Основы лабораторной диагностики "антифосфолипидного синдрома"

Размещено на http://www.allbest.ru

Основы лабораторной диагностики "антифосфолипидного синдрома"

Под термином "антифосфолипидный синдром" (АФС) объединяется группа аутоиммунных нарушений, характеризующаяся наличием в крови в высоком титре антител к содержащимся в плазме отрицательно заряженным мембранным фосфолипидам - фосфатидилсерину, кардиолипину и др., а также к связанным с этими фосфолипидами гликопротеинам (бета2-гликопротеину-I, аннексину V и/или протромбину). Другой важной характеристикой этого синдрома является нарушение ряда параметров свертываемости крови - развитие гипокоагуляции в различных так называемых фосфолипид-зависимых тестах, выполняемых на бедной тромбоцитами плазме (БТП). Эта гипокоагуляция, которая обозначается как наличие в плазме крови антикоагулянтов волчаночного типа (АВТ), устраняется или становится значительно менее выраженной при добавлении к БТП эмульсии нормальных фосфолипидных мембран, полученных из разрушенных тромбоцитов, либо эритрофосфатида [2,5].

Антифосфолипидный синдром является одним из наиболее часто встречающихся видов тромбофилии, в связи с чем его распознавание должно включаться в диагностический процесс во всех случаях ранних и, особенно, рецидивирующих венозных и артериальных тромбозов различной локализации, тромбоэмболий, динамических нарушений мозгового кровообращения и ишемических инсультов, в том числе протекающих с синдромами мигрени, нарушениями памяти, парезами, эпи-синдромом, нарушениями зрения и другими церебрально-сосудистыми проявлениями, а также при упорном невынашивании беременности (внутриутробная гибель плода, выкидыши), наличии ливедо, умеренной тромбоцитопении, сочетающейся с тромбозами и ишемическими явлениями, ложно положительной реакцией Вассермана и другими проявлениями [1,3,4,9,25,]. При этом следует учитывать, что наряду с так называемым "первичным антифосфолипидным синдромом" часты случаи его сочетания с системной красной волчанкой, узелковым периартериитом и другими заболеваниями аутоиммунной природы, а также с вирусными и лимфопролиферативными болезнями, меняющими иммунный статус организма. Эти формы обозначаются как "вторичный АФС" и в их симптоматику входят как признаки основного заболевания, так и АФС. К вторичному АФС могут быть отнесены и случаи этой формы патологии, возникающие вследствие ряда лекарственных воздействий, которые трактуются как гаптеновые иммунные антифосфолипидные синдромы.

В процессе многолетних наблюдений более, чем над 800 больными с АФС, многие из которых направлялись в наш центр для уточнения диагноза и проведения лечения, мы неоднократно сталкивались с рядом типичных ошибок, допускавшихся при распознавании АФС, в результате чего он либо не выявлялся, либо, что наблюдалось несравненно чаще, диагностировался ошибочно у больных, у которых в действительности этого синдрома не было. Среди ошибок в распознавании АФС такая гипердиагностика имела место более, чем в 70% случаев. Анализ этих ошибок показал, что они связаны, в основном, со следующими причинами:

Недостаточно полным обследованием больных и применением ограниченного числа рекомендуемых для такой диагностики тестов [2,11,17, 18, 26]. Так, мы неоднократно сталкиваемся с тем, что диагноз АФС ставится лишь на основании одного антикардиолипинового теста без определения антител к другим фосфолипидам и без выявления эффектов так называемых "волчаночных антикоагулянтов". Между тем известно, что антикардиолипиновый тест, несомненно являющийся наиболее "ходовым" и стандартизированным, обладает сравнительно низкой специфичностью, поскольку кардиолипин является компонентом лишь мембран внутриклеточных органелл, содержится в большом количестве в плазме здоровых людей, будучи в ней заблокирован другими компонентами [10] и бывает положительным не только при АФС, но и при других видах патологии [11,15, 19]. В силу этого, антикардиолипиновый тест при всей своей высокой стандартизации и воспроизводимости должен дополняться другими методами иммунологической диагностики (см. ниже), а также комплексным определением эффектов волчаночных антикоагулянтов. К этому нужно добавить, что антикардиолипиновый тест может считаться положительным лишь при очень высоких его показаниях, превышающих в несколько раз нормальный уровень этих антител. Вместе с тем, в настоящее время подчеркивается необходимость определения при АФС не только антикардиолипиновых антител, но и титра антител к другим мембранным фосфолипидам (фосфатидилсерину и др.), для чего ряд фирм (Stago и др.) выпускают тест-системы, содержащие антитела как к отдельным мембранным фосфолипидам, так и к их смесям.

Иммунодиагностика АФС согласно современным рекомендациям должна включать в себя помимо определения титра антифосфолипидных антител, принадлежащим к разным классам иммуноглобулинов, исследование антител к некоторым гликопротеинам, фиксированным на фосфолипидных мембранах. Важнейшими из них являются бета2-гликопротеин-I (бета2ГП-I), аннексин V и протромбин. Соответствующие диагностикумы также выпускаются рядом фирм (Stago, Loxo и др.). Для повышения точности диагностики и уточнения степени тромбогенности иммунного процесса существенное значение имеет определение титра антител хотя бы к одному из этих белков. Наиболее показательно в этом отношении определение титра антител к бета2-ГП-I, о чем говорит множество публикаций и докладов на Международных конференциях, посвященных антифосфолипидному синдрому, в том числе и работы нашей клиники [11, 20]. В настоящее время разрабатываются также методики определения в сыворотке крови титра антител к белково-фосфолипидным неоантигенам.

Следует иметь в виду, что и при достаточно полном иммунологическом обследовании значительная часть случаев АФС (по разным данным в пределах 35-60%) остается нераспознанным, если одновременно не определяются в плазме антикоагулянты волчаночного типа. Последние также неоднородны как и антифосфолипидные антитела, в связи с чем их выявление должно проводиться полным комплексом предложенных для этого методик. Недопустимо также применение с этой целью недостаточно проверенных "доморощенных" методов и их модификаций, не прошедших сравнения с признанными эталонными тестами. Мы это подчеркиваем, поскольку такими мало пригодными для использования в диагностическом процессе методиками очень засорена отечественная литература, что часто служит источником ошибочной постановки диагноза АФС, неправильного лечения больных. В этом мы неоднократно убеждались, подвергая повторному обследованию больных, направленных на консультирование в нашу клинику с якобы уже установленным АФС.

Иначе говоря, подобно тому, как один иммунологический тест не обеспечивает надежного распознавания АФС, выявление эффектов волчаночного антикоагулянта также требует использования полного комплекса предложенных для этого фосфолипид-зависимых скрининговых и подтверждающих методик, прошедших апробацию в многоцентровых исследованиях [2, 17, 18, 21, 27]. К сожалению в большинстве отечественных работ, посвященных АФС, в том числе и выполненных в крупных научных центрах, мы не встречаем такой четко построенной идентификации эффектов АВТ, без чего диагностика этого синдрома не может считаться достаточно обоснованной. Ниже будут рассмотрены основные принципы идентификации АВТ и иммунологических маркеров АФС.

Способы выявления и идентификации АВТ

Все включаемые в эту группу исследования выполняются на бедной тромбоцитами плазме (БТП). Они состоят из групп скрининговых и подтверждающих коагуляционных тестов, выполняемых либо мануально, либо на коагулометрах современных конструкций, но не на устаревших электрокоагулометрах и тромбоэластографах. Из скрининговых тестов наиболее доступным, но наименее специфичным является определение каолинового времени свертывания БТП. Наличие волчаночного антикоагулянта (ВА) может быть заподозрено при удлинении каолинового времени более, чем в 1,25 раза по сравнению с контролем. Вместе с тем следует помнить, что многие ВА не влияют на этот показатель и что его нарушение может быть обусловлено не только эффектами ВА, но и другими причинами.

Намного более информативны определения АЧТВ (АПТВ), но выполняемые не с обычными, а со специальными фосфолипидами, высоко чувствительными к действию ВА. Для этого, в качестве международных эталонов, признанных золотым стандартом, применяют диагностикумы, содержащие Platelin LS (фирмы "Organon-Teknika") или Staclot-LA (фирмы "Stago"). Многолетние испытания, проводившиеся в нашей лаборатории, подтвердили высокую информативность этих тестов. Под влиянием АВТ время свертывания в них удлиняется по сравнению с эталонной нормальной плазмой в 1,2 раза и более. Наличие ВА затем подтверждается другими скрининговыми и коррекционными пробами (см. ниже).

Особое место в выявлении ВА занимают тесты с фосфолипид-зависимыми коагулазами змеиных ядов. За рубежом с этой целью используется определение времени свертывания при добавлении к исследуемой БТП больного и к контрольной плазме разведенного яда гадюки Рассела [21,22,27]. В нашей лаборатории показано, что с этой же целью может быть использован коагуляционный тест с разведенным ядом среднеазиатской гюрзы (Vipera lebetina turanica), коагулаза которого по основным механизмам действия очень близка к коагулазе яда гадюки Рассела [12]. В больших сериях исследований, в том числе выполненных в нашем центре, показано, что коагуляционные тесты с фосфолипид-зависимыми разведенными змеиными ядами дают высокую корреляцию с показанием пробы с Platelin LS (коэффициент корреляции r =0.9; 0,02).

Для уточнения степени нарушения показаний фосфолипид-зависимых ядовых тестов используется определение отношения показателей времени свертывания, полученных в этих тестах, к времени свертывания, полученного в тестах с коагулазами ядов, не чувствительных к эффектам волчаночного антикоагулянта. С этой целью за рубежом чаще всего используется определение отношения времени свертывания в тесте с разведенным фосфолипид-чувствительным ядом змеи Pseudonaja textilis (текстарином) к свертыванию в тесте с фосфолипид-нечувствительным ядом Echis carinatus(песчаной эфы) [28]. Оба эти яда являются активаторами фактора II.

В нашем центре разработан аналогичный индекс, отражающий отношение времени свертывания в тестах с ядом гюрзы и эфы (Echis multisquamatus) той же активности. Показания последнего не зависят от участия в процессе свертывания фосфолипидных мембран [2, 5]. Определение этих индексов не только подтверждает то, что нарушение гемокоагуляции у исследуемого больного действительно зависит от блокады волчаночным антикоагулянтом плазменных фосфолипидных мембран, но и позволяет количественно оценить степень этой блокады. В норме указанные индексы варьируют в пределах от 0.9 до 1.1, а у больных с АФС - существенно повышены. Соответствующие ядовые диагностикумы выпускаются в Российской Федерации фирмой "Технология-Стандарт" (Барнаул), за рубежом - фирмами "American diagnostica", "Loxo", "Stago" и др.

Некоторые виды АВТ, отличающиеся высокой тромбогенностью [29], вызывают значительное замедление свертывания и в коагуляционном тесте с разведенным тканевым тромбопластином. Реагент разводится так, чтобы нормальное протромбиновое время было в пределах 45-55 с [2, 4, 13, 14, 17, 18]. Это определение также используется в комплексе диагностических тестов, выявляющих эффекты АВТ. Под влиянием АВТ протромбиновое время в плазме больного удлиняется по сравнению с эталонной нормальной плазмой в 1,2 раза и более. Однако нужно иметь в виду большое разнообразие выпускаемых разными фирмами тканевых тромбопластинов - получение их из разных исходных продуктов, неодинаковую чувствительность к действию АВТ и др. [2]. Поэтому в маркировках фирм-производителей должна быть указана возможность использования предлагаемого разведенного тромбопластина для определения антитромбопластиновой активности АВТ.

Качественно новым этапом в разработке методов диагностики АФС явилось создание в нашей лаборатории тестов, с помощью которых можно не косвенно, а путем прямого измерения оценивать степень блокады плазменных фосфолипидных мембран волчаночными антикоагулянтами [2, 6, 8, 15, 16]. В их основе лежит удаление плазменных фосфолипидных мембран (ПФМ) в процессе микрофильтрации БТП через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Наиболее простой способ, применяющийся для скрининга, заключается в определении каолинового времени свертывания (КВ) в БТП больного до и после ее микрофильтрации. Прокоагулянтную активность ПФМ оценивают по формуле, рассчитанной по калибровочным кривым:

X(%) = 10 3.8(lgtb-lgta)+1 ,

где ta- КВ до микрофильтрации,

tb- КВ после микрофильтрации.

У больных с АВТ в крови в 83% случаев определяется снижение активности ПФМ в плазме в среднем до 55% (от 0 до 70%), что обусловлено блокадой их антифосфолипидными антителами. Вместе с тем, снижение активности ПФМ в плазме больных может быть связано не только с их инактивацией АВТ, но и вследствие количественного уменьшения в процессе формирования тромба и в первой фазе ДВС-синдрома [7].

Подтверждающие тесты направлены на исключение наличия в плазме больных других ингибиторов свертывания крови, не относящихся к АВТ и не связанных с блокирующим действием последних на прокоагулянтную активность плазменных фосфолипидных мембран. С этой целью определяют исправляется ли выявленное нарушение свертываемости крови добавлением к БТП больного нормальной БТП в отношении 1:1 или 0,4:1,0 и таким же добавлением к БТП больного взвеси из тщательно разрушенных тромбоцитов, содержащих избыток нормальных фосфолипидных мембран. Для этого может быть использован реагент "тромбоцитин" фирмы "Технология-Стандарт" (диагностикум "Люпус-тест"), либо приготовленная в собственной лаборатории эмульсия из тщательно отмытых и затем разрушенных повторным (не менее трех раз) замораживанием и размораживанием нормальных тромбоцитов. За рубежом (фирмы Stago, Organon-Teknika и др.) готовятся специальные "подтверждающие" диагностические наборы, в которые входит наряду с реагентами для выполнения АПТВ, чувствительного к АВТ, фосфолипидный компонент из разрушенных тромбоцитов, гексагональные фосфолипиды.

Следует особо подчеркнуть то давно установленное обстоятельство, что АВТ гетерогенны и отличаются друг от друга по механизму действия на свертывающую систему крови [17] и у разных больных с АФС нарушены то одни, то другие коагуляционные тесты. Вследствие этого выявление АВТ ни в коем случае не должно ограничиваться выполнением лишь одного или части перечисленных выше тестов. Полноценная диагностика должна базироваться на комплексном использовании всех перечисленных выше определений, в сочетании с иммунологическим исследованием титра негативно заряженных мембранных антифосфолипидных антител (АФА и антител к некоторым связанным с фосфолипидами гликопротеинам, см. ниже).

Методы иммунной диагностики

Опыт нашей клиники, как и многочисленные исследования других авторов, свидетельствует о том, что выявление антифосфолипидных антител (АФА), принадлежащих к различным классам иммуноглобулинов (с тромбогенностью чаще всего ассоциируются иммуноглобулины IgG и IgA), должно базироваться не только на иммуноферментном определении титра антикардиолипиновых антител [11,20], хотя эта методика наиболее отработана, стандартизирована и достаточно важна, но и с исследованием других АФА. Так, установлена высокая частота и патогенность при этой патологии антител к фосфатидилсерину и к связанным с этими фосфолипидами белка - бета2ГП-I и аннексину V [13, 20, 23-25]. Особенно же важно, что дополнительное определение не только антикардиолипиновых, но и других антител к негативно заряженным фосфолипидам, как свидетельствуют и наши исследования, существенно увеличивают в комплексе с определением АВТ число диагностируемых случаев АФС [11].

Следует особо подчеркнуть, что высокий уровень антител к мембранным фосфолипидам отнюдь не является специфической особенностью только АФС, хотя и высоко характерен для последнего. Поэтому полноценная диагностика этого синдрома и связанной с ним тромбофилии, упорного невынашивания беременности и других клинических проявлений, может быть достигнута только путем развернутого исследования как всех эффектов волчаночных антикоагулянтов, так и важнейших антифосфолипидных антител и их белковых компонентов.

При АФС часто обнаруживаются также в высоком титре антитела к компонентам сосудистой стенки (коллагену, эндотелию) и ДНК, нарушается взаимодействие фосфолипидных мембран с важнейшим антикоагулянтом - протеином С, обнаруживаются иммунные сдвиги, обусловленные вирусными инфекциями. Выявление этих нарушений не имеет при данном синдроме диагностического значения, но проливает свет на некоторые стороны его патогенеза и на механизмы формирования тромбофилического статуса.

Таким образом, полноценная диагностика АФС должна базироваться на комплексном исследовании системы гемостаза с определением всех возможных эффектов АВТ и иммунологическом определении титра антител к отрицательно заряженным фосфолипидам (кардиолипину, фосфотидилсерину) и к связанным с фосфолипидными мембранами гликопротеинам.

Определение лишь отдельных из указанных параметров и неполное выполнение тестов, выявляющих АВТ, не может считаться достаточным для постановки диагноза.

иммунодиагностика антифосфолипидный волчаночный

Литература

1. Баркаган З.С. // Проблемы гематол. и перелив. крови. - 1996. - №3. - С.5-15.

2. Баркаган З.С., Момот А.П. Основы диагностики нарушений гемостаза. М., Ньюдиамед, 1999. - 217с.

3. Баркаган З.С., Сердюк Г.В. // Гематол. и трансфузиол. - 1991. - №4. - C.3-5.

4. Баркаган З.С., Сердюк Г.В., Дорохов А.Е. // Тезисы IV Всесоюзного съезда ревматологов. - Минск, 1991. - С.54.

5. Баркаган З.С., Цывкина Л.П., Цеймах И.Я.// Способ диагностики антифосфолипидного синдрома: Патент на изобретение №2104550 от 10/2 1998. РФ.

6. Мамаев А.H. Прокоагулянтная активность плазменных фосфолипидных мембран при тромбофилиях: Автореф. канд. дисс. -Барнаул, 1997. - 20 с.

7. Момот А.П., Бишевский К.М., Мамаев А.Н., Бaркaгaн З.С. // В кн: Сборник научных трудов Российской конференции "Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии". - С-Петербург, 1995. - С.126-127.

8. Момот А.П., Баркаган З.С., Мамаев А.Н., Бишевский К.М. // Клиническая лабораторная диагностика. - №8. - 1997. - С.20-22.

9. Насонов Е.Л., Алекберова З.С., Калашникова Л.А. и др. // Клин.мед. - 1988. - №2. - С.4.

10. Саенко В.А., Ротт Г.М., Поверенный А.М. // Бюлл. экспер. биол. мед. - 1989.-№2. - С.217-219.

11. Селиванов Е.В. Иммунные нарушения и особенности лабораторной диагностики антифосфолипидного синдрома: Автореф. канд. дисс. -Барнаул, 1998. - 33 с.

12. Цывкина Л.П. Клинико-диагностическое значение герпетотоксинов в распознавании основных видов патологии системы гемостаза: Автореф. докт. дисс. - Барнаул, 1997. - 35 с.

13. Amiral J., Larrivar J., Clureau D. et al. // Haemostasis, 1994. - Vol.24. - P.191-203.

14. Arnout J., Vanrusselt M., Huybrechts E. et al. // Br. J. Haematol. - 1994. - Vol.84. - P.94-99.

15. Barkagan Z.S., Momot A.P., Mamaev A.N. // In:14 th International Congress on Thrombosis. Montpellier. - 1996. - Abstr. 51. - P.342.

16. Barkagan Z.S., Mamaev A.N., Momot A.P., Ceimah I. // In: XIIIth Meeting of the International Society of Haematology. Istambul.- 1995. - P.945.

17. Brandt J.T., Barna L.K., Triplet D.A. // Thromb.Haemost. - 1995. -Vol.74. - №6. - P.1597-1603.

18. Brandt J.T., Triplet D.A., Alving B., Scharrer I. //Thromb.Haemost. - 1995. - Vol.74. - №4. - P.1185-1190.

19. Cohen J., Bakimer R., Blank M. et al. // Clin. Exp. Immunol., 1994.-Vol.97. - №2. - P.181-186.

20. Eschwedel V., Toti F., Grunebaschki L. et al. // Thromb. Haemost. - 1993. - Vol.69. - №6. - P.121.

Размещено на Allbest.ru