Скоротлива активність гладеньких м'язів артерій та вміст внутрішньоклітинного Са2+ за дії оксиду азоту та його донорів

Размещено на http://www.allbest.ru/

Академія медичних наук України

Інститут фармакології та токсикології

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

14.03.05 -- Фармакологія

Скоротлива активність гладеньких м'язів артерій та вміст внутрішньоклітинного Са2+ за дії оксиду азоту та його донорів (експериментальне дослідження)

Легенький В'ячеслав Володимирович

Київ -- 2001 рік

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Відділі експериментальної терапії Інституту фармакології та токсикології АМН України

Науковий керівник: доктор медичних наук Соловйов Анатолій Іванович Інститут фармакології та токсикології АМН України головний науковий співробітник Відділу експериментальної терапії

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук Парамонова Галина Іванівна Інститут геронтології АМН України провідний науковий співробітник лабораторії фізіології

доктор біологічних наук, академік АМН України Головенко Микола Якович Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України завідувач лабораторії фізико-хімічної фармакології

Провідна установа: Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 к. б. н. Данова І.В.

Анотації

скоротливий кальцій гладенький м'яз

Легенький В.В. Скоротлива активність гладеньких м'язів артерій та вміст внутрішньоклітинного Са2+ за дії оксиду азоту та його донорів. -- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 04.03.05 -- фармакологія. -- Інститут фармакології та токсикології АМН України, Київ, 2001.

Дисертація присвячена дослідженню змін скоротливої активності та вмісту внутрішньоклітинного Са2+ гладеньких м'язів хвостової артерії щура за дії оксиду азоту та його фармакологічних донорів -- нітрогліцерину (НГ) та нітропрусиду (НПН).

У результаті проведених досліджень було доведено, що NO викликає розслаблення гладеньких м'язів (ГМ) хвостової артерії щура не лише за рахунок зниження внутрішньоклітинної концентрації Са2+, а також за рахунок зменшення Са2+-чутливості регуляторних та/або скоротливих білків. НГ виявився єдиною речовиною, для котрої із збільшенням її концентрації скоротлива активність зменшується набагато більше, ніж зменшується рівень [Са2+]і, тобто відбувається дисоціація між зміною вмісту [Са2+]і та скоротливою активністю.

Було показано, що дія будь-якої з досліджуваних речовин -- НГ, НПН та NO, істотно залежить від способу преактивації ГМ, де для всіх досліджуваних речовин відбувається закономірний зсув кривих концентрація-ефект праворуч за умов преактивації ГМ з допомогою фенілефрину.

Для всіх досліджуваних речовин встановлена здатність розслабляти ГМ хвостової артерії щура та знижати вміст [Са2+]і через альтернативний цГМФ-незалежний шлях. Дані свідчать, що Са2+-чутливість регуляторних та/або скоротливих білків ГМ хвостової артерії щура за дії NO є цГМФ-залежною. Було виявлено, що вплив НГ на ГМ хвостової артерії щура може бути цГМФ-незалежним, але є тіолзалежним.

Також було встановлено, що NO та НПН властивий як цГМФ-незалежний, так і тіолнезалежний вплив на ГМ хвостової артерії щура.

Ключові слова: гладенькі м'язи артерій, скоротлива активність, внутрішньоклітинний Са2+, оксид азоту, нітрогліцерин, нітропрусид натрію, Са2+-чутливість.

Аннотация

Легенький В.В. Сократительная активность гладких мышщ артерий и содежание внутриклеточного Са2+ при действии оксида азота и его доноров. -- Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 04.03.05 -- фармакология. -- Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины, Киев, 2001.

Диссертация посвящена исследованиям изменений сократительной активности и содержания внутриклеточного Са2+ гладких мышц хвостовой артерии крысы при действии оксида азота и его фармакологических доноров -- нитроглицерина (НГ) и нитропруссида натрия (НПН).

В результате проведённых исследований было доказано, что NO вызывает расслабление гладких мышц (ГМ) хвостовой артерии крысы не только за счёт снижения внутриклеточной концентрации Са2+, а также за счёт уменьшения Са2+-чувстительности регуляторных и/или сократительных белков. Общее снижение содержания [Са2+]і соответствует большему снижению сократительной активности, что также свидетельствует об изменении Са2+-чувстительности, то есть о прямом влиянии NO на регуляторные и/или сократительные белки.

Результаты исследований показали, что в условиях ингибирования активности расстворимой гуанилатциклазы (рГЦ) с помощью LY83583 NO теряет свою эффективность снижения сократительной активности ГМ по сравнению с контролем. При этом уровень [Са2+]і снижался намного больше, чем сократительная активность. В условиях преактивации ГМ раствором Кребса с добавлением фенилефрина (ФЕ), т. е. когда К+-каналы не являются заблокированными, NO на 100% снижал содержание [Са2+]і, тогда как сократительная активность снижалась от 10 до 50%. В условиях К+-активации ГМ максимальное сокращение составляло 30%, тогда как изменения содержания [Са2+]і были в несколько раз большими. Это свидетельствует о том, что NO остается способным при цГМФ-независимых условиях расслаблять ГМ, хотя это расслабление является подавленным. Наряду с этим уровень [Са2+]і претерпевает намного ощутимые изменения.

Реакции ГМ хвостовой артерии крысы на NO претерпели еще большее угнетение по сравнению с условиями только ингибирования рГЦ с помощью LY83583. Одновременное применение блокатора рГЦ -- LY83583 и дитиотреитола (ДТТ) показало, что NO в тех же концентрациях не влиял на сократительную активность и только незначительно влиял на содержание [Са2+]і. Результати показали, что при условиях сокращения ГМ фенилефрином NO при максимальных концентрациях вызвал 100% снижение содержания [Са2+]і, что свидетельствует о том, что активация К+-каналов непосредственно NO происходит не через SH-группу канала, а другим образом, и что именно активацией К+-каналов, а отсюда гиперполяризацией плазматической мембраны можно объяснить такое снижение по сравнению с условиями К+-активации ГМ. Применение ДТТ предоставило возможность показать важность имеющихся в наличии свободных восстановленных SH-групп в ГМ для действия NO.

НГ в контрольных условиях в диапазоне концентраций 10-7 -- 10-4 М проявил себя как соединение, вызывающее минимальные изменения содержания [Са2+]і и в несколько раз большие изменения сократительной активности, сопровождающиеся сокращением деполяризацией мембраны ГМ, когда К+-каналы являются заблокированными. НГ оказался единственным веществом, для которого с увеличением его концентрации сократительная активность уменьшается намного больше, чем уменьшается уровень [Са2+]і, то есть имеет место диссоциация между изменением содержания [Са2+]і и сократительной активностью ГМ.

Наличие реакции на НГ в условиях ингибирования рГЦ с помощью LY83583 оказалось достаточно неожиданным, поскольку большинство литературных источников свидетельствуют об отсутствии такого влияния. При одновременном применении дитиотреитола (ДТТ) как SH-восстанавливающего агента удалось полностью ингибировать влияние НГ на ГМ хвостовой артерии крысы, что подтверждает данные относительно необходимости наличия свободных тиоловых групп для биотрансформации НГ.

Результаты исследований показали, что НПН также способен менять Са2+-чувствительность ГМ. Для НПН, в отличие от НГ, при действии которого отмечается параллельное уменьшение как уровня [Са2+]і, так и силы сокращения, кратковременное изменение содержания [Са2+]і сопровождается длительным снижением сократительной активности, в то время как уровень [Са2+]і остаётся на исходном уровне, что является свидетельством снижения Са2+-чувстительности ГМ.

Как и в случае с NO, НПН в условиях ингибирования LY83583 не вызывал изменения Са2+-чувстительности. Изменения содержания [Са2+]і полностью коррелируют с изменениями сократительной активности ГМ. НПН является прямым донором NO, поэтому его влияние в схоже с влиянием NO и полученные результаты также доказывают, что как и в случае с NO, изменения Са2+-чувстительности ГМ зависят от цГМФ.

При условиях применения LY83583 и ДТТ реакции на НПН являются также подавленными и зависят целиком от концентрации НПН. Правда в отличие от NO, НПН вызывает снижение сократительной активности, что целиком обусловленно снижением содержания [Са2+]і. Это можно объяснить еще и непосредственным действием НПН на ГМ, за счет биотрансформации НПН в микросомной фракции ГМ, что соответствует литературным данным. Как и в случае с NO, влияние НПН на ГМ при условиях активации ФЕ является более выразительным, чем при условиях активации К+-сокращения, что объясняется теми самыми причинами.

Было показано, что действие любого из исследуемых веществ -- НГ, НПН и NO, существенно зависит от способа преактивации ГМ, где для всех исследуемых веществ происходит закономерный сдвиг кривых концентрация-эффект вправо при условиях преактивации ГМ с помощью ФЕ.

Для всех исследуемых веществ установлена способность расслаблять ГМ хвостовой артерии крысы и снижать содержание [Са2+]і через альтернативный цГМФ-независимый путь. Данные свидетельствуют, что Са2+-чувстительность регуляторных и/или сократительных белков ГМ хвостовой артерии крысы при действии NO есть цГМФ-зависимой. Было установлено, что влияние НГ на ГМ хвостовой артерии крысы может быть цГМФ-независимым, но есть тиолзависимым.

Также было показано, что NO и НПН характерно как цГМФ-независимое, так и тиолнезависимое влияние на ГМ хвостовой артерии крысы.

Ключевые слова: гладкие мышцы артерий, сократительная активность, внутриклеточный Са2+, оксид азота, нитроглицерин, нитропрусид натрия, Са2+-чувствительность.

Annotation

Lehen'kyi V.V. The effects of NO and its donors on contractility and intracellular calcium level of arterial smooth muscles. -- Manuscript.

A dissertation for obtaining a scientific degree "Candidate of biological sciences" in speciality 04.03.05 -- pharmacology. -- Institute of Pharmacology and Toxicology, Kyiv, 2001.

The dissertation aims to study the effects of both NO and its pharmacological donors -- nitroglycerine (NG) and sodium nitroprusside (SNP) on contractile activity and intacellular calcium level of rat tail artery smooth muscles.

The results obtained revealed that NO relaxes arterial smooth muscles of rat tail artery not only due to decrease in intacellular calcium level, but also due to decrease in Са2+-sensitivity of regulating and/or contractile proteins. NG proved to be a sole compound for which with the increase of its level the contractile activity is decreased more considerable rather than intacellular calcium level, i. e. a dissociation between changes in [Са2+]і level and contractile activity occurs.

It was shown that the action of any studied compound essentially depends on a type of arterial smooth muscles preactivation, wherein for all the studied compounds a right-hand shift between concentration-effect curves is observed for arterial smooth muscles preactivated with phenylephrine.

The ability to relax arterial smooth muscles and decrease intacellular calcium level via a cGMP-independent way is intrinsic for all the studied compounds. The data suggest that Са2+-sensitivity of regulating and/or contractile proteins of rat tail artery smooth muscles caused by NO is cGMP-dependent. It was revealed that NG effects on rat tail artery vascular smooth muscles may be cGMP-independent, but are thiol-dependent.

It was also proved that both NO and sodium nitroprusside exert their effects on rat tail artery smooth muscles via a cGMP-independent, and thiol-independent ways of relaxation as well.

Key words: arterial smooth muscles, contractile activity, intracellular calcium, nitric oxide, nitroglycerine, sodium nitroprusside, Са2+-sensitivity.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. У наш час біля шістдесяти відсотків людей, що гинуть від хвороб, страждають на хвороби серцево-судинної системи, більшість з яких викликана підвищенням кров'яного тиску в периферійній кровоносній системі або ішемією органів та тканин, що обумовлює перспективність цієї галузі досліджень для фармакології.

Історія застосування судинорозширюючих лікарських засобів налічує вже не одне десятиріччя, проте, усвідомлення внутрішньоклітинних процесів, що покладені в основу їх дії, і досі не досягнуто.

Існує чимало наукових робіт, присвячених дії судинорозширюючих лікарських засобів, зокрема засобів -- донорів NO, який являється власним судинорозширюючим фактором судин кровоносної системи та синтезується ендотеліальними клітинами судин. Проте, в більшості з цих робіт закцентовано увагу на зовнішніх проявах дії оксиду азоту, в той час як процеси в середині клітини залишені осторонь, що обумовлюється, в першу чергу, наявністю певних методичних труднощів.

Дослідження останніх років у галузі молекулярної фізіології гладеньких м'язів (ГМ) кровоносних судин та фармакології кровообігу свідчать також про можливість існування альтернативних шляхів регуляції тонусу кровоносних судин. Саме вивчення цих альтернативних шляхів надасть можливість створити новий клас лікарських препаратів модуляторів Са2+-чутливості, що дозволить вирішити багато проблем сучасної терапії захворювань серцево-судинної системи.

Зв'язок роботи з іншими науковими програмами, планами, темами. Робота виконана згідно з планом основних напрямків наукових досліджень Відділу експериментальної терапії Інституту фармакології та токсикології АМН України (державна реєстрація №0197U004797), де автором особисто виконана своя частина експериментальної роботи та опублікувані результати досліджень.

Мета дослідження полягала в дослідженні шляхів впливу NO та його фармакологічних донорів -- нітрогліцерину та нітропрусиду натрію на скоротливу активність та вміст внутрішньоклітинного кальцію гладеньких м'язів хвостової артерії щура.

Для досягнення поставленої мети були визначені основні завдання дисертаційної роботи:

1. Вивчити динаміку одночасної зміни скоротливої активності та вмісту внутрішньоклітинного Ca2+ ([Са2+]i) ГМ хвостової артерії щура за дії NO та його фармакологічних донорів -- нітрогліцерину (НГ) та нітропрусиду натрію (НПН).

2. Дослідити вплив NO та його донорів на різні ланки Са2+-сигналізації скоротливої активності залежно від типу попередньої активації ГМ хвостової артерії щура.

3. З'ясувати існування цГМФ-незалежного механізму розслаблення ГМ хвостової артерії щура за дії NO та його донорів.

4. Установити існування цГМФ-незалежного та тіолнезалежного впливу NO та його донорів на скоротливу активність і вміст [Ca2+]i ГМ хвостової артерії щура.

5. Провести порівняльне дослідження судинорозслаблюючого впливу NO та його донорів з огляду на їх фармакологічну ефективність.

Об'єкт дослідження -- механізми регуляції тонусу судин, зокрема Са2+-сигналізація скоротливої активності ГМ хвостової артерії щура.

Предмет дослідження -- вплив NO та його фармакологічних донорів -- НГ та НПН на скоротливу активність та вміст [Са2+]і ГМ хвостової артерії щура.

Методи дослідження. У роботі застосовували методи: фармакологічні, фізіологічні, біофізичні, фізико-хімічні та статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше в Україні впроваджено метод одночасної реєстрації скоротливої активності сегментів кровоносних судин та визначення змін [Ca2+]i в ГМ. Це дозволяє принципово з нової точки зору досліджувати вплив різноманітних судиноактивних речовин на кровоносні судини. З огляду на досліджувані речовини показано можливість розслаблення ними ГМ, пов'язане зі зниженням Са2+-чутливості скоротливих та/або регуляторних білків. Доведено існування цГМФ-незалежного механізму розслаблення ГМ для досліджуваних сполук. Встановлена можливість прямого, за рахунок нітрозилювання, впливу NO на клітинні структури, що відповідають за цикл скорочення-розслаблення ГМ. Дана порівняльна характеристика препаратам-донорам NO, а також безпосередньо NO, з огляду на їх фармакологічну ефективність.

Практичне значення одержаних результатів:

1. Запропоновано новий метод скринінгу лікарських засобів, здатних безпосередньо впливати на Са2+-чутливість скоротливих та/або регуляторних білків ГМ.

2. Створено теоретичні передумови для розробки лікарських засобів, яким властива пряма дія на скоротливі та/або регуляторні білки ГМ.

3. Одержані дані дозволяють по-новому пояснити наявність відмінностей в судинних ефектах НГ та НПН.

4. Результати досліджень впроваджено в науковий та учбовий процеси кафедри фармакології Національного медичного університету ім. О. О. Богомольця (акт впровадження №67 від 25.06.2001 року), кафедри фармакології Луганського державного медичного університету (акт впровадження № 9 від 31.05.2001 року) та кафедри фармакології Вінницького державного медичного університету (акт впровадження № 18 від 27.06.2001 року).

Особистий внесок здобувача. Автором особисто було здійснено патентно-інформаційний пошук, проведено аналіз даних літератури за темою дисертації з використанням пошукових серверів "MEDLINE" та "PUBMED", опановані методи досліджень і виконані експериментальні дослідження. Також проведено аналіз, систематизацію та статистичну обробку одержаних результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались на Конференції молодих вчених "Актуальні проблеми фармакології та токсикології" (Київ, 2000); Конференції молодих вчених, присвяченій пам'яті академіка В.В. Фролькіса (Київ, 2001); II Конференції товариства нейронаук з міжнародною участю, присвяченій 70-річчю кафедри фізіології Донецького медичного університету ім. М. Горького (Донецьк, 2001); Конференції "Mechanisms of Vasodilation" (Бостон, США, 2001); Міжнародній конференції, присвяченій проблемам NO (Мінськ, Белорусь, 2001).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 9 робіт, з котрих 4 статті у фахових наукових журналах, а 5 в збірниках конгресів та конференцій.

Структура та об'єм дисертації. Дисертація написана на 173 сторінках машинописного тексту й складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, опису результатів досліджень, їх обговорення, висновків та списку використаних джерел. Роботу ілюстровано 63 рисунками. Бібліографія містить 193 джерела.

2. Основний зміст роботи

Методи дослідження

У дослідженнях використовували щурів-самців лінії Вістар з масою тіла 200--250 г віварію НДІ Фармакології та токсикології АМН України, яких утримували на стандартному харчуванні. Тварин умертвляли шляхом цирвікальної дислокації. Тварину перегортали на спину й розтинали хвіст хірургічним лезом з внутрішнього боку в напрямку від основи хвоста до кінчика на 3--4 см. Боки розтину затискували медичними затискачами й хвостову артерію відповідної довжини вирізали мікрохірургічними ножицями. Препарат переносили відразу до препарувальної ванночки об'ємом 5 мл з розчином Кребса (мМ): NaCl 122; KCl 4,7; KH2PO4 1,2; CaCl2 2,5; MgCl2 1,2; Глюкоза 11,5; HEPES 11,6; рН=7,35. Мікрохірургічними ножицями хвостову артерію очищали від оточуючої сполучної та жирової тканини й розрізали поперек на сегменти довжиною 2--3 мм. Під бінокулярним мікроскопом із збільшенням у 28 разів сегменти хвостової артерії вивертали просвітом судини назовні, використовуючи пару мікрощипців та надтонкі голки. Кільця вивертали назовні для того, щоб піддавати УФ-опроміненню гладку внутрішню поверхню. У внутрішній отвір сегменту хвостової артерії вводили голку 0,5 мм в діаметрі й проводили перпендикулярними до поздовжньої вісі сегменту рухами вздовж поверхні фільтрувального паперу “Watmann” для видалення ендотелію. Одержанні таким чином сегменти переносили до бюксу об'ємом 5 мл і залишали на одну годину.

Досліди виконували в камері об?ємом 500 мкл, установленій на предметний стіл флуоресцентного мікроскопу ЛЮМАМ-И2 (С.-Петербург, Росія). Сегменти переносили у ванночку з проточним промиванням розчином Кребса зі швидкістю 2 мл/хвилину й розміщували на гачки із нержавіючої сталі, один з яких зафіксований нерухомо, інший з'єднаний з датчиком скорочень типу AE 801 (SensoNor A/S, Horten, Норвегія), уводячи їх у внутрішній отвір сегменту. Скоротливу активність та ?[Ca2+]i кілець хвостової артерії щура реєстрували, використовуючи електронну інтеграцію активного натягу та флуоресцентного сигналу від фотоелектричного множника стосовно часу. Усі операції проводили за кімнатної температури.

Вміст [Са2+]і вимірювали з використанням флуоресцентного кальцієвого індикатора Fura-2, використовуючи ацетоксиметильний етер Fura-2, здатний до проникнення крізь клітинну мембрану (Fura-2 AM) (Grynkiewicz G. et al. 1985). Кільця хвостової артерії щура завантажували, використовуючи розчин для завантаження: Fura-2AM 10 мкМ; DMSO 2,5% (по об'єму); Pluronic F-127 0,5% (по масі); БСА 5% (по масі); розчин Кребса 95% (по об'єму); HEPES 11,6; рН=7,35; протягом 2 годин за кімнатної температури. Після завантаження кілець судин камеру піддавали перфузії вищезгаданим розчином Кребса протягом щонайменше 30 хвилин перед тим, як проводити дослідження.

Результи вимірювань ?[Ca2+]i представлені як співвідношення флуресцентних сигналів (F) при 340 та 380 нм, R = F340nm/F380nm. Абсолютні значення вмісту [Ca2+]i залежать від константи дисоціації Fura-2 (Grynkiewicz G. et al. 1985), його розповсюдження всередині клітини, зв?язування та компартменталізації (Blatter L. A. et al. 1990). Таким чином, метою наших досліджень було спостереження DF сигналу, що кількісно відображає D[Ca2+]i, а й отже вважається придатним для досліджень процесів Са2+-сигналізації всередині клітин (Baylor S. M. et al. 2000).

Результати та обговорення

Результати наших досліджень показали, що NO здатний знижувати скоротливу активність ГМ хвостової артерії щура, тобто викликати розслаблення, не лише за рахунок зниження вмісту [Са2+]і, що відбувається лише короткочасно, а й за рахунок зміни Са2+-чутливості регуляторних та/або скоротливих білків ГМ (Рис. 1.). Загальне зниження вмісту [Са2+]і відповідає більшому зниженню скоротливої активності, що також свідчить про зміну Са2+-чутливості, тобто безпосередній вплив NO на регуляторні та/або скоротливі білки.

Відомо, що основною мішенню NO в ГМ є розчинна форма гуанілатциклази (рГЦ). Активація рГЦ приводить до синтезу й накопиченню цГМФ в клітинах ГМ. Саме дії цГМФ зобов'язаний розслаблюючий ефект NO. Активація клітинних цГМФ-залежних протеїнкіназ приводить у кінцевому рахунку до зниження рівня [Са2+]і і розслаблення. У наших дослідженнях ми блокували синтез і накопичення цГМФ рГЦ за допомогою конкурентного інгібітора LY83583.

Результати досліджень показали, що за умов інгібування активності рГЦ з допомогою LY83583 NO втратив свою здатність знижувати скоротливу активність ГМ так ефективно, як за контрольних умов. Натомість рівень [Са2+]і знижувався набагато більше, ніж скоротлива активність. За умов попередньої активації ГМ розчином Кребса з додаванням фенілефрину (ФЕ), саме тоді, коли К+-канали не є заблокованими, NO на 100% знижував вміст [Са2+]і, тоді як скоротлива активність знижувалась від 10 до 50% (Рис. 2.). За умов К+-активації ГМ максимальне скорочення становило 30%, тоді як зміни [Са2+]і були в кілька разів більшими. Це свідчить про те, що NO лишається здатним за цГМФ-незалежних умов розслабляти ГМ, хоча це розслаблення є пригніченим. Натомість рівень [Са2+]і зазнає набагато відчутніших змін.

Виходячи з фізико-хімічних властивостей NO можна передбачити його легку реакцію з SH-групами білків і низькомолекулярних тіолів. Ми застосовували дитіотреїтол (ДТТ) для того, щоби запобігти реакції NO з тіолами й, відповідно, утворенню нітрозотіолів, що є також судиноактивними сполуками. Крім того, нітрозилювання внутрішньоклітинних білків може приводити до зміни їх функції в ГМ, а звідси до впливу на цикл скорочення-розслаблення ГМ.

Реакції ГМ хвостової артерії щура на NO зазнали ще більшого пригнічення порівняно з умовами лише інгібування рГЦ з допомогою LY83583. Одночасне застосування блокатору рГЦ -- LY83583 та ДТТ показало, що NO за тих самих концентрацій не впливав на скоротливу активність і лише незначно впливав на вміст [Са2+]і (Рис. 3.). Результати показали, що за умов скорочення ГМ за умов скорочення ФЕ NO за максимальних концентрацій викликав 100% зниження вмісту [Са2+]і, що свідчить про те, що активація К+-каналів безпосередньо NO відбувається не через SH-групу каналу, а йншим чином, і що саме активацією К+-каналів, а звідси гіперполяризацією плазматичної мембрани можна пояснити таке зниження порівяно з умовами К+-активації ГМ. Застосування ДТТ дало змогу показати важливість наявних вільних відновлених SH-груп в ГМ для дії NO.

НГ за контрольних умов проявив себе як сполука, що здатна мінімально змінюючи [Са2+]і викликати у кілька разів більші зміни скоротливої активності в діапазоні концентрацій 10-7--10-4 М за умов скорочення деполяризацією мембрани ГМ, за яких К+-канали є заблокованими. Результати показали, що НГ являє собою єдину речовину, для котрої за умов К+-активації ГМ хвостової артерії щура характерно, що із збільшенням концентрації НГ, скоротлива активність зменшується набагато більше, ніж зменшується рівень [Са2+]і, тобто відбувається дисоціація між зміною вмісту [Са2+]і та скоротливою активністю (Рис. 4.). За скорочення ГМ ФЕ такої дисоціації не спостерігається. Результати свідчать про сильну залежність дії НГ від типу активації [Са2+]і.

Наявність реакції на НГ за умов інгібування рГЦ з допомогою LY83583 виявилась досить несподіваною, оскільки більшість літературних джерел стверджують про відсутність такого впливу. За одночасного застосування ДТТ як SH-відновлюючого агента вдалось повністю інгібувати вплив НГ на скоротливу активність ГМ хвостової артерії щура, що підтверджує дані стосовно необхідності у вільних тіолових групах для біотрансформації НГ.

Результати досліджень показали, що НПН також здатен змінювати Са2+-чутливість ГМ. Для НПН, на відміну від НГ, якому властиве паралельне зменшення як рівню [Са2+]і, так і сили скорочення, короткочасна зміна вмісту [Са2+]і супроводжується тривалим зниженням скоротливої активності, у той час як рівень [Са2+]і залишається на вихідному рівні, що є свідченням на користь зниження Са2+-чутливості ГМ.

Як і у випадку з NO, НПН за умов інгібування LY83583 не виявляв жодних ознак зміни Са2+-чутливості. Зміни вмісту [Са2+]і повністю корилюють зі змінами скоротливої активності ГМ. НПН є прямим донором NO, тому його вплив в дечому походить на вплив NO. Одержані результати доводять, що як і у випадку з NO, зміни в Са2+-чутливості ГМ залежать від цГМФ.

За умов застосування LY83583 та ДТТ реакції НПН є також пригніченими й залежать цілком від концентрації НПН. Щоправда на відміну від NO, НПН викликає зниження скоротливої активності, що цілком обумовлене зниженням вмісту [Са2+]і.

Це можна пояснити ще й непрямою дієї НПН на ГМ, що відповідає існуючим у літературі даним щодо біотрансформації НПН в мікросомній фракції ГМ. Як і у випадку з NO, вплив НПН на ГМ за умов активації ФЕ є більш виразним, ніж за умов К+-скорочення, що пояснюється тими самими причинами.

Нами було показано, що за своєю фармакологічною ефективністю (здатністю розслабляти ГМ хвостової артерії щура) досліджувані речовини розташовані в наступному порядку від найбільшефективної речовини до найменшефективної NO ® НПН ® НГ, де за кожного типу попередньої активації ГМ значення ЕК50 кожної попередньої речовини перебільшує значення ЕК50 наступної майже на два порядки.

Динаміка змін скоротливої активності та вміст [Са2+]і, профіль кривих концентрація-ефект, кількісні значення вимірюваних показників, а також значення ЕК50 істотно залежать від умов попередньої активації ГМ хвостової артерії щура, де для всіх досліджуваних речовин відбувається закономірний зсув кривих концентрація-ефект праворуч за умов попередньої активації ГМ з допомогою ФЕ.

Одержані дані дозволяють припустити існування розбіжностей, що можуть мати місце в практичному застосуванні, тобто в кліниці, коли за однієї дози різні пацієнти або один і той же пацієнт залежно від фізіологічного стану виявляють різні реакції на препарат. Дослідження молекулярних механізмів, що лежать в основі дії лікарських засобів, дозволять модулювати дію цих засобів з урахуванням особливостей фенотипу та/або фізіологічного стану пацієнта, підвищувати їх біодоступність і ефективність.

Таким чином, доведено існування альтернативних шляхів регуляції циклу-скорочення-розслаблення ГМ хвостової артерії щура за дії NO, зокрема зміна Са2+-чутливості. Сам факт її зниження є підставою для пошуку речовин, що селективно б знижували Са2+-чутливість регуляторних та/або скоротливих білків, таким чином модулюючи реакційну здатність ГМ до змін в оточуючому середовищі. Показано, що зміна Са2+-чутливості ГМ опосередковується цГМФ, незважаючи на те, що ефект NO та його прямого донору НПН має місце не лише за відсутності цГМФ, а й вільних SH-груп в клітинах ГМ. Застосування методу одночасної реєстрації скоротливої активності та визначення вмісту [Са2+]і в ГМ дозволить проводити скринінг лікарських засобів, що можуть бути потенційними модуляторами Са2+-чутливості регуляторних та/або скоротливих білків ГМ, а також сприяти подальшому дослідженню альтернативних механізмів регуляції судинного тонусу.

Висновки

1. У результаті проведених досліджень було показано, що NO викликає розслаблення гладеньких м'язів хвостової артерії щура не лише за рахунок зниження вмісту [Са2+]і, а також за рахунок зменшення Са2+-чутливості регуляторних та/або скоротливих білків.

2. Зниження Са2+-чутливості регуляторних та/або скоротливих білків ГМ хвостової артерії щура за дії NO є цГМФ-залежним.

3. Для всіх досліджуваних речовин -- нітрогліцерину, нітропрусиду натрію та NO встановлена здатність розслабляти гладенькі м'язи хвостової артерії щура та знижати вміст [Са2+]і через альтернативний цГМФ-незалежний шлях.

4. За своєю судинорозслаблюючою активністю досліджувані речовини можуть бути розташовані в наступному порядку її зменшення: NO(ЕК50) ® НПН(ЕК50) ® НГ(ЕК50).

5. Розслаблення гладеньких м'язів хвостової артерії щура під впливом нітрогліцерину відбувається двома рівноцінними шляхами: цГМФ-залежним та цГМФ-незалежним, що є тіолзалежним.

6. З досліджуваних речовин нітрогліцерин являє собою єдину речовину, для котрої характерна найбільша дисоціація між зниженням вмісту [Са2+]і та зменшенням скоротливої активності.

7. Сукупність цГМФ-залежних та/або цГМФ-незалежних механізмів, що визначають кінетику й амплітуду розслаблення гладеньких м'язів хвостової артерії щура під впливом NO та його фармакологічних донорів, залежить як від способу попередньої активації гладеньких м'язів (фенілефрин або хлористий калій), так і від виду речовини-носія молекули NO (аутентичний NO або його донори). Чутливість до NO гладеньких м'язів хвостової артерії щура, активованих хлористим калієм, є вищою, ніж гладенких м'язів хвостової артерії щура, активованих фенілефрином.

Список опублікованих за темою дисертації робіт

1. Соловйов А.І., Легенький В.В., Зеленський С.М., Стефанов О.В. Вплив оксиду азоту та його донорів на скоротливу активність і вміст внутрішньоклітинного Са2+ гладеньких м'язів кровоносних судин щурів // Медична хімія. - 2000. - Т. 2. - № 4. - С. 9-12. (Внесок здобувача -- 70%).

2. Соловйов А.І., Легенький В.В., Зеленський С.М., Стефанов О.В. Метод дослідження скорочувальної активності та вмісту внутріклітинного Са2+ гладких м'язів кровоносних судин для вивчення кальцієвої чутливості та скринінгу серцево-судинних лікарських засобів // Львівський медичний часопис. - 2001. - № 1. - С. 29-34. (Внесок здобувача -- 60%).

3. Соловйов А.І., Легенький В.В., Зеленський С.М., Стефанов О.В., Мойбенко О.О. цГМФ-незалежний вплив оксиду азоту на скоротливу активність та вміст внутрішньоклітинного Са2+ гладеньких м'язів хвостової артерії щура // Фізіолгічний журнал. - 2001. - № 2. - С. 19-24. (Внесок здобувача -- 60%).

4. Соловйов А.І., Легенький В.В., Зеленський С.М., Стефанов О.В. Вплив нітрогліцерину на скоротливу активність та вміст внутрішньоклітинного Са2+ гладеньких м'язів хвостової артерії щура за різного типу попередньої активації // Медична хімія. - 2001. - Т. 2. - № 3. - С. 42-46. (Внесок здобувача -- 70%).

5. Легенький В.В., Зеленський С.М. цГМФ-незалежний механізм розслаблення гладеньких м'язів кровоносних судин щурів під дією оксиду азоту // Матеріали конференції молодих вчених "Актуальні проблеми фармакології та токсикології". - Київ. - 2000. - С. 26. (Внесок здобувача -- 90%).

6. Легенький В.В., Зеленський С.М. Дослідження змін сили скорочення та вмісту іонізованого кальцію гладеньких м'язів хвостової артерії щура при дії нітропрусиду натрію // Матеріали ІІ Української конференції молодих вчених, присвяченій пам'яті академіка В.В. Фролькіса. - Київ. - 2001. - С. 70. (Внесок здобувача -- 90%).

7. Легенький В.В., Зеленський С.М., Соловйов А.І., Стефанов О.В. Вплив нітрогліцерину на скоротливу активність і [Са2+]і гладеньких м'язів судин за умов скорочення a1-адренергістом -- фенілефрином // II Конференція Українського товариства нейронаук з міжнародною участю, присвячена 70-річчю кафедри фізіології Донецького державного медичного університету ім. М. Горького. - Донецьк. - 2001. - С. 180. (Внесок здобувача -- 80%).

8. Soloviev A., Legenky V., Zelensky S., Stefanov O., and P. Hellstrand. Nitric oxide induces vascular relaxation via a cGMP-independent mechanism related to decrease in myophilament calcium sensitivity // Abstract at 8th International Symposium on Mechanisms of Vasodilation, May 31 - June 3, 2001, Boston, USA. P. 23. (Внесок здобувача -- 70%).

9. Легенький В.В., Зеленский С.Н., Стефанов А.В., Соловйов А.И. Влияние оксида азота на сократительную активность и содержание внутриклеточного кальция гладких мышц хвостовой артерии крысы // Научная конференция, посвящённая проблемам оксида азота. - Минск. - Беларусь. - 2001. - С. 30-33. (Внесок здобувача -- 70%).

Размещено на Allbest.ru