини.

В групі хворих з ГЛЛ В-клітинного походження виявлено імунологічні підтипи з експресією мієлоїдних антигенів, присутністю 3-5% пероксидазопозитивних бластів, асинхронною експресією В-клітинних антигенів.

Виявлена імунологічна гетерогенність варіанту Т1 ГЛЛ і показана необхідність поглибленного вивчення клітинного субстрату при цьому варіанті захворювання.

Практичне значення одержаних результатів. Запропоновано набір маркерів для диференційної діагностики ГЛ мієлоїдного та лімфоїдного походження, критерії діагностики М0, М5а, М6 і М7 варіантів ГЛ мієлоїдного походження, лімфобластних ГЛ з експресією мієлоїдних антигенів, присутністю пероксидазопозитивних бластів, асинхронною експресією лімфоїдних антигенів.

Основні положення і висновки дисертації впроваджено в практику роботи гематологічних відділень № 1 і № 2 9-й клінічної лікарні м. Києва, Української дитячої спеціалізованої лікарні “Охматдит”, відділення онкогематології 16-ї дитячої клінічної лікарні м. Харкова. Їх використання дозволяє поліпшити встановлення правильного діагнозу, що є основою для призначення адекватних схем поліхіміотерапії і поліпшення результатів лікування хворих.

Особистий внесок здобувача полягає у виконанні цитохімічних та імунофенотипових досліджень, статистичній обробці результатів, підборі та аналізі данних наукової літератури, а також (при участі наукового керівника та співваторів публікацій) аналізі та інтерпретації одержаних результатів.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались та обговорювались на засіданні Київського міського товариства імунологів та алергологів (Київ, 1998); науково-практичному семінарі “Мієлодиспластичний синдром. Апластична анемія у дітей. Діагностика та сучасна концепція лікування” (Київ, 1999); нараді-семінарі спеціалістів з клінічної лабораторної діагностики, управлінь охорони здоров`я обласних та міських - Київської, Севастопольської, МОЗ автономної республіки Крим, завідуючих кафедрами лабораторної діагностики України (Київ, 1999); ІХ науково-практичній конференції лікарів-педіаторів міста “Сучасні методи діагностики та лікування - в практику охорони здоров`я дітей” (Харків, 2000).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 4 статті у провідних фахових журналах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота обсягом 134 сторінки складається із вступу, огляду літератури, трьох розділів власних досліджень, висновків, списку літератури, який включає 182 першоджерела, в тому числі 138 зарубіжних праць. Робота ілюстрована 18 рисунками, 8 таблицями.

2. Зміст роботи

Матеріали і методи дослідження. Досліджено пунктати кісткового мозку та периферичну кров 438 пацієнтів з ГЛ, які знаходились на лікуванні в гематологічних відділеннях 9-ї клінічної лікарні м. Києва та Української дитячої спеціалізованої лікарні “Охматдит”, серед яких 98 хворих на ГЛЛ і 340 - ГМЛ. Дослідження проводились до призначення специфічної хіміотерапії.

В цитологічних препаратах периферичної крові та кісткового мозку цитохімічними методами визначали активність мієлопероксидази (МПО) (Loele, 1936), лужної фосфатази (ЛФ) (Loffler, 1972), кислої фосфатази (КФ) (Goldberg, Barka, 1962), неспецифічної a-нафтилацетатестерази (НЕ) (Pearse, 1960; Loffler, 1961), кислої неспецифічної естерази (КНЕ) (Kaplow, 1975), хлорацетатестерази (ХАЕ) (Moloney, McPhearson, Fligelman, 1960), ліпідів (Ackerman, 1950), проводили PAS-реакцію (McManus, 1946; Hotchkiss, 1948).

Клітини для проведення імуноцитохімічних досліджень (досліджували гепаринізовану периферичну кров та гепаринизований пунктат кісткового мозку) отримували в градієнті щільності фікол-верографіну (d=1,076). Експресію антигенів диференціації (стовбурових та комітованих клітин-попередників - CD34, CD117, HLA-DR, CD38; мієлоїдних - CD33, CD13, CD14, CD15, CD16, CD64, МПО; еритроїдних - CD71, глікофорин А; мегакаріоцитарних - CD41, CD42, CD61; В-лімфоцитів - CD19, CD20, CD22, CD10; Т-лімфоцитів - CD7, CD3, CD5, CD2, CD4, CD8; натуральних кілерів, НК-клітин, - CD56) визначали авідин-біотиновим методом з використанням відповідних мкАТ та у якості барвника - лужної фосфатази або пероксидази (Рукосуев В.С., 1979; Абраменко И. В. і співавт., 1988).

Статистичну обробку результатів проводили на IBM PC 586 з використанням прикладних програм Micrоsоft Excel.

Результати та їх обговорення

Характеристика ГЛЛ В-клітинного похождення з мінімальними ознаками диференціювання бластів

При виконанні роботи нами було обстежено 67 хворих у віці від 4 місяців до 19 років, у яких був встановлений діагноз ГЛЛ В-клітинного походження (табл. 1). Варіанти захворювання виділяли за класифікацією EGIL (Garand R. et al., 1994).

Таблиця 1. Варіанти ГЛЛ В-клітинного походження в обстеженій групі хворих

В більшості випадків діагноз ГЛЛ не викликав сумніву. Труднощі диференційної діагностики були пов`язані з відсутністю експресії В-клітинних маркерів (4 хворих) та їх несинхронною експресією (1), атиповою експресією мієлоїдних антигенів (12) та присутністю невеликої кількості пероксидазопозитивних бластів (5).

Згідно з критеріями ФАБ-класифікації, при виявленні в кістковому мозку 3% бластів з позитивною реакцією на МПО правомірний діагноз ГМЛ М0. Однак, при проведенні імунофенотипування, у 5 хворих ми встановили лімфоїдне походження бластних клітин (1 хворий - пре-пре-В-ГЛЛ, 3 - ГЛЛ “загального типу”, 1 - пре-В-ГЛЛ). На це вказувала реакція бластних клітин хоча б з одним із В-лінійноасоційованих мкАТ (CD19 та/або CD22), з HLA-DR, при відсутності реакції з мієлоїдними антигенами (у 2 хворих знайдена реакція з мкАТ до CD15) та МПО; а також гранулярний характер PAS-реакції, слабка активність КФ, НЕ і КНЕ.

У 12 хворих з ГЛЛ В-клітинного походження на мембранах бластних клітин знайдена експресія мієлоїдних антигенів. Експресії МПО не знайдено ні в одному випадку. У 8 з них (6 - пре-пре-В-ГЛЛ і 2 - ГЛЛ “загального типу”) це була ізольована експресія антигену CD15 (у двох з них знайдено також 2-3% МПО-позитивних бластних клітин), у 4 хворих (3 - пре-пре-В-ГЛЛ і 1 - ГЛЛ “загального типу”) - експресія CD13 (4) і CD33 (2).

Диференційний діагноз проводили з ГМЛ М0, ГМЛ М6 і ГМЛ М7. На відміну від ГМЛ М0, бластні клітини експресували CD19, CD22; не реагували з мкАТ до МПО; містили гранули PAS-позитивних речовин.

В основу диференційного діагнозу з ГМЛ М6 і ГМЛ М7 було покладено такі пункти: 1) клітинний склад кістковомозкового пунктату (для ГМЛ М6 характерна наявність більш ніж 50% клітин еритробластичного ряду, а при ГМЛ М7 кількість бластних клітин звичайно перевищує 90%); 2) відсутність експресії антигенів еритробластів (CD71, глікофорину А) і мегакаріобластів (CD61, CD41, CD42) при наявності антигенів В-лімфоцитів; 3) слабка реакція при виявленні активності кислих гідролаз (при ГМЛ М6 і ГМЛ М7 активність КФ і КНЕ звичайно виявляється як локальна в області апарату Гольджі).

Ми проаналізували клінічні дані у 8 хворих з пре-пре-В-ГЛЛ і ГЛЛ “загального типу” з експресією антигену CD15 на бластних клітинах - 6 хлопчиків і 2 дівчат. Серед них не було дітей до 1 року. Середній вік пацієнтів - 10,75+3,6 років. Гепато- і спленомегалія на момент діагнозу виявлена у трьох, у одного - лейкемічна інфільтрація шкіри. Синдром гиперлейкоцитозу (147,5 х 10⁹/л), який співпадав з гепато- і спленомегалією, був виявлений у одного пацієнта 15 років, у двох загальна кількість лейкоцитів була нижче за 5 х 10⁹/л. Таким чином, дана група була гетерогенною за клінічними ознаками захворювання і не відповідала описаному в літературі варіанту ГЛЛ з присутністю хромосомної аберації t(4;11) і частою експресією мієлоїдних маркерів (Pui C. et al., 1993).

4 дітей з експресією на бластах антигенів CD13 і CD33 були віком 11 місяців, 4, 5 і 7 років. В жодного з них лейкоцитоз не перевищував 50 х 10⁹/л, органомегалії не було. Особливий інтерес представляють результати імунофенотипування бластних клітин хворого І-к, 11 місяців. Вони експресували антигени CD34, CD33, CD13, CD7 (що характерно для ГМЛ М0) і одночасно HLA-DR, CD19, CD22, CD10. За інтенсивністю забарвлення переважали В-клітинні маркери. Ми вважаємо, що в даному випадку злоякісна трансформація відбулась на початкових етапах комітації гемопоетичної стовбурової клітини в напрямку В-лімфопоезу. До аналогічного висновку прийшли Mizutani M. і співавт., 1997, які при анализі 832 випадків гострої лейкемії виявили 26 (3,1%) з фенотипом бластів CD13/CD33⁺CD7⁺CD19⁺. У 20 з них діагностований ГМЛ, 4 - пре-Т-ГЛЛ, у 2 - ГЛЛ В-клітинного походження.

Таким чином, в ході проведеного дослідження ми виявили достатньо часту експресію мієлоїдних антигенів на бластних клітинах при ГЛЛ В-клітинного походження: у 12 з 67 обстежених дітей (17,9%). В більшості випадків це була ізольована експресія CD15 (11,9%). Аналогічні дані наводять в своїх дослідженнях Pui C. і співавт. (1998), Tiensiwakul P. і співавт. (1999).

При проведенні імунофенотипування ми спостерігали у окремих хворих несинхронну експресію лімфоїдних антигенів CD19 і CD22. У пацієнта К-ка С., 16 років, бластні клітини були HLA-DR, CD38, CD34,CD10-позитивні (інші антигени та МПО були відсутні), містили гранули PAS-позитивних речовин, активність КФ, КНЕ, ХАЕ, НЕ не визначалась. У дівчини Б-вой, 3 роки, на бластних клітинах виявлена слабка експресія антигену CD19 та значна - CD34 і CD10, цитохімічні властивості відповідали В-лімфобластам.

У 4 хворих бластні клітини експресували тільки антигени CD34, HLA-DR, CD38 та окремі епітопи CD45 (CD45RO або CD45RA), в цитохімічному відношенні були інертні. Фенотипові ознаки бластів у них співпадали з фенотипом стовбурової гемопоетичної клітини, а саме:

хвора В-к, 5 років, - CD34⁺CD45RO⁺CD38^low HLA-DR^low;

хворий Г-р, 16 років, - CD34⁺CD45RO⁺CD38^lowcyHLA-DR⁺;

хворий Ш-н, 4 роки, - CD34⁺ CD45Ra^lowCD38⁺HLA-DR⁺;

хворий С-я, 15 років, - CD34⁺CD45RA⁺CD38⁺ HLA-DR⁺.

Ми розцінювали морфоцитохімічну і імунофенотипову мономорфність популяції бластів та відсутність експресії антигену CD7 як важливі диференційно-діагностичні ознаки при ГЛ з фенотипом стовбурової гемопоетичної клітини.

Асинхронна експресія В-клітинних антигенів диференціювання при ГЛЛ В-клітинного походження вже була відмічена дослідниками (Hurwitz C. і співавт., 1988; Lucio P. і співавт., 1999). Ми вважаємо, що асинхронна експресія В-лімфоїдних антигенів відображає ступінь зрілості бластних клітин та їх відповідність лімфобластам початкових етапів диференціювання. На наш погляд, за ступенем експресії антигенів CD34, CD10, CD19/CD22 можна виділити такі підваріанти ГЛЛ “загального типу”:

CD34⁺CD10⁺⁺CD19/CD22^low - можливим аналогом є лімфобласти, близькі до стовбурової гемопоетичної клітини (в нашому дослідженні 2 з 35 хворих на ГЛЛ “загального типу” - 5,7%);

CD34^-CD19⁺CD22⁺CD10⁺ - можливим аналогом є більш зрілі, комітовані у напрямку В-лімфопоезу клітини (в нашому дослідження 33 з 35 хворих на ГЛЛ “загального типу” - 94,3%).

Характеристика ГЛЛ Т-клітинного похождення з мінімальними ознаками диференціювання бластів.

У 31 обстеженого встановлено діагноз Т-ГЛЛ. Загальними цитохімічними ознаками бластів були відсутність активності МПО, ХАЕ, локальна реакція на КФ і, в ряді випадків, КНЕ; слабка реакція на НЕ, нечутлива до дії фториду натрію; гранулярна PAS-реакція. За антигенною експресією розрізняли 4 варіанти захворювання (табл. 2).

Таблиця 2. Характеристика обстежених хворих з Т-ГЛЛ та критерії виділення варіантів захворювання

Складності діагностики виникли в одному випадку. У хворого Б-к, 15 років, з попереднім діагнозом ГЛ, при обстеженні був виявлений гіперлейкоцитоз (75,8 х 10⁹/л, вміст бластів - 91%), тотальне заміщення кісткового мозку бластними клітинами L2 за ФАБ-класифікацією, рентгенологічно тінь в передньому середостінні. Бластні клітини експресували, крім Т-клітинних антигенів (CD3, CD5, CD7, CD4, CD8), також HLA-DR і мієлоїдний антиген CD14, активність КФ виявлялась у вигляді дрібних гранул (що нехарактерно для Т-лімфобластів), PAS-реакція була гранулярною. При цитогенетичному дослідженні (проведено к.м.н. Андреєвою С.В., Київский НДІ гематології і переливання крові МОЗ України) виявлена хромосомна аномалія t(2;11)(q33;p13). Ми не знайшли її опису в доступній літературі, однак відомо, що в області 11р13 локалізований ген RBTN2, реаранжування якого відбувається при Т-ГЛЛ (Scott C. et al., 1993). Ми провели короткотермінове культивування бластних клітин хворого в середовищі RPMI 1640 с додаванням супернатанту ФГА-стимульованих лімфоцитів донора. Це призвело до кластероутворювання і експресії додатково антигенів CD34, CD33, CD13.

На основі комплексної оцінки у хворого був встановлений діагноз Т1-ГЛЛ. Диференційний діагноз з ГМЛ проводили за такими ознаками: експресія на бластах антигену CD3, що відмічено при ГМЛ; відсутність антигенів CD13, CD33, CD34 при первинному обстеженні хворого; ізольована експресія CD14; хромосомна транслокація 11р13, яка спостерігається при Т-ГЛЛ.

Характеристика ГМЛ з мінімальними ознаками диференціювання

Обстежено 340 хворих (44 дитини і 296 дорослих) з різними формами ГМЛ (табл.3). Мінімальні ознаки диференціювання бластів спостерігали при М0, М5а, М6 і М7 ФАБ-варіантах захворювання.

Характеристика ГМЛ М0. Діагноз ГМЛ М0 був встановлений у 2 хворих. У них знайдено тотальне заміщення кістового мозку бластними клітинами типу L1-L2, які не мали активності ферментів, крім МПО в 2% і 3% клітин. У хворого Д-к бласти експресували CD34, CD117 (c-kit, рецептор фактору росту стовбурових клітин), TdT, HLA-DR, CD7, CD13, CD33, CD64 та МПО. У хворого П-ко - CD34, HLA-DR, CD33, CD13, CD10 та МПО.

Таблиця 3. ФАБ-варіанти ГМЛ в групі обстежених хворих

При диференційній діагностиці з ГЛЛ головними ознаками були присутність МПО, стабільна експресія антигенів CD34, CD33, CD13 при відсутності В-ассоційованих антигенів (крім CD10), цитохімічна інертність клітин. Відмінностями від ГМЛ М6 і ОМЛ М7 були: склад кістково-мозкового пунктату (>95% бластів); цитохімічна інертність бластівв; відсутність антигенів еритропоезу та мегакаріоцитопоезу; присутність МПО та тріади антигенів CD34-CD13-CD33.

Характеристика ГМЛ М5а. Серед 82 обстежених пацієнтів з ГМЛ М5 ми виділили групу з 4 пацієнтів, у яких більшість бластних клітин відповідала лімфобластам типу L2; активність НЕ, КФ і КНЕ була відсутня або слабка (вміст бластів із слабкою активністю КНЕ варіював від 12 до 38%), PAS-реакція була негативною або слабко дифузною. У 2 хворих 5% і 16% бластних клітин мали активність МПО.

Фенотипові і цитогенетичні ознаки бластів були такими:

а) хворий Ж-к, 7 років, - CD34⁺CD38^-CD45RA^lowcyHLA-DR⁺cyCD7⁺ (де “cy” - експресія антигена в цитоплазмі), каріотип без змін;

б) хворий Р-ка, 12 років, - CD34^-CD38^-cyHLA-DR⁺cyCD7⁺CD15⁺, гіподиплоїдія (32-42, xy);

в) хворий Д-ц, 61 рік, - CD34^-sHLA-DR⁺cyCD7⁺ (де s - експресія антигена на поверхневих мембранах), мінорна популяція CD15⁺CD13⁺CD14⁺, нормальний каріотип;

г) хворий Г-ко, 4 роки, - CD34^-CD45RA⁺cyHLA-DR⁺CD7^-CD15⁺ (мінорна популяція CD14⁺), нормальний каріотип. Інши антигени були відсутні.

Таким чином, у цих хворих бластні клітини відповідали раннім гемопоетичним клітинам-попередникам. Про часткову диференціацію у напрямку моноцитопоезу свідчила присутність невеликої кількості CD14⁺ бластів з активністю КНЕ і НЕ, гранулярна PAS-реакція на фоні дифузного забарвлення цитоплазми; нетипова для ГЛЛ експресія антигенів HLA-DR і CD7 в цитоплазмі клітин. Диференційний діагноз проводили з М0 ГМЛ (негативна реакція на МПО), з Т-ГЛЛ (відсутність експресії Т-клітинних антигенів, крім CD7), з ГЛЛ В-клітинного походження (відсутність експресії антигенів диференціювання В-лімфобластів).

Фенотипові ознаки бластів були дуже подібними до описаного вище ГЛ з фенотипом стовбурової гемопоетичної клітини, розрізняючись тільки присутністю мінорної популяції монобластів та цитоплазматичною експресією антигену СD7. У зв`язку з цим виникає питання, чи не є ці варіанти захворювання результатом злоякісної трансформації існуючих в нормі загальних клітин-попередників моноцитів і В-лімфоцитів, дещо відрізняючись за спрямованістю диференціювання? Існування таких біпотентних клітин-попередників показано в ембріональній печінці мишей (Оgawa M, 1993).

Ми проаналізували частоту експресії CD7 антигену при різних варіантах ГМЛ (табл. 4). В групі хворих з ГМЛ експресія CD7 антигену знайдена в 30,9% випадків, що співпадає з даними інших дослідників (Miwa H. et al., 1996). Серед хворих з ГЛЛ В-клітинного походження був виявлений тільки один CD7⁺ випадок захворювання (ГЛЛ “загального типу”). В зв`язку з цим ми вважаємо можливим використовувати визначення антигену CD7 для диференційного діагнозу ГЛЛ і ГМЛ з мінімальними ознаками диференціювання бластів.

Таблиця 4. Частота експресії антигену CD7 при окремих ФАБ варіантах ГЛ

Характеристика ГМЛ М6. Ми спостерігали 15 хворих з ГМЛ М6. У 9 пацієнтів діагноз захворювання був встановлений на основі цитоморфологічних і цитохімічних ознак. У 6 хворих (3 міс - 12 р.) в кістковомозковому пунктаті була знайдена мономорфна інфільтрація бластними клітинами типу L1. Активність МПО і ХАЕ була відсутня; КФ, КНЕ і НЕ у 4 хворих була локальна, а у 2 - відсутня; PAS-реакція -гранулярна. В зв`язку з цим необхідним було проведення диференційного діагнозу з ГЛЛ. У всіх 6 дітей бласти не експресували МПО, антигени В- (CD19, CD20, CD22, CD10, легкі і важкі ланцюги Ig) і Т-лімфоцитів (CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8), але реагували з мкАТ до глікофорину А, HLA-DR, CD33. Крім того, у 3 хворих знайдена експресія CD71 и CD13. Це дало можливість встановити діагноз ГМЛ М5b, що було неможливо без проведення імунофенотипування.

Характеристика ГМЛ М7. ГМЛ М7 - рідкісний варіант ГЛ, включений до ФАБ-класифікації в 1985 р. (Bennett J. et at, 1985). Ми спостерігали 4 хворих з ГМЛ М7. Бластні клітини відповідали лімфобластам L2; не мали активності МПО, ХАЕ; PAS-реакція була негативна; КФ і КНЕ слабка. У одного хворого субстратні клітини відповідали промегакаріобластам (sHLA-DR⁺s CD33⁺cyCD61⁺cyCD41⁺), у інших характеризувались більш зрілим імунофенотипом: CD61⁺CD41⁺HLA-DR^-CD34^-CD33^lowCD13^low (1 хворий) та CD34^-HLA-DR^-CD61⁺CD41⁺CD42⁺ (2 хворих).

Таким чином, при обстеженні хворих з ГМЛ діагностичні складності були пов`язані з мінімальними ознаками диференціації бластних клітин: лімфобластоподібною морфологією, негативною реакцією на МПО, експресією обмеженої кількості лінійноспецифічних антигенів.

Крім того, нами вперше в Україні був діагностований випадок ГЛ, який виник з клітин-попередників НК і мієлобластів (в літературі описаний Suzuki R. і співавт. в 1995 р.). L2 бластні клітини реагували з мкАТ до антигенів CD34, CD33, CD13, CD56 і CD7, активність МПО і КНЕ була відсутня, КФ - слабка, PAS-реакція дифузна. Можливим аналогом бластних клітин у двох інших хворих були біпотентні клітини-попередники НК та Т-лімфобластів: експресія маркерів комітації (HLA-DR і CD38), антигенів CD7, CD33, та CD3 в цитоплазмі при відсутності інших антигенів. Ще у 1 хворого, у якого при попередньому обстеженні діагностовано Т1-ГЛЛ, при імуноцитохімічному аналізі встановлено інший варіант - Т4-ГЛЛ з фенотипом бластів CD7⁺CD45RO⁺CD34⁺суCD3⁺ТCR⁺.

Основний висновок роботи полягає в тому, що у всіх випадках пероксидазонегативних ГЛ необхідне проведення імунофенотипування, що дозволяє правильно визначити походження злоякісно трансформованих клітин та встановити точний діагноз захворювання. Крім того, вивчення рідкісних фенотипових випадків ГЛ є важливим для вивчення процесів диференціювання гемопоетичних клітин, що відбуваються в нормі. Отримані нами дані дозволяють поставити питання про існування біпотентних клітин-попередників В-лімфоцитів та моноцитів/макрофагів; біпотентних клітин-попередників НК та мієлобластів, НК та Т-лімфобластів; біфазну експресію антигену СD10 в процесі розвитку В-лімфоцитів в нормі.

Висновки

Діагностика гострих лейкемій з мінімальними ознаками диференціювання бластів (М0, М5а, М6 і М7 ГМЛ) можлива тільки на основі комплексного вивчення морфологічних, цитохімічних і антигенних ознак злоякісно трансформованих кровотворних клітин.

Показано, що випадки гострої лейкемії з мінімальною (3-5%) кількістю пероксидазопозитивних бластних клітин можуть відноситись як до лейкемій мієлоїдного походження (М0 і М5а ГМЛ), так і до ГЛЛ В-клітинного походження. Запропоновано критерії їх диференційного діагнозу, як додатковий критерій - визначення експресії антигену CD7.

Ідентифіковано рідкісні варіанти ГЛЛ з фенотипом стовбурової гемопоетичної клітини, з асинхронною експресією В-асоційованих антигенів, проаналізований їх зв`язок з процесами диференціювання клітин-попередників лімфопоезу в нормі.

Охарактеризовано варіант гострої лейкемії, що виникає з клітин-попередників натуральних кілерів (НК) і мієлоїдних клітин.

Вперше описано випадок ГЛЛ Т-клітинного походження з транслокацією t(2;11) і атиповою експресією мієлоїдних антигенів.

Використання широкої панелі антитіл до антигенів диференціювання дозволило виявити гетерогенність Т1 варіанту ГЛЛ Т-клітинного походження. В цю групу захворювань, при яких бластні клітини характеризуються близькими цитохімічними ознаками і ідентичною експресією антигенів CD3, CD4, CD7, CD8, можуть входити як власне Т1-ГЛЛ, Т4-ГЛЛ, так і, можливо, ГЛ з загальних клітин-попередників Т-лімфоцитів і НК.

Поліпшення діагностики гострих лейкемій з мінімальними ознаками диференціювання бластів полягає в тому, що запропонований комплекс маркерів дозволяє розрізнити окремі варіанти у тих випадках гострих лейкемій, які раніше розглядались як однорідна група “недиференційованих лейкемій”, крім того, в процесі виконання досліджень ідентифіковано нові імунологічні підтипи захворювання. Отримані дані дозволяють визначити точне клітинне походження бластів та призначити хворому адекватну схему поліхіміотерапії, яка суттєво відрізняється при лімфобластних та мієлобластних гострих лейкеміях, а також при ГЛЛ В- та Т-клітинного походження.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Абраменко И.В., Глузман Д.Ф., Надгорная В.А., Скляренко Л.М., Белоус Н.И., Хруб К.Ю. Морфоцитохимические особенности острых лейкозов у детей, проживающих на загрязненных территориях Житомирской области // Онкология. - 1999. - № 1. - С. 29-35.

2. Абраменко И.В., Глузман Д.Ф., Надгорная В.А., Скляренко Л.М., Белоус Н.И., Хруб К.Ю. Современные принципы диагностики острых лейкозов миелоидного происхождения // Онкология. - 1999. - № 2. - С. 112-121.

3. Глузман Д.Ф., Надгорная В.А., Яременко С.В., Хруб К.Ю. Иммунофенотипическая классификация острых лимфобластных лейкозов // Лабораторная диагностика. - 1999. - № 2. - С. 16-20.

4. Глузман Д.Ф., Надгорная В.А., Яременко С.В., Хруб К.Ю. Иммуноферментный цитохимический метод диагностики лейкозов и метастазов опухолей // Лабораторная диагностика. - 1999. - № 3. - С. 55-62.

Размещено на Allbest.ru