Дослідження дії екзогенного церулоплазміну при хіміотерапії злоякісних новоутворень в експерименті та клініці

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут експериментальної патології, онкології і

радіобіології ім. Р.Є. Кавецького

УДК. 612.118.22:615.277.3

14.01.07- онкологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Дослідження дії екзогенного церулоплазміну при хіміотерапії злоякісних новоутворень в експерименті та клініці

Гоголь Сергій Володимирович

Київ 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України

Науковий керівник доктор медичних наук, професор Бердинських Ніна Костянтинівна, Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, провідний науковий співробітник відділу біохімії пухлин

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук Воронцова Ада Леонідівна, Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, провідний науковий співробітник відділу експериментальних клітинних систем;

кандидат біологічних наук Маєвська Людмила Павлівна, Інститут онкології АМН України, старший науковий співробітник відділу інформації, впроваджень та координації наукових досліджень

Провідна установа Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України, кафедра онкології

Захист відбудеться 23 січня 2002 року о 13 годині 30 хв. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України за адресою: 03022, Київ, вул. Васильківська, 45

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України

Автореферат розісланий 22 грудня 2001 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор медичних наук Н.В. Бородай

Анотації

Гоголь С.В. Дослідження дії екзогенного церулоплазміну при хіміотерапії злоякісних новоутворень в експерименті та клініці. Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.01.07 онкологія. Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, Київ, 2001.

Дисертацію присвячено вивченню механізмів зниження токсичної дії цитостатичних препаратів за допомогою екзогенного церулоплазміну в експерименті та клініці.

В експериментальних дослідженнях доведено, що церулоплазмін не тільки не знижує протипухлинної дії доксорубіцину і цисплатину, але і при самостійному застосуванні проявляє певну протипухлинну дію, зменшуючи масу карциноми Герена на 27%. Встановлено, що застосування церулоплазміну при проведенні хіміотерапії у тварин з перещеплюваними пухлинами призводить до стабілізації структурно-функціонального стану мембран гепатоцитів, кардіоцитів та еритроцитів, а також до зниження вираженості інтоксикації, викликаної доксорубіцином і цисплатином. Показано гальмування під впливом церулоплазміну процесу перекисного окислення ліпідів в тканинах печінки, серця та нирок із суттєвим зменшенням вмісту малонового діальдегіду. Встановлена можливість підвищення під впливом церулоплазміну ступеня антиоксидантного захисту за рахунок збільшення вмісту відновленого глутатіону в печінці на 19%, а також значного зниження рівня токсичних метаболітів в крові та підвищення вмісту гемоглобіну в крові та еритроциті у хворих з рецидивами раку прямої кишки внаслідок стабілізації клітинних мембран.

Показано зменшення токсичності використаної схеми поліхіміотерапії при застосуванні церулоплазміну. Встановлене зниження ступеня вираженості біохімічних ознак ендотоксикозу дає змогу не переривати курс хіміотерапії. Одержані експериментальні дані та результати клініко-лабораторних досліджень свідчать про доцільність призначення церулоплазміну як препарату супроводу при проведенні поліхіміотерапії у онкологічних хворих.

Ключові слова: злоякісні новоутворення, церулоплазмін, хіміотерапія, перекисне окислення ліпідів, відновлений глутатіон, плазматичні мембрани, ендотоксикоз.

Гоголь С.В. Исследование действия экзогенного церулоплазмина при химиотерапии злокачественных новообразований в эксперименте и клинике. Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.01.07 - онкология. Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины, Киев, 2001.

Диссертация посвящена изучению механизмов снижения токсического действия цитостатических препаратов с помощью экзогенного церулоплазмина в эксперименте и клинике.

В экспериментальных исследованиях показано, что церулоплазмин не снижает противоопухолевого действия доксорубицина, и при самостоятельном применении проявляет противоопухолевый эффект, уменьшая массу карциномы Герена на 27%. При совместном применении цисплатина и церулоплазмина последний также не препятствует противоопухолевому действию цитостатика. Установлено, что использование церулоплазмина при проведении химиотерапии у животных с перевивными опухолями приводит к стабилизации структурно-функционального состояния мембран гепатоцитов и кардиоцитов. При этом в мембранах клеток печени и сердца нормализуется содержание фосфолипидов, свободных жирных кислот, снижается до нормы активность фосфолипазы и маркерных ферментов (аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, лактатдегидрогеназы, креатинфосфокиназы, гаммаглутамилтрансферазы), а также уменьшаются проявления интоксикации, обусловленной доксорубицином и цисплатином. После применения церулоплазмина в мембранах гепатоцитов и кардиоцитов стабилизируется соотношение холестерин:фосфолипиды.

Показано торможение под влиянием церулоплазмина процесса перекисного окисления липидов в тканях печени, сердца и почек у исследуемых животных с карциномой Герена и асцитным раком Эрлиха с существенным снижением содержания малонового диальдегида. Установлено, что в различных органах наблюдается различная динамика изменений этого показателя. В печени уровень малонового диальдегида был наивысшим через 96 часов, в сердце через 4 часа, в почках через 24 часа после введения цисплатина.

Установлена возможность повышения под влиянием церулоплазмина степени антиоксидантной защиты за счет увеличения содержания восстановленного глутатиона в печени на 19%, а также значительного снижения уровня токсических метаболитов (среднемолекулярных пептидов) в крови и повышения концентрации гемоглобина в эритроцитах и цельной крови. Снижение с помощью церулоплазмина сорбционной способности эритроцитов указывает на стабилизацию структурно-функционального состояния эритроцитарной мембраны.

Результаты клинического исследования показали, что церулоплазмин, как препарат сопровождения при химиотерапии больных раком легкого и больных с рецидивами рака прямой кишки, способен тормозить процесс перекисного окисления липидов, снижая содержание малонового диальдегида в сыворотке крови. Установлено снижение под влиянием церулоплазмина уровня среднемолекулярных пептидов в крови, увеличение которого наблюдается после применения цитостатических препаратов.

Показано уменьшение токсичности химиопрепаратов в использованной схеме при применении церулоплазмина. Установленное снижение степени выраженности биохимических проявлений эндотоксикоза и улучшение состояния больных дает возможность не прерывать курс химиотерапии.

Полученные экспериментальные данные и результаты клинико-лабораторных исследований свидетельствуют о целесообразности назначения церулоплазмина как препарата сопровождения при проведении полихимиотерапии у онкологических больных.

Ключевые слова: злокачественные новообразования, церулоплазмин, химиотерапия, перекисное окисление липидов, восстановленный глутатион, плазматические мембраны, эндотоксикоз.

Gogol S.V. A study of the effect of exogenous ceruloplasmin in chemotherapy of malignant neoplasms in experiment and clinic. - Manuscript.

Dissertation for the degree of Candidate of Biological Sciences on speciality 14.01.07 - oncology. - R.E. Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology NAS of Ukraine, Kyiv, 2001.

The dissertation is dedicated to examination of mechanisms for decrease of toxic preparations with exogenous ceruloplasmin in experiment and clinic.

It was proved in experimental studies that ceruloplasmin not only doesn't decrease antitumor effect of doxorubicin and cisplatin but alone renders its own antitumor effect, decreasing mass of carcinoma Geren by 27%. It is detected that use of ceruloplasmin in chemotherapy in animals with inoculated tumors results in stabilization of structural and functional status of membranes of hepatocytes, cardiocytes and erythrocytes and in decrease of intoxication expression induced by doxorubicin and cisplatin. Inhibition of peroxidation of lipids in tissues of the liver, heart and kidneys with significant decrease of malone dialdehyde content is shown. A possibility of increase of the rate of antioxidant protection at the expense of the increase of the restored glutation in liver by 19% as well as significant decrease of toxic metabolites in blood and increase of the content of intraerythrocytic hemoglobin in the result of stabilization of cell membranes is revealed.

A decrease of the toxicity of used polychemotherapy scheme with ceruloplasmin as well as the level of expression of biochemical signs of endotoxicosis allows not to interrupt the course of polychemotherapy.

The obtained experimental results and the results of clinico-laboratory studies evidence on the expediency of prescription of ceruloplasmine as an accompanied agent of in polychemotherapy in oncologic patients.

Key words: malignant neoplasms, ceruloplasmin, chemotherapy, peroxidation of lipids, restored glutation, plasmatic membranes, endotoxicosis.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Цитостатичні препарати є однією з основних складових сучасного лікування онкологічних хворих. На теперішний час проведені численні дослідження по вивченню механізмів дії різноманітних протипухлинних препаратів, розроблені та вдосконалені схеми і методи їх оптимального застосування [Hortobagyi G.N., 1997; Wendel N. et al., 1998; Links M., Lewis C., 1999]. На жаль, не існує практично ні одного хіміопрепарату, який не мав би негативної побічної дії. В першу чергу це стосується гепато-, нефро- та кардіотоксичності цитостатиків, пригнічення кровотворення, впливу на центральну і периферичну нервову систему [Шалимов А.А. и соавт., 1998; Duncan R.I., Novell C.A., 2000; Nagi M., Mansour M., 2000]. Саме токсичні ефекти, викликані цитостатиками, призводять до необхідності переривати або припиняти курс лікування. Тому зменшення негативних наслідків хіміотерапії злоякісних новоутворень є одним з найважливіших завдань сучасної онкології. В експерименті та клініці постійно проводиться пошук засобів та методів зниження побічних ефектів цитостатичної терапії. В першу чергу це різноманітні суто детоксикаційні заходи: гемо- та ентеросорбція, плазмаферез, електрохімічне окислення крові [Кабан, Ганюшкина И.Г., 1997; Семиглазов В.Ф., 1997], а також медикаментозні методи впливу на прояви синдрому ендогенної інтоксикації, що виникає внаслідок дії хіміотерапевтичних препаратів [Кабан О.П. та співавт., 2001].

На жаль, існуючі засоби зниження негативних проявів хіміотерапії є недостатньо ефективними і часто не здатні попередити або зменшити системні метаболічні зрушення, які виникають після застосування цитостатичних препаратів [Гунина, 1998; Mostafa M.G. et al. 2000].

Слід підкреслити, що методи помякшення токсичного впливу цитостатиків на організм здебільшого стосуються одного, рідко двох ускладнень лікування. Тому в клініці для зниження побічних ефектів хіміотерапії водночас застосовують декілька засобів або препаратів.

Оскільки одним з основних механізмів дії хіміопрепаратів є активація процесів вільнорадикального окислення з подальшим зрушенням прооксидантно-антиоксидантної рівноваги, структурно-функціонального стану плазматичних мембран, в тому числі еритроцитарних, прогресуванням анемії, накопиченням токсичних продуктів метаболізму, найбільш доцільним було б призначення таких препаратів супроводу, які, не знижуючи протипухлинного ефекту цитостатиків, могли б одночасно впливати на декілька порушених ланок гомеостазу [Гуніна Л.М. та співавт., 2001].

Саме тому нашу увагу привернув природний антиоксидант, мідьвмісний білок 2-глобулінової фракції плазми крові людини церулоплазмін (ЦП). Експериментальними та клінічними дослідженнями було встановлено, що ЦП in vivo суттєво знижує інтенсивність процесів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ), зменшує вираженість інтоксикації та анемії [Бердинських Н.К. та співавт., 2001]. Існує багато досліджень по вивченню його структури, функції та метаболізму в нормі і при патології. В Україні "Церулоплазмін ліофілізований для інєкцій" був зареєстрований як фармацевтичний препарат (реєстраційне свідоцтво № П/96/322/6 від 11.10.96р.), але в сучасній літературі даних по вивченню впливу екзогенного церулоплазміну на гомеостаз онкологічних хворих і зокрема, тих, що проходять хіміотерапію, практично не існує. Тому дослідження ефективності застосування ЦП як препарату супроводу при хіміотерапії злоякісних новоутворень в експерименті та клініці є актуальною науковою проблемою.

Звязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота була виконана відповідно до науково-дослідних тем Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України ("Дослідження системи авторегуляції метаболізму поліамінів як засобу дії на певні етапи життєвого циклу пухлинних клітин" РК 197U006233; "Дослідження метаболізму поліамінів в пухлинних клітинах, що резистентні до хіміотерапії" РК 0100U000652. "Розчин церулоплазміну 2% для інєкцій" виконується згідно постанови Державного фармакологічного центру МОЗ України (протокол №5.12-1095/А від 12.06.2000 р.) та договору №28/2000 від 1.07.2000 р. між підприємством по виробництву бактерійних препаратів "Біофарма" та ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було вивчення впливу церулоплазміну на прооксидантно-антиоксидантний гомеостаз в тканинах життєво важливих органів і на структурно-функціональний стан плазматичних мембран при застосуванні цитостатиків в експерименті та клініці. церулоплазмін протипухлинний цитостатичний

Задачі дослідження:

вивчити антиоксидантну дію церулоплазміну на тканини печінки, серця та нирок у здорових тварин і тварин з експериментальними пухлинами при застосуванні доксорубіцину;

визначити вплив церулоплазміну на стан плазматичних мембран гепатоцитів і кардіоцитів у тварин при застосуванні доксорубіцину;

вивчити вплив церулоплазміну на перекисне окислення ліпідів в життєво важливих органах тварин з експериментальними пухлинами при застосуванні цисплатину;

дослідити вираженість анемії і структурно-функціональний стан мембран еритроцитів у тварин з пухлинами при застосуванні цисплатину;

проаналізувати антиоксидантну, мембранопротекторну і антианемічну дію церулоплазміну у хворих на рак легені та прямої кишки при поліхіміотерапії.

Обєкт дослідження щури лінії Вістар з перещеплюваною карциномою Герена, білі безпородні миші, миші лінії C57Bl з асцитним раком Ерліха, онкологічні хворі.

Предмет дослідження вплив екзогенного церулоплазміну на інтенсивність процесів вільнорадикального окислення в тканинах життєво важливих органів (печінка, серце, нирки) і клітинних мембранах.

Методи дослідження біохімічні, клініко-лабораторні та статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше експериментально доведено, що церулоплазмін не тільки не знижує протипухлинної ефективності доксорубіцину і цисплатину, але і при самостійному застосуванні проявляє цитостатичну активність, приводячи до зменшення маси пухлини. Встановлено, що застосування церулоплазміну при проведенні хіміотерапії у тварин з перещеплюваними пухлинами призводить до стабілізації структурно-функціонального стану мембран гепатоцитів, кардіоцитів та еритроцитів, а також до зниження вираженості інтоксикації, викликаної цитостатиками. Показано гальмування процесу перекисного окислення ліпідів в тканинах серця та нирок під впливом церулоплазміну. Встановлена можливість підвищення за допомогою церулоплазміну ступеня антиоксидантного захисту за рахунок збільшення вмісту відновленого глутатіону в печінці. Доведена можливість зниження рівня токсичних речовин в кровоносному руслі та підвищення вмісту внутрішньо еритроцитарного гемоглобіну внаслідок стабілізації клітинних мембран.

Практичне значення одержаних результатів. На основі експериментального дослідження впливу церулоплазміну на інтенсивність процесу перекисного окислення ліпідів в тканинах життєво важливих органів (печінки, серця та нирок) і клітинних мембранах, в тому числі еритроцитарних, доведена доцільність його призначення як препарату супроводу при проведенні поліхіміотерапії у хворих на рак легені або прямої кишки. Доведена можливість проведення повного курсу лікування хіміопрепаратами при застосуванні церулоплазміну.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто зібрана та проаналізована література за темою дисертації; проведено вивчення впливу церулоплазміну на ріст експериментальних пухлин тварин; здійснено визначення біохімічних показників прооксидантно-антиоксидантної рівноваги та досліджено стан плазматичних мембран; проведено комплексний аналіз результатів клініко-лабораторних і біохімічних досліджень у хворих на рак легені та прямої кишки, яким проводилася цитостатична терапія у супроводі церулоплазміну. Самостійно проведено статистичну обробку та узагальнення результатів досліджень.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались на конференції молодих вчених Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (Київ, 1998); конференції молодих вчених Інституту онкології АМН України (Київ, 1998); ІV Українській науково-практичній конференції з актуальних питань алергології та клінічної імунології (Київ, 1999); ІV зїзді гематологів України (Київ, 2001); Х зїзді онкологів України (Крим, 2001).

Публікації. Основний зміст дисертації викладений у 8 публікаціях, у тому числі в 4 статтях у виданнях, рекомендованих ВАК України.

Структура та обсяг роботи. Дисертація викладена на 148 сторінках друкованого тексту, складається із вступу, огляду літератури, трьох розділів власних досліджень та їх обговорення, заключення та висновків. Текст ілюстровано 7 таблицями та 22 рисунками. Список використаної літератури містить 189 джерел, із них 107 вітчизняних та 82 зарубіжних.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Експериментальні дослідження виконані на щурах лінії Вістар, білих безпородних мишах, мишах лінії C57Bl (всього 518 тварин); клінічні: у 28 хворих на рак легені, 27 з рецидивами раку прямої кишки та у 10 здорових людей (донори).

В першій серії досліджень вивчали вплив ЦП на зміни показників перекисного окислення ліпідів в органах здорових тварин при введенні доксорубіцина. Дослідження проведені на 30 щурах, які були розподілені на 5 груп. І група (інтактні тварини) служила контролем, щурам ІІ групи внутрішньоочеревинно вводили триразово через добу рідку форму ЦП в дозі 10 мг/кг. Тваринам ІІІ групи внутрішньоочеревинно триразово через добу вводили доксорубіцин в дозі 7 мг/кг. Щурам IV групи внутрішньоочеревинно триразово через добу вводили доксорубіцин, а на наступний день доповнювали хіміотерапію введенням рідкого ЦП по черзі з цитостатиком. Щурам V групи препарати вводили за тією ж схемою, що і тваринам IV групи, але використовували ліофілізовану форму ЦП. Для отримання матеріалу для дослідження тварин декапітували під ефірним наркозом.

В другій серії досліджень проводилось вивчення впливу ЦП на зміни показників перекисного окислення ліпідів в органах тварин при введенні доксорубіцина на 30 щурах з перещеплюваною карциномою Герена, які були розподілені на 5 груп. Схема експерименту, порядок введення і дозування препаратів в цій серії досліджень повністю співпадали з першою серією; І група інтактні тварини служила контролем, щурам інших груп було перещеплено карциному Герена. Препарати починали вводити на 7 добу після перещеплення пухлини. Слід зазначити, що в даній та наступних серіях досліджень використовували тільки ліофілізовану форму ЦП. Тканини для досліджень отримували на 16-й день після перещеплення пухлини і на 5-й день після останнього введення.

В третій серії експериментів вивчали вплив ЦП на різні показники біохімічного гомеостазу при застосуванні іншого цитостатику цисплатину. Дослідження проводили на 36 щурах, розподілених на 6 груп. І група служила контролем, щурам II - VІ груп було перещеплено карциному Герена. Тваринам ІІІ групи вводили ліофілізований ЦП в дозі 10 мг/кг. Щурам IV групи вводили цисплатин в дозі 3 мг/кг. В V групу увійшли тварини, яким вводили цисплатин, а починаючи з другого дня додатково препарат ЦП. Останню, VI групу склали тварини, яким ЦП вводили не після застосування цисплатину, а за добу до введення цитостатика. Препарати вводили почергово через день. Матеріал для досліджень отримували на 16-й день після перещеплення пухлини і на 5-й день після останнього введення. У тварин даної серії досліджували не тільки вплив ЦП на процеси ПОЛ, але і на вираженість інтоксикації та функціональний стан еритроцитарних мембран.

В четвертій серії досліджень, проведених на 90 білих безпородних мишах-самцях, вивчали влив ЦП на зміни інтенсивності ПОЛ у плазматичних мембранах життєво важливих органів дослідних тварин печінки та серця при введенні хіміопрепарату. Було сформовано 3 однакових за кількістю тварин групи. І група не отримувала препаратів і була контрольною; мишам ІІ дослідної групи одноразово вводили доксорубіцин в дозі 7 мг/кг; мишам ІІІ дослідної групи, крім доксорубіцину, 3 рази вводили ЦП: за годину до введення цитостатика, через 24 і 48 годин в дозі 20 мг/кг внутрішньоочеревинно. Матеріал отримували через 1 і 3 доби після введення доксорубіцину. Для виділення плазматичних мембран брали печінку від 5 тварин, серце від 10.

В пятій серії експерименти з застосуванням ЦП на фоні дії цисплатину були проведені на 200 мишах лінії С 57Bl. На 100 тваринах без пухлин вивчали інтенсивність процесів ПОЛ в життєво важливих органах (печінка, серце, нирки) під впливом церулоплазміну при застосуванні цисплатину. Решту 100 мишей розподілено на 5 рівних груп. В якості контролю використані здорові тварини (І група). Мишам ІІ, ІІІ, IV, V груп було перещеплено асцитний рак Ерліха (АРЕ): 5 млн. клітин в 0,2 мл 0,9 NaCl на мишу. Тварини ІІ групи не отримували ніяких препаратів. Мишам ІІІ групи вводили ЦП в дозі 10 мг/кг маси одноразово. Тварини IV групи отримували одноразово цисплатин в дозі 5 мг/кг маси; мишам V групи вводили цисплатин в такій же дозі з послідовним введенням через добу ЦП. Введення препаратів починали через тиждень після перещеплення пухлини. Для визначення ефективності цитостатичної дії хіміопрепаратів підраховували кількість пухлинних клітин в асцитичній рідині у кожній миші [Ларіонов, 1989].

Клінічна частина досліджень включала вивчення впливу ЦП на біохімічні показники сироватки та цільної крові 55 онкологічних хворих при застосуванні цитостатиків і 10 донорів.

28 чоловіків з нерезектабельним плоскоклітинним раком легені ІІІ-Iv ст. віком від 59 до 76 років були розподілені на 3 групи: "контрольну" групу (І) склали 8 хворих, яким одноразово вводили цисплатин в дозі 3мг/кг. Пацієнти інших груп отримували хіміопрепарат в такій самій дозі. 10 пацієнтам після введення цисплатину внутрішньовенно крапельно одноразово в дозі 0,5-0,7 г вводили ліофілізований ЦП, який розчиняли в 400 мл 0,9% натрію хлориду (II група). Іншим 10 пацієнтам III групи ЦП вводили до введення цитостатика в тій же дозі. Кров для дослідження інтенсивності ПОЛ у хворих І групи брали перед введенням та через 24 і 48 годин після введення цисплатину. У пацієнтів ІІ групи перед введенням та через добу після введення цисплатину (безпосередньо перед введенням церулоплазміну) і через добу після застосування церулоплазміну. У хворих ІІІ групи забір крові здійснювали перед введенням церулоплазміну, через добу після введення церулоплазміну (безпосередньо перед введенням цисплатину) і через добу після введення цитостатика.

Вивчення механізмів дії екзогенного ЦП при цитостатичній терапії було проведено також у 27 хворих з рецидивами раку прямої кишки до початку та після закінчення внутрішньо артеріальної хіміотерапії (ВАХТ) за схемою FАP (фторурацил, адріабластин, цисплатин, лейковорин). Курс ВАХТ складав 5 сеансів. Церулоплазмін в основній групі (15 пацієнтів) застосовували на протязі 7-10 днів під час проведення хіміотерапії. Співставлення отриманих показників проводили між 10 донорами і хворими основної та "контрольної" груп (12 однотипних за діагнозом, статтю, віком пацієнтів, яких лікували за такими ж схемами, але без застосування церулоплазміну). Біохімічні дослідження інтенсивності ПОЛ, вираженості інтоксикації, стану мембран еритроцитів та вмісту гемоглобіну в них у хворих обох груп проводили до початку та наприкінці курсу хіміотерапії. Вплив ЦП на зміни токсичності при застосуванні запропонованої схеми ВАХТ оцінювали за шкалою ВООЗ.

Біохімічні дослідження стану вільнорадикальних процесів у експериментальних тварин визначали за змінами вмісту малонового діальдегіду [Стальная, 1977] в тканинах печінки, серця та нирок і в плазматичних мембранах гепато- і кардіоцитів; фосфоліпідів і вільних жирних кислот [Биологические мембраны. Методы, 1990]. Ступінь антиоксидантного захисту в тканинах життєво важливих органів і в мембранах еритроцитів за змінами вмісту відновленого глутатіону (GSH) [Биохимические, иммунологические и биофизические методы в токсикологическом эксперименте (метод. руководство), 1989]. Активність маркерних ферментів визначали з допомогою стандартних наборів реактивів на автоматичному аналізаторі "Express-550". Як показник вираженості ендогенної інтоксикації визначали концентрацію в сироватці крові середньо молекулярних пептидів (СМП) [Габриелян, 1984]. Структурно-функціональний стан мембран еритроцитів досліджували за змінами їх сорбційної здатності (СЗЕ) [Тогайбаев, 1988]. Визначали також вміст гемоглобіну в крові та в еритроцитах (ВЕГ).

У онкологічних хворих вивчали вміст МДА в крові та мембранах еритроцитів, рівень середньомолекулярних пептидів в сироватці крові [Габриелян, 1984]. У хворих з рецидивами раку прямої кишки визначали функціональний стан мембран еритроцитів і внутрішньо еритроцитарний гемоглобін. Ці дослідження проводили на гемолітичному аналізаторі "Sysmek-1000", Японія.

Результати досліджень та їх обговорення

Вплив церулоплазміну на прооксидантні ефекти цитостатиків у експериментальних тварин. На початковому етапі досліджень було показано гальмування під впливом ЦП процесу ПОЛ, викликаного введенням доксорубіцину. Застосування як рідкої, так і ліофілізованої форм препарату ЦП приводило до суттєвого зменшення рівня МДА в життєво важливих органах.

При дослідженні стану антиоксидантної системи встановлено, що введення ЦП інтактним щурам вірогідно не змінює вміст GSH в печінці. Застосування ЦП на фоні введення цитостатика призводить до збільшення вмісту відновленого глутатіону в 2,3-2,4 рази залежно від форми ЦП (рідкої або ліофілізованої відповідно), що активує антиоксидантний процес.

Аналіз аналогічних показників у щурів з перещеплюваною карциномою Герена показав, що під впливом ЦП за умов застосування доксорубіцину кількість МДА в печінці зменшується на 36,5%, в серці на 36,3%, в нирках на 33,5%. Введення ЦП на фоні дії доксорубіцину у щурів з карциномою Герена призводить до збільшення вмісту GSH на 18,8%.

На заключному етапі досліджень в даній серії експериментів була встановлена відсутність впливу ЦП на протипухлинну дію доксорубіцину, яку оцінювали за визначенням маси пухлини (рис. 1).

Рис. 1. Динаміка маси карциноми Герена (К.Г.) при застосуванні доксорубіцину та церулоплазміну

В наступному фрагменті роботи вивчали вплив церулоплазміну на токсичну та протипухлинну дію цисплатину у тварин з експериментальними пухлинами. Введення щурам з карциномою Герена цисплатину супроводжувалось підвищенням рівня МДА в печінці на 90,2%, в серці на 98,7%, в нирках на 28,4% порівняно з показниками у інтактних тварин. При сумісному застосуванні ЦП і цисплатину послаблювалась токсична дія останнього, про що свідчить зниження рівня МДА в печінці на 25,3%, в серці на 51,1%, в нирках на 28,9% порівняно з показниками у тварин з карциномою Герена, яким не вводили препаратів. Слід зазначити, що очікувані результати по запобіганню виникнення токсичних ефектів хіміопрепарату спостерігались лише при введенні антиоксиданту після цитостатика.

Антиоксидантна дія ЦП підтверджується суттєвим зростанням вмісту GSH при введенні цисплатину тваринам з карциномою Герена (рис. 2).

Рис. 2. Рівень відновленого глутатіону в печінці щурів з карциномою Герена при введенні цисплатину та церулоплазміну.

Самостійне застосування ЦП у щурів з перещеплюваною карциномою Герена супроводжується зменшенням маси пухлини в порівнянні з контролем на 27,2%, що свідчить про певні протипухлинні властивості ЦП.

У мишей з асцитним раком Ерліха застосування екзогенного ЦП на фоні дії цисплатину супроводжується вірогідним зменшенням вмісту МДА в печінці до 1,61, в серці до 2,24, в нирках до 3,3 мкмоль/г тканини, тобто ЦП значною мірою здатний помякшувати прооксидантну дію цисплатину (рис. 3).



Рис. 3. Вміст МДА в органах мишей з АРЕ після застосування цисплатину і церулоплазміну.

Для встановлення впливу ЦП на протипухлинну дію цисплатину в усіх групах тварин був проведений підрахунок пухлинних клітин в асцитичній рідині (табл. 1).

Таблиця 1 Кількість пухлинних клітин в асцитичній рідині після застосування цисплатину і церулоплазміну

Показник	Контроль (АРЕ)	АРЕ+ЦП	АРЕ+ цисплатин	АРЕ+ цисплатин + ЦП
Кількість клітин на мишу (млн./10 мл асциту)	392,363,7	401,528,0	38,16,3*	33,074,5*
Примітка.	* р < 0,05 порівняно з контролем.

Кількість пухлинних клітин в групі мишей, яким вводили лише ЦП, не відрізнялась від такої в групі тварин з АРЕ, яким не вводили ніяких препаратів, тобто екзогенний ЦП не виявив власної протипухлинної дії.

При дослідженні впливу церулоплазміну на вміст МДА в печінці, серці, нирках на фоні дії цисплатину встановлено, що в різних органах спостерігається різна динаміка змін цього показника (рис. 4).

У тварин, які отримували лише цисплатин, з першої години після його введення починалось різке зростання активності процесів ПОЛ, яке досягало максимуму на 4 добу.

Рис. 4. Динаміка вмісту МДА під впливом ЦП в життєво важливих органах мишей з асцитним раком Ерліха при застосуванні цисплатину

Отримані результати свідчать, що ЦП здатний суттєво гальмувати інтенсивність процесів ПОЛ в життєво важливих органах за умов введення цисплатину.

Вплив церулоплазміну на токсичні ефекти цитостатиків у експериментальних тварин. Як відомо, активація ПОЛ призводить до порушення структурно-функціонального стану клітинних, зокрема еритроцитарних мембран, з наступним накопиченням високотоксичних продуктів ПОЛ, що супроводжується ендотоксикозом з ушкодженням багатьох органів і систем [Гуніна Л.М., 1998; Hahn S.M. et al., 1994]. Оскільки одним з проявів негативного впливу цитостатиків на організм є порушення з боку кровотворення [Fine R.L. et al., 1997], завданням досліджень на наступному етапі роботи було визначення концентрації токсичних метаболітів в сироватці крові, а також дослідження функціонального стану еритроцитів, їх кількості та вмісту гемоглобіну в них.

Результати досліджень довели, що в сироватці крові щурів з карциномою Герена накопичуються токсичні продукти метаболізму, що підтверджується збільшенням концентрації СМП в 1,24 рази порівняно з таким у інтактних тварин і становить 0,4210,004 відповідно (табл. 2).

Таблиця 2 Рівень СМП у сироватці крові щурів з карциномою Герена при застосуванні цисплатину і церулоплазміну

Групи тварин	Умови досліду	Вміст СМП (ум.од.)
I	Інтактні щури	0,3400,005
IІ	Щури з карциномою Герена	0,4210,004*
III	введення ЦП	0,3120,006**
IV	введення цисплатину	0,4950,006**
V	введення цисплатину + ЦП	0,3930,007** #
VI	введення ЦП + цисплатин	0,4830,004** #

Примітки: 1. * р<0,05 порівняно з даними в групі I

2. **р<0,05 порівняно з даними в групі IІ

3. #р<0,05 порівняно з даними в групі IV

Застосування цитостатика у тварин з пухлинами призводить до збільшення вмісту СМП на 17,5% порівняно з таким у тварин ІІ групи. Введення антиоксиданту на фоні дії цитостатика викликає суттєве зниження рівня цього показника.

Введення цисплатину щурам з карциномою Герена значно збільшує вміст МДА в еритроцитарних мембранах, в той час, як використання ЦП після введення цитостатика супроводжується зниженням вмісту МДА в мембранах еритроцитів на 24,3%.

Зміни кількості еритроцитів в цих групах тварин були прямо протилежні по відношенню до кількісних змін вмісту МДА в мембранах еритроцитів. Так, введення цисплатину тваринам з карциномою Герена супроводжувалось зниженням кількості еритроцитів до 6,31012/л проти 8,71012/л (p<0,05) в контролі.

Отримані результати добре корелюють з даними по визначенню вмісту гемоглобіну в крові і абсолютного вмісту його в еритроцитах (рис. 5). Сумісне застосування цисплатину і церулоплазміну супроводжується нормалізацією вмісту внутрішньоеритроцитарного гемоглобіну у тварин з перещеплюваною пухлиною.

Рис. 5. Вміст гемоглобіну в крові (А) і еритроцитах (Б) щурів з карциномою Герена при застосуванні цисплатину при дії церулоплазміну

Таким чином, результати проведених експериментальних досліджень свідчать, що екзогенний ЦП у тварин з перещеплюваною карциномою Герена, яким вводили цисплатин, сприяв зниженню активності процесу перекисного окислення ліпідів не тільки в життєво важливих органах, попереджуючи розвиток ендотоксикозу, але і в еритроцитарних мембранах, що призводило до зменшення сорбційної здатності еритроцитів, стабілізації їх структурно-функціонального стану та збільшення концентрації гемоглобіну в еритроцитах.

Мембранопротекторний вплив церулоплазміну при застосуванні цитостатиків у експериментальних тварин. В даному фрагменті роботи були вивчені більш тонкі субклітинні механізми впливу ЦП на прояв токсичних ефектів цитостатиків. У дослідних тварин введення доксорубіцину супроводжувалось накопиченням МДА в плазматичних мембранах, а застосування антиоксиданту приводило до гальмування процесів ПОЛ. У тварин, яким вводили доксорубіцин і ЦП, вміст МДА в плазматичних мембранах гепатоцитів практично не змінювався, а в мембранах міокардіоцитів через 24 години після введення доксорубіцину спостерігалось невелике підвищення рівня цього показника.

Слід, імовірно, вважати, що саме мембрани в першу чергу підпадають під вплив цитостатика з розгортанням процесів ПОЛ і подальшим зрушенням структурно-функціонального стану мембран, яке призводить до появи токсичних продуктів метаболізму.

Введення доксорубіцину активує фосфоліпазу в плазматичних мембранах гепатоцитів і кардіоцитів мишей. У тварин, яким вводили доксорубіцин і ЦП, в плазматичних мембранах печінки активність фосфоліпази не перевищувала цей показник у інтактних тварин. В плазматичних мембранах кардіоцитів у цих же тварин через 1 добу спостерігалося підвищення активності фосфоліпази в порівнянні з показником у контрольній групі, а через 3 доби активність ферменту нормалізувалась.

З цими результатами добре узгоджуються дані кількісного визначення фосфоліпідів і вільних жирних кислот в плазматичних мембранах клітин печінки і серця. У тварин, яким вводили тільки доксорубіцин, вміст фосфоліпідів в плазматичних мембранах гепато- та кардіоцитів знижувався. Введення церулоплазміну на фоні дії доксорубіцину попереджувало зміни вмісту фосфоліпідів в мембранах клітин, що досліджувались.

Слід відзначити, що введення церулоплазміну за умов застосування цитостатика практично нормалізувало величину співвідношення "холестерин-фосфоліпіди", підвищуючи вміст фосфоліпідів до вихідного рівня. Отримані дані свідчать, що у відповідь на активацію процесу ПОЛ в мембранах розвивається адаптивна перебудова ліпідного бішару мембран.

Вміст вільних жирних кислот в плазматичних мембранах клітин печінки і серця дослідних тварин через 1 і 3 доби після введення доксорубіцину достовірно збільшувався. В плазматичних мембранах гепатоцитів тварин, яким цитостатик вводили сумісно з церулоплазміном, вміст вільних жирних кислот був майже таким, як у інтактних тварин. Зміни вмісту вільних жирних кислот і активності фосфоліпази відбувалися паралельно.

Церулоплазмін ефективно гальмував індуковану доксорубіцином активацію ПОЛ в плазматичних мембранах гепато- та кардиоцитів дослідних тварин, зберігаючи цілісну структуру ліпідного бішару мембран.

Після введення доксорубіцину в сироватці крові мишей збільшувалась активність маркерних ферментів: аланін- та аспартатамінотрансфераз, креатинфосфокінази, лактатдегідрогенази, гаммаглутамінтрансферази, що свідчить про пошкодження доксорубіцином плазматичних мембран клітин печінки і серця мишей. Під впливом ЦП спостерігалося поступове зниження ферментативної активності і на 3 добу вона майже досягала величини показників у інтактних тварин.

Було досліджено вплив ЦП на рівень МДА в мембранах гепато- та кардіоцитів при застосуванні цисплатину у мишей з перещеплюваним АРЕ. Розвиток експериментальної пухлини супроводжувався вираженою активацією процесів вільнорадикального окислення в плазматичних мембранах клітин життєво важливих органів, і, особливо, в мембранах гепатоцитів, про що свідчить накопичення в них МДА (табл. 3). Введення цисплатину ще більш стимулювало активність ПОЛ в мебранах клітин печінки та серця.

Спрямованість змін показників, що відображуюють активність ПОЛ в плазматичних мембранах під впливом цитостатичних препаратів, була однаковою у інтактних тварин та у тварин з перещепленою пухлиною. Використання різних класів хіміотерапевтичних препаратів антрациклінового антибіотика та комплексної сполуки платини теж суттєво не змінювало величину показників, що досліджувались, і ЦП в обох випадках проявляв свій антиоксидантний ефект.

Таблиця 3 Вміст малонового діальдегіду (мкмоль/мг білка) в плазматичних мембранах гепатоцитів і кардіоцитів мишей з АРЕ після введення цисплатину і церулоплазміну

Групи	Строки спостереження
тварин	до введення цитостатика	через 24 год. після введення	через 72 год. після введення
гепатоцити
АРЕ (контроль)	1,130,07
введення ЦСП		3,590,06*	2,760,05*
введення ЦСП+ЦП		1,450,04* **	1,300,07**
кардіоцити
АРЕ (контроль)	1,580,04
введення ЦСП		2,780,06*	2,330,05*
введення ЦСП+ЦП		1,990,07* **	1,650,04**

Примітки: 1. *р<0,05 порівняно з контролем

2. ** p<0,05 порівняно з даними попередньої групи

Застосування церулоплазміну при хіміотерапії онкологічних хворих. Дослідження впливу екзогенного ЦП на показники біохімічного гомеостазу були проведені у пацієнтів на рак легені (відд. торакальної онкології Інституту онкології АМН України, керівник доктор мед. наук, професор член-кор. НАН і АМН України В.Л. Ганул) та з рецидивами раку прямої кишки (відд. абдомінальної онкології Інституту онкології АМН України, керівник доктор мед. наук, професор В.О. Чорний).

В групі хворих на рак легені після введення цисплатину через 24 год. рівень МДА в сироватці крові зріс утричі, залишаючись майже на такому рівні до 48 год. В групі пацієнтів, яким введення цисплатину здійснювали із застосуванням в якості препарату супроводу ЦП, рівень МДА в сироватці крові в першу добу збільшувався також приблизно в 3 рази, але вже на наступну добу він досягав вихідного, до початку введення цитостатику, рівня (рис. 6).

Рис. 6. Вміст сироваткового МДА у сироватці крові хворих на рак легені при введенні церулоплазміну після застосування цисплатину

При введенні цитостатика разом з активацією ПОЛ зростав і рівень СМП: з 0,2970,005 ум.од. до 0,4320,008 ум.од. (р<0,05). На другу добу вміст СМП на 48,1% перевищував вихідне значення і повертався до вихідного рівня лише на 6-7 добу спостереження.

На наступному етапі досліджень нами було вивчено вплив церулоплазміну на функціональний стан мембран еритроцитів, рівень внутрішньоклітинного гемоглобіну, а також на вираженість ендогенної інтоксикації при проведенні хіміотерапії у хворих з рецидивами раку прямої кишки.

В основній групі хворих на момент закінчення хіміотерапії із застосуванням ЦП як препарату супроводу спостерігалося зниження сорбційної здатності мембран еритроцитів і гальмування накопичення МДА в них порівняно з показниками у хворих "контрольної" групи (табл. 4). Застосування ЦП в основній групі хворих при проведенні хіміотерапевтичного лікування супроводжувалось вірогідним зниженням вмісту в сироватці крові СМП порівняно з контрольною групою.

Таблиця 4 Показники структурно-функціонального стану еритроцитів та вміст токсичних метаболітів у хворих з рецидивами раку прямої кишки

	Групи дослідження
Показники,	донори	хворі з рецидивами раку прямої кишки:
що вивчались		до початку лікування	"контрольна" (по закінченні лікування)	Основна (по закінченні лікування)
СЗЕ (%)	21,62,4	35,61,2#	41,72,2*	34,61,3**
МДА (нмоль106 ер.)	3,670,10	6,610,19#	7,830,28*	5,360,18*
СМП (ум.од.)	0,2560,007	0,3210,011#	0,3060,004*	0,2780,006*

Примітки: 1. # р<0,01 порівняно з показниками у донорів

2. * р<0,05 порівняно з показниками у хворих до початку лікування

3. ** р<0,05 порівняно з показниками у хворих контрольної групи

При оцінці клінічних ознак ендогенної інтоксикації показано, що токсичність внутрішньо артеріальної хіміотерапії, яка проводилась в "контрольній" групі хворих, у 7 пацієнтів складала 1 бал за шкалою ВООЗ, у 5 2 бали. В основній групі, де як препарат супроводу при проведенні хіміотерапії застосовувався ЦП, цей показник у 9 пацієнтів складав 0 балів, а у 6 1 бал за шкалою ВООЗ.

Встановлені під впливом ЦП зрушення структурно-функціонального стану мембран еритроцитів не тільки сприяли зниженню вмісту токсичних метаболітів, але, супроводжувались зниженням проявів анемії у хворих основної групи, які визначались за показниками вмісту гемоглобіну в крові та в еритроцитах (табл. 5).

Таким чином, церулоплазмін, як препарат супроводу при хіміотерапії хворих на злоякісні новоутворення, проявляє виражений антиоксидантний, антитоксичний, мембранопротекторний та антианемічний ефект.

Таблиця 5 Показники гемограми у хворих з рецидивами раку прямої кишки

	Групи дослідження
Показники,	донори	хворі:
що вивчались		до початку лікування	"контрольна" (після лікування)	основна(після лікування)
HGB (г/л)	138,268,74	113,454,97*	106,575,21*	120,454,24#
ВЕГ (пг)	32,62,3	22,541,72*	24,481,89	29,652,11#

Примітки: 1. * р<0,01 порівняно з показниками у донорів

2. # р<0,05 порівняно з показниками у хворих контрольної групи

Висновки

Екзогенний церулоплазмін у інтактних тварин та у тварин з експериментальними пухлинами проявляє виражену антиоксидантну дію, що супроводжується значним зниженням вмісту в печінці, серці та нирках одного з кінцевих продуктів ПОЛ малонового діальдегіду.

Сумісне застосування доксорубіцину або цисплатину з церулоплазміном у тварин з карциномою Герена або асцитним раком Ерліха призводить до зниження активності ПОЛ в життєво важливих органах і мембранах гепатоцитів та кардіоцитів.

Церулоплазмін на 19% підвищує вміст відновленого глутатіону в печінці щурів з карциномою Герена при застосуванні доксорубіцину та на 83% в печінці мишей з асцитним раком Ерліха при застосуванні цисплатину.

В експерименті встановлено, що церулоплазмін має виражену протекторну дію на мембрани гепато- та кардіоцитів, знижуючи в експерименті активність фосфоліпази на 25% і 40% відповідно, нормалізуючи вміст фосфоліпідів, холестерину та вільних жирних кислот.

Екзогенний церулоплазмін не впливає на ефективність доксорубіцину та цисплатину і виявляє певну протипухлинну активність, знижуючи масу перещеплюваної карциноми Герена. Сумісне застосування церулоплазміну з цитостатиками у тварин з перещеплюваними пухлинами призводить до зменшення токсичного впливу хіміотерапії, зниження вмісту токсичних метаболітів (на 21%), попереджує розвиток анемії та сприяє зростанню вмісту внутрішньоеритроцитарного гемоглобіну більш ніж на 10%.

Призначення церулоплазміну при хіміотерапії хворих на рак легені та хворих з рецидивами раку прямої кишки призводить до зниження рівня МДА і токсичних метаболітів в крові, до нормалізації вмісту гемоглобіну та стабілізації мембран еритроцитів, що втілюється в зниженні токсичності за шкалою ВООЗ до 0-1 бала.Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Гоголь С.В., Бердинських Н.К. Зменшення токсичної дії доксорубіцину за допомогою церулоплазміну //Эксперим. онкол.2000.22,№4.С.225-227. (Самостійно проводив експериментальні дослідження, статистичну обробку та теоретичне узагальнення результатів роботи).

2. Гоголь С.В., Бердинських Н.К. Активація ПОЛ в органах тварин цисплатином і антиоксидантна дія церулоплазміну //Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології: збірник наукових праць.Київ-Луганськ-Харків: "Планета-Копі"2000.Вип.5,№31.С.275-284. (Самостійно проводив експериментальні дослідження, статистичну обробку та теоретичне узагальнення результатів роботи).

3. Гуніна Л.М., Бердинських Н.К., Гоголь С.В., Сорокін Б.В., Олійник С.А. Застосування церулоплазміну при хіміотерапії злоякісних новоутворень в експерименті та клініці //Онкологія.2001.3,№1.С.48-50. (Самостійно визначав біохімічні показники дослідного матеріалу).

4. Гуніна Л.М., Кабан О.П., Бердинських Н.К. Литвиненко О.О., Гоголь С.В., Коробко В.Б., Сорокін Б.В. Антианемічна активність церулоплазміну під час хіміотерапії у хворих на рак шлунка та рак прямої кишки //Укр. хіміотер. журн.2001.№1.С.55-57. (Самостійно визначав біохімічні показники дослідного матеріалу).

5. Бердинських Н.К., Курищук І.В., Рядська Л.С., Лялюшко Н.М., Корж С.М., Гоголь С.В. Церулоплазмін і досвід його застосування в лікарській практиці //Шляхи і перспективи розвитку експериментальної онкології в Україні : збірник наукових праць, присвячений 40-річчю ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАНУ.- Київ: ДІА, 2001.С.137-143. (Самостійно проводив статистичну обробку результатів).

6. Бердинских Н.К., Волощенко Ю.В., Савцова З.Д., Рядская Л.С., Корж С.Н., Гоголь С.В. Иммуномодулирующее и антиоксидантное действие нового лекарственного препарата церулоплазмин: матеріали IV науково-практичної конференції з актуальних питань алергології та клінічної імунології.- Київ, 1999 //Імунологія і алергологія.1999.№3.С. 57.

7. Гуніна Л.М., Бердинських Н.К., Кабан О.П., Сорокін Б.В., Коробко В.Б., Гоголь С.В. Вплив церулоплазміну на стан еритроцитарних мембран та вміст гемоглобіну у онкологічних хворих: матеріали IV зїзду гематологів та трансфузіологів України.- Київ, 2001 //Гематология и переливание крови.2001.Вип.30.С. 103.

8. Гоголь С.В., Гуніна Л.М., Сорокін Б.В. Застосування церулоплазміну як препарату супроводу при хіміотерапії злоякісних новоутворень в експерименті та клініці : матеріали Х зїзду онкологів України.Крим, 2001.Київ, 2001.С. 37.

Размещено на Allbest.ru

...