Стан ендогенної інтоксикації і захисних систем при пухлинному рості

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

ТЕРНОПІЛЬСЬКА ДЕРЖАВНА МЕДИЧНА АКАДЕМІЯ

ім.І.Я.ГОРБАЧЕВСЬКОГО

УДК 616-006.6-099-092.19-092.4/.9

СТАН ЕНДОГЕННОЇ ІНТОКСИКАЦІЇ І ЗАХИСНИХ СИСТЕМ

ПРИ ПУХЛИННОМУ РОСТІ

(експериментально-клінічне дослідження)

14.03.04 - патологічна фізіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

ІВАНКІВ ОКСАНА ЛЬВІВНА

Тернопіль - 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському державному медичному університеті ім. Данила Галицького Міністерства охорони здоров'я України.

Науковий керівник: заслужений діяч науки і техніки України, доктор медичних наук, професор Білинський Борис Тарасович, Львівський державний медичний університет ім. Данила Галицького, завідувач кафедри онкології і медичної радіології факультету післядипломної освіти

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, доцент Корда Михайло Михайлович, Тернопільська державна медична академія ім. І.Я Горбачевського, доцент кафедри медичної хімії;

кандидат медичних наук, доцент Потопальський Анатолій Іванович, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, керівник групи модифікації структури біологічно активних речовин, м. Київ.

Провідна установа: Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України, відділ механізмів протипухлинної терапії, м.Київ.

Захист дисертації відбудеться 25 жовтня 2001р. о 14⁰⁰ год. на засіданні спеціалізованої вченої ради К 58.601.01 Тернопільської державної медичної академії ім.І.Я.Горбачевського (46000, м.Тернопіль, Майдан Волі, 1).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Тернопільської державної медичної академії ім.І.Я.Горбачевського (46001, м.Тернопіль, вул. Руська, 12).

Автореферат розісланий 21 вересня 2001 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор медичних наук, професор Боднар Я.Я.

АНОТАЦІЯ

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.04 - патологічна фізіологія. Тернопільська державна медична академія ім.І.Я.Горбачевського МОЗ України. - Тернопіль, 2001.

Дисертація присвячена важливій проблемі сучасної онкології - дослідженню закономірностей розвитку синдрому ендогенної інтоксикації в експерименті та клініці. Проведено комплексне експериментальне дослідження пероксидного окиснення ліпідів, як одного з основних механізмів пошкодження клітинних мембран при пухлинному рості, а також прослідковано зв'язок даного процесу з хірургічним і цитостатичним лікуванням. Для цього використовували метод індукованої хемілюмінесценції плазми крові в сукупності з біохімічним визначенням продуктів пероксидного окиснення ліпідів (дієнових кон'югатів, малонового диальдегіду) та антиоксидантної активності (каталази, супероксиддисмутази, глутатіонпероксидази) в експериментальних тварин з карциномою Ерліха та у хворих на рак легень до і після лікування. Результати порівнювали з відповідними параметрами плазми крові контрольної групи. Встановлена кореляція у поведінці біохімічних та фізичних характеристик досліджень. Запропоновано механізм проходження реакції пероксидного окиснення ліпідів і математична модель процесу окиснення, які добре узгоджуються з одержаними експериментальними результатами.

Ключові слова: рак легень, плазма крові, інтенсивність хемілюмінесценції, пероксидне окиснення ліпідів, антиоксидантна активність, лікування онкологічних хворих.

АННОТАЦИЯ

Иванкив О.Л. Состояние эндогенной интоксикации и защитных систем при опухолевом росте. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.04 - патологическая физиология. Тернопольская государственная медицинская академия им. И.Я. Горбачевского МОЗ Украины. - Тернополь, 2001.

Диссертация посвящена важной проблемме современной онкологии - исследованию закономерностей развития синдрома эндогенной интоксикации в экспериментальных и клинических условиях. Учитывая полученные результаты, можна утверждать о развитии эндогенной интоксикации в процессе опухолевого роста. Так, при экспериментальной асцитной карциноме Эрлиха у мышей в плазме крови прогрессивно увеличивается концентрация среднемолекулярных пептидов, особенно той фракции их, которые не имеют в своем составе ароматических аминокислот. По мере накопления токсических продуктов в крови животных с опухолью изменялись физико - химические особенности мембран форменных элементов ее. При этом увеличивалась проницаемость мембран эритроцитов, а также их сорбционная способность.

В зависимости от продолжительности опухолевого роста развиваются характерные особенности изменений иммунологической реактивности. После привития карциномы мышам наблюдались значительные изменения со стороны гуморального звена иммунологической реактивности, которые проявлялись повышением в плазме крови уровня иммуноглобулинов A, M, G, повышением количества больших и мелких циркулирующих имунных комплексов.

Проведено комплексное экспериментальное исследование перекисного окисления липидов, как одного из основных механизмов повреждения клеточных мембран при опухолевом росте. Проанализирована связь этого процесса с хирургическим и цитостатическим лечением. Для этого использовали метод индуцированной хемилюминесценции плазмы крови в совокупности с биохимическим определением продуктов перекисного окисления липидов (диеновых коньюгатов, малонового диальдегида) и антиоксидантной активности (каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы) у экспериментальных животных с асцитной карциномой Эрлиха и у больных раком легких до и после лечения. Результаты сравнивали с соответствующими параметрами плазмы крови контрольной группы. Повышенная активность перекисного окисления липидов и высокая концентрация продуктов липопероксидации в крови поддерживается на протяжении всего периода заболевания. Удаление очага опухолевого роста или угнетение его химиотерапевтическими препаратами некоторым образом восстанавливает сбалансированность прооксидантных процессов в организме, уменьшает проявления “опухолевого токсикоза”. Установлена корреляция в поведении биохимических и физических характеристик исследований. Предложен механизм прохождения реакции перекисного окисления липидов и математическая модель процесса окисления, которые хорошо согласуются с полученными экспериментальными результатами.

Таким образом, в процессе опухолевого роста в клинических условиях развивается комплекс метаболических нарушений и неспецифических клинических проявлений, которые можна охарактеризовать как синдром эндогенной интоксикации. Условно его можна разделить на следующие фазы:

- доклиническая фаза или фаза метаболических нарушений. Характеризуется нарушением про - и антиоксидантных процессов; изменения часто носят специфический характер вследствие продукции опухолевых маркеров; - фаза ранних проявлений интоксикации. Расширяется спектр метаболических нарушений, увеличивается уровень малонового диальдегида, диеновых конъюгатов, изменяется активность супероксиддисмутазы, снижается интенсивность хемилюминесценции плазмы крови, увеличивается концентрация в крови циркулирующих имунных комплексов, а также имеют место субъетивные жалобы: слабость, раздраженность, нарушения сна, сниженная работоспособность; - развитие умеренной интоксикации. Концентрация продуктов липопероксидации - диеновых коньюгатов, малонового диальдегида выходит на наивысший уровень, значительно изменяется активность, супероксиддисмутазы уменьшается интенсивность хемилюминесценции плазмы крови, максимально увеличивается в крови количество циркулирующих имунных комплексов. Кроме субъетивных жалоб, выражены объективные изменения: похудение, гипертермия, бледность или серость кожных покровов, потливость, тахикардия, затруднения при выполнении физической работы; - выраженная интоксикация, конечным проявлением которой является кахексия, фиксируется исчезновением второго максимума на кривой интенсивности хемилюминесценции плазмы крови, уменьшается уровень малонового диальдегида, активность каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы крови.

Такая трактовка развития токсических нарушений при раке позволяет сосредоточить внимание на ранних проявлениях интоксикации и проводить комплекс лечебных мероприятий для предупреждения возникновения выраженной интоксикации, особенно в процессе химиотерапевтического лечения.

Ключевые слова: рак легких, плазма крови, интенсивность хемилюмине-сценции, перекисное окисление липидов, антиоксидантная активность, лечение онкологических больных.

ANNOTATION

Ivankiv O.L. Endogenous intoxication and condition of resistant systems in tumour growth. - Manuscript.

Thesis on search of the scientific degree of candidate of medical sciences by speciality 14.03.04 - pathologic physiology - I.Gorbachevsky Ternopil State Medical Academy, - Ternopil , 2001.

Dissertation is dedicated to a significant update oncological problem - research of peculiarities of the development of endogenous intoxication syndrom in experiment and clinics. Complex experimental studies of lipid peroxide oxidation as one of the main mechanisms of the cellular membrane lesion in tumour growth were conducted and interrelation of this process with the surgical and cytostatic treatment assessed. To this purpose, the method of initiated chemiluminiscence of blood plasma in combination with the biochemical determination of products of lipid peroxide oxidation ( dien conjugates, malondialdehyde) was used. Antioxidant action of catalase, superoxidesmutase, peroxidase glutatione in experimental animals with Erlich's carcinoma and in patients with the lung, stomach and breast cancer was estimated before and after the treatment. The results were compared to the adequate findins of blood plasma in the control group. The correlation of the investigated biochemical and biophysical characteristics was determined. Mechanisms of the course of lipid peroxide oxidation and a mathematical model of the oxidation process were suggested, they corresponding to the results obtained experimentally.

Key words: lung cancer, blood plasma, intensity of chemiluminiscence, lipid peroxidation, antioxidant activify, neoplasma treatment.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. За останні роки у всьому світі, в тому числі в Україні, спостерігається тенденція до зростання онкологічних захворювань (Гуслицер Л.Н., 1988, Ганина К.П., 1996, Білинський Б.Т., 1997, 1998). Результати традиційних хірургічних і хіміотерапевтичних методів лікування клініцисти стали пов'язувати з ендогенною інтоксикацією, викликаною посиленням процесів катаболізму, нагромадженням в організмі проміжних і кінцевих продуктів обміну, біологічно - активних речовин, деструкцією тканин, яка суттєво знижує їх (Body J.J.,1987, Молюк Е.Д.,1993, Николаев В.Г.,1997). Тому, вивчення загальних рис морфології і функції структурних елементів та проявів синдрому ендогеннної інтоксикації, закономірностей його розвитку, порушень зв'язків між окремими структурно-функціональними системами і їх регуляторними механізмами внаслідок реакції організму на дію токсинів є актуальною фундаментальною проблемою в біології і медицині (Уманский М.А., Пінчук Л.Б., 1979, Norton et al., 1987, Карабанов Г.Н., 1985,1989, Фецич Т.Г., 1998, 1999).

Успіхи при вирішенні даної проблеми в сучасній медицині пов'язані із застосуванням поряд з традиційними - нових методів та ідей. Серед них перспективними є фізико-хімічні методи, в тому числі хемілюмінесценція (Тарусов Б.Н., 1961), за спектрами якої визначають інтенсивність вільнорадикального окиснення, що дає інформацію про обмін речовин (Барабой В.А., 1997) та стан пероксидного окиснення ліпідів (Владимиров Ю.А., 1978; Журавльов А.И., 1991), що можна використати як неспецифічний показник ендогенної інтоксикації.

Вивчення процесів ліпопероксидації і реакцій антиоксидантного захисту має важливе значення як в експериментальних, так і клінічних дослідженнях, поскільки пероксидному окисненню ліпідів надається значна роль, як одному з основних механізмів пошкодження клітини (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972). Порушення рівноваги між даними процесами має велике значення в розумінні патогенезу різних захворювань, в тому числі онкологічних, а також може бути важливим показником, який в цілому може свідчити про характер метаболічних змін в організмі.

Пероксидне окиснення ліпідів відноситься до показників, які здатні дати нову важливу інформацію про пухлинний процес, про вплив пухлини на організм і визначає пухлинну хворобу як вільнорадикальну патологію (Серкіз Я.І., Чеботарев Е.Е., 1984). Одним з найбільш адекватних методів вивчення пероксидного окиснення ліпідів є біофізичний метод визначення інтенсивності надслабкого світіння біологічних тканин - спонтанна або індукована хемілюмінесценція (Сидорик Е.П, Баглей Е.А.,1989).

У літературі процес ендогенної інтоксикації викладений переважно у вигляді характеристики симптомів захворювання, клінічної картини інтоксикації, при майже повній відсутності інформації про механізми його розвитку. Одне з найскладніших і маловивчених питань вчення про інтоксикацію - проблема локального вогнища як первинного джерела токсинів і реалізації інтоксикації на рівні організму, тобто відповіді всіх клітинних, тканинних і органних систем. Якраз ця проблема є основною в розробці патогенетичної терапії ендогенної інтоксикації (Уманский М.А., Пінчук Л.Б., 1979, Фецич Т.Г., 1998, 1999).

Особливо важливим є одночасне дослідження маркерів ендогенної інтоксикації, хемілюмінесценції плазми крові з визначенням вмісту продуктів пероксидного окиснення ліпідів, активності антиоксидантного захисту, імунної відповіді в процесі розвитку експериментальної пухлини та співставлення цих результатів з клінічними даними обстежень, що дозволить всебічно оцінити синдром ендогенної інтоксикації.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація є фрагментом планової наукової програми досліджень кафедри онкології і медичної радіології Львівського державного медичного університету ім. Данила Галицького на тему “Сучасні підходи до хіміотерапії рака з врахуванням системного впливу пухлин і токсичної дії цитостатиків“ (шифр ІН.18.00.0001.97). Автором особисто досліджувався вплив дії цитостатиків на перебіг онкологічних захворювань, що викладено в матеріалах дисертації.

Мета і задачі дослідження. Визначити в експериментально - клінічному аспекті патогенетичну роль ендогенної інтоксикації і системи імунного та антиоксидантного захисту при злоякісному пухлинному рості і застосуванні хірургічного і цитостатичного лікування хворих та вдосконалити її діагностику з допомогою хемілюмінесценції. Для досягнення цієї мети було поставлено наступні завдання:

1. Вивчити показники імунного захисту та параметри маркерів ендогенної інтоксикації на основі визначення середньомолекулярних пептидів, сорбційної здатності еритроцитів, циркулюючих імунних комплексів у досліджуваних тварин з асцитною карциномою Ерліха.

3. З'ясувати в модельних дослідах механізми окиснення ліпідів, характер його перебігу та роль антиоксидантної системи для теоретичного обгрунтування діагностики синдрому ендогенної інтоксикації.

4. Дослідити активність процесів пероксидного окиснення ліпідів за рівнем продуктів ліпопероксидації та функціональний стан системи антиоксидантного захисту плазми крові в мишей з асцитною карциномою Ерліха та в онкологічних хворих на різних стадіях пухлинного росту і в результаті їх лікування.

Об'єкт дослідження - пухлинний ріст.

Предмет дослідження - ендогенна інтоксикація і системи імунного та антиоксидантного захисту.

Методи дослідження - про наявність ендогенної інтоксикації судили на основі визначення середньомолекулярних пептидів (СМ), сорбційної здатності еритроцитів (СЗЕ), циркулюючих імунних комплексів (ЦІК). Стан пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ) оцінювали за допомогою методу хемілюмінесценції (ХЛ), визначення вмісту продуктів ПОЛ - дієнових кон'югатів (ДК), малонового діальдегіду (МДА). Для оцінки антиоксидантного захисту визначали активність ферментів каталази, супероксиддисмутази (СОД), глутатіонпероксидази (ГП). Стан імунної системи оцінювали за рівнем імуноглобулінів Ig A, G, M і фагоцитарної активності - за допомогою тесту нітросинього тетразолію (NST - тест).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в експерименті та клініці проведено комплексне дослідженння ракової інтоксикації з допомогою методу хемілюмінесценції. Досліджено кінетику інтенсивності надслабкого світіння плазми крові, співставлено отримані результати з рівнем факторів гуморальної імунореактивності, що дало можливість виявити нові закономірності розвитку ендогенної інтоксикації.

Встановлено, що стан ендогенної інтоксикації супроводжується порушенням балансу про- та антиоксидантних процесів і є суттєвою ланкою в патогенезі пошкодження клітинних мембран при пухлинному рості. Дано математичний опис процесу окиснення ліпідів, який розкриває і обгрунтовує суть процесу пероксидації ліпідів при пухлинному рості.

На основі теоретичних і експериментальних узагальнень доведено, що окиснені антиоксиданти відновлюються при окисненні ліпідів плазми крові і знову окиснюються, багаторазово повторюючи процес. При цьому встановлено, що кінетика інтенсивності хемілюмінесценції плазми крові залежить від концентрації антиоксидантів і автокаталітичних її властивостей.

Доказана ефективність застосування цитостатичного та хірургічного лікування хворих на рак для нормалізації окисно - відновних процесів та утримання пероксидного окиснення ліпідів і антиоксидантної активності в динамічній рівновазі.

Практичне значення одержаних результатів. Результати проведених досліджень розширюють знання про вплив ендогенної інтоксикації на організм, зокрема, на процеси ПОЛ, імунну та антиоксидантну системи. Використання результатів проведених комплексних досліджень окремих патогенетичних ланок метаболічних порушень при онкологічній патології дає можливість більш адекватно оцінювати стан інтоксикації та діагностувати захворювання.

Розроблена методика ХЛ плазми крові складає практичний інтерес і може бути застосована в: наукових дослідженнях з метою вивчення активності процесу ПОЛ, його зміщення від стаціонарного рівня при захворюванні на рак, а також виявлення ролі антиоксидантів у процесі ПОЛ; лікувальній практиці як метод моніторингу хворих після закінчення радикального лікування, а також як додатковий метод діагностики і уточнення стадії процесу.

Матеріали дисертації включено до програми навчання лікарів на кафедрі онкології і медичної радіології Львівського державного медичного університету ім. Данила Галицького, що підтверджено актами впроваджень.

Особистий внесок здобувача полягає в оцінці сучасного стану вивчення та актуальності проблеми на основі проведеного глибокого літературного огляду, виборі та опрацюванні моделей і методик дослідження, самостійному проведенні як експериментальних досліджень, так і участі в клінічному обстеженні тематичних хворих з подальшим вивченням клінічного матеріалу, статистичній обробці, аналізі, узагальненні отриманих результатів, рекомендацій.

Здобувачем разом з керівником сформульовано завдання роботи, проведено обговорення, аналіз одержаних результатів та формулювання висновків.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації оприлюднені на I з'їзді Українського біофізичного товариства (Київ, 1994), IX з'їзді онкологів України (Вінниця, 1995), Міжнародному конгресі молодих вчених українців “Актуальні питання медицини” (Івано-Франківськ, 1995), Міжнародній науково-практичній конференції “Нові підходи до організації і проведення лікування, реабілітації і рекреації в умовах курорту” (Трускавець, 1995), VІІ Українському біохімічному з'їзді (Київ, 1997), спільній науковій конференції кафедр онкології, патофізіології і біохімії ЛДМУ(Львів,1997/98), 2^nd International Medical Conferens for Students and Young Doctors and 9^th EMSA International Scintific Symposium (Lublin, Poland, 2000), ІІ Міжнародному Смакулівському симпозіумі “Фундаментальні і прикладні проблеми сучасної фізики“ (Тернопіль, 2000).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 наукових праць, 4 з яких - у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, інші - у матеріалах наукових конференцій і з'їздів, які повністю віддзеркалюють зміст дисертації.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 128 сторінках і складається із вступу, 7 розділів, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних літературних джерел, який містить 230 бібліографічних описів. Робота ілюстрована 12 рисунками і 16 таблицями. Загальний обсяг ілюстрацій, таблиць, списку використаних джерел та додатків складає 23 сторінки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Досліди проводили на 160 безпородних білих мишах, яких утримували в умовах стандартного харчового раціону. Карциному Ерліха отримали із банку пухлинних штамів Київського інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.Р.Є. Кавецького НАН України. Карциному прищеплювали мишам шляхом внутрішньоочеревинного введення 10 млн. живих клітин (0,3-0,5 мл розведеної асцитної рідини) на тварину. Тварин декапітували під ефірним наркозом. Досліджувані параметри визначали у сироватці крові та асцитній рідині на 7, 14, 21 добу після прищеплення карциноми.

Під обстеженням знаходилося 20 практично здорових осіб - донорів Львівської станції перливання крові і 135 осіб хворих на рак легень, шлунка, грудної залози, які знаходилися на лікуванні у Львівському обласному онкологічному диспансері. Діагноз встановлювали на основі клінічних спостережень і результатів морфологічних, рентгенологічних та лабораторних досліджень.

При аналізі клінічних проявів ендогенної інтоксикації, у хворих оцінювали суб'єктивні (слабість, втомлюваність, зниження працездатності) та об'єктивні (блідість або сірість шкірних покривів, похудіння, підвищення температури тіла, пітливість) симптоми. Хворим проводили хірургічне та хіміотерапевтичне лікування. Застосовували поліхіміотерапію FAP (Wakui A., Kikuchi K., 1990) хворим з неоперабельним раком шлунка у зв'язку з проростанням його у суміжні структури, або дисемінацією раку по очеревині в межах верхнього поверху черевної порожнини. Хворим на рак легень, шлунка, грудної залози І, ІІ, ІІІ стадій проводили радикальні операції. Кров у хворих забирали з ліктьової вени, натще після встановленого діагнозу і на 14, 21, 28 день після проведеного лікування.

Вимірювання інтенсивності ХЛ проводилося на біохемілюмінометрі БХЛ-06, програмне забезпечення якого дозволяло фіксувати кінетику процесу та розраховувати максимальну інтенсивність світіння (І_max ХЛ), загальну світлосуму сигналу - S (60с) та швидкість наростання і спаду світіння. Чутливість приладу 100 квантів/імп., з коефіцієнтом підсилення від 1 до 100. Температура в усіх випадках підтримувалася при 381⁰С. В склад біохемілюмінометра входив пристрій зв'язку з персональним комп'ютером типу ІВМ/РС (Серкиз Я., Чеботарев Е., 1984).

Рівень ПОЛ у плазмі крові оцінювали також за вмістом дієнових кон'югатів (ДК) та малонового діальдегіду (МДА), які визначали методами В.В.Гаврилова та М.І.Мішкорудної (1983р.), Р.А. Тімірбулатова та Е.І.Селезньова (1981р.). Стан антиоксидантної системи (АОС) крові визначався за активністю каталази (М.А.Королюк, 1968) та супероксиддисмутази (СОД) (Костюк В.А., 1990), глутатіонпероксидази (ГП) (Моин В.И.,1986).

Рівень циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) проводили за допомогою ПЕГІКЕМ - тесту (Haskova V., Kaslik J., Math J., 1977), вміст імуноглобулінів А, G, М визначали методом радіальної дифузіїї в агарі (Mancini C., Carbonara A.O., Heremans J.E., 1965), для функціональної активності поліморфноядерних лейкоцитів використовували тест відновлення нітросинього тетразолію - NST-тест (Park J., 1968). Середньомолекулярні пептиди (СМ) - обчислювали коефіцієнт (К_СМ) - відношення значення оптичної густини при 280 нм до такого ж при 254 нм (Н.І. Габріелян і співавт., 1984,1985), визначення величини сорбційної здатності еритроцитів (СЗЕ) проводили за А.А.Тогайбаєвим і співавт., 1988. Результати лабораторних досліджень були опрацьовані методом варіаційної статистики, достовірність різниці оцінювали за критерієм Стьюдента.

Основні результати досліджень. На підставі отриманих результатів можна стверджувати про розвиток ендогенної інтоксикації в процесі пухлинного росту. Так, при експериментальній асцитній карциномі Ерліха у мишей в плазмі крові прогресивно наростає концентрація середньомолекулярних пептидів, особливо тієї фракції їх, які не мали в своєму складі ароматичних амінокислот, а ті, що мали їх, зростали на початку прищеплення пухлини (7 доба) і на кінцевому етапі росту (21 доба). Можливо, що деструктивні процеси в організмі і пухлині відбуваються в певній взаємообумовленій послідовності, що веде до своєрідних змін біохімічного складу крові.

В міру накопичення токсичних продуктів у крові тварин з пухлиною змінювалися фізико - хімічні властивості мембран форменних елементів. При цьому підвищувалася проникність мембран еритроцитів, зростала їх сорбційна здатність. Сорбційна здатність еритроцитів мишей з асцитною карциномою збільшилась на 14 - ту добу розвитку пухлини на 31,9 %, а на 21 - шу добу - на 62,3 % порівняно з контрольними тваринами. Причиною підвищення концентрації токсичних метаболітів є первинні порушення обміну речовин пов'язані з недостатнім надходженням в організм продуктів, необхідних для здійснення нормальних анаболічних процесів, інші порушення, наслідком яких є підвищення катаболізму та спотворення біосинтетичних процесів. Важливою причиною синдрому ендогенної інтоксикації є також пошкодження бар'єрних систем і утворень, які в нормальних умовах перешкоджають проникненню токсичних речовин в міжклітинну рідину та клітини (Габріелян Н.І., 1984).

Залежно від тривалості пухлинного росту розвиваються характерні особливості змін імунологічної реактивності. Після прищеплення карциноми мишам виникали значні зрушення з боку гуморальної ланки імунологічної реактивності, які проявлялися підвищенням у плазмі крові рівня імуноглобулінів A, M, G, зростанням кількості великих і дрібних імунних комплексів. Слід зазначити, що в процесі розмноження і розпаду пухлинних клітин в асцитній рідині відбувалося поступове підвищення рівня імуноглобулінів у плазмі крові і на 14 - ту добу вони досягали максимальних значень. В найбільшій мірі підвищувався рівень (на 55,7 %) Ig M, а концентрація Ig G зросла на 36,1 %, Ig А - на 28,6%. Така неоднорідність реакції з боку зазначених класів імуноглобулінів пов'язана з їх функціональним значенням. Відомо, що Ig M та Ig G опосередковують реакцію антитілозалежної клітинної цитотоксичності, що в даному разі в повній мірі відповідає їх реакції на пухлинний ріст. Руйнування пухлинних клітин, у свою чергу, призводить до появи в рідких середовищах організму різнодисперсних антигенів, які, реагуючи з наявними імуноглобулінами, сприяють утворенню різної величини імунних комплексів. Результати представлені у таблиці 1.

інтоксикація антиоксидантний пухлина цитостатичний

Таблиця 1. Концентрація імуноглобулінів класів G, М, А, рівень циркулюючих імунних комплексів у плазмі крові мишей з карциномою Ерліха (М m)

Примітка: - р < 0,05 порівняно з контролем; - р < 0,01 порівняно з контролем.

Як свідчать наші дослідження, циркулюючі імунні комплекси починали утворюватись в значних кількостях на ранніх етапах пухлинного росту, тобто на 7 - му добу і досягали значних концентрацій, як і імуноглобуліни, на 14 - ту добу. Спочатку переважали великі і середні імунні комплекси, а в подальші терміни, коли інтенсивно йшло не тільки розмноження пухлинних клітин, а також і їх руйнування, переважали великі і дрібні. На 14 - ту добу прищеплення пухлини концентрація в плазмі крові великих імунних комплексів збільшилася майже вдвічі, дрібних - в 1,6 рази, середніх - в 1,3 рази. На шляху елімінації імунних комплексів різної дисперсності із судинного русла відбувалась активація протеолізу крові, підвищувалася фагоцитарна активність поліморфноядерних лейкоцитів. Так, якщо в контрольній групі тварин NST-тест становив 10,00,1%, то на 7-му добу після прищеплення мишам карциноми він досягав 14,31,5%, а на 14-ту добу росту пухлини становив уже 17,51,8% (р0,01), що неминуче призводило до збільшення концентрації біологічно - активних речовин у крові, порушень мікроциркуляції і органних пошкоджень. Підвищена здатність поліморфноядерних лейкоцитів до фагоцитозу має в даному разі подвійне значення: по - перше, вона спрямована на знищення як фрагментів зруйнованих пухлинних клітин, так і життєздатних клітин, а по - друге - на захоплення і знищення преципітованих імунних комплексів. Враховуючи наявність значної кількості антигенних компонентів крові, які з'являються внаслідок розвитку пухлини, ця захисна реакція може перевищити фізіологічні межі і набути патологічного значення, проявом чого є ендогенна інтоксикація. В той же час по відношенню до пухлинних клітин вона виявляється недостатньою, щоб ліквідувати пухлинний процес. Одною із причин цього може бути опосередковане блокування клітинної відповіді неадекватною гуморальною реакцією.

Одними з найважливіших елементів ендогенної інтоксикації є продукти, що утворюються внаслідок вільнорадикального окиснення, ініційованого активними формами кисню, металами змінної валентності, метаболічними перетвореннями в пухлинних клітинах, лейкоцитах крові, макрофагах тканин та інших клітинах організму під дією токсичного впливу речовин і змінених обмінних процесів. В більшості випадків вільнорадикальне окиснення зростає прямопропорційно до тяжкості захворювання (Журавлев А.К, Шерстнев М.П., 1985, Барабой В.А., Сутковой Д.А.,1997), а тому метод хемілюмінесценції може використовуватися для оцінки ступеня тяжкості хвороби.

Виявилося, що прищеплення асцитної карциноми мишам викликає зниження світлосуми ініційованої хемілюмінесценції їх плазми крові, починаючи з ранніх етапів розвитку пухлини. Так, на 7 - му добу вільнорадикальне окиснення зменшилося порівняно з контрольною величиною у 2,5 рази, а на 14 - ту і 21 - шу доби цей показник був дещо вищим на відміну від попереднього терміну, але не досягав вихідного рівня, і зниження відбулося відповідно в 1,8 рази і у 2,3 рази. Різко знижувався також рівень максимальної інтенсивності хемілюмінесценції, який становив на 7 - му і 14 - ту доби росту пухлини лише 46,9 % від контрольного. В подальшому, у міру прогресування росту пухлини і розвитку інтоксикації, він зменшився у 2,2 рази на 21 - шу добу.

Дослідження хемілюмінесценції суспензії асцитної рідини і осадових клітин карциноми Ерліха свідчить про суттєві порушення співвідношення про- і антиоксидантних процесів у пухлині даного експериментального штаму. Зокрема, світлосума ініційованої хемілюмінесценції як суспензії асцитної рідини, так і осадових пухлинних клітин, взятих на 7 - му і 14 - ту доби розвитку пухлини, знижувалась по мірі подальшого її росту. Отримані результати хемілюмінесценції цих субстратів дозволяють припустити, що гальмування вільнорадикального окиснення в пухлині відбувається за рахунок активації антиоксидантного захисту, посиленого транспорту антиоксидантів з місця їх біосинтезу і нагромадження в пухлині.

У зв'язку з вищенаведеними узагальненнями були проведені дослідження хемілюмінесценції плазми крові хворих на рак легень, у результаті яких була виявлена особлива і характерна її кінетика. Кінетика інтенсивності ХЛ плазми крові донорів і хворих на рак легень представлена на рис.1.

Рис.1. Кінетика інтенсивності хемілюмінесценції плазми крові донорів (крива а) та хворих на рак легень (крива б).

Проведені експериментальні дослідження розкривають діагностичні можливості методу хемілюмінесценції в клінічній онкології для раннього встановлення токсичності процесу і як додатковий метод діагностики і уточнення стадії процесу.

Так, інтенсивність хемілюмінесценції першого максимуму кінетичної кривої виявилася нижчою в 1,3 - 1,5 рази, ніж у донорів, потім вона знижувалася з часом по експоненті перших 15 с від початку світіння, а через 15 - 20 с знову починалося підсилення хемілюмінесценції і з'являвся другий, значно менший ніж перший максимум.

Видно, що кінетика інтенсивності ХЛ плазми крові хворих зареєстрована з двома максимумами. Наявність двох максимумів на кінетичній кривій свідчить, що відбувається не просте монотонне зниження з часом швидкості окиснення ліпідів та антиоксидантів, а наприкінці першої половини за часом настає ще додаткове світіння (поява другого максимуму), викликане окисненням ліпідів окисненими антиоксидантами, яке протікає паралельно з першими двома процесами окиснення.

Отже, реальний процес - це одночасний процес окиснення ліпідів киснем, який виділяється при дисоціації пероксиду водню, окиснення антиоксидантів киснем такого ж походження, а також окиснення ліпідів окисненими антиоксидантами, яке породжує другий максимум на кінетичній кривій хемілюмінесценції. Величина цього максимуму є значно меншою, порівняно з головним максимумом. Наявність неявного другого максимуму виявляється по зламу на графіку логарифмічної шкали. Поява двох максимумів на кінетичній кривій хемілюмінесценції плазми крові хворих на рак легень свідчить про появу нового окиснювача ліпідів.

З метою з'ясування механізмів розвитку даного явища була побудована феноменологічна модель, яка дозволяє описати швидкість окиснення ліпідів. При цьому враховується зміна з часом концентрації ліпідів і антиоксидантів в їх реакції з киснем, а швидкість окиснення ліпідів пероксидом водню (dL₁/dt) і окисненими антиоксидантами (dL₂/dt) визначають інтенсивність ХЛ плазми крові у вигляді:

_,

де к₁, к₂ - коефіцієнти квантового виходу, а аналітичні вирази для швидкості окиснення (dL₁/dt) та (dL₂/dt) описуються системою диференціальних рівнянь. Швидкість перебігу хімічних реакцій пропорційна масам відповідних речовин, що вступають в реакцію (ліпідів, антиоксидантів, кисню).

Модельна крива інтенсивності ХЛ плазми крові, отримана шляхом чисельного розв'язку системи диференціальних рівнянь виявилася близькою до досліджуваної як за характером, так і за інтенсивністю процесів, залежить від концентрації антиоксидантів та її відношення до концентрації ліпідів. Розрахункові кінетичні криві інтенсивності ХЛ плазми крові при різних значеннях концентрацій антиоксидантів і ліпідів та їх відношень повністю охоплюють всі експериментально одержані криві. Широкий спектр спостережуваних експериментальних кінетичних кривих дотепер залишався без пояснення, що в значній мірі сповільнювало використання методу ХЛ на практиці. На рис.2 представлена крива (3) I(t) залежності інтенсивності ХЛ плазми крові від часу при концентрації в ній антиоксидантів n. При збільшенні їх концентрації ця крива трансформується (рис.2б) і наближається до експериментально спостережуваної. Повне співпадіння розрахованої і спостереженої часової залежності інтенсивності ХЛ плазми крові має місце при n^m (m>1) і представлено на рис.2в. Це означає, що під час реакції окиснення ліпідів, в тому числі окисненими антиоксидантами, антиоксиданти вступають в реакцію більше, ніж один раз. Повторна взаємодія антиоксидантів в розвиненій моделі враховується через показник степені m концентрації антиоксиданта n в рівнянні для швидкості окиснення, який є більшим за одиницю.

Рис.2. Криві інтенсивності хемілюмінесценції плазми крові при різній концентрації антиоксидантів: а) n, б) N > n, в) n^m (m > 1);

1-швидкість окиснення ліпідів пероксидом водню, 2-швидкість окиснення антиоксидантів, 3-сумарна швидкість окиснення ліпідів пероксидом водню і окисненими антиоксидантами.

Таким чином, запропонована модель ПОЛ в повній мірі відповідає реальному процесу і пояснює всі закономірності окиснення ліпідів плазми крові донорів і хворих на рак легень. Приведені результати підтверджують важливу роль антиоксидантів в біохімічних процесах, які відбуваються в організмі.

Концентрація вільних радикалів і продуктів ПОЛ при хворобах на рак зростає, що свідчить про інтоксикацію організму (S.Noriki, Y.Imamura, 1989, М.А. Уманский, 1979) і є одним із проявів симптомокомплексу “пухлинного токсикозу”.

На підставі отриманих результатів можна засвідчити про наростання токсичних проявів у процесі росту пухлини різної локалізації. У всіх хворих до лікування (хірургічного чи хіміотерапевтичного) спостерігалося збільшення первинних і вторинних продуктів пероксидного окиснення ліпідів. Найбільш виражені ці прояви були виявлені у хворих на рак легень і шлунка. Після лікування в бік нормалізації змінювався тільки рівень МДА. Активність каталази знижувалася переважно в післяопераційний період.

З метою знаходження кореляційних зв'язків між даними біохімічних аналізів плазми крові і хемілюмінесценції вибрали 20 хворих на рак легень і 15 хворих на рак шлунка, в яких, крім ДК і МДА, процеси ПОЛ досліджували методом хемілюмінесценції. Результати представлені в таблиці 2.

Таблиця 2. Зміни інтенсивності ХЛ, вмісту ДК, МДА, активності каталази у хворих на рак легень у процесі хірургічного лікування та у хворих на рак шлунка в процесі хіміотерапії(M m)

Примітка: * - Р 0,01 порівняно з контролем; **- Р 0,05 порівняно з контролем.

Виявилося, що інтенсивність хемілюмінесценції плазми крові обох груп хворих була нижча від контрольної майже на третину, а кількість продуктів ПОЛ вища приблизно в 1,5 рази. Така розбіжність в кількісних даних інтенсивності хемілюмінесценції і вмістом ДК і МДА не суперечить моделі процесу ПОЛ, запропонованої нами раніше, а, навпаки, підтверджує її. Крім того, інтенсивність хемілюмінесценції плазми крові фіксує швидкість реакції ПОЛ в даний момент часу, а ДК і МДА накопичуються протягом всього періоду і кількість їх добре корелює з величиною площі під кінетичною кривою хемілюмінесценції плазми крові. До того ж окиснені в процесі ПОЛ антиоксиданти, з одного боку, сповільнюють швидкість окиснення ліпідів і внаслідок цього зменшують інтенсивність хемілюмінесценції, а з другого боку - окиснені антиоксиданти продовжують окиснювати ліпіди, збільшуючи продукти реакції - ДК і МДА. Таким чином, співвідношення кількісних величин хемілюмінесценції плазми крові хворих на рак і величин продуктів пероксидації ліпідів відображає хід одного і того ж процесу з різних сторін.

Підвищена активність ПОЛ і висока концентрація продуктів пероксидації ліпідів у крові підтримується протягом всього періоду перебігу захворювання. Видалення вогнища пухлинного росту або пригнічення його хіміотерапевтичними препаратами в певній мірі повертає збалансованість прооксидантних процесів в організмі, зменшує прояви “пухлинного токсикозу”.

Організм здатний тривалий час підтримувати процес вільнорадикального окиснення на стаціонарному рівні, завдяки наявності потужної антиоксидантної системи. Одною з головних ланок її є ферментативна. Тому на наступному етапі наших досліджень у хворих на рак легень, шлунка, грудної залози вивчалась активність ферментів супероксиддисмутази і глутатіонпероксидази на різних стадіях захворювання і в процесі оперативного та хіміотерапевтичного лікування. У хворих на рак легень активність супероксиддисмутази суттєво підвищувалася тільки на третій стадії росту пухлини, а на четвертій стадії різко знижувалася. Активність глутатіонпероксидази прогресивно знижувалася, починаючи з першої стадії раку легень. У цих же хворих концентрація ДК і МДА в крові невпинно зростала, починаючи від першої стадії хвороби, а на четвертій стадії вона вже вдвічі перевищувала контрольні величини. Після хірургічного втручання у хворих на рак легень, коли не спостерігалися післяопераційні ускладнення, активність супероксиддисмутази різко знижувалась, починаючи з раннього періоду (7 днів), а в подальшому підвищувалася і не досягала рівня передопераційного періоду. В тому випадку, коли були наявні ускладнення, активність ферменту залишалася на низькому рівні до 28 дня. Концентрація в крові МДА при цьому залишалася високою, на відміну від хворих без операційних ускладнень, в яких цей показник через два тижні був значно нижчий, порівнюючи з доопераційним рівнем.

Звичайно, що активність ферментів антиоксидантної системи залежить не тільки від наявності хвороби, але в значній мірі також від вікових особливостей хворих на рак. Нами спостерігалися хворі на рак легень двох груп: перша - віком від 35 до 60 років, друга - старші 60 років. Активність супероксиддисмутази виявилася в 1,8 рази нижчою у хворих 60 і більше років, порівнюючи з контрольними. Активність глутатіонпероксидази була знижена у хворих обох вікових груп відповідно у 2,5 рази і в 4,3 рази. Інтенсивність хемілюмінесценції плазми крові хворих на рак легень спостерігалась на найбільш низькому рівні у хворих першої групи. Отже, у хворих на рак легень з віком послаблюється активність ферментів антиоксидантної системи, що неминуче веде до більшої активації процесу пероксидації ліпідів, нагромадженню токсичних продуктів оксидації і більшому прояву ендогенної інтоксикації з усіма негативними наслідками.

Дослідження в крові продуктів вільнорадикального окиснення та активності системи антиоксидантного захисту плазми крові мишей з асцитною карциномою Ерліха свідчить про підвищену активність прооксидантних процесів та недостатню антиоксидантну активність, особливо на ранніх стадіях токсикозу. Інтенсифікація пероксидного окиснення ліпідів супроводжувалася підвищенням концентрації в крові тварин ДК і МДА: на сьому добу відповідно на 38,5 % і на 56,7 %; на чотирнадцяту добу - на 84,6 % і 83,3 %; на двадцять першу добу - відповідно на 84,6 % і 50,2 %. Активність каталази спочатку знижувалася, потім вирівнювалася з контрольною, а в пізній період (двадцять першу добу) підвищувалася. При дослідженні активність ПОЛ і АОА суспензії асцитної рідини спостерігали зворотню тенденцію. Рівень продуктів пероксидації знижувався, особливо на пізніх стадіях розвитку карциноми, на фоні значного підвищення активності каталази. Отже, у хворих на рак з різною локалізацією існує дисбаланс активності процесів вільнорадикального окиснення і антиоксидантного захисту, що веде до нагромадження гідропероксидів та проміжних і кінцевих продуктів ПОЛ, розвитку ендогенної інтоксикації. Порушення динамічної рівноваги в системі ПОЛ - АОС є важливим механізмом пошкодження клітинних мембран при канцерогенезі. Внаслідок цього виникають порушення життєдіяльності тканин, органів і організму в цілому. Хірургічне та хіміотерапевтичне лікування з оптимальним ефектом призводить до корекції окисно - відновних процесів, утримуючи процеси пероксидного окиснення ліпідів і антиоксидантну активність в динамічній рівновазі. В інших випадках, зокрема цитостатичне лікування, особливо без видалення первинного вогнища пухлинного росту, часто призводить до наростання клінічних проявів інтоксикації (слабість, нудота, блювота та ін) і виражених порушень прооксидантних та антиоксидантних процесів, які зберігаються тривалий час після закінчення лікування, зумовлюючи порушення якості життя і обмежують можливість проведення наступних циклів хіміотерапії.

Таким чином, у процесі пухлинного росту в клінічних умовах розвивається комплекс метаболічних порушень і неспецифічних клінічних проявів, які можна охарактеризувати як синдром ендогенної інтоксикації. Умовно його можна розділити на наступні фази:

- доклінічна фаза або фаза метаболічних порушень. Характеризується порушенням про - та антиоксидантних процесів; зміни часто носять специфічний характер внаслідок продукції пухлинних маркерів;

- фаза ранніх проявів інтоксикації. Розширюється спектр метаболічних порушень, зростає рівень МДА, ДК, змінюється активність СОД, знижується І_ХЛ плазми крові, підвищується концентрація в крові ЦІК, а також мають місце суб'єктивні скарги: слабість, роздратованість, порушення сну, знижена працездатність;

- розвиток помірної інтоксикації. Концентрація продуктів ліпопероксидації - ДК, МДА виходить на найвищий рівень, значно змінюється активність СОД, знижується І_ХЛ плазми крові, максимально збільшується в крові кількість ЦІК. Крім суб'єктивних скарг є виражені об'єктивні зміни: похудіння, гіпертермія, блідість або сірість шкірних покривів, пітливість, тахікардія, труднощі при виконанні фізичної роботи;

- виражена інтоксикація, кінцевим проявом якої є кахексія, фіксується зникненням другого максимума на кінетичній кривій І_ХЛ плазми крові, знижується рівень МДА, активність каталази, СОД, ГП крові.

Таке трактування розвитку токсичних порушень при раку дозволяє зосередити увагу на ранніх проявах інтоксикації і проводити комплекс лікувальних заходів для запобігання виникнення вираженої інтоксикації, особливо в процесі хіміотерапевтичного лікування.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі стосовно пухлинного росту, що виявляється у встановленні ролі у цьому патологічному процесі ендогенної інтоксикації та розкриває механізми її впливу на пероксидне окиснення ліпідів, антиоксидантну активність та імунологічну реактивність, прослідковано зв'язок процесів пероксидного окиснення ліпідів і антиоксидантного захисту в результаті застосування хірургічного та цитостатичного лікування. В результаті вирішення наукової задачі встановлено такі наукові і прикладні висновки:

1. У процесі росту експериментальної пухлини і розпаду пухлинних клітин у плазмі крові збільшується концентрація середньомолекулярних пептидів, підвищується сорбційна здатність еритроцитів, що є свідченням розвитку синдрому ендогенної інтоксикації.

2. Вивчення хемілюмінесценції крові експериментальних тварин, а також в онкологічних хворих дозволяє виявити нові закономірності розвитку ендогенної інтоксикації, як важливої складової частини пухлинного процесу в організмі. Зокрема, встановлено, що у хворих на рак легень IІ і IІІ ст. інтенсивність хемілюмінесценції плазми крові менша ніж у донорів на 30-40 %, що свідчить про порушення балансу про- та антиоксидантних процесів.

3. Пухлинний ріст супроводжується підвищенням процесів ліпопероксидації із збільшенням первинних і вторинних продуктів пероксидного окиснення ліпідів - дієнових кон'югатів та малонового діальдегіду, підвищенням активності супероксиддисмутази, зниженням активності глутатіонпероксидази крові в хворих на ІІ-ІІІ стадії та пригніченням активності ферментів антиоксидантного захисту (супероксиддисмутази, глутатіонпероксидази, каталази) на ІV стадії захворювання. Крім того, активність ферментів антиоксидантної системи послаблюється з віком, що сприяє ще більшому підвищенню пероксидації ліпідів і нагромадженню токсичних продуктів.

4. Встановлено особливості формування адаптаційної імунної відповіді в динаміці експериментальної карциноми Ерліха, що характеризується підвищенням рівня імуноглобулінів A, M, G, середніх та дрібних імунних комплексів у плазмі крові з активацією кілінгової активності полінуклеарів крові в стадії маніфестації карциноми в мишей.

5. Досліджений механізм процесу пероксидного окиснення ліпідів включає три складові ланки: окиснення ліпідів, окиснення антиоксидантів, окиснення ліпідів продуктами окиснених антиоксидантів. Ці три чинники зумовлюють утворення характерної кінетичної кривої інтенсивності хемілюмінесценції плазми крові хворих на рак легень і можуть бути зображені рівняннями в аналітичному вигляді.

6. Клінічно ефективне лікування хворих на рак легень, шлунка, грудної залози призводить до нормалізації окисно-відновних процесів, утримуючи пероксидне окиснення ліпідів і антиоксидантну активність в динамічній рівновазі. Застосування хіміотерапевтичного лікування не усуває прояви інтоксикації, а в ряді випадків викликає, навпаки, підсилення її внаслідок більшого розповсюдження пухлинного процесу і підвищення деструкції пухлинних клітин.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1.Пропонується використовувати параметри кінетики інтенсивності хемілюмінесценції плазми крові як метод моніторингу хворих після проведеного радикального лікування, а також як додатковий метод діагностики і уточнення стадії процесу при онкологічній патології.

2.Запропоновані критерії оцінки ступеня інтоксикації онкологічних хворих використовувати в практичній медицині з метою визначення показів до застосування детоксикаційної терапії.

3.Використовувати результати наших досліджень у навчальному процесі на кафедрах біохімії, патофізіології, онкології медичних вузів України у вигляді задач та інформаційно - аналітичних карт.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.Білинський Б.Т., Іванків О.Л., Тимочко М.Ф., Шлемкевич М.П. Про кінетику інтенсивності хемілюменесценції крові хворих на рак легенів // Експериментальна онкологія. - 1996. - Т.18, № 3. -С.290 - 292.