ЯМР-спектроскопия и ее применение в фармацевтическом анализе

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство здравоохранения Республики Беларусь

Витебский государственный медицинский университет

Кафедра фармацевтической химии с курсом ФПКС

Курсовая работа

на тему:

ЯМР-спектроскопия и ее применение в фармацевтическом анализе

Мельник Антон Дмитриевич

Витебск - 2013

Оглавление

Введение

1. История развития ЯМР-спектроскопии

2. Ядерный магнитный резонанс. Теоретические основы физики

3. Принципиальная схема ЯМР-спектрометра. Спектры ЯМР и их интерпретация

4. Приборы, применяемые в ЯМР-спектроскопии. Виды ЯМР-спектроскопии

5. Применение ЯМР-спектроскопии

Заключение

Литература

Введение

Кроме массы (М) и заряда (I), ядро имеет еще третью характеристику, а именно момент количества движения /, обусловленный его вращением (спином) вокруг оси. Поскольку атом можно рассматривать как миниатюрную солнечную систему, в которой вокруг солнца (ядра) вращаются планеты (электроны), постольку и ядерный спин можно сравнить с вращением солнца вокруг его оси. (Электроны также обладают спином, которые аналогичны вращению планет, вызывающему смену дня и ночи.)

Поскольку ядро заряжено, его вращение вокруг собственной оси приводит к круговому движению заряда, что формально эквивалентно электрическому току, движущемуся в витке провода. Круговой ток составляет соленоид, который создает магнитное поле, так что вращающееся ядро ведет себя подобно крошечному магниту, ось которого совпадает с осью спина. В результате этого ядро характеризуется магнитным дипольным моментом µ, величину которого можно измерить соответствующим образом.

Рассмотрим магнитный диполь, ориентированный под некоторым углом ? к направлению постоянного магнитного поля Н 0 (рис.1). Это поле обусловливает появление силы, стремящейся расположить магнит вдоль поля, но поскольку магнит вращается, то результатом будет прецессия магнита вокруг оси поля, подобно тому как прецессирует волчок, если он наклонен по отношению к силовым линиям гравитационного поля Земли. Классическая электродинамика показывает, что угловая скорость щ прецессии не зависит от угла ?, а пропорциональна напряженности приложенного поля Но:

щ=уН 0. (1)

Объяснение к рисунку 1: ядро находится в начале прямоугольных координат xyz, причем z параллельна Н 0.

Фактор пропорциональности у называется гиромагнитным отношением, оно включает ядерный магнитный момент µ, а также некоторые универсальные постоянные.

Теперь рассмотрим влияние небольшого магнитного поля Н 1 перпендикулярного к Н 0. Н 1 стремится отклонить диполь в плоскость ху (рис. 1), но это действие сравнительно малоэффективно до тех пор, пока Н 1 не вращается вокруг оси Н 0 с той же угловой частотой щ, что и частота прецессии. Если вращение Н 1 медленно изменять, проходя частоту прецессии, то при достижении частоты прецессии угол ? будет сильно изменяться, что соответствует обмену энергией между прецессирующим ядром и вращающимся полем Н 1. Это явление есть не что иное, как вид резонанса, так что теперь становится понятным термин "ядерный магнитный резонанс" (ЯМР). Обмен энергии соответствует поглощению или испусканию излучения, и его можно регистрировать.

В рамках квантовой теории необходимо принять дискретные энергетические уровни и переходы между ними, обусловленные испусканием или поглощением излучения. Квантованные энергетические уровни возникают как следствие ограничений, налагаемых правилами квантования на момент I количества движения ядра. Эти ограничения имеют две стороны. Во-первых, момент количества движения может принимать одно из возможных значение определяемых уравнением:

где I - квантовое число, которое может быть целым, полуцелым или равным нулю, и которую в химии можно рассматривать как характеристику данного ядра, иными словами все ядра одного вида, например, все протоны, характеризуются одной и той же величиной I. Важно понять, что ядра с одним и тем же спином, например, ядра фтора (19F) и фосфора (31P), а также протоны (1H), все имеют один и тот же момент количества движения I независимо от различия в массе. Аналогичным образом ядра с I=0 лишены спина и поэтому все они не магнитны. Углерод 12С и кислород 16О характерные представители этих атомов.

Второе квантовое ограничение относится к компоненте момента количества движения, направленных вдоль магнитных силовых линий приложенного поля Н 0 . Эта компонента Iz не может меняться непрерывно, а должна принимать одно из значений, задаваемых уравнением

Iz=mh/2р

Где m-квантовое число, которое может иметь любое из 2I+1 значений.

Суммарный результат заключается в том, что ось спина может занимать только некоторые определенные ориентации ? по отношению к направлению поля.

Потенциальная энергия Е диполя определяется выражением:

Е= µН 0cos?

Cледовательно, если ядро поместить в поле Н 0, то эта энергия будет либо возрастать, либо уменьшиться в зависимости от того, какая спиновая ориентация выбрана.

В радиочастотном поле вероятность переходов вверх (при поглощении) и вниз (при испускании) фактически одинакова. Следовательно суммарное поглощение энергии зависит от того будет ли ядер на нижнем или на верхнем уровнях. Если принять заселенность нижнего уровня за единицу, то относительную "заселенность" верхнего уровня можно найти с помощью фактора Больцмана

е-?Е/kt=1-?Е/kt

В уравнении ?Е обозначает расстояние между энергетическими уровнями ядра.

Эффекты окружения в протонном резонансе.

Если бы для всех ковалентно связанных атомов водорода резонанс наблюдался бы при одной и той же частоте, то нельзя было бы получить никаких сведений о структуре. В действительности же частота резонанса водорода несколько меняется в различных молекулах и даже в различных положениях в одной и той же молекуле, так что спектр позволяет распознавать типы водородных атомов в неизвестной структуре. Сдвиги частоты никак не связаны с самими протонами, так как все протоны имеют одинаковые магнитные моменты; различным образом связанные протоны имеют различное окружение, взаимодействие которого с приложенным полем заставляет точную величину поля вблизи протона весьма незначительно изменяться от одного случая к другому. Следовательно, протоны в различных положениях в молекуле оказываются в слегка отличающихся полях, хотя приложенное внешнее поле одинаково для всех. Суммарный эффект окружения для данного протона можно разбить на две части, одна из которых связана с окружающими электронами, а другая-- с соседними магнитными ядрами. Рассмотрим теперь эти два фактора по порядку. ядерный фармацевтический лекарственный химический

Электронное экранирование. Химический сдвиг. Рассмотрим вначале такой простой углеводород, как метан СН ₄. Действие магнитного поля должно вызвать вращение всей системы электронов вокруг некоторой оси, как это указано на рис. 3 для одного из электронов. Вращающиеся электронные заряды составляют соленоид, поле которого направлено против внешнего поля, так что суммарное поле вблизи ядра несколько меньше, чем поле, приложенное извне. В этом смысле электроны частично экранируют, или заслоняют, ядро от внешнего поля. В случае метана все атомы водорода эквивалентны и поэтому экранированы в равной мере, так что резонансный спектр состоит из одной линии.

Резонанс наступает тогда, когда поле вблизи протона достигает критического значения, поэтому, чем больше экранировано данное ядро, тем большее поле необходимо приложить, чтобы вызвать резонанс ядра.

Влияние других магнитных ядер: спин-спиновое взаимодействие. Взаимодействие между ядрами принимает простейшую форму в тех молекулах, которые содержат только два неэквивалентных магнитных ядра. Наличие неэквивалентных атомов водорода у соседних атомов углерода усложняет спектр. Это усложнение делает спектр более информативным.

На спектре данное влияние проявляется в расщеплении сигнала. Расстояние между линиями в расщепленном сигнале называется константой спин-спинового взаимодействия (КССВ), которая не зависит от внешнего поля Н0. Это важно, т.к. позволяет различить два отдельных синглета от сигнала в виде дублета. Для этого необходимо записать спектры при различных радиочастотах. Если интервал между пиками пропорционально изменяется, значит, эти пики разных синглетов, т.е. двух разных протонов, а не дублет одного протона. В общем виде взаимодействие протона с n неэквивалентными ему протонами у соседнего атома углерода приводит к резонансному сигналу, состоящему из n+1 пиков. Таким образом, мультиплетность сигнала несет информацию о том, сколько протонов находится с ним по соседству. Интенсивность сигнала пропорциональна числу протонов, дающий данный сигнал [4].

3. Принципиальная схема ЯМР-спектрометра. Спектры ЯМР и их интерпретация

Впервые явление ядерного магнитного резонанса осуществил на практике в своем эксперименте Пурселлом. Сердцем спектрометра ЯМР является мощный магнитный образец, помещенный в стеклянную ампулу диаметром около 5 мм, заключается между полюсами сильного электромагнита. Затем ампула начинает вращаться, а магнитное поле, действующее на нее, постепенно усиливают. В качестве источника излучения используется радиочастотный генератор высокой добротности. Под действием усиливающегося магнитного поля начинают резонировать ядра, на которые настроен спектрометр. При этом экранированные ядра резонируют на частоте чуть меньшей, чем номинальная частота резонанса (и прибора).

Поглощение энергии фиксируется радиочастотным мостом и затем записывается самописцем. Частоту увеличивают до тех пор, пока она не достигнет некого предела, выше которого резонанс невозможен.

Рис.1 Схема спектрометра ЯМР: 1 - катушка с образцом; 2 - полюса магнита; 3 -генератор радиочастотного поля; 4 -усилитель и детектор; 5 - генератор модулирующего напряжения; 6 - катушки модуляции поля Н 0; 7 - осциллограф.

Так как идущие от моста токи весьма малы, снятием одного спектра не ограничиваются, а делают несколько десятков проходов. Все полученные сигналы суммируются на итоговом графике, качество которого зависит от отношения сигнал/шум прибора.

В данном методе образец подвергается радиочастотному облучению неизменной частоты, в то время как сила магнитного поля изменяется, поэтому его еще называют методом постоянного поля (CW).

Традиционный метод ЯМР-спектроскопии имеет множество недостатков. Во-первых, он требует большого количества времени для построения каждого спектра. Во-вторых, он очень требователен к отсутствию внешних помех, и, как правило, получаемые спектры имеют значительные шумы. В-третьих, он непригоден для создания спектрометров высоких частот (300, 400, 500 и более МГц). Поэтому в современных приборах ЯМР используется метод так называемой импульсной спектроскопии (PW), основанной на фурье-преобразованиях полученного сигнала. В настоящее время все ЯМР-спектрометры строятся на основе мощных сверхпроводящих магнитов с постоянной величиной магнитного поля.

В отличие от CW-метода, в импульсном варианте возбуждение ядер осуществляют не "постоянной волной", а с помощью короткого импульса, продолжительностью несколько микросекунд. Амплитуды частотных компонент импульса уменьшаются с увеличением расстояния от н0. Но так как желательно, чтобы все ядра облучались одинаково, необходимо использовать "жесткие импульсы", то есть короткие импульсы большой мощности. Продолжительность импульса выбирают так, чтобы ширина частотной полосы была больше ширины спектра на один-два порядка. Мощность достигает нескольких ватт.

В результате импульсной спектроскопии получают не обычный спектр с видимыми пиками резонанса, а изображение затухающих резонансных колебаний, в котором смешаны все сигналы от всех резонирующих ядер - так называемый "спад свободной индукции" (FID, free induction decay). Для преобразования данного спектра используют математические методы, так называемое фурье-преобразование, по которому любая функция может быть представлена в виде суммы множества гармонических колебаний.

На рисунке 3 представлен ЯМР-спектрометр. Большая часть его - это просто большой "холодильник", заполненный двумя очень холодными жидкостями, жидким азотом и жидким гелием. Жидкий азот обладает температурой -195oC, а жидкий гелий кипит при -269oC.Жидкий гелий находится в самой центральной части холодильника, и он охлаждает сверхпроводящую катушку, которая создает магнитное поле при -269oC, а все это окружено жидким азотом, который предотвращает слишком быстрое испарение жидкого гелия.

Отверстие в верхней части прибора (на которое показывает лаборант) используется для загрузки образцов в спектрометр. Когда образец попадает в машину, то струя воздуха вращает пробирку, чтобы при сканировании образец был более однородным.

Когда образец готовится для ЯМР-спектроскопии в виде раствора, то растворитель или его часть должна быть насыщена дейтерием. Это означает, что часть атомов водорода в молекуле растворителя должна быть заменена атомами дейтерия. У атома водорода ядро состоит из единственного протона, а у дейтерия - из протона и нейтрона. Это необходимо, чтобы "привязать" ЯМР к фиксированной частоте, чтобы во время снятия спектра не возникло систематической ошибки.

Радиочастотный генератор посылает к образцу "импульсы", то есть короткие всплески радиоволн. Эти волны поглощаются и передаются через образец в приемник, который улавливает сигнал от образца. Затем информация передается в компьютер, связанный с ЯМР-спектрометром, в котором данные переводятся, и происходит их анализ.

Я опишу метод для 1H, поскольку именно в этом случае наглядно проявляются свойства ЯМР-спектроскопии.

Все ядра обладают положительным зарядом и постоянно вращаются как волчок. Движущийся заряд создает магнитное поле. В ЯМР, когда мы облучаем ядро электромагнитным излучением радиодиапазона, это заставляет ядро и его магнитное поле поворачиваться (то есть возникает ядерный магнитный резонанс, отсюда и название ЯМР). В ЯМР-спектрометре существует проволочная катушка, которая окружает образец. Мы также знаем из физики, что магнит, движущийся внутри проволочной катушки, вызывает перемещение зарядов в этой катушке. Поэтому когда магнитное поле ядра поворачивается, это вызывает появление в проволоке тока, который может быть зафиксирован компьютером.

Информация на выходе спектрометра выглядит примерно вот так:

Рисунок 4

Данный спектр называется Свободным Затуханием Индукции или СЗИ. Он выглядит именно так потому, что когда на ядра действует электромагнитный импульс, то спины одинаковых ядер группируются вместе, а после того, как импульс закончился, они медленно разбредаются в разные стороны, поэтому сигнал затухает. После преобразования получают вот такой спектр:

Рисунок 5

Прежде, чем определять, какой из пиков соответствует определенному ядру, необходимо задать масштаб для химических сдвигов спектров. Химический сдвиг - это характеристика положения пика в спектре. Для того, чтобы проградуировать шкалу спектра, необходим стандарт. Таким стандартом часто служит тетраметилсилан или ТМС.

ТМС используется потому, что это одна из наиболее сильно экранированных молекул, а все ее протоны эквивалентны. Поэтому эта молекула должна проявиться в спектре как единственный пик, который может потом быть использован для задания точки отсчета в спектре. Его пик находится в нулевой точке графика вверху.

Но на спектре присутствуют не просто несколько отдельных пиков, а некоторые отдельные пики, некоторые - двойные, а иногда и большие группы пиков. Каждая из этих групп пиков соответствуют одному типу ядер, а не разным, как можно предположить. Причиной же того, является то, что атомы водорода, присоединенные к одному атому углерода, взаимодействуют, то есть испытывают влияние со стороны магнитных полей соседних атомов водорода. Это взаимодействие "расщепляет" сигнал на несколько пиков, видимых в спектре. Это расщепление следует правилу, которое называется "правило N + 1". Оно заключается в том, что количество пиков для каждого типа водорода равно количеству атомов водорода на соседних ядрах (N) плюс единица.

Для качественного анализа при помощи ЯМР используют анализ спектров, основанный на таких свойствах данного метода:

· сигналы ядер атомов, входящих в определенные функциональные группы, лежат в строго определенных участках спектра;

· интегральная площадь, ограниченная пиком, строго пропорциональна количеству резонирующих атомов;

· ядра, лежащие через 1-4 связи, способны давать мультиплетные сигналы в результате т. н. расщепления друг на друге.

Положение сигнала в спектрах ЯМР характеризуют химическим сдвигом их относительно эталонного сигнала. В качестве последнего в ЯМР 1Н и 13С применяют тетраметилсилан Si(CH₃)₄. Единицей химического сдвига является миллионная доля (м.д.) частоты прибора. Если принять сигнал ТМС за 0, а смещение сигнала в слабое поле считать положительным химическим сдвигом, то мы получим так называемую шкалу д. Если спектр вещества слишком сложен для интерпретирования, можно воспользоваться квантовохимическими методами расчета констант экранирования и на их основании соотнести сигналы [7]

4. Приборы, применяемые в ЯМР-спектроскопии. Виды ЯМР-спектроскопии

По назначению ЯМР - спектрометры делят на приборы высокого и низкого разрешения. Граница здесь условная, и все чаще характеристики ЯМР - спектрометров высокого и низкого разрешения объединяют в одном универсальном приборе. Типичный прибор низкого разрешения должен иметь магнит, обеспечивающий относительное разрешение порядка 10-6 ч-1, возможность регистрации ЯМР многих магнитных ядер в широком интервале температур, сопряжение с системой обработки данных, гониометр для кристаллофизических измерений [6].

Спектрометры высокого разрешения по способу нахождения условий резонанса разделяются на стационарные и импульсные спектрометры. В стационарных спектрометрах резонанс находится изменением (разверткой) одного из параметров (частота или величина магнитного поля) при фиксировании другого. В импульсных спектрометрах при постоянном внешнем поле образец облучают коротким высокочастотным импульсом, при котором возбуждаются все соответствующие переходы ЯМР, дающие отклик- сигнал спада свободной индукции. Фурье- преобразование этого сигнала дает обычный спектр ЯМР.

Фурье-ЯМР спектрометры. Приборы данного семейства позволяют использовать до 10 рабочих радиоканалов, каждый из которых поддерживает широкий диапазон частот: от 10 МГц до 1 ГГц. При этом каждый канал управляется независимо от других. ECA спектрометры обеспечивают генерацию импульсов произвольной формы, в зависимости от решаемой задачи. Управление частотой, фазой и амплитудой сигнала осуществляется с высокой скоростью и точностью.

ЯМР-спектрометр 60. Эта управляемая компьютером экономичная ЯМР-система предназначена для исследования протонов 1H. Использование постоянного магнита обеспечивает высокое качество, стабильность работы и простоту технического обслуживания. Управление прибором максимально упрощено, дружественный интерфейс штатного программного обеспечения позволяет выполнять любые операции в один "клик" мышью. JNM-MY60 имеет также функцию сбора и хранения информации, а также обеспечивает необходимую точность их обработки, поскольку все операции выполняются в цифровом виде. Он представлен на рисунке 6. Эта модель идеальна как для работы (проверка результатов органического синтеза), так и для обучения [6]. А Фурье-модификация (FT NMR) этого прибора позволяет проводить исследования на еще более высоком уровне: позволяет наблюдать спектры всех магнитных ядер [9].

В последнее время приобретают все большую популярность импульсные методы регистрации широких линий ЯМР в твердых телах, однако здесь возникают свои трудности. Чтобы одинаковым образом возбудить все переходы в спиновой системе, необходимо применять очень короткие импульсы, что требует мощных источников радиочастотных колебаний. Кроме того, временный отклик спиновой системы для широких линий затухает очень быстро; чтобы за несколько микросекунд произвести достаточное число отсчетов, необходим аналого-цифровой преобразователь с быстродействием порядка 0,1 мкс канал.

Большие трудности возникают из-за звона контура в датчике и перегрузки приемника после мощного импульса. Преимуществом импульсной техники является то, что в одном эксперименте могут быть определены все параметры ядерного магнетизма в образце - моменты, форма линии и времена релаксации. По теореме Фурье, большие частоты соответствуют малым временам. Поэтому создаются импульсные методы для анализа явлений, происходящих через ничтожно малое время после окончания импульса. Они повышают точность определения высших моментов линии ЯМР вплоть до n=14.

В ЯМР-спектроскопии используют двойной и тройной резонанс. Для упрощения сложных спектров ЯМР на образец накладывают второе радиочастотное поле Н 2, частота которого совпадает с положением сигнала, мешающего расшифровке спектра. Амплитуда магнитного поля выбирается достаточной для насыщения переходов соответствующего ядра, устраняя ССВ этого ядра с др. ядрами молекулы. Если наложить на поле Н 2 шумовую модуляцию, то достигается выключение ССВ всех ядер в выбранном спектральном интервале. Такое подавление широко применяют при наблюдении ЯМР 13С и других ядер. Методом тройного резонанса ЯМР 13С-{1Н}-57 Fе измерялись химические сдвиги в органических соединениях железа. Применяют многочисленные разновидности множественных резонансов.

Двумерная и многомерная фурье-спектроскопия. Двумерная фурье-спектроскопия - естественное обобщение методов двойного резонанса. В одномерной спектроскопии спектр получают как фурье-образ отклика G(t) спин-системы на зондирующий импульс. В двумерной спектроскопии эксперимент начинается с приготовления спин-системы в некотором заданном состоянии посредством импульса или серии импульсов. Время эволюции системы после ее приготовления разбивается на равные интервалы. После каждого i-го интервала t2i = ni xt2 (ni= 1, 2, 3, ..., N2)производится обычная регистрация получившегося i-гo отклика Gi(t1). После N2 фурье-преобразований получают N2 спектров, отображающих в частотной области (от спектра к спектру) эволюцию спин-системы на интервале t2. Эволюция каждого соответственного пика в этих спектрах создает интерферограмму Gj(t2). После необходимого числа фурье-преобразований получают двумерный спектр, отображающий выбранные парные взаимодействия в изучаемой системе. Чаще всего такой спектр изображают в виде карты, пики на которой окружены замкнутыми изолиниями. Двумерную спектроскопию ЯМР применяют для анализа протон-протонных, протон-углеродных, углерод-углеродных и т. п. спин-спиновых взаимодействий. в самых сложных молекулах, для исследования многопозиционного химического обмена, структурного анализа белков в растворах. Разбив при помощи удачно подобранной импульсной последовательности период эволюции на две части, вводят в эксперимент время t3 и переходят к 3-мерной спектроскопии; ведутся успешные работы по 4- и 5-мерной фурье-спектроскопии ЯМР.

Многоквантовая фильтрация. Использование импульсных последовательностей позволяет, помимо разрешенных переходов можно наблюдать также первоначально запрещенные переходы m = 3 и т. д. (т. наз. n-квантовая фильтрация). При включении в схему эксперимента двухквантового фильтра из сложного спектра высокого разрешения будут удалены все линии первого порядка. Это существенно облегчает интерпретацию спектров олиго- и полипептидов и др. сложных молекул.

Релаксационная спектроскопия. Ядерная магнитная релаксация обусловлена процессами обмена энергией между ядерными спинами. Переориентация спинов в поле Н 0 происходит под действием флуктуирующих локальных магнитных или электростатических. полей. В зависимости от механизма обмена энергией различают диполь-дипольную, квадрупольную, спин-вращательную и др. типы релаксации.

Поскольку различные типы внутренних движений имеют различные времена корреляции, они м. б. выявлены с помощью измерения зависимостей времен спин-решеточной и спин-спиновой релаксации Т 1и Т 2 от частоты магнитных полей и температуры. Измерения Т 2и обнаружение максимумов скорости спин-решеточной релаксации позволяют отнести наблюдаемые изменения к конкретным типам движений специфичных молекулярных фрагментов, однозначно указывают на последовательность "размораживания" различных типов подвижности. Смещения максимумов Т 1-1при изменении Н 0 дают возможность измерить частоты соответствующих движений и на основании известных теоретических моделей измерить термодинамические параметры различных процессов в изучаемом образце. В простых случаях, если доминирует диполь-дипольный механизм релаксации, то из данных релаксационной спектроскопии ЯМР извлекают сведения о межъядерных расстояниях в молекулах жидкостей.

Квадрупольные эффекты. В твердых телах для ядер со спином I>1/2 возникают уровни энергии. Если e2Qq < 1 МГц, где eQ - электрический квадрупольный момент ядра, eq - градиент напряженности электрического поля (ГЭП) на ядре, то для монокристалла наблюдается 2I-1 линий, расстояния между которыми закономерно меняются при изменении ориентации кристалла в поле В 0. Из этих зависимостей находят положения главных осей тензора ГЭП, значения параметра его асимметрии и e2Qq. Выявляется химическая и кристаллографическая неэквивалентность. Это полезно при исследовании фазовых переходов и динамики решетки в сегнетоэлектриках, цеолитах и др. практически важных веществах. Примеси, вакансии, дислокации, любые напряжения решетки создают на квадрупольных ядрах разброс ГЭП, размывая линии ЯМР. Если МГц, то в хороших кристаллах соответствующие переходы можно наблюдать без поля Н 0. Это ядерный квадрупольный резонанс.

5. Применение ЯМР-спектроскопии

Спектроскопия ЯМР относится к неразрушающим методам анализа. Современная импульсная ЯМР фурье-спектроскопия позволяет вести анализ по 80 магнитным ядрам. ЯМР спектроскопия - один из основных физико-химических методов анализа, ее данные используют для однозначной идентификации, как промежуточных продуктов химических реакций, так и целевых веществ. Помимо структурных отнесений и количеств анализа, спектроскопия ЯМР приносит информацию о конформационных равновесиях, диффузии атомов и молекул в твердых телах, внутренних движениях, водородных связях и ассоциации в жидкостях, кето-енольной таутомерии, металлo- и прототропии, упорядоченности и распределении звеньев в полимерных цепях, адсорбции веществ, электронной структуре ионных кристаллов, жидких кристаллов и др. Спектроскопия ЯМР - источник информации о структуре биополимеров, в т. ч. белковых молекул в растворах, сопоставимой по достоверности с данными рентгеноструктурного анализа. В 80-е гг. началось бурное внедрение методов спектроскопии и томографии ЯМР в медицину для диагностики сложных заболеваний и при диспансеризации населения.

Число и положение линий в спектрах ЯМР однозначно характеризуют все фракции сырой нефти, синтетических каучуков, пластмасс, сланцев, углей, лекарств, препаратов, продукции химической и фармацевтической промышленности и др.

Интенсивность и ширина линии ЯМР воды или масла позволяют с высокой точностью измерять влажность и масличность семян, сохранность зерна. При отстройке от сигналов воды можно регистрировать содержание клейковины в каждом зерне, что так же, как и анализ масличности, позволяет вести ускоренную селекцию сельскохозяйственных культур.

Применение все более сильных магнитных полей (до 14 Тл в серийных приборах и до 19 Тл в экспериментных установках) обеспечивает возможность полного определения структуры белковых молекул в растворах, экспресс-анализа биологических жидкостей (концентрации эндогенных метаболитов в крови, моче, лимфе, спинномозговой жидкости), контроля качества новых полимерных материалов. При этом применяют многочисленные варианты многоквантовых и многомерных фурье-спектроскопических методик.

Практически сразу же после открытия ядерно-магнитный резонанс (ЯМР) стал использоваться в молекулярном анализе, метод позволяет определять точное расположение атомов в молекуле, т.е. молекулярную структуру различных соединений.

Одномерные ЯМР спектры содержат информацию обо всех химических сдвигах и обо всех атомах водорода в молекуле, однако для определения индивидуальных химических сдвигов этого бывает недостаточно. Проблема решается использованием двумерной ЯМР спектроскопии, из которой можно получить информацию об относительном положении атомов водорода в молекулах. Полная структура рассчитывается путем последовательного учета взаимодействий в двумерных спектрах.

Развитие аналитических методов двухмерной спектроскопии ЯМР в начале 1970-х гг. с применением Фурье-преобразования существенно расширило возможности анализа строения молекул. Несколько позднее ядерный магнитный резонанс стал применяться для изучения структуры биологических макромолекул, в частности белков.

Вообще говоря, для изучения молекулярных структур существует множество методик, однако только две из них рентгеновская кристаллография и ЯМР обладают разрешением, позволяющим различать отдельные атомы. Рентгеновская кристаллография является весьма привлекательной методикой, ее разрешающая способность составляет порядка 2A, однако для определения структуры белка кристаллографическими методами необходим большой белковый кристалл, внутри которого белки формируют регулярную решетку. При этом практически невозможно разрешить неструктурированные или мобильные части молекулы. При использовании ядерно-магнитного резонанса эта проблема не возникает. В ЯМР исследования проводятся в растворах, а на определение затрачивается очень небольшое время. Поэтому ЯМР позволяет различать как подвижные, так и доменные структуры.

При определении структуры белков обычно используют ЯМР спектры протонов (ядер водорода Н₁). Делается это по следующим причинам: водород Н₁ присутствует во многих узлах белков, нуклеиновых кислот и полисахаридов, кроме того ЯМР атома водорода Н₁ наиболее просто детектируется.

Для того чтобы при получении ЯМР-спектров в растворах не вносить погрешностей в результаты измерений используются специальные растворители для ЯМР, с повышенным содержанием дейтерия.

В настоящее время предельный размер белков, чья структура может быть определена методами ядерно-магнитного резонанса, составляет примерно 200 аминокислот.

Разработаны множество методик применения ЯМР-спектрометрии в химическом анализе. А.Г. Крушельницкий в своей работе "Обменная ЯМР спектроскопия твердого тела: применение для изучения крупномасштабной конформационной динамики биополимеров". Где обменный ЯМР эксперимент основан на сравнении резонансной частоты магнитного ядра до и после так называемого времени смешивания, что дает информацию о молекулярной динамике в миллисекундном и секундном диапазонах времени. Хотя в растворах обменные ЯМР эксперименты используются уже долгое время, в твердых телах их применение было ограничено рядом методических проблем. Только к концу 90-х годов XX века развитие методики твердотельной обменной спектроскопии позволило использовать этот тип экспериментов для исследования таких сложных объектов, как биополимеры [10].

Сотрудниками Казанского университета описана работа "ЯМР-спектроскопия в исследованиях структуры органических и биоорганических соединений в лиотропных жидкокристаллических системах" [11].

ЯМР-спектроскопия используется для определения продуктов метаболизма.

Это явилось основой для определения метаболитов в работе ЗАО "Научно-исследовательского института Аджиномото-Генетика". Оптимизации экспрессии генов в бактериальных клетках в биотехнологических исследованиях ХХI века". На основе ЯМР-спектроскопии препаратов гидролизата белков клеток, выросших в присутствии глюкозы с добавлением 10% [C13]-глюкозы, расчетным путем определен долевой вклад альтернативных цепей метаболических реакций в реальный процесс образования некоторых центральных метаболитов (Риболоза-5-фосфат - Rl5P; Глицеральдегид-3-фосфат - G3P; Оксалоацетат - OAA; Серин - Ser; Глицин - Gly). Этот современный метод исследований дает чрезвычайно полезную информацию о жизнедеятельности организма и рассматривается как очень перспективный. В качестве примера возможности получения информации о метаболизме клети был представлен результат анализа распределения основных потоков углерода в центральном метаболизме клетки E.coli дикого типа, растущей на среде, содержащей глюкозу в качестве единственного источника углерода, проведенный на основе экспериментов по ЯМР-спектроскопии.

Заключение

В последние годы наметилась тенденция к переходу на расширенное использование физических и физико-химических методов анализа. В частности, широко применяются спектральные методы: инфракрасная (ИК) и ультрафиолетовая (УФ) спектрофотометрия, спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и др. Активно используются хроматографические методы: высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), газожидкостная хроматография (ГЖХ), тонкослойная хроматография (ТСХ), электрофорез и др.

ЯМР дал учёным элегантный и точный метод определения химической структуры и свойств материалов и широко используется в настоящее время в физике и химии. Он также является основой метода ЯМР-изображений - одного из наиболее важных достижений в медицине XX-го века. За открытие ЯМР Пурселл и Блох были удостоены Нобелевской премии.

Основные достоинства метода ЯМР.

- Высокая разрешающая способность - на десять порядков больше, чем у оптической спектроскопии.

- Спектры ЯМР высокого разрешения позволяют проводить как качественный, так и количественный анализ (интенсивности (площади) сигналов при записи спектров пропорциональны числу магнитных ядер в каждой группировке, что дает возможность проводить количественный анализ по спектрам ЯМР без предварительной калибровки).

- Спектры ЯМР зависят от характера процессов, протекающих в исследуемом веществе. Поэтому эти процессы можно изучать указанным методом. Причем доступной оказывается временная шкала в очень широких пределах - от многих часов до малых долей секунды. Линии ЯМР в спектрах жидкостей обычно имеют ширину 0,1 - 1 Гц (ЯМР высокого разрешения), в то время как те же самые ядра, исследуемые в твердой фазе, будут обусловливать появление линий шириной порядка 1*104 Гц (отсюда понятие ЯМР широких линий).

- Современная радиоэлектронная аппаратура и ЭВМ позволяют получать параметры, характеризующие явление, в удобной для исследователей и потребителей метода ЯМР форме. Данное обстоятельство особенно важно, когда речь идет о практическом использовании экспериментальных данных.

-С помощью спектрометров работающих в импульсном режиме можно детектировать сигналы ЯМР от любого сколь угодно малого количества вещества. Конечно, в этом случае требуется просто больше времени, чтобы получить достаточно надежные экспериментальные результаты. Также внедрение импульсных спектрометров ЯМР в повседневную практику существенно расширило экспериментальные возможности этого вида спектроскопии. В частности, запись спектров ЯМР 13C растворов - важнейшего для химии изотопа - теперь является фактически привычной процедурой. Обычным явлением стало также детектирование сигналов от ядер, интенсивность сигналов ЯМР которых во много раз меньше интенсивности для сигналов от 1H, в том числе и в твердой фазе.

-Многие вещества, как известно, не растворяются или растворяются ограниченно. В этом случае сигнал ЯМР можно зарегистрировать от твердой фазы. Требуемая навеска исследуемого образца- до трех граммов. Уместно здесь отметить, что в процессе эксперимента образец не разрушается и может быть использован впоследствии для других целей.

-Высокая специфичность и оперативность метода ЯМР, отсутствие химического воздействия на образец, возможность непрерывного измерения параметров открывают многообразные пути его применения в промышленности.

-Метод ЯМР позволяет добиваться почти идеального спектрального разделения компонентов, поэтому анализ смеси, как правило, не требует дополнительного хроматографирования. Однако если число компонентов очень большое или резонансные пики соответствуют больше метаболитам, чем основным компонентам, то используют комбинированный метод ВЭЖХ-ЯМР или ВЭЖХ-ЯМР-МС. Поэтому популярность комбинированного метода ВЭЖХ-ЯМР при идентификации компонентов биожидкостей растет. Миниатюризация аппаратуры и возможности измерения пикомолярных количеств образца привлекают к себе большое внимание. Уже существуют экспериментальные системы для ВЭЖХ-ЯМР, соединенные с Фурье-преобразователем, ИК- и масс-спектрометрометрами. В будущем такие системы дадут возможность анализировать смеси добавок полимера или идентифицировать in vivo неизвестные компоненты, не изолируя их в индивидуальном виде.

С помощью ЯМР-анализа были расшифрованы и уточнены многие метаболические процессы - от биосинтеза коферментов в микробах и регуляции метаболизма глюкозы у млекопитающих до реакций переноса метильной группы в структуре метаболита при токсических поражениях печени [9].

Говоря о достоинствах приборов ЯМР, необходимо исходить из реальных возможностей в приобретении и эксплуатации ЯМР-спектрометров. В этой связи необходимо отметить следующее. Операторские обязанности при работе на этих спектрометрах может выполнять любой человек. Но самообслуживание и ремонт требуют высокой квалификации.

Внедрению метода ЯМР препятствуют: сложность аппаратуры и ее эксплуатации, высокая стоимость спектрометров, исследовательский характер самого метода.

Так в нашей стране ЯМР-спектроскопия не получила должностного распространения в связи с высокой стоимостью аппаратуры. Следует отметить, что ЯМР-спектроскопия в большей мере используется при анализе новых синтезированных или открытых в лекарственном сырье веществ, а так же в медицине.

Литература

1. Дж. Бранд, Г. Эглинтон Применение спектроскопии в органической химии, Москва "Мир" 1967

2. Фармацевтическое обозрение, Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова В.Л. Дорофеев сентябрь, 2002

3.Гюнтер Х. Введение в курс спектроскопии ЯМР, Москва "Мир" 1984

4. Дегтерев Е.В. Анализ лекарственных средств в исследованиях, производстве и контроле качества, Москва 2002

5. Абрагам А. Ядерный магнетизм, М.: Издательство иностранной литературы, 1963.

6.Сликтер Ч. Основы теории магнитного резонанса, М.: Мир, 1981.

7. Аминова Р.М. Квантовохимические методы вычисления констант ядерного магнитного экранирования - в журн. Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения. 2002. № 6. С. 11.

8. Дероум. Современные методы ЯМР для химических исследований.

9. www.bioinformatix.ru/metabolomika/metabolomika-i-metabonomika-sovremennyie-tehnologii-toksikologicheskih-issledovaniy-chast-4.html

10. Крушельницкий А.Г. Обменная ЯМР спектроскопия твердого тела: применение для изучения крупномасштабной конформационной динамики биополимеров, 2005

11. Гакель В.А. "Исследования по стандартизации сырья и настоек гомеопатических матричных кактуса крупноцветного" Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук, Москва 2008

12. Скороходова А.Ю., Зименьков Д.В., Гавриков А.В. Научно-исследрвальская работа "Оптимизация экспрессии генов в бактериальных клетках в биотехнологических исследованиях ХХI века" ЗАО "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ")

13.Клочков В.В., Клочков А.В. и соавторы научно-исследовательская работа " ЯМР-спектроскопия в исследованиях органических и биорганических соединений в лиотропных жидкокристаллических системах", Казанский государственный университет, Выпуск Х, часть 2, 2003

Размещено на Allbest.ru