Вплив пептидогліканів на функціональну активність моноцитів в експерименті

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

Одеський державний медичний університет

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

Вплив пептидогліканів на функціональну активність моноцитів в експерименті

14.03.04 - патологічна фізіологія

Вітріщак Світлана Валентинівна

Одеса 2001

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Загальновідомо, що розвиток патологічних процесів, в тому числі гнійно-запальних, неможливо розглядати, не маючи уяви про механізми, які забезпечують загальну резистентність організму. Так, навіть умовно-патогенні бактерії, які за звичай не виявляють своєї агресивності, при зниженні загальної резистентності організму здатні викликати той чи інший інфекційно-запальний процес (Бухарін О.В., 1999). Найчастіше роль збудника належить стафілококам, проти яких не розвивається в повній мірі гуморальний імунітет (Сидоренко С.В., 1999). Мікроорганізми під час свого еволюційного розвитку виробили спеціальну систему пристосувань, спрямовану на пригнічення резистентності організму. Так, пептидоглікан (ПГ), який є основним полімером клітинної стінки грампозитивних бактерій, очолює список найважливіших бактеріальних молекул з імуномодулюючою активністю як in vivo, так і in vitro (Маянський А.Н. та співавт., 1997). Внутрішньошкірне введення здоровим та хворим особам ПГ в якості чужорідного фактора викликало певні патологічні зміни із загальними рисами (набряк, еритему і переважно гранулоцитарну інфільтрацію) (Beranova-Giorgianni S., et al., 1998). Поряд з активацією ПГ системи комплементу, вченими обговорюються експериментальні дані про активацію поліморфноядерних лейкоцитів, індукцію запальних процесів шкіри (Liu C. et al., 2000). ПГ можуть також діяти імуносупресивно, при відповідних умовах вони пригнічують специфічні реакції з участю антитіл (Mattsson E. et al., 1994).

З іншого боку, в формуванні захисних, компенсаторних і адаптивних реакцій організму суттєва роль належить багатофункціональній системі мононуклеарних фагоцитів (СМФ), завдяки їх неспецифічному фагоцитозу, здатності руйнувати деякі білки, знешкоджувати сторонні молекули і клітини, утворювати макромолекули, які специфічно реагують з чужорідними сполуками (Белобородова Н.В., Бачинская Е.Н., 2000). Одержані переконливі дані про участь клітин СМФ в боротьбі зі спонтанно виникаючими пухлинами, в загоєнні ран, обміні кісткової тканини, секреції ферментів та інших біологічно активних речовин (Клебанов Г.И., Владимиров Ю.А., 1999). Зокрема, макрофаги утворюють та виділяють С2-, С3-, С4- та С5-компоненти комплементу, лізоцим, інтерферони, мітогенний фактор для лімфоцитів, фактори некрозу пухлин (ФНП), медіатори імунної відповіді (монокіни): фактор, прискорюючий дозрівання тимоцитів, фактор, який може заміняти макрофаги при індукції антитілогенезу, пособляючий появі Т-хелперів, а також фактори, які пригнічують гуморальні та клітинні імунні реакції (Ломакин М.С., Арцимович Н.Г., 1991).

Доведено, що цитокіни (ФНП-б, інтерлейкіни (ІЛ)-1, -6) є основними прозапальними медіторами, які індукуються в організмі людини компонентами клітинної стінки бактерій (Дегтярева М.В. та співавт., 1996). Відзначено, що активація макрофагів за допомогою ПГ сприяє підвищенню їх метаболічної активності. Зокрема, ПГ впливав на хемотаксис макрофагів і гальмував їх переміщення і фагоцитарну реакцію; стимулював виділення макрофагами групи подібних між собою монокінів (ІЛ-1, ендогенного медіатора лейкоцитів); виявилося, що макрофаги при поглинанні ПГ утворюють біологічно активні глікопептиди з низькою молекулярною масою, які згодом виділяються за їх межі (Кетлинский С.А., 1999).

В патогенезі багатьох запальних процесів важлива роль належить мембранодеструктивним процесам, пов'язаним з вільно-радикальним окисленням ліпідів (Клименко М.О., Шевченко О.М., 1997). Вплив інфекційного фактора, розвиток місцевої і системної гіпоксії тканин створює умови для посилення пероксидації ліпідів (ПОЛ) у мембранах, активації ендогенних фосфоліпаз, пригнічення антиоксидантних ферментів захисту (Шандала М.Г., Лищенко Н.Н., 1999). Як результат, відбувається накопичення в тканинах продуктів, які ушкоджують клітинні мембрани і порушують їх функцію. Активація ПОЛ ініціює каскад перетворень арахідонової кислоти з утворенням ейкозаноїдів (простагландінів (ПГЛ) і лейкотрієнів), спроможних негативно впливати на імунокомпетентні клітини організму. Для пригнічення циклооксигеназного і ліпооксигеназного шляхів метаболізму арахідонової кислоти в даний час використовуються глюкокортикоїди і нестероїдні протизапальні препарати з антифлогогенними і імуносупресивними властивостями (Персиянова В.О. та співавт., 1998).

Зв'язок роботи з науковими програмами, темами. Дисертація виконана як ініціативна робота та є продовженням наукової роботи кафедри патологічної фізіології Луганського державного медичного університету № 01980005713 “Етіологія і патогенез гнійно-запальних поразок шкіри”.

Мета дослідження: Вивчити механізми дії пептидогліканів стафілококів на секреторну і фагоцитарну активність моноцитів та їх дерматонекротичну активність в експерименті за умов імуносупресії та імуностимуляції.

Для досягнення мети були визначені наступні окремі завдання:

1. В культурі моноцитів людини за умов імуносупресії та імуномодуляції дослідити дію пептидогліканів стафілококів на:

- продукцію інтерлейкінів-1в, 6, фактора некрозу пухлин і простагландіну Е₂;

- вміст циклічних нуклеотидів;

- активність перекисного окислення ліпідів і стан системи антиоксидантного захисту;

- фагоцитарну активність;

- апоптоз.

2. Дослідити дерматонекротичну активність стафілококових пептидогліканів в експерименті на білих мишах.

Об'єкт дослідження: моноцити крові людини, білі миші.

Предмет дослідження: вплив стафілококових пептидогліканів на секреторну і фагоцитарну активність моноцитів людини in vitro та дерматонекротичну активність в експерименті за умов моделювання імуносупресивного та імуностимулюючого стану.

Методи дослідження: імунологічні, біохімічні, бактеріологічні, експериментальні.

Наукова новизна отриманих результатів. Одержані нові дані про дозозалежний та видоспецифічний вплив ПГ на продукцію моноцитами ІЛ-1в, 6, ФНП-б і ПГЛ Е₂. Показаний різноспрямований і дозозалежний вплив ПГ на вміст циклічних нуклеотидів у моноцитах. Встановлена дозозалежна прооксидантна дія ПГ, яка полягає в активації ПОЛ в моноцитах на фоні недостатності ферментативної системи антиоксидантного захисту (АОЗ). Показаний стимулюючий вплив на фагоцитоз моноцитів малих доз ПГ і інгібуючий вплив великих доз. Доведена спроможність високих концентрацій ПГ індукувати апоптоз моноцитів. Вивчена дерматонекротична активність ПГ.

Практичне значення отриманих результатів. Результати проведених досліджень суттєво поширюють уявлення про механізм дії стафілококових ПГ на секреторну і фагоцитарну активність моноцитів і тим самим визначають патогенетичні підходи стосовно лікування гнійно-запальних захворювань цієї етіології. Актуальними для клінічної практики є одержані дані про вплив преднізолону та левамізолу на функціональну активність моноцитів за умов дії на них ПГ стафілококів. Отримані дані впроваджені в навчальний процес 3-х медичних вузів України: Луганського та Запорізького державних медичних університетів, Української медичної стоматологічної академії (м. Полтава).

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведені: інформаційний пошук за допомогою бази даних “Medline”, аналіз літератури, виконана експериментальна частина роботи, написані всі розділи дисертації та автореферат. Автор приймала участь у проведені імуноферментного та радіоімунного методів дослідження разом з працівниками кафедри клінічної імунології та мікробіології ХМАПО.

Апробація роботи. Основні положення дисертації повідомлені та обговорені на науковій конференції співробітників КМАПО “Актуальні проблеми гематології і трансфузіології” (Київ, червень 1999 р.); на III-му Національному конгресі патофізіологів України (Одеса, 2000 р.); а також на засіданнях Луганського обласного товариства патофізіологів у 1998-2001 рр.

Публікації. За матеріалами дисертації надруковані 10 робіт, у тому числі 7 статей в фахових журналах (4 статті - одним автором).

Обсяг і структура дисертації. Робота написана на 148 сторінках комп'ютерного тексту, складається із вступу, огляду літератури, 6 розділів власних досліджень, висновків. Список літератури включає 192 джерела, дисертація ілюстрована 30 таблицями.

Основний зміст роботи

пептидоглікан функціональна активність моноцит

Матеріали і методи дослідження. Об'єктом дослідження були 119 культур моноцитів периферичної крові практично здорових донорів. Виділення моноцитів з периферичної крові здійснювали за методикою Boyum (1998) в градієнті щільності фікол-верографін. Моноцити ідентифікували шляхом фарбування за Романовським-Гімзою. З отриманої визвесі моноцитів готували робочу концентрацію 10⁶ клітин/мл.

ПГ отримували з культур S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus, виділених від 39 хворих на гнійно-запальні захворювання, які находились на стаціонарному лікуванні в урологічному відділенні Луганської обласної клінічної лікарні з січня по вересень 2000 р. Встановлення родової приналежності культур та видову ідентифікацію стафілококів проводили згідно з наказом МОЗ СРСР № 535 від 22.04. 1985 р. ПГ одержували з клітинних стінок бактерій за методом Peterson P.K. et al. (1978). Проводили визначення фагоцитарної активності моноцитів (ФАМ) чашковим методом. Підраховували фагоцитарний індекс (ФІ) та фагоцитарне число (ФЧ). З метою вивчення впливу ПГ на моноцити їх попередньо інкубували з різними концентраціями ПГ кожного з видів стафілококів (0,01; 0,1; 1,0; 10,0; 100,0; 200,0 мг/л).

В моноцитах вивчали також вміст малонового діальдегіду (МДА), дієнових кон'югатів (ДК), активність каталази (КТ) та супероксиддисмутази (СОД). Визначення ІЛ-1в, -6, ФНП-б проводили в супернатантах моноцитів з допомогою комерційних наборів ELISA (Medgenix Diagnostics, Бельгія). Визначення ПГЛ Е₂, циклічних нуклеотидів (цАМФ та цГМФ) проводили радіоімунним методом з використанням комерційних тест-систем фірми Amersham (Велика Британія). Для визначення кількості СD₉₅-моноцитів використовували цитотоксичний метод.

Вивчення дерматонекротичних властивостей ПГ стафілококів проводили на 441 білих мишах-самцях масою тіла 14-17 г. ПГ S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus в дозах 0,01, 0,1, 1,0, 10,0, 100,0 та 200,0 мг/л у вигляді суспензії в ізотонічному розчині NaCl в об'ємі 0,1 мл вводили мишам внутрішньошкірно (в/ш) в область черевця. Через 24 год після зараження проводили облік шкірної реакції. Характер і інтенсивність поразок позначали за ступенями: I ступінь поразки (+) - крапкові малі некрози діаметром до 2 мм або інфільтрати, що не супроводжуються некротичним процесом; II ступінь (++) - некрози діаметром від 3 до 5 мм; III ступінь (+++) - некрози діаметром від 6 мм і більше. Площу некротичної ділянки (у мм²) у кожної миші обчисляли щодня протягом 21 дня. Протягом усього досліду для кожного дня спостереження виводили середній розмір площі поразки. Сума зазначених середніх розмірів, отриманих протягом усього терміну спостереження за тваринами, являла собою індекс поразки. Тварини були розподілені на 3 групи. Перша група тварин отримувала тільки ПГ, другій групі попередньо вводили підшкірно одноразово преднізолон (0,002 мг на 1 г маси), третя група отримувала з їжею левамізол (10 мг одноразово).

Статистична обробка отриманих цифрових даних здійснювалась на “Pentium-133” з використанням стандартних пакетів прикладних програм.

Вплив ПГ на секреторну активність моноцитів in vitro. ПГ суттєво впливали на секреторну функцію моноцитів периферичної крові донорів, що виявлялося в індукції продукції ІЛ-1в і 6, ФНП-б і ПГЕ₂. Вплив ПГ на синтез монокінів залежав від концентрації та від видової приналежності. Продукція моноцитами ІЛ-1в і 6 прогресивно збільшувалася в міру зростання дози ПГ; при використанні концентрацій ПГ 0,01-1,0 мг/л мало місце переважання продукції ІЛ-6, тоді як при дії більших доз - ІЛ-1в. Це було характерним для всіх ПГ, використаних в експерименті. Так, при використанні 0,01 мг/л ПГ S. aureus кратність збільшення продукції ІЛ-1в культурою моноцитів склала 1,3 раз порівняно з референтною нормою, а при концентраціях 0,1; 1,0; 10; 100 та 200 мг/л - 2,4; 5,1; 107,3; 219,6 та 406,9 разів відповідно. Аналогічні показники для синтезу ІЛ-6 перевищували референтну норму у 1,5; 5,0; 14,6; 28,2; 43,8 і 80,5 разів. Таким чином, невисокі рівні ПГ S. aureus більш інтенсивно стимулюють продукцію ІЛ-6, ніж ІЛ-1в, при високих концентраціях ПГ синтез ІЛ-1в є переважним. Подібні зміни в продукції ІЛ моноцитами периферичної крові людини мали також місце при використанні ПГ S. epidermidis та S. saprophyticus, але їх ІЛ-стимулююча активність була меншою порівняно з такою ПГ S. aureus.

ПГ стимулювали синтез ФНП-б в моноцитах, при цьому зі збільшенням концентрації ПГ інтенсивність продукції ФНП-б прогресивно зростала і була найбільшою при 200 мг/л. Ефект не залежав від видової приналежності ПГ, хоча і був найбільш вираженим при використанні ПГ S. aureus.

ПГ стафілококів стимулювали синтез ПГЛ Е₂, який був найбільшим в ПГ S. aureus, починаючи з концентрації 0,01 мг/л - при цій дозі синтез ПГЛ Е₂ перевищував показник референтної норми в 1,3 раз (р<0,05). Аналогічні дози ПГ S. epidermidis і S. saprophyticus істотної активації продукції ПГЛ Е₂ не викликали (р>0,05). В міру збільшення діючої дози ПГ стафілококів всіх видів синтез ПГЛ Е₂ посилювався. Найбільшу стимуляцію синтезу ПГЛ Е₂ викликали ПГ S. aureus, у ПГ S. saprophyticus зазначена спроможність була найменшою.

З метою вивчення впливу ПГ на секреторну активність моноцитів за умов імунодефіцитного стану, останній був модельований шляхом попереднього впливу на культуру моноцитів імунодепресанта - преднізолону протягом 1 год при 37 ? С у концентрації 1 мг/л, яка рекомендується для пригнічення імунітету in vivo. Далі моноцити піддавали впливу ПГ. Встановлено, що під впливом преднізолону секреторна активність моноцитів, які не контактують у наступному з ПГ, була вірогідно нижчою показника референтної норми. Вплив ПГ на продукцію ІЛ виявлявся в активації екскреції ІЛ-1в і 6, яка залежала як від чинної дози, так і від їх видової приналежності. Водночас, продукція ІЛ була значно нижчою такої для моноцитів, що не контактували з преднізолоном. Так, ПГ S. aureus у дозі 0,01 мг/л у моноцитів, підданих дії преднізолону, викликав підвищення продукції ІЛ-1в в 1,4 раз, у дозі 200,0 мг/л - у 219 разів порівняно з референтною нормою; кратність зростання екскреції ІЛ-6 склала 1,2 і 28,3 раз відповідно. У той же час, рівні ІЛ-1в і ІЛ-6 у моноцитів, які контактували з преднізолоном, були вірогідно нижчими таких у інтактних клітин. Менш виражено впливали на продукцію ІЛ моноцитами, підданими впливу преднізолону, ПГ S. epidermidis і S. saprophyticus (особливо в значних концентраціях). Таким чином, преднізолон пригнічує спроможність моноцитів in vitro продукувати ІЛ-1в і 6 як у відсутності додаткового впливу ПГ, так і при наявності такого.

Попередня обробка моноцитів преднізолоном в концентрації 1,0 мг/л істотно знижувала їх спроможність продукувати ФНП-б і ПГЛ Е₂. Порівняльний аналіз продукції моноцитами периферичної крові людини ФНП-б і ПГЛ Е₂ під дією преднізолону й у відсутність такого показав, що за умов його дії стимулюючий вплив ПГ зберігається, але він істотно менш виражений в порівнянні з таким для моноцитів, не підданих впливу преднізолону. Відзначена обставина не залежала від видової приналежності ПГ.

З метою вивчення впливу ПГ на секреторну спроможність моноцитів в умовах імуноактивного стану, останній був модельований шляхом попереднього впливу на визвесь моноцитів (протягом 1 год при 37 ? С) левамізолом у концентрації 2,5 мг/л, яка рекомендується для стимуляції імунітету в умовах in vivo. Встановлено, що левамізол стимулює секреторну активність моноцитів, що виявляється в посиленні продукції ІЛ-1в і 6, ФНП-б і ПГЛ Е₂. Так, під впливом левамізолу секреція ІЛ-1в моноцитами, не підданими в наступному дії ПГ, зросла в порівнянні з референтною нормою в 1,4 раз, ІЛ-6 - у 1,8 раз, ФНП-б і ПГЛ Е₂ - у 1,37 і 1,5 раз відповідно (р<0,05). Наступний додатковий вплив на стимульовані левамізолом моноцити ПГ стафілококів супроводжувався посиленням продукції монокінів, що залежало як від чинної концентрації ПГ, так і від його видової приналежності. Найбільша секреція монокінів реєструвалася при дії на стимульовані левамізолом моноцити дози ПГ 200,0 мг/л. При цьому найбільш активними виявилися ПГ S. aureus, найменш - ПГ S. saprophyticus. Вплив ПГ на ПОЛ. ПОЛ грає істотну роль у функціональній активності всіх клітин організму людини в нормі та при патології, тому становило інтерес дослідити активність пероксидації ліпідів у моноцитах, стимульованих in vitro ПГ стафілококів, як найбільш частих чинників розвитку різноманітних гнійно-запальних захворювань. Про вплив ПГ на ПОЛ в моноцитах судили за зміною концентрацій ДК і МДА. Встановлено, що ПГ стафілококів стимулювали ПОЛ в моноцитах, про що свідчило збільшення вмісту в досліджуваних культуральних рідинах ДК і МДА. Як виявилося, активуюча ПОЛ дія ПГ була дозозалежною і видоспецифічною. В міру збільшення концентрації ПГ реєструвалося істотне прогресуюче зростання рівнів ДК і МДА, яке сягало найбільших абсолютних розмірів при використанні ПГ у дозі 200 мг/л. Крім того, відзначалося превалювання прооксидантного потенціалу ПГ S. aureus порівняно з таким для ПГ S. epidermidis і S. saprophyticus. При використанні ПГ S. aureus у дозі 0,01 мг/л утворення ДК на 10⁶ моноцитів перевищило показник референтної норми в 1,2 раз (р<0,05), а МДА - у 1,44 раз (р<0,05); при 0,1 мг/л - в 1,5 та 1,9 раз; 1,0 мг/л - в 2,0 і 2,7 разів; 200 мг/л - в 3,2 та 5,0 разів відповідно.

Активність ПОЛ під впливом преднізолону в моноцитах, які не були піддані впливу ПГ, була значно нижчою такої для клітин референтної норми, що, мабуть, пояснюється антиоксидантними властивостями преднізолону. Так, вміст ДК для інтактних моноцитів виявився в 4,3 рази нижчим показника референтної норми, а рівень МДА - у 3,0 раз (р<0,05). При впливі на піддані дії преднізолону моноцити ПГ стафілококів відзначалася активація ПОЛ, що супроводжувалося підвищенням рівнів ДК і МДА. Пероксидація ліпідів збільшувалася в міру зростання дози ПГ. Вплив ПГ на активність ПОЛ за умов дії преднізолону на моноцити носив видоспецифічний характер. Найбільшим прооксидантним ефектом характеризувалися ПГ S. aureus, найменшим - ПГ S. saprophyticus, але вірогідних розходжень у продукції ДК і МДА під впливом зазначених ПГ виявлено не було. При порівнянні активності ПОЛ при дії преднізолону і без неї в моноцитах, які знаходяться під впливом ПГ, виявилося, що концентрації ДК і МДА були істотно нижчими таких при добавці до культурального середовища преднізолону. Таким чином, преднізолон значно знижує активність ПОЛ в моноцитах in vitro як при дії ПГ стафілококів, так і без неї. Зі збільшенням дози ПГ, діючої на моноцити, антиоксидантний ефект преднізолону знижується.

Стимуляція левамізолом моноцитів, які не контактують з ПГ стафілококів, не має розходжень з референтною нормою в показниках ПОЛ (р>0,05). В той же час, додатковий вплив на моноцити ПГ супроводжується активацією пероксидації ліпідів і накопиченням ДК і МДА. При цьому активність ПОЛ в моноцитах була тим вищою, чим більшою була чинна доза ПГ. Найбільшим проокислювальним ефектом на стимульовані левамізолом моноцити володіли ПГ S. aureus. Зіставлення активності ПОЛ показало, що концентрації ДК і МДА в стимульованих левамізолом моноцитах, додатково оброблених ПГ, були вірогідно нижчими таких для інтактних клітин.

Вплив ПГ на систему АОЗ. Активність процесів ПОЛ знаходиться під контролем системи АОЗ. Основними ферментами зазначеної системи є КТ і СОД. В зв'язку з цим, становило інтерес вивчення стану активності КТ і СОД в моноцитах крові людини, підданих впливу in vitro ПГ стафілококів. Встановлено, що активність внутрішньоклітинних КТ і СОД мала тенденцію до збільшення в міру зростання концентрації ПГ. При цьому відзначено, що вплив ПГ на каталітичну активність ферментів системи АОЗ має видоспецифічний характер. При впливі на моноцити ПГ S. aureus встановлено, що при збільшенні дози до 10,0 мг/л функціональна спроможність КТ і СОД моноцитів зростає. При концентраціях ПГ S. aureus 100-200 мг/л має місце виснаження функціональної активності зазначеної системи, що виявляється в зниженні активності КТ і СОД. Аналогічна тенденція змін активності ферментів системи АОЗ спостерігалась при включенні до експерименту ПГ S. epidermidis і S. saprophyticus, але зміни активності СОД і КТ були більш помітно виражені в порівнянні з такими для ПГ S. aureus при використанні доз 0,01-10,0 мг/л. При дослідженні впливу ПГ на активність ферментів системи АОЗ в моноцитах, попередньо підданих дії преднізолону, встановлено, що дія на моноцити преднізолону в дозі 1,0 мг/л, без наступного контакту клітин з ПГ, супроводжувалась невірогідним зниженням активності КТ і СОД відносно референтної норми. Встановлено, що дози ПГ 0,01-1,0 мг/л за умов дії на моноцити преднізолону істотно не змінюють активність їх КТ і СОД, а дози 10,0-200 мг/л її підвищують. Найбільш показовими в цьому відношенні є зміни, що розвиваються під впливом ПГ S. aureus. Статистично вірогідні зміни активності СОД і КТ відзначалися під впливом ПГ S. epidermidis і S. saprophyticus в дозі 100 мг/л, тобто, найменший інгібуючий вплив цих ПГ зберігається й за умов дії на моноцити преднізолону.

Функціональна активність ключових ферментів системи АОЗ в моноцитах, які були піддані дії преднізолону і ПГ стафілококів, була вірогідно нижчою такої лише при дії преднізолону. При цьому використання доз ПГ 0,01-1,0 мг/л не супроводжувалося значимою зміною активності СОД і КТ порівняно з такою при відсутності ПГ. В той же час, при наявності преднізолону навіть незначні концентрації ПГ викликали посилення активності КТ і СОД моноцитів. Так, активність КТ при добавці преднізолону та дозі ПГ S. aureus 0,01 мг/л була в 1,35 раз вищою порівняно з такою для моноцитів, не підданих впливу преднізолону (р<0,05). Подібна тенденція мала місце і при всіх інших концентраціях ПГ незалежно від їх видової приналежності. Таким чином, під дією преднізолону в моноцитах, які контактують у наступному з ПГ стафілококів, спостерігалося зниження активності ферментів системи АОЗ, при домінуванні в цілому даної системи над активністю процесів ПОЛ.

При дослідженні впливу ПГ на активність ферментів АОЗ в моноцитах, стимульованих левамізолом, встановлено, що при відсутності стимуляції, а також при наявності такої в дозах 0,01-0,1 мг/л, істотних змін активності КТ і СОД не спостерігалося. В міру збільшення чинної концентрації ПГ, а також залежно від їх видової приналежності, реєструвалося статистично значиме підвищення каталітичної спроможності СОД і КТ в стимульованих левамізолом моноцитах. Найбільші активності зазначених ферментів системи АОЗ реєструвались при дозах ПГ 200 мг/л.

Вплив ПГ на систему циклічних нуклеотидів. Циклічні нуклеотиди - цАМФ і цГМФ - є універсальними месенджерами зовнішніх сигналів на клітину. Від вмісту циклічних нуклеотидів залежить функціональний стан клітини. Нами встановлено, що ПГ стафілококів при безпосередній дії на моноцити in vitro змінюють внутрішньоклітинний вміст цАМФ і цГМФ. Вплив ПГ на систему циклічних нуклеотидів у моноцитах людини є дозозалежним і видоспецифічним. Так, внесення до культури моноцитів ПГ S. aureus в дозі 0,01 мг/л приводило до збільшення внутрішньоклітинного вмісту цАМФ і цГМФ при зберіганні вихідного співвідношення між ними. Подальше зростання чинної концентрації цього ПГ супроводжувалося прогресуючим накопиченням внутрішньоклітинного рівня цАМФ і зниженням цГМФ, що вело до збільшення співвідношення цАМФ/цГМФ. Вплив in vitro на моноцити крові людини ПГ S. epidermidis та S. saprophyticus приводив до менш виражених змін вмісту циклічних нуклеотидів, ніж при використанні ПГ S. aureus.

При дослідженні впливу ПГ на систему циклічних нуклеотидів в моноцитах на фоні дії преднізолону встановлено, що преднізолон в інтактних моноцитах викликає збільшення вмісту цАМФ і зниження цГМФ. При цьому коефіцієнт цАМФ/цГМФ в 2,0 рази перевищував референтну норму. Додатковий вплив на моноцити ПГ за цих умов сприяв подальшому поглибленню дисбалансу в системі циклічних нуклеотидів. Зі збільшенням чинної дози ПГ мало місце прогресивне підвищення цАМФ і зниження цГМФ при зростанні значення цАМФ/цГМФ. Аналогічні тенденції змін циклічних нуклеотидів, а також співвідношення між ними спостерігалися і при дії на стимульовані преднізолоном моноцити крові людини ПГ S. epidermidis і S. saprophyticus, але виразність змін була менш значною.

При дослідженні впливу левамізолу на систему циклічних нуклеотидів моноцитів in vitro встановлено, що левамізол, без наступного контакту клітин з ПГ стафілококів, викликає зниження рівня цАМФ і збільшення вмісту цГМФ. Вплив ПГ на систему циклічних нуклеотидів у стимульованих левамізолом моноцитах крові людини залежав як від чинної концентрації ПГ, так і від їх видової приналежності. Малі дози ПГ викликали найбільше підвищення рівня внутрішньоклітинного цГМФ на фоні зниження цАМФ. В міру збільшення концентрації ПГ вміст внутрішньоклітинного цГМФ зменшувався, сягаючи або навіть перевищуючи показник для інтактних моноцитів. У той же час, рівень цАМФ мав тенденцію до підвищення. Відповідно змінювався коефіцієнт цАМФ/цГМФ - при малих дозах ПГ він мав тенденцію до зниження, тоді як при високих - збільшувався, сягаючи рівня інтактних моноцитів. Вплив левамізолу на систему циклічних нуклеотидів моноцитів залежав від видової приналежності ПГ. Як виявилося, найменшою протидією левамізолу на систему цАМФ/цГМФ володіли ПГ S. saprophyticus, найбільшою - ПГ S. aureus.

Вплив ПГ на фагоцитоз. Фагоцитоз - одна з важливих функцій СМФ макроорганізму. Подавало значний інтерес вивчення впливу ПГ на ФАМ. Встановлено, що вплив ПГ на ФАМ є дозозалежним і видоспецифічним: малі дози ПГ стимулювали фагоцитоз, тоді як високі - пригнічували. Вплив на фагоцитоз моноцитів залежав від видової приналежності ПГ: найбільша інгібіція фагоцитозу мала місце у випадку контакту моноцитів з ПГ S. aureus (100-200 мг/л), найменша - з ПГ S. saprophyticus. Попередній контакт моноцитів крові людини з ПГ S. aureus у концентрації 0,01 мг/л стимулював ФАМ (ФІ та ФЧ збільшились в 1,56 і 1,7 разів відповідно, р<0,05); у дозі 0,1 мг/л - не виявив істотних розходжень показників ФІ і ФЧ порівняно з показниками референтної норми, що було розцінено як прояв інгібуючого впливу ПГ даної концентрації на ФАМ. При використанні в експерименті ПГ у дозі 1,0 мг/л і вищій спостерігалось пригнічення фагоцитозу. Аналогічні, але менш виражені зміни ФАМ відмічені при дії ПГ S. epidermidis і S. saprophyticus.

При дослідженні впливу ПГ стафілококів на фагоцитарну активність моноцитів, підданих дії преднізолону, встановлено, що вплив ПГ супроводжується вираженим пригніченням ФАМ. Так, вже при дозах 0,01 мг/л кратність зниження ФІ складала від 2,2 разів для ПГ S. saprophyticus до 3,8 раз для ПГ S. aureus (p<0,01); ФЧ - 1,7 та 2,2 разів відповідно (p<0,05). При зростанні чинної концентрації ПГ ФАМ прогресивно знижувалась. При дозі ПГ 10 мг/л ФІ та ФЧ дорівнювали нулю при обробці моноцитів ПГ S. aureus та S. epidermidis, тоді як аналогічний результат при використанні ПГ S. saprophyticus був отриманий при 100 мг/л. Встановлено, що ПГ S. aureus на фоні попередньої обробки моноцитів преднізолоном виявляли найбільший інгібуючий вплив на фагоцитоз порівняно з ПГ S. epidermidis та S. saprophyticus. Аналогічна тенденція реєструвалась також при концентраціях ПГ 0,1 та 1,0 мг/л.

Попередня стимуляція моноцитів крові людини левамізолом з наступним їх контактом з ПГ стафілококів супроводжується посиленням ФАМ. Виразність стимулюючої активності залежала як від чинної концентрації ПГ, так і від їх видової приналежності. Вплив ПГ на стимульовані левамізолом моноцити в дозі 0,01 мг/л супроводжувався збільшенням ФІ відносно референтної норми в 2,1-2,7 разів, а ФЧ - в 2,3-4,2 разів; при збільшенні дози ПГ показники ФЧ та ФІ прогресивно знижувались, сягаючи рівня референтної норми при концентрації ПГ S. aureus 10,0 мг/л, ПГ S. epidermidis та S. saprophyticus - 100-200 мг/л.

Вплив ПГ на апоптоз. Посилення апоптозу - запрограмованої клітинної загибелі клітин - може бути однією з причин розвитку імунодефіцитного стану при гнійно-запальних захворюваннях, викликаних бактеріальною мікрофлорою. Через це становило інтерес дослідження впливу ПГ стафілококів на апоптоз моноцитів. Встановлено, що ПГ індукували апоптоз моноцитів, що виявлялося в експресії на клітинах маркера апоптозу - рецептора СD95. Концентрації ПГ 0,01-0,1 мг/л не індукували апоптоз. Найбільшою стимулюючою апоптоз дією володіли ПГ S. aureus. Так, при 1,0 мг/л ПГ S. aureus кількість CD95+-моноцитів була в 2,3 рази вищою порівняно з референтною нормою (р<0,05), ПГ S. epidermidis і S. saprophyticus - в 1,7 і 1,3 раз відповідно. Інтенсивність апоптозу зростала в міру збільшення чинної дози ПГ і була найбільшою при концентрації ПГ S. aureus 200 мг/л (ступінь збільшення - 10,9 раз; для ПГ S. epidermidis і S. saprophyticus - відповідно 6,9 і 6,5 разів).

Попередня обробка моноцитів крові людини преднізолоном з наступною дією на них ПГ супроводжувалась зниженням експресії на моноцитах маркера апоптозу СD₉₅. Найбільший антиапоптозний ефект преднізолону реєструвався при використанні ПГ в дозі 0,01 мг/л. По мірі збільшення чинної концентрації ПГ кількість стимульованих преднізолоном CD₉₅₊-клітин зростала, перевищуючи показник референтної норми при концентраціях ПГ 1,0-10,0 мг/л. Найбільша кількість апоптуючих моноцитів виникала під дією ПГ в концентрації 200,0 мг/л (збільшення проти референтної норми - 4,7-6,9 разів залежно від видової приналежності ПГ). Найбільшою індукуючою апоптоз дією на моноцити володіли ПГ S. aureus, найменшою - ПГ S. saprophyticus.

Обробка моноцитів левамізолом з наступною дією на них ПГ супроводжувалась стимуляцією апоптозу. Вже при концентраціях ПГ 0,01 мг/л рівень апоптуючих моноцитів був в 1,8-2,4 рази вищим аналогічного показника референтної норми, сягаючи найбільших значень при 200 мг/л. Найбільший апоптогенний ефект у стимульованих левамізолом моноцитів реєструвався при використанні ПГ S. aureus, найменший - ПГ S. saprophyticus. Наприклад, при концентрації ПГ S. aureus 200,0 мг/л кількість CD₉₅₊-моноцитів була в 1,4 рази вищою порівняно з такою для ПГ S. saprophyticus.

Дерматонекротична активність ПГ стафілококів. Встановлено, що ПГ викликали запальні зміни шкіри мишей, причому ступінь виявлених змін залежав від діючої концентрації ПГ, його видової приналежності і від умов проведення експерименту. В/ш введення за стерильних умов ізотонічного розчину NaCl не викликало будь-яких запальних реакцій у місці ін'єкції. Навпаки, в/ш введення розчинів ПГ супроводжувалось запальною реакцією, виразність якої та тривалість загоєння шкірних осередків поразки визначалась концентрацією та видовою приналежністю ПГ. Найменші запальні зміни реєструвались при використанні концентрацій ПГ 0,01 мг/л, найбільші (до розвитку гнійно-некротичних осередків поразок шкіри) - при концентраціях 200,0 мг/л.

Так, при використанні ПГ S. aureus в концентрації 0,01 мг/л індекс поразки склав 11,5+0,6 при середньому терміні загоєння 6,5+0,4 дні. При цьому у 86 % мишей спостерігались гнійно-некротичні зміни на шкірі малої та середньої інтенсивності, а у решти запальна реакція була відсутньою. Збільшення дози ПГ до 0,1 мг/л сприяло підвищенню індексу поразки в 2,6 раз, а терміну загоєння - в 1,2 раз порівняно з аналогічними показниками при концентрації ПГ S. aureus 0,01 мг/л. При дозі ПГ 1,0 мг/л кратність збільшення цих показників склала 3,6 та 1,4 раз, при 10,0 мг/л - 4,5 та 1,6 раз, при 100,0 і 200,0 мг/л - 9,3, 2,0 та 16,5, 2,3 раз відповідно. Аналогічні, але менш виражені зміни шкіри мишей реєструвались при використанні ПГ S. epidermidis та S. saprophyticus.

Результати дослідження дерматонекротичної активності стафілококових ПГ при в/ш введенні мишам, які попередньо отримували преднізолон, показали, що преднізолон суттєво пригнічував дерматонекротичну активність ПГ. Проявом цього було зниження індексу поразки, скорочення термінів загоєння шкірних поразок і частоти розвитку гнійно-некротичних процесів у місцях введення ПГ. Відзначені зміни мали місце при різних концентраціях ПГ та їх видовій приналежності. Так, індекс поразки при використанні ПГ S. aureus в дозі 0,01 мг/л склав 6,7+0,4, що було в 1,7 раз нижчим аналогічного показника у інтактних мишей. При в/ш введенні вказаного ПГ в концентрації 200,0 мг/л індекс поразки у стимульованих преднізолоном мишей був в 2,2 раз нижчим порівняно з таким для інтактних тварин (р<0,01). Відповідно до цього скорочувались і терміни загоєння шкірних поразок - у 1,8 (концентрація ПГ 0,01 мг/л) та 1,6 раз (концентрація ПГ 200,0 мг/л). Аналогічна тенденція до зниження проявів дерматонекротичної активності під впливом преднізолону мала також місце при використанні ПГ S. epidermidis та S. saprophyticus. При цьому найменша дерматонекротична активність під дією преднізолону реєструвалась для ПГ S. saprophyticus, що, очевидно, пов'язано з його індивідуальними біологічними властивостями.

При вивченні дерматонекротичної активності ПГ стафілококів при в/ш введенні мишам, які отримували левамізол, встановлено, що попередня імуностимуляція левамізолом супроводжувалась посиленням дерматонекротичного ефекту ПГ. Це проявлялось у збільшенні частоти розвитку гнійно-некротичних змін у місцях введення ПГ, у збільшенні термінів загоєння шкірних поразок. При цьому відмічалась залежність дерматонекротичної активності ПГ від їх дози та видової приналежності. Так, наприклад, у стимульованих левамізолом мишей індекс поразки при використанні ПГ S. aureus був в 1,2 раз вищим аналогічного показника для інтактних тварин, а при концентрації ПГ 200,0 мг/л - в 1,4 раз (р<0,05). Поряд з цим, відмічалось збільшення терміну загоєння шкірних поразок, а також частоти розвитку гнійно-некротичних змін у місцях ін'єкцій ПГ. Подібна активація дерматонекротичної здатності ПГ стафілококів на фоні стимуляції левамізолом мала також місце відносно S. epidermidis та S. saprophyticus.

Підводячи підсумок, можна констатувати, що одержані нами результати свідчать про важливе значення ПГ - компонентів клітинних стінок стафілококів - в виникненні запальних процесів, завдяки, їх спроможності змінювати метаболізм моноцитів, впливати на їх секреторну функцію, поглинальну здатність і апоптоз.

Висновки

Пептидоглікани стафілококів при контакті in vitro з моноцитами периферичної крові людини спроможні активувати їх секреторну функцію, що виражається в збільшеній продукції моноцитами інтерлейкіну-1в, інтерлейкіну-6, фактора некрозу пухлин і простагландіну Е₂. Найбільшою спроможністю індукувати секрецію монокінів володіли пептидоглікани S. aureus, найменшою - S. saprophyticus. За умов дії преднізолону, секреторна активність моноцитів знижувалася, тоді як стимуляція моноцитів левамізолом приводила до вираженого посилення продукції інтерлейкінів, фактора некрозу пухлин-б і простагландіну Е₂. В обох випадках відзначалася залежність продукції монокінів від чинної дози пептидогліканів та їх видової приналежності

Пептидоглікани стафілококів спроможні викликати in vitro у моноцитах периферичної крові людини метаболічні зміни, які виражаються в активації процесів перекисного окислення ліпідів, стимуляції і наступному виснаженні ферментативної системи антиоксидантного захисту, впливі на внутрішньоклітинний вміст цАМФ т цГМФ. Зазначені зміни залежали як від чинної дози пептидоглікану, так і від його видової приналежності. Найбільші метаболічні порушення в моноцитах реєструвалися при дії високих концентрацій пептидогліканів, особливо похідних S. aureus.

Попередній вплив на моноцити крові людини преднізолоном, з наступною обробкою пептидогліканом, знижує активність перекисного окислення ліпідів, активність системи антиоксидантного захисту, підвищує внутрішньоклітинний вміст цАМФ при зниженні цГМФ. Попередня дія на моноцити левамізолом з наступною обробкою пептидогліканами стафілококів не впливала на активність перекисного окислення ліпідів і ферментативної системи антиоксидантного захисту, але приводила до збільшення внутрішньоклітинного вмісту цГМФ і зниження цАМФ.

Пептидоглікани стафілококів здатні in vitro пригнічувати фагоцитарну активність моноцитів периферичної крові людини та стимулювати їх апоптоз. Найбільшою імуносупресивною та проапоптогенною дією володіють високі концентрації пептидогліканів, особливо S. aureus. Попередня обробка моноцитів крові людини преднізолоном при наступному контакті клітин з пептидогліканами посилює їх імуносупресивну та знижує апоптогенну дію. Напроти, попередня стимуляція моноцитів левамізолом з наступним їх контактом з пептидогліканами стафілококів супроводжується активацією як фагоцитозу, так і посиленням запрограмованої загибелі клітин.

Стафілококові пептидоглікани проявляють дерматонекротичну активність in vivo, яка зростає по мірі збільшення концентрації пептидоглікану. Попереднє введення експериментальним тваринам преднізолону сприяє пригніченню дерматонекротичної активності пептидогліканів, тоді як попередня стимуляція левамізолом її посилює.

Список наукових праць, опублікованих за темою дисертації

Вітріщак С.В. Інфекційно-запальний процес як наслідок дії бактерій // Український медичний альманах. - 2001. - № 1. - С. 35-40.

Вітріщак С.В. Вивчення дерматонекротичних властивостей стафілококів в експерименті // Український медичний альманах. - 2000. - № 1. - С. 194-196.

Вітріщак С.В. Видовий спектр та дерматонекротичні властивості стафілококів - збудників внутрішньошпитальних гнійно-запальних захворювань // Буковинський медичний вісник. - 2000. - № 2. - С. 42-47.

Вітріщак С.В. Вплив стафілококового токсину на Т- та В-лімфоцити і на показники фагоцитозу // Науковий вісник Ужгородського державного університету. Серія “Медицина”. - 2000. - Випуск 12. - С. 70-72.

Гаврик С.Ю., Волобуєва Л.М., Вітріщак С.В. Вплив стафілококового токсину на лімфоцити здорових донорів in vitro // Український медичний альманах. - 2001. - № 2. - С. 129-131.

Гайдаш І.С., Флегонтова В.В., Вітріщак С.В., Суглобов Є.В., Шевченко М.Ю., Клиса Т.Л. Видовий склад збудників внутрішньогоспітальних інфекцій у відділеннях хірургічного профілю та їх вплив на апоптоз лімфоцитів // Шпитальна хірургія. - 2001. - № 3. - С. 107-110.

Гайдаш І.С., Флегонтова В.В., Вітріщак С.В., Флегонтова А.В. Склад умовно-патогенних бактерій - збудників гнійно-запальних захворювань жіночих статевих органів та їхній вплив на апоптоз моноцитів та нейтрофілів // Вісник асоціації акушерів-гінекологів України. - 2000. - № 4. - С. 33-37.

Гайдаш І.С., Флегонтова В.В., Казимірко Н.К., Романюк Б.П., Шевченко М.Ю., Суглобов Є.В., Рубан О.В., Вітріщак С.В. Шпитальні інфекції на межі тисячоліть. - Луганськ: Елтон-2, 2000. - 65 с.

Гайдаш І.С., Флегонтова В.В., Казимірко Н.К., Флегонтова А.В., Вітріщак С.В. Вплив збудників гнійно-запальних захворювань гінекологічного профілю на гуморальні чинники імунітету in vitro та стан деяких імунних показників // Вісник асоціації акушерів-гінекологів України. - 2001. - № 1. - С. 37-42.

Казимірко Н.К., Вітріщак С.В., Рубан О.В., Рогов В.В. Апоптозіндукуюча активність ліпополісахариду Neisseria meningitidis // Український медичний альманах. - 2000. - № 5. - С. 82-83.

Анотація

Вітріщак С.В. Вплив пептидогліканів на функціональну активність моноцитів в експерименті. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.04 - патологічна фізіологія. - Одеський державний медичний університет МОЗ України. - Одеса, 2001.

Дисертацію присвячено питанням вивчення механізмів дії пептидогліканів стафілококів на секреторну і фагоцитарну активність моноцитів та їх дерматонекротичну активність в експерименті за умов імуносупресії та імуностимуляції. Встановлений дозозалежний вплив пептидогліканів на продукцію моноцитами прозапальних цитокінів. Показаний різноспрямований і дозозалежний вплив пептидогліканів на вміст циклічних нуклеотидів у моноцитах. Встановлена дозозалежна прооксидантна дія пептидогліканів. Показаний стимулюючий вплив на фагоцитоз моноцитів малих доз пептидогліканів і інгібуючий вплив великих доз. Встановлено спроможність високих концентрацій пептидогліканів індукувати апоптоз моноцитів. Визначені патогенетичні підходи до лікування гнійно-запальних захворювань, викликаних стафілококами, на основі вивчення імунозапального потенціалу стафілококових пептидогліканів. Отримані дані впроваджені в навчальний процес 3-х медичних вузів України.

Ключові слова: моноцити, секреторна активність, фагоцитоз, пептидоглікани.

Аннотация

Витрищак С.В. Влияние пептидогликанов на функциональную активность моноцитов в эксперименте. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.04 - патологическая физиология. - Одесский государственный медицинский университет МЗ Украины. - Одесса, 2001.

Ключевые слова: моноциты, секреторная активность, фагоцитоз, пептидогликаны.

Summary

Vitrishak S. V. Peptidoglycan influence on functional activity of monocytes in experiment. - Manuscript.

The dissertation on obtaining of scientific degree of the candidate of medical sciences on speciality 14.03.04 - pathological physiology. - Odessa State Medical University. - Odessa, 2001.

The thesis is dedicated to analysis of staphylococcal peptidoglycan influence on secretory and cytophagous activity of monocytes and their dermatonecrotic activity in experiment in conditions of immune suppression and immune stimulation. The phagocytosis is one of main processes of protection of organism from invasion of stranger matters. The development of zymotic process in many respects depends on a condition of a cytophagous system, capacity of phagocytes to seize and to digest bacteria. At staphylococcal infection the humoral immunity develops is gentle and does not provide effective protection. The formations of humoral immunity to staphylococci are determined by antigenic properties of components of cell wall of bacteria on the one hand and level of immune reactivity of the host - with another. The efficiency of immunological protection thus depends both on quantity of antimicrobial antibodies, and from their quality characteristics, among which important are fitting to definite isotype and specificity in relation of protective antigens. In phagocytosis, except for fixed phagocytes, 2 groups of cells participate, that can move: polymorphonuclear leukocytes and mononuclear (monocytes, macrophages), which free an organism from stranger matters, occluding and digesting them. Besides the macrophages are indispensable for induction of the immune answer as in initial phase (concentration, processing and presentation of antigen to Т- and B-lymphocytes), and at following phases (intercellular co-operation, proliferation and derivation of lymph cells of organs) and, therefore, efficiency of the immune answer in many respects depends on functional activity of macrophages. The cytophagous activity of macrophages at staphylococcal infection is in most cases weak that is conditioned by toxic or antiphagocytic activity of extracellular and somatic antigenic staphylococcal substances concerning phagocyte and supplementary cells. It is established the dose-dependent influence of peptidoglycans on production by monocytes ІL-1в, -6, TNF-б and PGЕ2: with increase of the operational concentration of peptidoglycans the secretory activity of monocytes increases predominantly at the expense of ІL-1в. It is rotined different-directed and dose-dependent influence of peptidoglycans on the content of cyclical nucleotides in monocytes. The low peptidoglycans concentrations cause endocellular dominance cGMP above cAMP, high - dominance of cAMP above cGMP. It is established dose-dependent prooxydative action of peptidoglycans, which is encompassed by activation of lipid peroxydation in monocytes on a background of insufficiency of enzymatic system of antioxydant protection. The challenging influencing on phagocytosis of monocytes of peptidoglycans small doses and inhibiting influencing of large doses is rotined. The capacity of peptidoglycans high concentrations is established to induce monocytes apoptosis. The pathogenetic approaches to treatment of purulent-inflammatory diseases caused by staphylococci are determined on the basis of analysis immune-inflammatory potential of staphylococcal peptidoglycans. The obtained data are used in educational process of 3 medical high schools of Ukraine.

Keywords: monocytes, secretory activity, phagocytosis, peptidoglycans.

Размещено на Allbest.ru