Аналіз мутацій гена CFTR (ТРБМ) у хворих високого ризику муковісцидозу із Західного регіону України

Размещено на http:www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

Макух Галина Василівна

УДК 616.37-008.6-056.7:577.21

АНАЛІЗ МУТАЦІЙ ГЕНА CFTR (ТРБМ) У ХВОРИХ ВИСОКОГО РИЗИКУ МУКОВІСЦИДОЗУ ІЗ ЗАХІДНОГО РЕГІОНУ УКРАЇНИ

03.00.15 - генетика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті спадкової патології АМН України, м. Львів.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор

Гнатейко Олег Зіновійович,

Інститут спадкової патології АМН України,

м. Львів, директор

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший

науковий співробітник

Лівшиць Людмила Аврамівна,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ, провідний науковий співробітник відділу генетики людини;

доктор медичних наук, професор

Пілінська Марія Андріївна,

Науковий центр радіаційної медицини

АМН України, м. Київ,

завідувач лабораторії цитогенетики.

Провідна установа: Інститут біології клітин, відділ регуляції проліферації клітин, НАН України, м. Львів

Захист дисертації відбудеться “15“ січня 2002р. о 14.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.202.01 Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, м. Київ-143, вул. Академіка Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, 03143, м. Київ-143, вул. Академіка Заболотного, 148.

Автореферат розісланий “ 10 “ грудня 2001р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Науменко В.Д.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Муковісцидоз (МВ) - найпоширеніше аутосомно-рецесивне захворювання осіб європейсько-азіатської популяції, причиною якого є спадкові мутації у межах гена ТРБМ (Трансмембранний Регуляторний Білок Муковісцидозу). Для цього гена є характерною велика кількість мутацій (>1000) та поліморфізмів (>300) (http://genet.sickkids.on.ca), які мають різну частоту розповсюдження у різних популяціях та регіонах, що вимагає попередніх досліджень у кожній конкретній популяції чи етнічній групі з метою визначення найбільш поширених, а отже - й найбільш інформативних для проведення діагностики.

У Західному регіоні України (вісім адміністративно-територіальних областей із загальною чисельністю населення понад 10 мільйонів чоловік), за нашими підрахунками, щороку очікується народження близько 45 дітей хворих на МВ. Зважаючи на історико-географічні та демографічні особливості Західного регіону України й те, що вивчення спектру та частот поширення мутацiй та поліморфізму гена ТРБМ у хворих на МВ цього регіону прицільно не проводилося, є важливим здійснення такого аналізу. Мутації гена ТРБМ можуть по-різному проявлятися при формуванні фенотипу. У зв'язку із цим, актуальним є й визначення ролі поліморфності послідовності гена ТРБМ у патогенезі захворювання й розширення розуміння взаємодії між мутантним генотипом та формуванням фенотипу.

Актуальність даних досліджень полягає й у їх прикладному значенні з точки зору діагностики та профілактики МВ. Рекомендації про стратегію проведення молекулярно-генетичного тестування МВ на основі частот мутацій гена ТРБМ у конкретних популяціях сформульовані Європейською робочою групою із проблем МВ (ECCACF) [Dequeker E., 2000]. Такий підхід дозволяє зменшити фінансові та робочі витрати на проведення молекулярно-генетичної діагностики МВ, одночасно підвищуючи її ефективність. Лікування та утримання хворих на МВ потребує значних як матеріальних, так і моральних витрат. За даними Національного інституту здоров'я США у цій країні прямі та непрямі витрати від народження одного хворого на МВ становлять 800.000 доларів [NIH Consens Statement, 1997]. Ефективна профiлактика МВ можлива лише шляхом проведення пренатальної дiагностики. Для цього є необхідним проведення молекулярно-генетичної діагностики у сім'ях з високим ризиком МВ, а також виявлення випадків гетерозиготного носійства мутацій гена ТРБМ [Лівшиць Л., 2001].

Зв'язок роботи із науковими програмами, планами, темами. Дана робота є фрагментом комплексних тем, що виконувались в Інституті спадкової патології АМН України, “Молекулярно-генетичний аналіз поширеної спадкової патології” (шифр теми за Зведеним планом НДР ІН.04.0000.003.95, номер держреєстрації 0195U026071, 1995-1997рр.), “Дослідження поширеної спадкової патології (фенілкетонурія, муковісцидоз) серед дітей Західного регіону України в умовах масового та селективного скринінгу” (шифр теми за Зведеним планом НДР ЦФ, номер держреєстрації 0197U008338, 1997-1999рр.), “Проспективне спостереження за частотою та спектром поширеної спадкової патології серед дітей Західного регіону України в умовах масового та селективного скринінгу” (шифр теми за Зведеним планом НДР 05, номер держреєстрації 01999U001345, 1999 - 2001рр.).

Частково робота виконувалась в межах виконання проектів отриманих на конкурсних засадах від Західно-Українського Біо-Медичного Дослідницького Центру (WUBMRC) підтримки молодих вчених.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було встановлення частоти найбільш поширених мутацій і поліморфних варіантів гена ТРБМ у хворих на МВ із Західного регіону України та дослідження їх зв'язку з фенотипом

Для досягнення цієї мети були поставлені наступні основні задачі дослідження:

1). Провести вимірювання концентрації електролітів у поті хворих із підозрою на МВ та сформувати групу пацієнтів, що підлягають проведенню молекулярно-генетичного аналізу мутацій гена ТРБМ.

2). Створити банк ДНК пацієнтів із високим ризиком МВ та членів їх родин.

3). Провести аналіз мажорної у більшості європейсько-азіатських популяцій мутації delF508 гена ТРБМ у пацієнтів високого ризику МВ і членів їх родин та встановити частоту цієї мутації у хворих на МВ із Західного регіону України. мутація поліморфний муковісцидоз

4). Провести дослідження та встановити частоти і спектр найбільш поширених мутацій гена ТРБМ, відмінних від delF508 алелі, у хворих на МВ із Західного регіону України.

5). Встановити особливості асоціацій між різними генотипами та проявами фенотипу у досліджуваній групі хворих на МВ.

Об'єктом дослідження є клініко-генетичний поліморфізм випадків МВ. Предмет дослідження: аналіз мутацій та поліморфізму гена ТРБМ у хворих високого ризику МВ із Західного регіону України.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено частоти та вивчено спектр найпоширеніших мутацій гена ТРБМ у хворих на МВ із Західного регіону України. Вперше в Україні у групі хворих на МВ проведено скринінг можливих аберацій у межах гена ТРБМ методом аналізу ДНК у денатуруючому градієнтному гелі (DGGE). Дістало подальший розвиток розуміння впливу комбінацій мутантних алелей у гені ТРБМ на прояви фенотипу МВ.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані щодо частоти та спектру мутацій гена ТРБМ у хворих на МВ із Західного регіону України будуть основою формування підходів до пре- та постнатальної діагностики МВ з використанням молекулярно-генетичних методів. Проведення допологової діагностики МВ молекулярно-генетичними методами та встановлення гетерозиготного носійства різних мутацій гена ТРБМ буде використано для профілактики МВ, що повинно дати значний економічний та медико-соціальний ефект.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійним дослідженням автора. Весь обсяг експериментальної частини дисертації, пошук та обробка літературних даних виконані автором особисто. Самостійно опрацьовано результати роботи, здійснено аналіз отриманих даних та підготовлено текст дисертації.

У виконанні окремих етапів роботи брали участь співробітники лабораторії молекулярної генетики Інституту спадкової патології АМН України, що відмічено у спільних публікаціях. Клінічне спостереження хворих на МВ проводилося співавторами: лікарями Бобер Л.Й. та Влох М.В.

Автор вдячний лікарям Львівського ММГЦ та медико-генетичних консультацій Західного регіону України, які надавали зразки ДНК для аналізу.

Автор висловлює щиру подяку професорові Єфремову Г. - керівникові Центру генетичної інженерії та біотехнології (м.Скоп'є, Македонія) за надану можливість проведення експериментів на базі цього центру та доктору Кочевій С. за допомогу у проведенні DGGE аналізу та секвенуванні ДНК.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації викладені у доповідях на ІІ-му з'їзді медичних генетиків України (Львів,1995), на І-му міжнародному медичному конгресі студентів та молодих вчених (Тернопіль, 1997), на VII-му конгресі СФУЛТ (Ужгород, 1998), на конференції “Пренатальний та постнатальний скринінг природженої та спадкової патології” (Львів, 2000), на міжнародному симпозіумі “4-th International Symposium for Cystic Fibrosis” (Hungary, Budapest, 2000).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 11 друкованих робіт, в тому числі 4 статті та 7 тез доповідей.

Обсяг та структура роботи. Дисертаційна робота, викладена на 156 сторінках машинопису, складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, шести розділів власних досліджень та їх обговорення, узагальнення, висновків та переліку використаних джерел. Текст дисертації ілюстровано 20 таблицями та 13 малюнками. Перелік використаних джерел містить 276 посилань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи

Дослідну групу склали пацієнти, які проходили обстеження в Інституті спадкової патології АМН України, Львівському міжобласному медико-генетичному центрі, Івано-Франківському, Тернопільському, Закарпатському медико-генетичних кабінетах та перебували на стаціонарному лікуванні у Львівській обласній дитячій клінічній лікарні й у Львівській обласній спеціалізованій клінічній дитячій лікарні з приводу підозри на МВ. Для формування груп пацієнтів із високим ризиком МВ визначали вміст електролітів у поті методом пілокарпінового електрофорезу [Gibson L., Cooke R. 1959]. Проводили виділення та очистку ДНК із лейкоцитів периферійної крові методом ферментативного розщеплення та подальшої фенольної екстракції [Маниатис Т. 1988]. У випадках пренатальної діагностики МВ виділяли ДНК із клітин амніотичних вод та хоріона. На подальших етапах дослідження проводили ампліфікацію послідовностей ДНК in vitro, використовуючи метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) [Saiki et al, 1983]. ПЛР проводили в автоматич-ному режимі на термоциклерах “АМП-4” (Новосибірськ, Росія), “Perkin Elmer” 4800 та 2400 (“Cetus”, США), "АМРLY-4" (“Биоком”, Москва, Росія). Олігонуклеотидні праймери були синтезовані в Інституті Біоорганічної хімії РАН (м. Москва, Росія). Праймери для DGGE-аналізу були люб'язно надані Європейською робочою групою із проблем МВ (ECCACF). Послідовності праймерів для аналізу мутації CFTRdele2,3(21kb) люб'язно надав доктор Mr. J.Macek (Institute of Biology and Medical Genetics, Прага, Чехія); контрольні зразки ДНК доктор S.Koceva (RCGEB, Скоп'є, Македонія). Використовували термостабільну Taq-полімеразу (“Fermentas”, Вільнюс, Литва).

Залежно від типу досліджуваних мутацій проводили аналіз продуктів ПЛР шляхом електрофорезу у агарозному, поліакриламідному або денатуруючому градієнтному гелях (DGGE). Для визначення характеру аберацій, що не були ідентифіковані при DGGE-аналізі, проводили секвенування фрагментів ДНК. Для встановлення взаємозв'язку між генотипом та різними фенотиповими ознаками, була визначена вірогідність різниці частот ознак попарно для усіх генотипних груп за критерієм Стьюдента.

Результати дослідження та їх обговорення

Відомо, що ТРБМ має функцію мембранного каналу аніонів Cl в тканинах залоз зовнішньої секреції, до яких належать й потові залози. Першим етапом нашої роботи було проведення визначення вмісту електролітів у поті пацієнтів із підозрою МВ і формування груп хворих, що підлягають молекулярно-генетичній діагностиці мутацій гена ТРБМ.

Позитивним вважали потовий тест при встановленні концентрації іонів хлору понад 60 мекв/л, сумнівним - при 40-60мекв/л, негативним - менше 40 мекв/л. Діагностично значимим для МВ вважали отримання позитивного результату двох або більше аналізів поту. Для вимірювання вмісту електролітів використовували зразки поту із наважкою не менше 100 мг. При отриманні наважки 80-90 мг аналіз проводився, проте результат вважали сумнівним і проведення потової проби повторювали через певний проміжок часу.

Внаслідок проведеного нами аналізу встановлено, що результати потового тесту були позитивними у 16,7% випадків, сумнівними - 10,6% випадків, негативними - 66,8% випадків вимірювань. У 24 випадках (5,9%) не було зібрано необхідної для аналізу кількості поту.

При порівнянні середнього вмісту електролітів у поті пацієнтів, яким за даними клінічних та параклінічних обстежень встановлено діагноз МВ з групою пацієнтів з хронічними бронхолегеневими та кишково-шлунковими розладами, що були скеровані для проведення потової проби, показано значну різницю показників у цих групах (Табл.1).

Як видно із даних, поданих у табл.1, у своїй практиці ми спостерігали окремі випадки нормальних чи граничних значень вмісту електролітів у поті серед групи хворих на МВ. У цих пацієнтів не було встановлено наявності жодної із досліджуваних нами мутацій МВ. Такі дані ми пояснюємо можливістю дії мутацій гена ТРБМ, що зустрічаються у частини хворих на МВ й призводять до утворення нормального клітинного каналу хлору. Проте у більшості хворих на МВ реєстрували суттєво підвищені рівні електролітів у поті, що підтверджує показовість потової проби. У нашій практиці було виявлено також окремі випадки підвищеної концентрації електролітів у поті пацієнтів, у яких у подальшому діагноз МВ не був підтвердженим, а результати повторного потового тесту були негативними. При виході із гострої фази хвороби спостерігали зниження рівня електролітів у поті, що не має місця при МВ. Тому необхідним є кількаразове проведення потового тесту, й зокрема - у період ремісії.

Таким чином, потова проба є методом селективного відбору контингенту хворих, які повинні скеровуватися для проведення молекулярно-генетичної діагностики. У свою чергу точне встановлення діагнозу МВ можливе лише при умові діагностики мутацій у гені ТРБМ.

Аналіз мажорної delF508 мутації гена ТРБМ та вивчення
її частоти у досліджуваній групі хворих високого ризику МВ

Пацієнти, у яких виявлено підвищений рівень електролітів у поті та спостерігалися клінічні прояви МВ, підлягали проведенню молекулярно-генетичної діагностики мутацій гена ТРБМ. Першим етапом молекулярно-генетичних досліджень є виділення та очистка ДНК, яка є об'єктом аналізу.

Детекцію мутації delF508 проводили шляхом ампліфікації ділянки можливої делеції із використанням специфічних праймерів, що гомологічні ділянкам ДНК, які фланкують локус можливої мутації, та наступним аналізом продуктів у поліакриламідному гелі. Пряму детекцію мутації delF508 проведено у 389 осіб. У нашій роботі для детекції мутації delF508 використовували праймери, які дозволять синтезувати фрагменти ДНК величиною (відповідно нормальний та мутантний) 97 та 94п.н. й дозволяють одночасно за характером гетеродуплексів визначати й інші мутації ТРБМ, що можуть виникати у досліджуваному локусі гена (ДI507, F508C, 1677delTA). Проте, названі вище мутації у даному досліджені у жодному із зразків ДНК не виявлені. Такі результати говорять про низьку частоту цих мутацій у західноукраїнській популяції. Подібні результати отримано іншими авторами для популяції України [Лівшиць Л, 2000].

Аналіз результатів проведених клінічних, параклінічних та молекулярно-генетичних обстежень дозволив створити групу із 63 пробандів, що мали підтверджений діагноз МВ та не мали між собою родинних зв'язків. Серед цих пацієнтів у 16 осіб мутація delF508 була виявлена у гомозиготному стані, в 28 - у гетерозиготному стані, а в 19 осіб дана мажорна мутація не виявлена. Встановлена нами частота мутації delF508 у досліджуваній групі хворих на МВ із Західного регіону України становила 47,6%.

Виявлена у даному дослідженні частота мутації delF508 серед хворих на МВ із Західного регіону України вказує на те, що понад 50% відсотків мутантних алелей залишаються неідентифікованими щодо стану гена ТРБМ. У зв'язку з цим необхідно визначати частоту поширення та спектр мутацій ТРБМ, відмінних від мутації delF508, які були б найбільш інформативними для проведення молекулярно-генетичної діагностики МВ у цьому регіоні.

Скринінг мутацій відмінних від delF508 алелі та поліморфізму
гена ТРБМ в осіб високого ризику МВ із Західного регіону України

У роботі ми застосовували метод мультилокусної ПЛР та наступний аналіз продуктів шляхом DGGE для проведення скринінгу можливих мутацій та поліморфізмів п'ятнадцяти екзонів гена ТРБМ: 11; 14в; 17; 21; 9; 6а; 20; 14а; 15; 12; 3; 23; 8; 15; 18. Здійснювали ампліфікацію досліджуваних ділянок ДНК за допомогою мультилокусної ПЛР, у якій відбувається одночасний синтез ділянок трьох екзонів гена ТРБМ. Для кожної групи екзонів проводили 40 циклів ПЛР з таким режимом: 1 хвилина при 95^оС, 1 хвилина при температурі відпалу оптимальній для кожної групи праймерів, 2 хвилини при 72^оС.

Ідентифікація мутацій проводилася шляхом порівняння характеру аберантних фрагментів із контрольними зразками ДНК. Результати аналізу структури ДНК методом DGGE в екзонах 11, 14b, 17b представлено на рис.1; екзонах 14а, 15, 20 - рис.2, екзонах 21, 9, 6а - рис.3, екзонах 12, 3, 23.

В одному із зразків ДНК було виявлено аберантний фрагмент в екзоні 14а гена ТРБМ, що відрізнявся від наявних контрольних проб ДНК (рис. 2). Для того, щоб встановити характер даної перебудови, було проведене секвенування ділянки ДНК екзону 14а у цього пацієнта. В результаті ідентифіковано мутацію 2721del11, яку вперше описав Cuppens зі співавторами [Cuppens et al, 1993]. У іншій алелі гена ТРБМ цієї пацієнтки виявлено мутацію delF508. У даного пробанда діагностовано змішану форму МВ важкого перебігу. Обстежений пацієнт є другою хворою на МВ дитиною у цій родині. У цьому випадку підтверджено батьківське походження мутації 2721del11. У матері пробанда діагностовано носійство мутації delF508 (екзон 10).

У результаті проведеного аналізу у хворих на МВ вперше в Україні проведено скринінг можливих мутацій у п'ятнадцяти екзонах гена ТРБМ. Дане дослідження дозволило підтвердити наявність більше ніж 50% мутацій, зареєстрованих у межах гена ТРБМ. Крім мутацій, виявлено поліморфні варіанти гена, що можуть бути використані як для проведення аналізу сегрегації хромосом, так і для популяційно-генетичних досліджень. Спектр виявлених мутацій і поліморфізм у досліджуваній групі хворих на МВ із Західного регіону України подано у табл. 2.

Проведені дослідження показали, що в обстеженій групі хворих на МВ із Західного регіону України, найпоширенішими після delF508 є ті ж мутації, що й у європейській популяції. Специфічною можна вважати вперше виявлену в Східній Європі мутацію 2721del11 (екзон 14а) [Macek et al, 2000].

У результаті проведених досліджень виявлено та встановлено частоту наступних мутацій гена ТРБМ: W1282X (екзон 20) - 3,2%; G542X - 2,4% (екзон 11); N1303K (екзон 21) - 2,4%. Такі частоти мутацій для обстеженої групи пацієнтів узгоджуються із узагальненими даними для Центральної та Східної Європи та із даними щодо загальноукраїнської популяції (рис.5) [Macek et al, 2000, Лівшиць Л, 2001].

Виявлену нами високу частоту мутації W1282X можна вважати характерною особливістю спектру мутацій гена ТРБМ хворих на МВ Західного регіону України.

Окрім мутацій, в обстеженій групі пацієнтів з високим ризиком МВ виявлено деякі поліморфні варіанти гена ТРБМ та встановлено їх частоти: 875+40АG (екзон 6а) - 8,6%; Р1209Р (екзон 20) - 5,1%; Т854Т (екзон 14а) - 32,7%. Встанов-лена висока частота інтрагенного поліморфізму Т854Т вказує на можливість використання його для внутрішньосімейного аналізу сегрегації хромосом та дородової діагностики у сім'ях, де не ідентифіковано мутацій гена ТРБМ.

Загальна частота ідентифікованих алелей гена ТРБМ відмінних від delF508 у групі обстежених хворих на МВ є нижчою від очікуваної. Проте високими є частоти виявлених поліморфізмів гена ТРБМ. Не можна відкидати можливості впливу поліморфних варіантів гена ТРБМ на формування фенотипу при МВ. У більшості випадків поліморфні варіанти нами виявлено серед пацієнтів, у яких не ідентифіковано жодної мутації у гені ТРБМ (15 осіб), чи ідентифіковано одну мутацію (5 осіб) і лише в одного пацієнта з двома ідентифікованими мутаціями. Проте у всіх цих пацієнтів спостерігалися клінічні прояви МВ й підвищений рівень електролітів у поті. Отримані дані схиляють до думки про можливість впливу поліморфізму гена ТРБМ на формування фенотипу при захворюванні на МВ.

Аналіз CFTRdele2,3(21kB) мутації у досліджуваній групі хворих на МВ із Західного регіону України

У деяких слов'янських популяціях значний відсоток серед мутацій гена ТРБМ становить недавно описана протяжна делеція CFTRdele2,3(21kb), яка охоплює інтрони 1-3, екзони 2 і 3 даного гена та має розмір 21 т.п.н. [Doerk T. et al, 2000]. Оскільки об'єктом нашого дослідження був стан гена ТРБМ в осіб слов'янської популяції, ми вважали за доцільне провести аналіз даної мутації у групі хворих на МВ із Західного регіону України. Аналіз мутації CFTRdele2,3(21kb) був проведений у зразках банку ДНК хворих із підозрою на МВ із неідентифікованими алелями гена ТРБМ. Виявлено два зразки ДНК із мутацією CFTRdele2,3(21kb) у гетерозиготному стані. В одного пацієнта попередньо було ідентифіковано мажорну мутацію delF508 у гетерозиготному стані. Обстежений пробанд із генотипом CFTRdele2,3(21kb)/delF508 був третьою дитиною, хворою на МВ у цій родині, причому, двоє попередніх дітей померло у ранньому віці. Незважаючи на ранній вік діагностики та постійне одержання необхідної терапії, у цього пробанда спостерігалися важкі клінічні прояви МВ.

У другому випадку ідентифікації мутації CFTRdele2,3(21kb), не виявлено мутації delF508 та жодних мутацій у досліджених п'ятнадцяти екзонах гена ТРБМ. У цього пацієнта встановлено наявність поліморфного локусу Т854Т (екзон 14а) у гетерозиготному стані. Треба відзначити, що у сім'ї цей пробанд був другою дитиною, що померла від МВ на перших місяцях життя. Таким чином, у цій родині спостерігався важкий клінічний перебіг захворювання.

Частота мутації CFTRdele2,3(21kb) серед хворих на МВ із Західного регіону України склала 1,6%. Таке значення узгоджується із узагальненими даними для Центральної та Східної Європи та із даними щодо загальноукраїнської популяції (рис.5) [Macek et al, 2000, Лівшиць Л, 2001].

Аналіз асоціацій між різними типами мутацій гена ТРБМ та клінічними проявами МВ

Виявлена нами значна генетична гетерогенність випадків МВ дозволила провести аналіз між встановленим генотипом хворих на МВ та деякими фенотиповими ознаками. Всіх пацієнтів із МВ було розділено на п'ять генотипних груп. Першу групу склали пацієнти гомозиготи за мажорною мутацією delF508. Друга генотипна група - це пацієнти, у яких ідентифіковано мутацію delF508 у компауді з іншою мутацією гена ТРБМ. У наступну генотипну групу увійшли хворі МВ - гетерозиготи за мутацією delF508. До четвертої групи було віднесено пацієнтів з однією ідентифікованою, відмінною від мажорної delF508, мутацією гена ТРБМ. П'яту генотипну групу склали хворі на МВ із двома неідентифікованими мутаціями у гені ТРБМ.

Ми провели порівняльний аналіз пацієнтів груп спостереження за такими ознаками: вік пацієнта на час встановлення діагнозу МВ; рівень електролітів у поті; фізичний розвиток; наявність панкреатичної недостатності; наявність та ступінь ураження гепатобіліарної, бронхолегеневої та серцево-судинної систем; кількість та вік настання летальних випадків. Визначення вірогідності різниці між частотами фенотипних ознак попарно для усіх генотипними груп дозволило встановити статистично вірогідні відмінності (P<0,05) між генотипними групами щодо окремих показників. Проведений аналіз показав, що присутність у генотипі мажорної мутації delF508, особливо у гомозиготному стані, веде до важких клінічних проявів захворювання та вищого ступеня летальності порівняно із пацієнтами інших генотипів. Цей вплив реалізується через панкреатичну недостатність, на рівень якого найбільше впливає дана мутація. Не встановлено вірогідної різниці за ступенем ураження бронхолегеневої системи між пацієнтами з різними поєднаннями алелей у гені ТРБМ. Це дозволяє припустити вплив інших факторів генотипу та середовища на формування легеневого фенотипу при МВ.

Використання ДНК-аналізу для проведення пренатальної діагностики МВ та встановлення гетерозиготного носійства мутацій гена ТРБМ в родинах з високим ризиком захворювання

У ході виконання цієї роботи проведено чотири пренатальних діагностики МВ з використанням молекулярно-генетичних методів. У двох випадках у плодів було діагностовано МВ й вагітність рекомендовано перервати. У решті випадків, на основі проведеного аналізу, вагітність рекомендували пролонгувати.

Нами виявлено 79 гетерозиготних носіїв різного роду мутацій гена ТРБМ серед родичів пробандів.

Як видно із даних, поданих у табл. 3, переважна більшість (81%) - це гетерозиготні носії мажорної мутації delF508. Гетерозиготні носії мутацій гена ТРБМ, сибси та їхні батьки отримали рекомендації щодо необхідності проходження медико-генетичного консультування при плануванні вагітності. Встановлення гетерозиготного носійства мутацій гена ТРБМ є першим кроком на шляху профілактики МВ, і може мати у майбутньому значний економічний та медико-соціальний ефект.

У ході проведення роботи нами виявлено низьку поінформованість пацієнтів про можливості пре- та постнатальної молекулярно-генетичної діагностики МВ, що було перешкодою для ширшого запровадження цього аналізу. Для вирішення даної проблеми необхідно поширювати знання про сучасні можливості пре- та постнатальної діагностики серед таких сімей та осіб, що пов'язані у суспільстві із вирішенням проблем МВ.

Результати цих досліджень будуть використані при формуванні підходів до пре- та постнатальної діагностики МВ за допомогою молекулярно-генетичних методів та сприятимуть поступовому ви-рiшенню проблем діагностики та профілактики випадків МВ у нашому регіоні.

ВИСНОВКИ

У результаті виконання поставлених у даній роботі задач встановлено спектр та частоти найбільш поширених мутацій і поліморфних варіантів гена ТРБМ у хворих на муковісцидоз із Західного регіону України, що дозволить проводити ефективну пре- і постнатальну діагностику та профілактику муковісцидозу та розширено розуміння зв'язку мутантного генотипу із фенотипом.

1. Встановлено середнє значення концентрації іонів хлору в поті у пацієнтів із хронічними бронхолегеневими та шлунково-кишковими розладами 24,37 + 2,80 мекв/л, тоді як у групі хворих на МВ цей показник сягає 103,29 + 15,78 мекв/л. Підтверджено специфічність потового тесту для формування селективної групи пацієнтів, яким необхідно проведення молекулярно-генетичного аналізу мутацій гена ТРБМ.

2. Створено банк ДНК пацієнтів високого ризику МВ та членів їх сімей, який налічує 410 зразків й постійно поповнюється.

3. Мутація delF508 є мажорною у досліджуваній групі хворих на МВ із Західного регіону Україні і її частота становить 47,6%.

4. Встановлено частоти та спектр найпоширеніших мутацій гена ТРБМ серед хворих на МВ із Західного регіону України: W1282X (екзон 20) - 3,2%; G542X (екзон 11) - 2,4%; N1303K (екзон 21) - 2,4%; CFTRdele2,3(21kb) - 1,6%. Висока частота мутації W1282X та ідентифікована нами мутація 2721del11 є виявленими особливостями хворих на МВ Західного регіону у порівнянні з іншими регіонами України.

5. Виявлено та встановлено частоти окремих поліморфних варіантів гена ТРБМ: 875+40АG (екзон 6а) - 8,6%; Р1209Р (екзон 20) - 5,1%; Т854Т (екзон 14а) - 32,7%.

6. Показано, що наявність у генотипі мажорної мутації delF508, особливо у гомозиготному стані, асоціюється з важкими клінічними проявами захворювання та вищим ступенем летальності порівняно з пацієнтами з іншими генотипами.

7. Отримані нами дані свідчать про значний генетичний та клінічний поліморфізм випадків МВ та необхідність охоплення молекулярно-генетичним аналізом гена ТРБМ усіх випадків підозри цього захворювання.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

Корнієнко Ю.О., Макух Г.В., Фоменко Н.М., Коссак І.Б. Ідентифікація мутацій delF508 та G542X гена ТРБМ у Західноукраїнській регіональній популяції // Практична медицина. - 1999. - №5-6. - с.6-9.

Макух Г.В. Мутації гена ТРБМ та їх молекулярно-генетична діагностика // Acta Medica Leopoliencia. -2000. -№3. -с.5-8.

Макух Г.В., Кочева С., Заставна Д.В., Корнієнко Ю.О., Гнатейко О.З. Скринінг мутацій гена ТРБМ методом DGGE аналізу в осіб високого ризику муковісцидозу із Західного регіону України // Біополімери та клітини. -2001. -Т.17, №4, -с.319-324.

Заставна Д.В, Терпиляк О.І., Корнієнко Ю.О., Макух Г.В., Гулеюк Н.Л., Безкоровайна Г.М., Гнатейко О.З. Первинна та вторинна профілактика вродженої та спадкової патології // Українські медичні вісті. -2000. -Т.3, №1. -с.63-65.

Заставна Д.В., Гулеюк Н.Л., Терпиляк О.І, Макух Г.В., Гнатейко О.З. Особливості деяких генетичних структур соматичних клітин як маркерів для пренатальної діагностики природженої та спадкової патології // Ехографія в перінатології, гінекології та педіатрії. Збірник наукових праць. -1999. -Кривий ріг. -с.175-177.

Корнієнко Ю.О., Соколов С.Є., Нестор О.В., Сбейх Р., Смердова Т.А., Боровська (Макух) Г.В., Тишкевич А.А., Гнатейко О.З. Перспективи застосування імпендансометрії в діагностиці муковісцидозу // Матеріали ІІ-го з'їзду медичних генетиків України. -1995. -Львів. -с.82.

Корнієнко Ю.О., Струс Г.В., Боровська (Макух) Г.В., Франків М.Я., Тишкевич А.А., Гнатейко О.З. Розробка підходів у потовій діагностиці муковісцидозу // Матеріали ІІ-го з'їзду медичних генетиків України. -1995. -Львів. -с.82.

Макух Г.В. Детекція мутації delF508 гена ТРБМ // 1-ий Міжнародний медичний конгрес студентів та молодих вчених. Тези доповідей. -1997. -Тернопіль. -с.259.

Макух Г.В. Потова проба для діагностики муковісцидозу (МВ) // 1-ий Міжнародний медичний конгрес студентів та молодих вчених. Тези доповідей. -1997. -Тернопіль. -с.259.

Корнієнко Ю.О., Бобер Л.Й., Рудак А.В., Макух Г.В. Муковісцидоз: стан проблеми та формування підходів до клініко-лабораторної діагностики // VII-ий конгрес СФУЛТ. Тези доповідей. -1998. -Ужгород. -ч.2, с.143.

H. Makukh, S.Koceva, O.Hnateyko, G.Efremov. Mutation analysis of CFTR gene by DGGE in patients from West Ukraine // Abstracts 4-th Intern. Sympos. For Cystic Fibrosis. -Budapest. -2000. - #27.

АНОТАЦІЇ

Макух Г.В. Аналіз мутацій гена СFTR (ТРБМ) у хворих високого ризику муковісцидозу із Західного регіону України. -Рукопис

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика. -Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 2001.

Проведено аналіз та встановлено частоти і спектр найпоширеніших мутацій гена ТРБМ серед хворих на муковісцидоз із Західного регіону України: delF508 (екзон 10) - 47,6%, W1282X (екзон 20) - 3,2%; G542X (екзон 11) - 2,4%; N1303K (екзон 21) - 2,4%; CFTRdele2,3(21kb) - 1,6%. Вперше серед хворих муковісцидозом із Східної Європи ідентифіковано мутацію 2721del11 (екзон14а).

Виявлено та встановлено частоти поліморфних варіантів гена ТРБМ: 875+40АG (екзон 6а) - 8,6%; Р1209Р (екзон 20) - 5,1%; Т854Т (екзон 14а) - 32,7%. Показано, що наявність у генотипі мажорної мутації delF508, особливо у гомозиготному стані, асоціюється з важкими клінічними проявами захворювання та вищим ступенем летальності порівняно з пацієнтами інших генотипів. Отримані дані свідчать про значний генетичний та клінічний поліморфізм випадків муковісцидозу та необхідність охоплення молекулярно-генетичним аналізом гена ТРБМ усіх випадків підозри цього захворювання.

Ключові слова: ген ТРБМ, мутація, поліморфізм, муковісцидоз, Західний регіон України, молекулярно-генетичний аналіз.

Макух Г.В. Анализ мутаций гена СFTR (ТРБМ) у больных высокого риска муковисцидоза из Западного региона Украины.

Диссертация на соискание ученой ступени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика.- Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 2001.

Муковисцидоз - самое распространённое наследственное заболевание из аутосомно-рецессивным типом наследования. В Западном регионе Украины каждый год ожидается рождение 45 детей с данным наследственным заболеванием.

Целью диссертационного исследования был анализ спектра, частоты и характера ассоциаций из фенотипом мутаций и полиморфных вариантов гена ТРБМ у больных высокого риска муковисцидоза из Западного региона Украины.

Первым этапом исследований было проведение измерений концентрации ионов хлора и натрия в поте пациентов с подозрением муковисцидоза. Пациенты, у которых наблюдались клинические проявления муковисцидоза и был установлен позитивный результат потового теста, подвергались проведению молекулярно-генетического анализа гена ТРБМ. Прямую детекцию мажорной мутации delF508 с использованием полимеразной цепной реакции и последующего анализа путём электрофореза в полиакриламидном геле проведено у 389 лиц. По результатам клинических наблюдений и проведённых молекулярно-генетических исследований сформировано группу из 63 пробандов, которые не имели между собой родственных связей, и у которых был установлен диагноз муковисцидоз. В этой группе пробандов проведено скрининг возможных аберраций в пятнадцати экзонах гена ТРБМ (11; 14в; 17; 21; 9; 6а; 20; 14а; 15; 12; 3; 23; 8; 15; 18) с помощью электрофореза в денатурирующем градиентном геле (DGGE). Мы проанализировали и установили частоту протяжной делеции экзонов 2, 3 гена ТРБМ - мутации CFTRdele2,3(21kb). Значительный генетический полиморфизм выявленных случаев муковисцидоза позволил провести анализ между установленным генотипом пациентов и некоторыми фенотипическими признаками. Мы провели сравнительный анализ генотипических групп по следующими признакам: возраст пациента на время установления диагноза; уровень электролитов в поте; наличие панкреатической недостаточности; наличие и степень поражения гепатобилиарной, бронхолёгочной и сердечно-сосудистой систем; количество и возраст летальных исходов. В ходе выполнения работы проведено четыре пренатальные диагностики муковисцидоза и выявлено 79 гетерозиготных носителей мутаций гена ТРБМ.

Установлено частоты и спектр самых распространённых мутаций гена ТРБМ среди больных муковисцидозом из Западного региона Украины: delF508 (экзон 10) - 47,6%, W1282X (экзон 20) - 3,2%; G542X (экзон 11) - 2,4%; N1303K (экзон 21) - 2,4%; CFTRdele2,3(21kb) - 1,6%. В результате проведённого секвенирования впервые среди больных на муковисцидоз из Восточной Европы идентифицирована мутация 2721del11 (экзон 14а).

Выявлено и установлено частоты полиморфных вариантов гена ТРБМ: 875+40АG (экзон 6а) - 8,6%; Р1209Р (экзон 20) - 5,1%; Т854Т (экзон 14а) - 32,7%.

Показано, что присутствие в генотипе мажорной мутации delF508, особенно в гомозиготном состоянии, ассоциируется с тяжёлыми клиническими проявлениями заболевания и высшим уровнем летальности в сравнении с пациентами других генотипов.

Полученные вследствие проведённых исследований результаты указывают на значительный генетический и клинический полиморфизм случаев муковисцидоза и необходимость охватывания молекулярно-генетическим анализом всех случаев подозрения данного наследственного заболевания.

Ключевые слова: ген ТРБМ, полиморфизм, муковисцидоз, Западный регион Украины, молекулярно-генетический анализ.

Makukh H.V. The mutation analysis of CFTR gene among high risk of Cystic Fibrosis patients from Western Ukraine. -Manuscript.

Thesis for a Candidate of biological science degree in specialty 03.00.15 - genetics. Institute of Cell Biology and Genetic Engineering of National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 2001.

It has been determined the frequency and spectrum of the most common CFTR gene mutations among Cystic fibrosis patients from West Ukrainian region: delF508 (exon 10) - 47,6%, W1282X (exon 20) - 3,2%; G542X (exon 11) - 2,4%; N1303K (exon 21) - 2,4%; CFTRdele2,3(21kb) - 1,6%. The mutation 2721del11 (exon14a) has been identified for the first time in Cystic fibrosis patients from East Europe. It has been found out and determined the frequencies of some CFTR gene polymorphism: 875+40АG (exon 6а) - 8,6%; Р1209Р (exon 20) - 5,1%; Т854Т (exon 14а) - 32,7%. It has been shown that the presence of the major delF508 mutation in genotype and especially in homozygous state has been associated with more difficult disease manifestations and with higher level of mortality in comparison with other genotypes groups of patients. These data have proved considerable genetical and clinical polymorphism of Cystic fibrosis cases and the necessity of molecular-genetics analyses of CFTR gene in all cases of this disease suspicion.

Key words: CFTR gene, mutation, polymorphism, West Ukraine, molecular-genetics analysis.

Размещено на Allbest.ru