Размещено на http://www.allbest.ru/

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ

ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ УААН

УДК 619:616.98:579.842.14:616-084

Дідок Юлія Валентинівна

Фімбріальні адгезини сальмонел та їх використання при

конструюванні засобів специфічної профілактики

сальмонельозу тварин

16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Харків - 2001

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано в лабораторії вивчення бактеріальних хвороб молодняка Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини Української академії аграрних наук.

Науковий керівник: доктор ветеринарних наук, старший науковий співробітник, Головко Анатолій Миколайович, Державний науково-контрольний інститут біотехнології і штамів мікроорганізмів Міністерства аграрної політики України, директор інституту

Офіційні опоненти:

доктор ветеринарних наук, старший науковий співробітник Волинець Леонід Кузьмич, Інститут ветеринарної медицини УААН, завідувач лабораторії ветсанекспертизи

кандидат біологічних наук Трускова Тетяна Юріївна, Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, завідувач лабораторії технологій виготовлення ветбіопрепаратів

Провідна установа:

Національний аграрний університет, кафедра мікробіології та вірусології Кабінету Міністрів України, м.Київ

Захист відбудеться “27” квітня 2001 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 в Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою: 61023, м.Харків, вул.Пушкінська 83.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, м.Харків, вул.Пушкінська 83.

Автореферат розісланий “26” березня 2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор ветеринарних наук, професор Конаржевський К.Є.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема сальмонельозу - одного з найбільш поширених зоонозних захворювань, яке реєструється майже в усіх країнах світу, в тому числі в Україні, продовжує залишатись актуальною для ветеринарної науки та практики. Сальмонельоз молодняку сільськогосподарських тварин має широке розповсюдження і завдає значних економічних збитків тваринницьким господарствам.

На сучасному етапі боротьби з цим захворюванням найбільш економічно виправданим та ефективним заходом є проведення масових профілактичних обробок тварин. Саме тому велике значення має подальше удосконалення існуючих та створення нових ефективних засобів специфічної профілактики сальмонельозу.

На засіданні комітету експертів ВООЗ по боротьбі з сальмонельозом (1991) рекомендовано особливу увагу приділяти конструюванню субодиничних імунізуючих препаратів на основі факторів патогенності збудника.

Одним з основних факторів патогенності сальмонел є адгезивність - спроможність продукувати біологічні субстанції (фімбрії, фімбріальні адгезини), які забезпечують адгезію і колонізацію епітеліальної тканини кишечнику. Фімбріальні адгезини виконують в життєдіяльності бактерій також інші важливі функції, наприклад, дозволяють протистояти впливу таких бар'єрів захисту макроорганізму, як перистальтичні рухи та секрети слизової оболонки.

Фімбрії грамнегативних бактерій - органели, що локалізуються на поверхні бактеріальної клітини. Здатність до експресії фімбрій корелює з вірулентністю бактерій (Далина А.М., 1989; Головко А.М., 1996; Полоцький Ю.Е., Авдеєва Т.А., 1981; Thorns S.J., 1995). Це робить можливим використання вилучених з бактеріальних клітин фімбріальних адгезинів як носіїв антигенних детермінант при створенні нових засобів імунопрофілактики і терапії сальмонельозу.

Питання можливості застосування фімбрій сальмонел в імунопрофілактиці захворювань сальмонельозної етіології, за даними зарубіжної літератури, є маловивченим, а в Україні розробляється вперше. Отже, дослідження факторів патогенності сальмонел, зокрема фімбріальних адгезинів, має як теоретичне, так і практичне значення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є складовою частиною досліджень, передбачених тематичним планом ІЕКВМ УААН (№ державної реєстрації 0197U000757).

Мета і задачі досліджень. Мета роботи - визначити наявність фімбріальних адгезинів у сальмонел і розробити засоби специфічної профілактики сальмонельозу на їх основі. Основні задачі досліджень:

вивчити епізоотичну ситуацію щодо сальмонельозу молодняку сільськогосподарських тварин у тваринницьких господарствах Харківської області;

виділити збудників сальмонельозу із патологічного матеріалу різних видів тварин та дослідити їх біологічні властивості;

визначити частоту наявності фімбріальних адгезинів у польових ізолятів сальмонел;

дослідити антигенну спорідненість фімбрій у сальмонел та ешерихій;

визначити можливість передачі плазмід, що кодують синтез фімбрій, від ешерихій сальмонелам;

дослідити біологічні та фізико-хімічні властивості фімбріальних адгезинів сальмонел;

визначити імуногенні властивості фімбріальних адгезинів сальмонел;

розробити спосіб виготовлення сироватки проти сальмонельозу та ешерихіозу молодняку тварин;

вивчити лікувально-профілактичну ефективність сироватки проти сальмонельозу та ешерихіозу в лабораторних та виробничих умовах;

розробити нормативно-технічну документацію на сироватку антитоксичну та антиадгезивну проти сальмонельозу та ешерихіозу тварин.

Об'єкт дослідження: фактори патогенності збудника сальмонельозу та засоби специфічної профілактики на їх основі.

Предмет дослідження: морфологічні, фізико-хімічні та імуногенні властивості фімбріальних адгезинів сальмонел.

Методи дослідження: Виділення та ідентифікацію культур сальмонел здійснювали згідно з методичними вказівками "Лабораторная диагностика сальмонеллезов человека и животных, обнаружение сальмонелл в кормах, продуктах питания и объектах внешней среды" (Москва, 1990). Адгезивні властивості сальмонел вивчали в реакції гемаглютинації, реакції манозорезистентної гемаглютинації та методом електронної мікроскопії. Отримання фімбріальних адгезинів, відокремлених від бактеріальних клітин, проводили за Головком А.М. (1996), визначення їх хімічної природи та імуногенних властивостей - за допомогою загальноприйнятих біохімічних та імунологічних методів.

Наукова новизна отриманих результатів. Проведено вивчення ступеня розповсюдження сальмонельозу молодняку сільськогосподарських тварин у тваринницьких господарствах Харківської області та динаміки епізоотичного процесу. Визначено наявність у сальмонел фімбріальних адгезинів, розроблено методи їх отримання і очищення, досліджено фізико-хімічні властивості. Встановлено можливість передачі плазмід, які кодують синтез фімбріальних адгезинів, поміж родами Salmonella та Escheriсhia ентеробактерій. Розроблено спосіб виготовлення сироватки антитоксичної та антиадгезивної проти сальмонельозу та ешерихіозу тварин. Наукова новизна та пріоритет досліджень підтверджені деклараційним патентом на винахід.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено технологію виготовлення та вироблено дослідну серію “Сироватки антитоксичної та антиадгезивної проти сальмонельозу та ешерихіозу тварин” (сироватки ААСЕ) на Гожулівській біофабриці. Розроблено нормативну документацію: технічні умови на дослідну серію, настанову по застосуванню (затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України), інструкцію по виготовленню і контролю сироватки ААСЕ.

Особистий внесок здобувача. Експериментальні дослідження, аналіз отриманих результатів та їх узагальнення виконані дисертантом особисто. Біохімічні дослідження проводилися спільно із співробітниками лабораторії біохімії ІЕКВМ УААН (Антонов В.С., Романько М.Є., Долгая М.М.). Електронномікроскопічні дослідження виконувались спільно із В.О.Ушкаловим, В.Н.Коноваловим. При відборі штамів сальмонел за токсигенними властивостями були використані результати досліджень, проведених канд.вет.наук В.О.Ушкаловим (ІЕКВМ УААН).

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були повідомлені та обговорені на звітних сесіях вченої ради ІЕКВМ УААН (м.Харків,1998-2000) та наукових конференціях: “Інфекційна патологія молодняку сільськогосподарських тварин і птиці” (Сумський державний аграрний університет, м.Суми, 1999); “Стан та перспективи розвитку ветеринарної науки” (Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, м.Харків, 1999); “Ветеринарна наука на порозі 21 століття” (Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, м.Харків, 2000).

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 7 наукових праць.

Структура дисертації. Дисертація викладена на 139 сторінках машинописного тексту і складається з таких розділів: вступ, огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати власних досліджень, аналіз та узагальнення одержаних результатів, висновки, список використаної літератури, додатки. Роботу ілюстровано 21 таблицею, 7 рисунками, 3 фотознімками. Список використаних літературних джерел включає 177 найменувань, в тому числі 101 - зарубіжних авторів.

сальмонельоз фімбріальні імуногенні адгезини

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Епізоотичну ситуацію оцінювали шляхом аналізу та узагальнення звітних матеріалів за формами статистичної звітності обласного управління та лабораторії державної ветеринарної медицини (м.Харків). Визначення адгезивних властивостей сальмонел проводили в реакції гемаглютинації (РГА) та реакції манозо-резистентної гемаглютинації (РМРГА) з еритроцитами морської свинки, білих мишей, барана, свині та бика (Головко А.М. із співавт., 1989р). Електронно-мікроскопічні дослідження проводили з використанням електронного мікроскопа ЕМВ-100 Л. Вплив температури культивування та складу живильних середовищ на рівень експресії сальмонелами фімбрій визначали шляхом культивування штамів сальмонел у різних температурних режимах на середовищах Мінка та УНДІЕВ, МПБ та МПА, після чого вивчали адгезивні властивості культур в РГА та РМРГА з еритроцитами свині. Наявність у штамів сальмонел фімбрій гомологічних до фімбрій E.coli визначали в РА з моноспецифічними антиадгезивними сироватками ешерихій (типи К99, Att25, 987p, К88ac).

Вивчення можливості передачі плазмід, які кодують синтез фімбрій, від ешерихій до сальмонел проводили шляхом схрещування бактерій у рідкому середовищі за методом Д. Г. Кудлай (1977). Отримання препаратів фімбріальних адгезинів здійснювали за методикою А.М. Головка (1996).

Імуногенні властивості фімбріальних адгезинів сальмонел вивчали в моделі активного захисту мишей після двократної імунізації препаратами фімбріальних адгезинів та за спроможністю стимулювати вироблення специфічних антитіл. У сироватках крові білих мишей визначали титр специфічних антитіл за допомогою розгорнутої РА з вихідними культурами сальмонел, з яких були одержані фімбріальні антигени (Меньшиков В.В.,1987).

З метою визначення фізико-хімічних властивостей у препаратах фімбріальних адгезинів досліджували вміст загального білка колориметричним методом за Лоурі в модифікації Міллера (Miller G.L.,1959), вміст загальних ліпідів - методом Ілька (Остерман Л.А.,1981), вміст вуглеводів - колориметрично за кольоровою реакцією з орто-толуїдином (Меньшиков В.В.,1987), оптичні властивості - спектрофотометричним методом (Демченко А.П.,1981), електрокінетичні властивості (Виноградова та ін., 1983), молекулярну масу (Кучеренко Н.Е. та ін.,1988). Перевірку гомогенності фімбріальних адгезинів та їх очистку здійснювали фракціонуванням за допомогою гель-проникаючої хроматографії на сефадексі G-200 (Кондрахін І.П. та ін., 1985).

Статистичну обробку даних проводили за допомогою комп'ютера IBM PC з використанням програми ветеринарної статистики.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Епізоотологія сальмонельозу телят і поросят у тваринницьких господарствах Харківської області

При вивченні динаміки виявлення нових неблагополучних пунктів щодо сальмонельозу телят і поросят у Харківській області було встановлено, що максимальна реєстрація кількості нових неблагополучних пунктів щодо сальмонельозу як поросят, так і телят припадала на 1991-1992 (відповідно 83 та 41) і 1995 роки (89 та 38 неблагополучних пунктів). Мінімальну кількість нових неблагополучних пунктів щодо сальмонельозу телят було зареєстровано у 1999 році (10), а щодо сальмонельозу поросят - у 1997 році (16).

Аналіз результатів лабораторних досліджень щодо виділення збудників сальмонельозу (табл.1) свідчить, що середньорічне виділення збудників сальмонельозу телят протягом даного періоду становило 5,2%, а середньорічне виділення збудників сальмонельозу поросят - 9,1%.

Таблиця 1. Інтенсивність виділення збудників сальмонельозу великої рогатої худоби та свиней у період з 1990 по 1999 р. в тваринницьких господарствах Харківської області

Роки	Велика рогата худоба	Свині
	Проведено досліджень	Одержано позитивних результатів	Проведено досліджень	Одержано позитивних результатів
		кількість	%		кількість	%
1990	2774	134	4,8	4761	385	8,1
1991	2735	159	5,8	5497	495	9,0
1992	3271	228	6,9	4551	290	6,4
1993	3153	126	3,9	4828	500	10,3
1994	2870	168	5,8	5224	554	10,6
1995	2875	166	5,7	6687	671	10,0
1996	3305	159	4,8	5715	379	6,6
1997	3940	207	5,2	3591	283	7,9
1998	2233	109	4,8	2572	174	6,7
1999	1888	75	3,9	2320	346	14,9
M ± m	2904,4 ± 171,5	153,1 ± 14,1	5,2 ± 0,3	4574,6 ± 440,1	407,7 ± 49,3	9,1 ± 0,7

При визначенні питомої ваги різних сероварів сальмонел в етіології сальмонельозу тварин на території Харківської області за період з 1990 по 1999 роки було встановлено, що у поросят превалювала S.choleraesuis (рис.1), а сальмонельоз телят найчастіше обумовлювала S.dublin (рис.2).

Найменшу питому вагу серед сероварів, визнаних патогенними для телят і поросят, займала S.typhimurium.

За останніми відомостями рід Salmonella нараховує близько 2500 серологічних варіантів. На території України, за статистичними даними, зареєстровано 17 сероваріантів сальмонел, тому стає очевидною неможливість створення ефективних засобів захисту тварин проти даного захворювання шляхом врахування різноманітності сероварів. Виникає необхідність використання інших підходів.

У результаті проведення бактеріологічних досліджень патматеріалу від загиблих телят і поросят було виділено та ідентифіковано 39 культур сальмонел, віднесених до 12 сероварів. Ці культури були використані при проведенні подальших досліджень.

Рис. 1. Питома вага різних сероварів сальмонел у виникненні сальмонельозів поросят

Рис. 2. Питома вага різних сероварів сальмонел у виникненні сальмонельозів телят

Визначення адгезивних властивостей культур сальмонел, виділених із патологічного матеріалу від різних видів тварин

Проведеними дослідженнями встановлено, що 36 (92,3%) культур здатні аглютинувати еритроцити різних видів тварин, що свідчить про наявність у них манозочутливих та/або манозостійких типів фімбрій. При цьому 28 (71,8%) культур мали в своїй структурі обидва типи фімбріальних адгезинів, а решта - тільки манозочутливі або манозостійкі. У 3 (7,7%) культур адгезивні властивості були відсутні.

Здатність сальмонел аглютинувати еритроцити різних видів тварин свідчить, що найчастіше ця властивість проявляється по відношенню до еритроцитів свині (табл.2). Це може бути обумовлено більшою кількістю або специфічністю рецепторів на поверхні еритроцитів даного виду тварин.

Таблиця 2. Гемаглютинаційні властивості культур сальмонел відносно еритроцитів різних видів тварин

Еритроцити тварин	Позитивно реагуючі культури в:
	РГА	РМРГА
	кількість	%	кількість	%
морської свинки	11	28,2	4	10,2
білих мишей	14	35,8	4	10,2
бика	1	2,5	2	5,1
свині	29	74,4	30	76,9
барана	2	5,1	5	12,8

Залежності між здатністю різних сероварів сальмонел аглютинувати еритроцити певного виду тварин виявлено не було.

У результаті проведених електронномікроскопічних досліджень на поверхні клітин сальмонел, які виявили адгезивні властивості, було встановлено наявність ниткоподібних структур, згорнених у клубки, які рівномірно покривають поверхню клітини.

Підбір живильних середовищ та режимів культивування для забезпечення максимального рівня експресії адгезинів

Синтез фімбріальних адгезинів залежить від умов культивування. З метою пошуку оптимальних живильних середовищ для культивування сальмонел з фімбріальними адгезинами було випробовано середовища УНДІЕВ, Мінка, МПБ та МПА. Найбільш високий рівень експресії манозочутливих та манозостійких адгезинів бактеріальними клітинами досліджених штамів сальмонел (n=6) відмічався після культивування на м'ясопептонних середовищах, про що свідчили гемаглютинаційні титри 3,84+1,40 log2 та 5,83+0,90 log2 відповідно. Менш придатними виявили себе середовища Мінка та УНДІЕВ, оскільки результати РГА та РМРГА були негативними або реєструвалися в низьких титрах, що говорить про зменшення здатності сальмонел експресувати манозочутливі та манозостійкі типи фімбрій при культивуванні на цих середовищах.

Максимальний рівень експресії манозочутливих та манозостійких фімбрій спостерігали після культивування на м'ясопептонних середовищах, що зумовило використання їх в подальшій роботі.

Для визначення впливу температури на здатність продукувати фімбріальні адгезини проводили культивування сальмонел у МПБ при 18⁰С та при 37⁰С протягом 18 годин, потім пересівали на МПА і культивували в тих самих режимах. Після цього культури досліджували в РГА та РМРГА з еритроцитами свині.

Встановлено, що культивування при температурі 18⁰С призводить до пригнічення спроможності сальмонел продукувати фімбрії. Так, після культивування ізолятів з високою гемаглютинаційною активністю (титри РГА та РМРГА від 3 log₂ до 6 log₂) при 18⁰С їх спроможність викликати аглютинацію еритроцитів значно знижувалась або повністю зникала (титри 1-1,5 log₂, відсутність аглютинації). Максимальний рівень експресії манозостійких та манозочутливих фімбріальних адгезинів сальмонел спостерігали при температурі 37⁰С (титри 5-6 log₂).

Характеристика фізико-хімічних властивостей фімбріальних адгезинів сальмонел

Для визначення фізико-хімічних властивостей та складу фімбріальних адгезинів з культур сальмонел, що мали найбільш виражені адгезивні властивості, були отримані препарати фімбрій.

У результаті проведених досліджень було встановлено, що фімбріальні адгезини різних сероварів сальмонел є глікопротеїнами. В складі досліджуваних препаратів було виявлено значну кількість вуглеводів та білків (табл.3).

Ізоелектричні точки фімбріальних адгезинів сальмонел знаходяться в межах 4,4-5,0 pH, що притаманно білкам кислої природи: S.typhimurium №4, S.abortus ovis №19 - pH 4,4; S.choleraesuis № 3, S.dublin №12, S.virchov №31, S.enteritidis №34 - 4,7; S.dublin №17, S.newlands №2 - 5,0.

Максимум поглинання в ультрафіолетовому спектрі фімбріальними адгезинами спостерігали в діапазоні 190-230 нм, що свідчить про наявність у складі поліпептидного ланцюга даних білків циклічних амінокислот - тирозину, триптофану, фенілаланіну та ін.

Результати електрофорезу в градієнті 5-20% ПААГ показали, що фімбріальні адгезини сальмонел розділились на чотири фракції. Основна молекулярна маса білкових субодиниць фімбрій знаходилась в межах 18 кДа. Адгезини, одержані із штаму S.typhimurium №4, мали дві додаткові фракції, молекулярна маса яких знаходилась в межах 70-90 кДа.

Результати встановлення меж характеристичної в'язкості дозволили охарактеризувати досліджувані білки за формою як некомпактні структури, що наближаються до статичних клубків. Це співпадає з даними, отриманими в ході електронномікроскопічних досліджень, що підтверджує достовірність отриманих результатів.

Таблиця 3. Фізико-хімічні властивості фімбріальних адгезинів різних сероварів сальмонел

Культури сальмонел, які використовували для одержання препаратів фімбрій	П О К А З Н И К И
	Кількість фракцій	Хімічний склад	Характе- ристична в'язкість дцл/г	max ЕМ в УФ-спектрі, л= 260 нм
		Загальний білок, ммоль/л	Загальні ліпіди, ммоль/моль білку	Загальні вуглеводи ммоль/моль білку
S.newlands № 2	4	0,31	сліди	2,28	0,045	0,6
S.choleraesuis № 3	4	0,30	сліди	3,57	0,050	0,8
S.typhimurium №4	6	0,29	сліди	5,37	0,050	0,6
S.dublin №12	4	0,48	сліди	3,90	0,035	0,8
S.abortus ovis №19	4	0,59	сліди	4,19	0,030	0,6
S.dublin №17	4	0,22	сліди	4,75	0,050	0,7
S.virchov №31	4	0,24	сліди	9,07	0,060	0,6
S.enteritidis №34	4	0,38	сліди	4,83	0,040	0,8

Вивчення імуногенних властивостей фімбріальних адгезинів сальмонел

Були вивчені імуногенні властивості культур, у яких попередніми дослідженнями встановили високу адгезивну активність. Для цього безпородних білих мишей масою 14-16 г імунізували субодиничними антигенами фімбріальних адгезинів сальмонел підшкірно, в дозі 0,3 см³, двократно, з інтервалом між ін'єкціями 14 діб. Через 15 діб після другої імунізації частину мишей знекровлювали, а в отриманих сироватках крові визначали титр антиадгезивних антитіл. Решту мишей заражали летальними дозами (ЛД₁₀₀=100000 мк.кл.) гомологічних і гетерологічних штамів сальмонел та вели за ними спостереження протягом 3 діб. За кількістю мишей, що залишились живими, оцінювали рівень захисту, який забезпечує імунізація препаратами фімбрій.

Отримані результати (табл.4) свідчать, що титри антитіл у сироватках крові мишей, імунізованих препаратами фімбріальних адгезинів, були вірогідно вищими за цей показник у тварин дослідної групи.

Таблиця 4. Результати дослідження сироваток крові білих мишей, імунізованих антигенами фімбрій сальмонел (n=10)

Фімбріальні адгезини сальмонел	Титр специфічних антитіл у log2 (M+m)
S.choleraesuis №3	5,0+0,3
S.dublin № 12	6,8+0,2
S.enteritidis №34	7,2+0,3
S.choleraesuis v.kunzendorf №43	4,6+0,3
S.typhimurium №16	6,5+0,3
Нещеплені миші	0

Найбільш високі титри антитіл спостерігали у сироватках крові мишей, імунізованих препаратами фімбрій, отриманими із штамів S.enteritidis №34, S.dublin № 12 та S.typhimurium №16, що вказує на виражену імуногенну активність даних препаратів.

Результати вивчення імуногенних властивостей субодиничних фімбріальних адгезинів показали, що рівень захисту імунізованих тварин від летальних доз гомологічних та гетерологічних штамів сальмонел становив 40-80% при 100% загибелі нещеплених мишей. Найбільший рівень захисту мишей забезпечували фімбріальні антигени, одержані із культур S.dublin №12 та S.enteritidis №34, оскільки після зараження гомологічними штамами тварин, імунізованих даним препаратом, живими лишалось 70% та 80% мишей, а після зараження гетерологічними штамами -75 та 60% відповідно. Високі імуногенні властивості мав препарат, отриманий із культури S.typhimurium №16, який забезпечував 65% та 60% захисту імунізованих тварин при зараженні летальними дозами гомологічних та гетерологічних сероварів. Менший захист спостерігали в групах тварин, щеплених фімбріальними антигенами, отриманими із культур S.choleraesuis №3 та S.choleraesuis v.kunzendorf №43 (40-50%).

Вивчення антигенної спорідненості фімбріальних адгезинів бактерій родів Salmonella та Е.coli

Для виявлення наявності у сальмонел фімбріальних адгезинів, які гомологічні за антигенними властивостями фімбріям ешерихій, 8-годинні бульйонні культури сальмонел досліджували в РА з моноспецифічними антиадгезивними ешерихіозними сироватками К99, Att25, F41, К88aс.

У результаті проведеного дослідження серед 39 культур сальмонел були виявлені такі, що мають антигенну спорідненість з адгезинами Е.coli вищезазначених типів (табл.5).

Таблиця 5. Антигенна спорідненість фімбріальних адгезинів ешерихій і сальмонел за результатами РА

Типи фімбріальних адгезинів E.coli	Культури сальмонел
	Досліджено	Виявлено із спорідненими фімбріями
К99	39	3 (7,6 %)
Att25	39	4 (10,2%)
F41	39	5 (12,6%)
К88aс	39	1 (2,5%)

Слід підкреслити, що антигенна спорідненість фімбрій сальмонел з аналогічними структурами ешерихій була виявлена у 71,4% культур, що належать до серовару S.typhimurium, у 10% культур серовару S.dublin, у 28,6% культур S.choleraesuis, S.breslau, S.heidelberg, S.choleraesuis var.kunzendorf та S.newlands. При цьому культура S.breslau експресувала одночасно фімбрії, споріднені з типами Att25 та F41. У S.abortus ovis, S.pullorum-gallinarum, S.virchov та S.enteritidis не були виявлені фімбріальні адгезини, споріднені з цими структурами E.coli. Отримані результати дали поштовх дослідженням по визначенню можливості передачі плазмід, які кодують синтез адгезинів, від ешерихій сальмонелам.

Виявлення можливості передачі плазмід, які кодують синтез фімбрій, від ешерихій до сальмонел

Дослідженнями багатьох вчених доведено, що синтез фімбрій кодується плазмідами, які є позахромосомним фактором спадковості і можуть передаватися від однієї бактерії до іншої (Брода П., 1982; Кудлай Д.Г., 1977). Для визначення можливості передачі плазмід, що кодують синтез фімбрій, від ешерихій до сальмонел використали культури сальмонел, у яких попередніми дослідженнями не були виявлені адгезини E.coli. Ці культури схрещували з культурами ешерихій, які експресують фімбрії К99, Att25, F41 за методом Д.Г.Кудлай (1977).

Після спільного культивування з зазначеними культурами ешерихій в рідкому середовищі культури S.enteritidis №37 та S.choleraesuis №22 почали позитивно реагувати з антиадгезивною ешерихіозною сироваткою К99, а культура S.typhimurium №13 - з моноспецифічною антиадгезивною сироваткою до фімбрій типу F41, що свідчить про надбання сальмонелами плазмід, які кодують синтез даних фімбрій.

Визначення рівня експресії фімбріальних адгезинів у культур сальмонел №№ 13,22,17 у розгорнутій РА з моноспецифічними антиадгезивними ешерихіозними сироватками К99, Att25, F41 (граничний титр 1:1600) показало, що дані штами реагували з зазначеними сироватками E.coli у титрах 1:100-1:200. Через місяць культура S.typhimurium №13 втратила цю здатність, але у штамів S.enteritidis №37 та S.choleraesuis №22 спостерігали збереженість даної ознаки.

Таким чином, в умовах експерименту частота процесу передачі плазмід складала в середньому 23%, що підтверджується наявністю у адгезин-негативних культур сальмонел після спільного культивування з ешерихіями властивостей, які детермінуються плазмідами.

Розробка технології виготовлення і виробництво дослідної серії сироватки ААСЕ

Аналіз даних літератури та результати власних досліджень стали підставою для розробки способу отримання сироватки антитоксичної та антиадгезивної проти сальмонельозу та ешерихіозу тварин. При відборі виробничих штамів основну увагу приділяли рівню продукції фімбріальних адгезинів та ентеротоксинів. Із урахуванням цих вимог було відібрано штами S.enteritidis №34 та S.dublin №12, S.typhimurium №16 та виробничі штами E.coli №№ 957, 4, 688, 798, 866, які використовуються для виготовлення антиадгезивної та антитоксичної сироватки проти ешерихіозів молодняку сільськогосподарських тварин (ТУ У 46.15.178-96). Результати вивчення біологічних характеристик виробничих штамів сальмонел та ешерихій, високий рівень продукції фімбріальних адгезинів та токсинів, а також стабільне збереження біологічних властивостей протягом 10 років для штамів ешерихій та 2-х років для штамів сальмонел дозволили використати дані культури мікроорганізмів для виготовлення імунізуючих препаратів.

Виготовлення і контроль сироватки ААСЕ проводили на базі Гожулівської біофабрики (Полтавська область). За основу технологічного процесу був узятий регламент виготовлення антиадгезивної та антитоксичної сироватки проти ешерихіозів молодняку сільськогосподарських тварин (ТУУ 46.15.178-96). Технологічний процес виробництва сироватки містив у собі такі стадії:

1. Виготовлення живильних середовищ для культивування виробничих штамів сальмонел та ешерихій, виготовлення робочих розчинів.

2. Виготовлення антигенів для імунізації донорів сироватки крові.

3. Грундімунізація та гіперімунізація донорів сироватки крові.

4. Виробничий контроль сироватки.

5. Циклова експлуатація волів-донорів сироватки крові.

6. Відбір крові.

7. Виготовлення сироватки крові, консервування сироватки.

8. Складання серії, фасування сироватки.

9. Контроль сироватки.

10. Пакування, транспортування, зберігання сироватки.

У грудні 1999 року виготовлено дослідну серію загальним об'ємом 40 л, яка за результатами проведеного контролю була стерильною, нешкідливою для білих мишей та морських свинок, забезпечувала захист 70% мишей, оброблених сироваткою в дозі 0,4 см³, після контрольного зараження штамами E.coli №866 та S.dublin №12, реагувала в РА з антигенами на основі виробничих штамів сальмонел в титрах 1:80- 1:320 та з антигенами на основі виробничих штамів ешерихій в титрах 1:160-1:640. Проведені роботи показали придатність розробленої технології отримання сироватки ААСЕ для використання в умовах біофабрики, а також можливість одержання згідно з запропонованою технологією активного біопрепарату, призначеного для специфічної профілактики і лікування сальмонельозної та ешерихіозної інфекцій.

Вивчення превентивних властивостей дослідної серії сироватки ААСЕ

Превентивні властивості виготовленої сироватки було вивчено в дослідах на білих мишах відносно гомологічних і гетерологічних культур сальмонел та ешерихій.

Для цього тваринам дослідних груп вводили сироватку ААСЕ підшкірно, одноразово, в дозі 0,5 см³. Тварин контрольних груп щепленню сироваткою не піддавали. Через 1 добу всіх тварин заражали 3LD50 гомологічних і гетерологічних культур сальмонел та E.colі. Спостереження вели протягом 8 діб. По кількості мишей, які залишились живими в дослідних та контрольних групах, робили висновки про рівень превентивних властивостей сироватки.

Результати проведених досліджень свідчать про те, що сироватка попереджувала у 70% випадків загибель тварин від зараженння летальними дозами культур гомологічних сероварів сальмонел (S.dublin №12, S.typhimurium №16, S.enteritidis №34) та ешерихій (E.coli №№ 866,798) і захищала від розвитку експериментального сальмонельозу та ешерихіозу, викликаного гетерологічними сероварами, в середньому 60% мишей. Отже, одноразове введення сироватки забезпечує у більшості імунізованих тварин формування стану несприйнятливості до зараження летальними дозами збудників сальмонельозу та ешерихіозу гомологічних та гетерологічних сероварів.

Виробничі випробування сироватки ААСЕ та вивчення її лікувально-профілактичної ефективності

Виробничу перевірку сироватки ААСЕ проводили в господарствах Чугуївського, Первомайського та Ізюмського районів Харківської області, які були неблагополучними щодо сальмонельозу телят і поросят протягом останніх 6-20 років, що підтверджено результатами лабораторних досліджень обласної та районних лабораторій державної ветеринарної медицини.

Випробування проводили згідно з методикою, затвердженою методичною комісією ІЕКВМ УААН. Профілактичну та лікувальну ефективність сироватки оцінювали за рівнем захворюваності та загибелі тварин, у яких спостерігався симптомокомплекс діареї, в порівнянні з цими ж показниками в контрольних групах, а також за частотою виділення збудників сальмонельозу. Результатами проведених випробувань встановлено, що сироватка - нешкідлива, про що свідчить відсутність ускладнень та алергічних реакцій після її введення, і ефективна при застосуванні з профілактичною (табл.6) і лікувальною метою (табл.7).

Таблиця 6. Результати виробничих випробувань профілактичної ефективності сироватки ААСЕ в господарствах Харківської області

Види тварин	Дослідна група	Контрольна група
	Кількість тварин	Захворіло	Загинуло	Кількість тварин	Захворіло	Загинуло
		гол.	%	гол.	%		гол.	%	гол.	%
телята	125	19	15,2	4	3,2	70	55	78,6	26	37,2
поросята	319	93	29,2	8	2,5	166	100	60,3	45	24,1

Таблиця 7. Результати виробничих випробувань лікувальної ефективності сироватки АССЕ в господарствах Харківської області

Види тварин	Дослідна група	Контрольна група
	Кількість тварин	Одужало	Загинуло	Кількість тварин	Одужало	Загинуло
		гол.	%	гол.	%		гол.	%	гол.	%
поросята	232	224	96,6	8	3,4	220	162	73,7	58	26,3

Нормативна документація пройшла експертизу у Державному науково-контрольному інституті біотехнології і штамів мікроорганізмів, після чого в установленому порядку була затверджена Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України.

Висновки

Сальмонельози молодняку сільськогосподарських тварин завдають значних економічних збитків тваринництву та створюють загрозу для здоров'я людей. Засоби специфічної профілактики, які застосовуються в цей час, не забезпечують надійного захисту тварин, що диктує необхідність розробки принципово нових препаратів, які базуються на сучасних знаннях біології збудника та патогенезу захворювання.

У 92,3% досліджених епізоотичних культур сальмонел виявлені фімбріальні адгезини: 71,8% культур мали і манозочутливі, і манозостійкі фімбрії, а 20,5% культур - фімбрії одного типу.

Фімбріальні адгезини сальмонел відрізняються за активністю щодо аглютинації еритроцитів різних видів тварин. Найбільш високу аглютинаційну активність усі досліджені культури (незалежно від сероваріанту) виявили відносно еритроцитів свиней.

Встановлено, що фімбріальні адгезини всіх досліджених сероварів сальмонел є глікопротеїнами, належать до низькомолекулярних білків кислої природи, мають молекулярну масу в межах 18 кДа, розташовані на поверхні клітини і являють собою ниткоподібні структури, згорнуті у вигляді клубків.

Фімбріальні адгезини сальмонел мають виражені антигенні та імуногенні властивості, про що свідчить здатність індукувати в імунізованих тварин синтез специфічних антитіл у титрах від 4,60,3 до 7,20,3 log₂, які забезпечують захист від летальних доз гомологічних та гетерологічних сероварів сальмонел на рівні 40-80%.

Експресію фімбріальних адгезинів у сальмонел на максимальному рівні відмічено у разі культивування в МПБ і на МПА при температурі 37⁰С.

Встановлено наявність антигеноспоріднених фімбріальних адгезинів у представників родів Salmonella та Escherichia і можливість передачі in vitro плазмід, які кодують синтез фімбріальних адгезинів, від ешерихій сальмонелам, що свідчить про доцільність конструювання спільних засобів специфічної профілактики сальмонельозу та ешерихіозу.

Розроблена технологія виготовлення антитоксичної та антиадгезивної сироватки проти сальмонельозу та ешерихіозу, яка забезпечує щепленим тваринам надійний захист проти цих інфекцій і підвищує їх збереження на 21,6-34,0%.

Перелік робіт, які були опубліковані за темою дисертації

Дідок Ю.В., Головко А.М., Ушкалов В.О. Адгезивні властивості різноманітних штамів сальмонел і фактори, які впливають на рівень їх проявлення // Вісн. Сумськ. держ. аграр. ун-ту. - Суми, 1999. - Вип. 3. - С. 31-33. (Особистий внесок здобувача 80%. Проведено експериментальні дослідження, аналіз та узагальнення отриманих результатів, зроблено висновки).

Дідок Ю.В., Головко А.М. Передача плазмід, які кодують синтез фімбрій, від ешеріхій до сальмонел // Вісн. Сумськ. держ. аграр. ун-ту. - Суми, 1999. - Вип. 4. - С. 70-71. (Особистий внесок здобувача 80%. Проведено експерименти, аналіз та узагальнення результатів, зроблено висновки).

Дидок Ю.В., Ушкалов В.А., Головко А.Н. Факторы патогенности эпизоотических культур сальмонелл // Вет. медицина: Міжвід. темат. наук. зб. - Х., 1999.- С. 13-16. (Особистий внесок здобувача 60%. Проведено лабораторні дослідження з вивчення адгезивних властивостей ізолятів сальмонел, зроблено аналіз літератури, узагальнення отриманих результатів, висновки).

4. Дідок Ю.В. Деякі епізоотологічні особливості сальмонельозів телят і поросят // Вет. медицина: Міжвід. темат. наук. зб. - Х., 2000.- С. 79-85.

Golovko A., Ushkalov V., Didok Y. Іmmunoprophylaxis of animal salmonellosis: principles of vaccines development // Ukraine - Цsterreich. Landwirtschaft: Wissenschaft und Praxis: Materials of ІІІ international symposium, Tschernivci, 14-16 Sept. 2000. - Tschernivci, 2000. - P. 75. (Особистий внесок здобувача 60%. Проведено аналіз літератури, експериментальні дослідження, зроблено узагальнення отриманих результатів та висновки).

Хімічна природа і фізико-хімічні властивості адгезивних антигенів сальмонел. / Ушкалов В.О., Головко А.М., Дідок Ю.В., Романько М.Є., Долгая М.М. // Вісн. Білоцерк. держ. аграр. ун-ту. - Біла Церква, 2000. - Вип. 14. - С. 256-261. (Особистий внесок здобувача 40%. Проведено лабораторні дослідження з питання відокремлення фімбріальних адгезинів сальмонел, зроблено аналіз літератури).

Деклараційний пат. 99042052 Україна, МПК 6 А61К39/085. Спосіб одержання антиадгезивної та антитоксичної сироватки проти сальмонельозів та ешерихіозів тварин / В.О.Ушкалов, А.М.Головко, Ю.В.Дідок (Україна); ІЕКВМ УААН. - № 32341 А; Заявл. 13.04.99; Опубл. 15.12.2000, Бюл. №7 - 11. - 2 с.

Дідок Ю.В. Фімбріальні адгезини сальмонел та їх використання при конструюванні засобів специфічної профілактики сальмонельозу тварин. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03. - ветеринарна мікробіологія та вірусологія. Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, Харків, 2001.

Дисертація присвячена вивченню фімбріальних адгезинів сальмонел та розробці препарату для серопрофілактики і терапії сальмонельозу. Проаналізовано епізоотичну ситуацію щодо сальмонельозу великої рогатої худоби та свиней на території Харківської області за період з 1990 по 1999 рік. Встановлено, що мікробні клітини епізоотичних ізолятів сальмонел, виділених від молодняку різних видів тварин, мають манозочутливі та манозостійкі фімбрії.

Визначені умови культивування, які забезпечують високий рівень експресії фімбріальних адгезинів. Одержано відокремлені від бактеріальних клітин фімбрії, вивчено їх фізико-хімічні, структурні та імуногенні властивості.

У досліджених епізоотичних ізолятів сальмонел виявлені фімбріальні антигени, характерні для E.coli (типи К99, К88 ас, F41, Att25). Встановлено можливість передачі від ешерихій до сальмонел плазмід, що кодують синтез фімбрій.

Розроблено технологію та виготовлено дослідну серію препарату сироватки антитоксичної та антиадгезивної проти сальмонельозу та ешерихіозу тварин, проведено її виробниче випробування, вивчення профілактичної та лікувальної ефективності.

Ключові слова: фімбріальні адгезини, сальмонельоз, ешерихіоз, специфічна профілактика, плазміди.

Дидок Юлия Валентиновна. Фимбриальные адгезины сальмонелл и их использование при конструировании средств специфической профилактики сальмонеллеза животных. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03. - ветеринарная микробиология и вирусология. Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины УААН, Харьков, 2001.

Диссертация посвящена изучению фимбриальных адгезинов сальмонелл и разработке препарата для серопрофилактики и терапии сальмонельоза. Проанализирована эпизоотическая ситуация по сальмонеллезу телят и поросят за период с 1990 по 1999 гг. в животноводческих хозяйствах Харьковской области. Выяснено, что этиопричиной сальмонеллеза телят в большинстве случаев является S.dublin; от поросят чаше выделяют серовар S.choleraesuis. Эпизоотические изоляты сальмонелл, выделенные от молодняка разных видов животных, имеют маннозочувствительные и маннозоустойчивые фимбриальные адгезины. Определено, что фимбриальные адгезины изученных штаммов сальмонелл характеризуются гетерогенностью по способности агглютинировать эритроциты разных видов животных. У большинства культур сальмонелл выявлена высокая гемаглютинирующая активность в отношении эритроцитов свиньи.

Установлены оптимальные режимы культивирования сальмонел с фимбриальными адгезинами, отработана методика получения очищенных препаратов фимбрий, изучены их физико-химические и антигенные свойства, структура.

У эпизоотических изолятов сальмонелл выявлены фимбриальные антигены типов К99, К88 ас, F41, Att25, характерные для E.coli. Установлена возможность передачи плазмид, которые кодируют синтез фимбрий F41 и К99, от эшерихий S.typhimurium, S.choleraesuis, S.enteritidis в экспериментальных условиях.

Разработана технология изготовления сыворотки антитоксической и антиадгезивной против сальмонеллеза и эшерихиоза животных; изготовлена и испытана в лабораторных и производственных условиях опытная серия препарата.

Ключевые слова: фимбриальные адгезины, сальмонеллез, эшерихиоз, специфическая профилактика, плазмиды.

Didok Yuliya Valentinovna. Salmonella fimbrial adhesins and their use at the development of preparations for the specific prophylaxis of animal salmonellosis. - Manuscript.

The dissertation thesis for the degree of candidate of veterinary sciences on the speciality 16.00.03. - veterinary microbiology and virology. Institute of experimental and clinical veterinary medicine of the Ukrainian Academy of Agrarian Sciences, Kharkov, 2001.

The dissertation is devoted to the studying of salmonella fimbrial adhesins and elaboration of means for immunoprophylaxis of animal salmonellosis.

For the effective control of Salmonella infection in man and animals it is of great importance to learn and characterize Salmonella isolates from different animal species for the presence of virulence factors. The main bacterial factors involved in salmonella infection are fimbrial adhesins and enterotoxins. This knowledge regarding the salmonella fimbriae antigenic and biochemical properties is essential for the development of vaccines and serum.

The epizootic situation concerning bovine and swine salmonellosis in Kharkov region during the period from 1990 to 1999 was analyzed. It was found that within analyzed period S.dublin dominated among other serovars in initiation of salmonella infection in calves, S.choleraesuis was isolated more frequently from piglets, S.typhimurium was the rarest cause of salmonellosis in both these animal species.

It was established that majority 36 (92,3%) of epizootic salmonella strains investigated in this study, which were isolated from calves, piglets, lambs and chicken have in their structure mannose-sensitive (type 1 fimbriae) and mannose-resistant fimbriae (type 2). In 28 (71,8%) strains both types of fimbriae were detected, other strains produced type 1 fimbriae or type 2 fimbriae, 3 (7,7%) strains didn't have adhesive properties. In the presence and absence of d-mannose salmonella isolates agglutinated erythrocytes of guinea pig, white mice, bull, pig and ram to varying degrees. The highest hemagglutinating activity of all salmonella strains tested was established with pig erythrocytes.

Studying of the influence of different growth conditions on the level of fimbriae expression showed, that low temperature of cultivation (18⁰C) depresses salmonella ability to produce fimbrial adhesins. The maximum level of fimbriae production was registered after cultivation of bacteria at 37⁰C.

By chemical nature fimbriae of salmonella strains were the glicoproteins of between 18 kDa relative molecular weight. Physical and chemical properties of salmonella fimbrial adhesins separated from bacterial cells were also studied.

Immunization of mice by parenteral administration of salmonella fimbrial adhesins separated from bacterial cells induced specific antibodies production (titres from 4,60,3 to 7,20,3 log₂), which protected 40-80% of animals against experimental salmonellosis.

In laboratory conditions the presence of Escherichia coli fimbrial adhesins on the surface of epizootic salmonella strains were detected in the reaction of agglutination with Escherichia coli monospecific antiadhesive serum to the fimbriae types К99, К88 ас, F41, Att25. The possibility of plasmids (which code fimbriae synthesis) exchange between escherichia and salmonella strains were detected after the common culturing in solid medium.

Three salmonella strains (S.dublin №12, S.enteritidis №34, S.typhimurium №16) and five Escherichia coli strains (№№ 957, 4. 688, 798, 866) which have high level of adhesins and toxins production were selected and used for the development of “Antitoxic and antiadhesive serum against salmonellosis and escherichiosis in animals” intended for passive immunoprophylaxis and treatment of the above infections. The experimental series of the preparation was produced at the Gojulskiy biofactory (Poltava region, Ukraine).

The technological process included preparation of medium and solutions for growth of Salmonella and E.coli strains, preparation of complex antigens which consist of fimbrial adhesins and enterotoxins separated from bacterial cells, immunization of bulls, receiving of blood serum and other stages. The effectiveness of obtained serum was studied in laboratory and field conditions.

Key words: Salmonella, Escherichia coli, fimbrial adhesins, mannose-sensitive fimbriae, mannose-resistant fimbriae, cattle, pigs, immunoprophylaxis, plasmids.

Размещено на Allbest.ru

...