Протисудомні властивості ксеногенної цереброспинальної рідини на різних моделях епілептогенезу

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

Тернопільська державна

медична академія ім. І. Я. Горбачевського

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Протисудомні властивості ксеногенної цереброспинальної рідини на різних моделях епілептогенезу

14. 03. 04 - патологічна фізіологія

Ткач Владислав Владиславович

Тернопіль - 2001

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

цереброспинальна рідина епілептогенез

Актуальність теми. Проблема епілепсії протягом останніх десятиліть привертає все більшу увагу вчених різних спеціальностей. Це пов'язано з рядом факторів і, насамперед, з широким розповсюдженням захворювання і потенційно важкими його наслідками. За даними світової статистики, захворюваність на епілепсію в ряді країн досягає 0, 8 - 1, 2% популяції.

Таким чином, стає зрозумілим, чому це захворювання є не тільки медичною, а й важливою соціальною та державною проблемою. Тому вивчення епілепсії, її етіології, клініки та лікування набуває великого практичного значення (Сараджишвілі П. М., Геладзе Т. Ш., 1977; Карлов В. А., 1990).

Протисудомна терапія є основним компонентом комплексного лікування епілепсії та спрямована безпосередньо на зниження пароксизмальної активності мозку.

Як відомо, медикаментозне лікування приступів проводиться безперервно протягом кількох років, а інколи і всього життя хворого. Більшість синтетичних препаратів, які застосовуються для лікування епілепсії, мають побічну токсичну та алергічну дію. Ось чому низька токсичність антиепілептичних засобів має особливе значення (Вайнтруб М. Я., 1995). На сучасному етапі розвитку лікувально-профілактичної медицини пошук препаратів, особливо біологічного (тваринного) походження, з низькою токсичністю є актуальним і перспективним завданням. У зв'язку з цим виникає питання про можливість використання для цієї мети ксеногенної цереброспинальної рідини (ЦСР) великої рогатої худоби. Як біологічний субстрат тваринного походження, вона може служити основою для розробки якісно нових лікарських засобів.

Різноманітний вплив ЦСР визначається наявністю в ній біологічно активних речовин - гіпоталамічних рилізинг-факторів, гормонів гіпофіза і шишкоподібного тіла (епіфіза), гормонів периферичних ендокринних залоз, медіаторів нервового збудження, метаболітів мозку і вегетативної нервової системи, простагландинів, ендорфінів, лізоциму.

Найближчою до ліквору людини, як засвідчили дослідження, є ЦСР великої рогатої худоби. Це стало підставою для розвитку ксенолікворології з використанням ЦСР тварин для лікування людей. Теоретичні передумови з застосуванням цього методу були розроблені Фрідманом О. П. (1940, 1957, 1971).

У 1949 р. Пападато Л. Л. вперше успішно застосував ЦСР великої рогатої худоби для лікування епілептичних приступів у людей і одержав позитивні результати. Пошук препаратів, що впливають на ліквідацію епілептичних приступів, “пом'якшення” чи їхнє попередження, є актуальним, оскільки антиконвульсійна терапія епілепсії і досьогодні є недостатньо ефективною.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. У Кримському медичному університеті 1988 року була створена науково-дослідна гетеролікворологічна лабораторія (наказ № 389 від 10. 11. 88 р.) з розробки лікувально-профілактичних препаратів з СМР великої рогатої худоби у відповідності з наказом № 232 ДКНТ СРСР від 15 червня 1988 року. Робота проводилася спільно з Інститутом біофізики МОЗ СРСР (м. Москва) по розробці нового ін'єкційного біопрепарату за програмою Фармкомітету СРСР для лікування гострої променевої хвороби. Робота виконувалася з грифом “секретно”. З серпня 1993 р. по 1997 р. фінансування роботи проводив ДКНТ України.

Дисертація виконана у відповідності з планом науково-дослідних робіт Кримського державного медичного університету ім. С. І. Георгієвського і є фрагментом комплексного дослідження по темі “Розробка нового імунобіологічного препарату з спинномозкової рідини великої рогатої худоби (корів) ” (№ держреєстрації 01. 93U041176, шифр - 01. 02. 02/03397). Автором особисто виконано розділ стосовно встановлення протисудомних властивостей ксеногенної цереброспинальної рідини на різних моделях епілептогенезу, що викладено у матеріалах дисертації.

Мета дослідження. Експериментальне обгрунтування і вивчення протисудомних властивостей нового ін'єкційного біопрепарату, одержаного на основі прижиттєво взятої ксеногенної ЦСР великої рогатої худоби (корів) на різних моделях епілептогенезу у лабораторних тварин.

Задачі дослідження:

1. Встановити ефективність протисудомної дії ксеногенної цереброспинальної рідини (КЦСР) на моделях гострих генералізованих, хронічних і вогнищевих форм епілептогенезу.

2. З'ясувати особливості антиконвульсивної дії ксеногенної цереброспинальної рідини при використанні епілептогенів з різними механізмами дії.

3. Виявити ефективність протисудомної дії ксеногенної цереброспинальної рідини у залежності від кратності і шляхів її введення.

4. Встановити вираженість антиконвульсійної дії КЦСР на різних видах лабораторних тварин.

5. Розробити технологію одержання нового ін'єкційного біопрепарату (робоча назва “Лікворин” від слова “liquor cerebrospinalis”) з цереброспинальної рідини великої рогатої худоби (корів) - ЦСР ВРХК.

Об'єкт дослідження. Експериментальна епілепсія (гостра, хронічна, і вогнищева форми епілептогенезу).

Предмет дослідження. Протисудомні властивості цереброспинальної рідини лактуючих корів як сировини для отримання нових антиепілептичних препаратів.

Методи дослідження. Патофізіологічні - 5-бальна оцінка тяжкості судом, електроенцефалографія; фармакологічні - створення гострої, хронічної і вогнищевої форм експериментальної епілепсії за допомогою конвульсантів з різними механізмами епілептогенного ефекту; прижиттєвий забір ЦСР з наступною її обробкою (кріоконсервація, гама-стерилізація, центрифугування і фільтрація).

Наукова новизна одержаних результатів. На експериментальному матеріалі нами вперше виявлені протисудомні властивості нового ін'єкційного біопрепарату з ЦСР ВРХК за різних шляхів його введення (інтрацеребральний, внутрішньоочеревинний, аплікаційний) лабораторним тваринам (щурі, миші, кішки) на різних моделях епілептогенезу (гострі генералізовані, хронічні, вогнищеві). Під впливом ліквору спостерігалося пригнічення як клінічних, так і електроенцефалографічних проявів епілептичних судом у тварин.

У результаті проведеного комплексного дослідження на сучасному рівні нами вперше експериментально доведено, що протисудомний ефект препарату не залежить від шляхів його введення. Вперше встановлено особливості динаміки протисудомної дії КЦСР протягом двох діб і доведено, що протисудомні прояви біопрепарату реєструються через 2 год з моменту його введення і максимально виражений ефект спостерігається впродовж 24 год, а ефективність його дії зростає пропорційно кількості введень (3; 5 ін'єкцій). Це вказує на те, що біопрепарат здатний забезпечувати стабільний ефект при повторних введеннях через сприйнятливі проміжки часу, тобто задовольняє вимоги антиепілептичних препаратів.

Використовувані нами конвульсанти (коразол, пікротоксин, бікукуллін, стрихнін, тіосемикарбазид) за різних шляхів їхнього введення і з відмінними один від одного механізмами епілептогенезу дозволили вперше одержати дані про переважну реалізацію ефекту КЦСР за рахунок ГАМКергічних систем головного мозку.

У роботі експериментально обгрунтовано доцільність застосування ксеногенної цереброспинальної рідини у комплексному лікуванні епілепсії.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані дані про протисудомні властивості КЦСЖ у лабораторних тварин на різних формах епілептогенезу можуть бути використані як рекомендації для розробки лікарських засобів на основі ЦСР з метою їх занесення до арсеналу комплексних сучасних антиепілептичних препаратів. У нашій роботі одержала подальший розвиток методика послідовної технологічної обробки прижиттєво взятої ЦСР корів. Матеріали дисертації впроваджені у педагогічний процес на кафедрах патофізіології, нервових хвороб і психіатрії Кримського держмедуніверситету, анатомії і фізіології тварин Кримського державного аграрного університету, патофізіології, топографічної анатомії та оперативної хірургії, нервових хвороб, анатомії людини Буковинської державної медичної академії, сімейної медицини Запорізького інституту удосконалення лікарів, анатомії людини Івано-Франківської державної медичної академії, анатомії людини, патофізіології, нервових хвороб із нейрохірургією та курсом дитячої неврології Луганського держмедуніверситету, патофізіології Запорізького держмедуніверситету, патофізіології Харьківського держмедуніверситету, загальної і кліничної патофізіології Одеського держмедуніверситету, патофізіології НМУ ім. О. О. Богомольця”, патофізіології Донецького держмедуніверситету.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок автора полягає в аналізі актуальності і ступеня вивчення проблеми роботи. Автором визначені методологічні підходи, оброблені моделі, згідно з якими особисто проведено експериментальні дослідження, виконано аналіз, систематизацію і статистичну обробку результатів дослідження. Розроблено основні положення дисертації. Обгрунтовано наукові висновки і практичні рекомендації.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації опрелюднені на засіданнях центральної науково-дослідної лабораторії Кримського державного медичного університету (1997), на засіданні Кримського республіканського товариства невропатологів (1998), на спільних засіданнях кафедр патологічної фізіології та нервових хвороб Кримського державного медичного університету (1999), на ІІІ Національному конгресі патофізіологів України (Одеса, 2000).

Матеріали з вивчення різних властивостей КЦСР оприлюднені на конференції “Актуальні питання теоретичної і клінічної медицини” (Полтава, 1991), на Міжнародному симпозіумі “Фізіологія і патологія гемостазу” (Сімферополь - Полтава, 1994), на III-й науковій конференції морфологів “Морфофункціональний статус ссавців та птахів” (Сімферополь, 1995), на Республіканській науковій конференції анатомів, гістологів, ембріологів і топографоанатомів (Івано-Франківськ, 2000).

Публікації. Матеріали дисертації опубліковані у 6 наукових працях, із них 4 - у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України.

Структура дисертації. Дисертація викладена на 147 сторінках і складається з вступу, розділів огляду літератури, матеріалу та методів дослідження, власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень; висновків, практичних рекомендацій і списку використаних джерел (всього - 231 бібліографічних описів). Робота ілюстрована 9 таблицями та 13 рисунками.

ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал та методи дослідження. Досліди виконані нами на 193 щурах-самцях лінії Вістар масою 180-250 г, 220 мишах лінії F1 (CBAxC57BL/6) масою 18-24 г та на 10 кішках масою 2, 5-3, 1 кг на моделях хронічних, гострих та вогнищевих форм епілептогенезу.

Гострі генералізовані судоми у щурів і мишей викликали шляхом внутрішньоочеревинного введення конвульсантів: коразолу (40-50 мг/кг маси тіла), солянокислого бікукулліну (3, 5 мг/кг), пікротоксину (4, 0 мг/кг), азотнокислого стрихніну (1, 5 мг/кг), тіосемикарбазиду (15 мг/кг).

Введення ліквору здійснювали мишам внутрішньоочеревинно в об'ємі 0, 2 мл. Тваринам контрольної групи вводили відповідні об'єми 0, 9% розчину хлористого натрію.

Вплив КЦСР на судомну активність у щурів вивчався на моделях гострої та хронічної епілептизації.

Щурам робили інтрацеребральні ін'єкції біопрепарату під гексеналовим наркозом (100 мг/кг маси тіла). При цьому введення 10 мкл КЦСР проводилося за допомогою мікроін'єктора (протягом 1, 5-2 хв) у порожнину шлуночків мозку за координатами атласу АР=0, Л=1, 0 і Н=3, 5 (Paxinos, 1982). Кожна піддослідна група (миші та щурі) включала не менш як 10 тварин.

Після введення конвульсанта тварин роздільно поміщали у прямокутну скляну камеру (40х60х90 см), де за ними спостерігали протягом 60 хв, визначаючи тривалість латентного періоду перших судомних реакцій, латентний період і кількість тварин з генералізованими клоніко-тонічними судомними приступами, а також кількість загиблих тварин. Інтенсивність судом оцінювали у балах за шкалою (Крижановський Г. Н. і співавт., 1982, 1985).

Хронічна епілептична активність у щурів викликалася з допомогою повторних внутрішньоочеревинних введень пікротоксину (1, 25 мг/кг маси тіла) в об'ємі 0, 5 мл 0, 9% фізіологічного розчину щоденно, впродовж трьох тижнів, в одних і тих же умовах, формували стан підвищеної судомної готовності - фармакологічний кіндлінг з появою і поступовим наростанням, при кожному наступному введенні пікротоксину, вираженості судомних реакцій у тварин у відповідь на застосування спочатку неефективної субконвульсивної дози конвульсанта (Крижановський Г. Н. і співавт., 1988; 1989). Інтенсивність судом оцінювали в балах. Для дослідження електричної активності мозку щурам з кіндлінгом вводили реєструючі ніхромові електроди у сенсомоторну кору, гіпокамп і хвостате ядро, а також вентролатеральні ядра таламуса. Через 5-7 днів після операції тварин використовували в експерименті.

В умовах вільної поведінки тварин, після попереднього інтрацеребрального застосування препарату, через 24 год здійснювали внутрішньоочеревинне введення тестуючої дози пікротоксину (1, 25 мг/кг) і оцінювали вираженість судомних проявів за вищевказаною шкалою.

У всіх тварин проводили реєстрацію біопотенціалів мозку на чорнилопишучому електроенцефалографі Ч-ЕЕГ-8.

Досліди проводилися на 10 кішках масою 2, 5 - 3, 1 кг. Тваринам під ефірним наркозом проводили трахеотомію і трепанацію черепа, хрестоподібно розкривали тверду мозкову оболонку, що забезпечує доступ до відділів кори великого мозку, через 2, 5 год після припинення подачі ефіру тваринам вводили міорелаксант (тубокурарин 0, 12-0, 28 мг/кг маси) і переводили їх на штучне дихання. Створювали поодинокі вогнища ЕпА за допомогою аплікації фільтрувального паперу (2х2 мм), змоченого у 0, 1% розчині азотнокислого стрихніну, на різних ділянках сигмовидних звивин. Електричну активність мозку реєстрували монополярно, для чого індиферентний електрод закріплювали у носових кістках, активним електродом служили бавовняні нитки, змочені у 0, 9% NaCL. Біоелектрична активність записувалася на апараті Ч-ЕЕГ. Після появи перших спайкових розрядів аплікацію конвульсанта припиняли.

На стадії стійкої епілептичної активності у вогнищі наносили на вогнище дозу підігрітого (+37 оС) ліквору за допомогою фільтрувального паперу (2х2 мм).

Результати експериментів обробляли статистично, з використанням критерію Стьюдента (Вальвачев Н. И., 1989).

Результати досліджень та їх обговорення. Прижиттєве одержання початкової лікарської сировини здійснювалось на донорських пунктах держплемзаводу “Широке” Сімферопольського району і в НВО “Еліта” Красногвардійського району Автономної Республіки Крим, де ветеринарно-санітарний нагляд і зоотехнічні умови утримання тварин були на належному рівні.

Стерильні флакони з ЦСР розміщували в спеціальні контейнери і відправляли на Кримську республіканську станцію переливання крові (КРСПК), де їх заморожували. Ліквор піддавався екологічній експертизі і далі відправлявся на Білгород-Дністровський завод медвиробів для гама-стерилізації. ЦСР в контейнерах знову доставлялася на КРСПК, розморожувалась, піддавалася центрифугуванню, фільтруванню через фільтри “Міліпор” і розливу в ампули. Здійснювали біологічний контроль препарату на пірогенність, токсичність, алергенність і стерильність. Біопрепарат зберігався при температурі +20 оС, у захищеному від світла місці. Термін придатності - 3 роки.

Таким чином, нами був одержаний біопрепарат, що представляє собою фільтрат з прижиттєво взятої, кріоконсервованої, гама-стерилізованої цереброспинальної рідини великої рогатої худоби (корів).

Завданням першої серії експериментів стало дослідження впливу інтрацеребрального застосування КЦСР (у порожнину шлуночків мозку) на судоми, що викликаються у щурів внутрішньоочеревинним введенням коразолу, а також встановлення характеру судомних проявів у різні строки від моменту введення препарату (30 хв, 2 г, 6 г, 10 г, 24 г, 48 г).

Вираженість протисудомної дії ксеногенної цереброспинальної рідини залежала від часу з моменту її інтрацеребральної ін'єкції: зниження тяжкості судомних проявів реєструвалося через 2 г з поступовим наростанням ефективності і було максимально виражене через 24 г.

Введення коразолу тваринам через 24 г після введення ліквору викликало виникнення судомних здригань у середньому через 210, 6 ±18, 6 с, що було достовірно більше порівняно з відповідними спостереженнями у контролі (Р<0, 01). При цьому в усіх тварин реєструвалися судомні здригання або одиничні клонуси м'язів тулуба. Показник відношення числа тварин з генералізованими судомними приступами до загального числа тварин у групі був достовірно меншим, ніж у контрольних спостереженнях (Р<0, 025). Середня тяжкість судомних реакцій складала 1, 5±0, 3 бала, що також було достовірно менше, ніж у контрольних спостереженнях (Р<0, 01).

Через 48 г після застосування КЦСР середня тяжкість судомних реакцій була аналогічною у тварин контрольної групи (Р>0, 05). У подальших серіях дослідів на щурах протисудомна дія ліквору вивчалася через 24 г після його введення.

Завданням наступної серії експериментів стало дослідження впливу інтрацеребрального введення КЦСР на судоми різної природи, що провокуються у щурів внутрішньоочеревинним введенням різних епилептогенів: пікротоксину, бікукулліну, стрихніну. Такий підбір був зроблений не випадково. Важливо було спробувати встановити загальні закономірності залежності судомних реакцій у тварин від дії не однієї, а групи хімічних речовин і визначити можливі механізми реалізації протисудомної дії ліквору.

Застосування пікротоксину у щурів, яким вводили біопрепарат з ЦСР ВРХК, супроводжувалося виникненням перших судом у середньому через 16, 5±1, 0 хв, що було достовірно більше порівняно з аналогічним показником у тварин контрольної групи (Р<0, 05).

Середня тяжкість судом складала 2, 6±0, 3 бала і суттєво відрізнялася від такої ж у контрольних спостереженнях (Р<0, 05).

Вплив пікротоксину на ЦНС обумовлено блокадою постсинаптичних ГАМКергічних рецепторів і послабленням внаслідок цього гальмівної дії ГАМК на нейрони.

Застосування бікукулліну у щурів, яким у шлуночки мозку вводили ксеногенну цереброспинальну рідину, супроводжувалось розвитком судомних реакцій у середньому через 6, 1±0, 3 хв, що було достовірно більше, ніж в контрольних спостереженнях (Р<0, 05). При цьому у тварин відмічались окремі судомні здригання і клонічні судоми м'язів передніх кінцівок. Середня тяжкість судом складала 1, 7±0, 2 бала і також була достовірно меншою порівняно з контрольними спостереженнями (Р<0, 01).

Необхідність проведення подальших дослідів обумовлена вивченням дії КЦСР на судоми, що викликаються конвульсантами з іншою точкою прикладання. До таких конвульсантів належить стрихнін.

У наукових дослідженнях одержав пояснення факт блокування стрихніном постсинаптичної дії гліцину і відсутність його впливу на дію ГАМК. (Поздєєв В. К., 1983). Введення стрихніну щурам, яким робили ін'єкцію ксеногенної цереброспинальної рідини у шлуночки мозку, суттєво не змінювало показники тяжкості судом, які не відрізнялися від таких же у тварин контрольної групи. Наведені нами дані свідчать про те, що введення КЦСР безпосередньо в лікворну систему мозку щурів, минаючи ГЕБ, чинить протиепілептичну дію, яка реалізується за рахунок переважного впливу на ГАМКергічні нейрони ЦНС.

Завданням наступної серії експериментів стало вивчення впливу КЦСР при інтрацеребральному введенні на генералізовану судомну активність у щурів в умовах пікротоксинового кіндлінгу.

Розвиток судомного синдрому при кіндлінгу пов'язаний з формуванням епілептичної системи, патологічною детермінантою якої є гіперактивний гіпокамп. (Крижановський Г. Н., 1985).

В умовах введення КЦСР кіндлінговим щурам у дослідній групі застосування пікротоксину супроводжувалося розвитком перших судом у середньому через 17, 8±0, 8 хв, що було достовірно більше порівняно з контрольними спостереженнями (Р<0, 001). У щурів спостерігалися лише одиничні здригання або окремі клонічні судоми м'язів тулуба.

Середня тяжкість судомних проявів у групі становить 1, 5±0, 3 бала, що також було достовірно менше порівняно з такою ж (4, 0 бала) у тварин контрольної групи (Р<0, 001).

Паралельне зняття ЕЕГ з різних відділів головного мозку (сенсомоторна кора, хвостате ядро, вентро-латеральні таламічні ядра, гіпокамп) у тварин дослідної та контрольної груп проводилося для визначення відповідності епілептичної активності за даними ЕЕГ і клінічної картини генералізованих судом з переважним впливом внутрішньошлуночкового введення КЦСР на епілептичну активність головного мозку щурів.

У кіндлінгових тварин, яким вводили ксеногенну цереброспинальну рідину, відмічалась поява на ЕЕГ спалахів повільних хвиль і спайк-хвильових комплексів частотою від 5 до 8-12 в с і тривалістю до 4 - 5 с. Амплітуда потенціалів становила 1, 5 - 2, 0 мВ, і лише окремі спайкові розряди мали амплітуду потенціалів до 2, 2 мВ, під час яких у тварин клінічно реєструвалися лише судомні здригання і клонічні судоми окремих груп м'язів. Нормалізація електроенцефалограми була критерієм ефективності і доцільності ксенолікворотерапії. Таким чином, під впливом ліквору спостерігалось зниження як клінічних, так і електроенцефалографічних проявів судомних реакцій. Ці дані вказують на властивість ліквору пригнічувати судоми, викликані пікротоксином, що використовується, звичайно, як основна модель при фармакологічному скринінгу протисудомних препаратів.

На наступному етапі досліджень нами зроблена спроба довести видонеспецифічність препарату, для чого використовувався інший вид тварин (миші). Крім того, застосовувалася модель епілептогенезу, що відрізняється від кіндлінгового (гострі судоми), а також змінювався шлях введення КЦСР (внутрішньоочеревинний).

Завданням наступної серії експериментів стало вивчення впливу внутрішньоочеревинного введення ліквору в об'ємі 0, 2 мл на генералізовані судомні прояви, що індукуються у тварин внутрішньоочеревинною ін'єкцією коразолу в дозі 60 мг/кг. Окремим завданням було дослідження характеру судомних реакцій у мишей у різні строки після застосування біопрепарату з ЦСР корів (через 30 хв, 2 г, 6 г, 10 г, 24 г, 48 г).

Проведені дослідження показали, що одноразове внутрішньоочеревинне застосування біопрепарату у мишей викликає зниження вираженості генералізованих судомних реакцій, які провокуються внутрішньоочеревинним застосуванням коразолу. Даний ефект ксеногенної цереброспинальної рідини розвивався через 2-6 г з моменту застосування біопрепарату і був найвираженішим через 24 г.

Через 24 г після внутрішньоочеревинного введення біопрепарату латентний період перших судом склав 204, 2±11, 4 с, що було достовірно більше порівняно з тривалістю латентного періоду у тварин контрольної групи (Р<0, 001). У мишей спостерігались лише судомні здригання, поодинокі клонічні судоми м'язів всього тіла. Середня тяжкість судомних проявів склала 2, 0±0, 5 бала і також була достовірно меншою, ніж в групі контрольних тварин (Р<0, 05). Тестування судомної чутливості у тварин через 48 г після введення ліквору показало відсутність відмінностей порівняно з контрольною групою тварин.

Результати даної серії досліджень засвідчили, що ксеногенна цереброспинальна рідина володіє видонеспецифічною дією, ефективність якої не залежить від шляхів введення.

Завданням наступної серії експериментів стало дослідження характеру судомних реакцій, що провокуються коразолом у дозі 60 мг/кг у мишей, яким внутрішньоочеревинно робили багаторазові введення біопрепарату з ЦСР корів. Тестування судомних реакцій здійснювали через 24 г після 3-го і 5-го введення біопрепарату.

В умовах застосування коразолу після третьої ін'єкції КЦСР перші судомні реакції виникали через 171, 6±11, 0 с, що було достовірно більше, ніж у тварин контрольної групи (Р<0, 01). У тварин реєструвалися судомні здригання, а також поодинокі клонічні судоми м'язів тулуба. Середня тяжкість судом складала 1, 9±0, 2 бала і також була достовірно меншою, ніж у контролі (Р<0, 001).

В умовах застосування коразолу після п'ятої ін'єкції ліквору латентний період перших судом склав 182, 0±15, 0 с, що було достовірно більше порівняно з таким же показником у тварин контрольної групи (Р<0, 001). У тварин реєструвалися судомні реакції у вигляді здригань і поодиноких клонічних скорочень м'язів тулуба, у 2 з 10 мишей судоми повністю були відсутні. Середня тяжкість судомних реакцій складала 1, 0±0, 2 бала, що було достовірно менше порівняно з аналогічним показником у тварин контрольної групи (Р<0, 001).

Таким чином, проведені дослідження засвідчили, що повторні введення ліквору викликають протисудомну дію, що виявляється у збільшенні латентного періоду перших судомних проявів, запобіганні генералізованих судомних нападів, зниженні тяжкості клонічних судомних реакцій.

Завданням наступної серії експериментів було вивчення впливу ксеногенної цереброспинальної рідини на вираженість гострих судомних реакцій у мишей, які провокуються внутрішньоочеревинним введенням конвульсантів з різними механізмами судомної дії: пікротоксину, бікукулліну, тіосемикарбазиду і стрихніну. Застосування бікукулліну в умовах попереднього введення КЦСР (дослідна група мишей) супроводжувалось виникненням перших судомних реакцій у середньому через 6, 8±1, 0 хв, що було достовірно більше, ніж у тварин контрольної групи (Р<0, 05). Середня тяжкість судомних реакцій склала 2, 0±0, 2 бала і також була достовірно меншою порівняно з тяжкістю реакцій у тварин контрольної групи (Р<0, 01).

В умовах введення пікротоксину латентний період перших судомних проявів у мишей дослідної групи склав 15, 7±0, 5 хв і достовірно перевищував відповідний показник у тварин контрольної групи (Р<0, 01), а середня тяжкість судом складала 3, 2±0, 2 бала (Р<0, 01).

Таким чином, проведені дослідження засвідчили, що одноразове внутрішньоочеревинне застосування КЦСР у мишей викликає зниження вираженості генералізованих судомних реакцій, що провокується внутрішньоочеревинним застосуванням бікукулліну і пікротоксину. У тварин спостерігалось достовірне збільшення латентного періоду перших судом і в умовах застосування бікукулліну - запобігання розвитку генералізованих клоніко-тонічних приступів.

Необхідність проведення подальших дослідів обумовлена вивченням можливості впливу ліквору корів на судоми, що викликаються конвульсантами з іншими точками прикладання їхньої дії: стрихнін і тіосемикарбазид. Епілептогенний ефект тіосемикарбазиду виникає в результаті порушення синтезу ГАМК. В основі ефекту стрихніну є специфічна конкурентна взаємодія його з постсинаптичними гліциновими рецепторами, що приводить до гіперактивності нейрона і судомної активності (Крижановський Г. Н., 1997).

Застосування КЦСР на моделі гострих генералізованих епілептиформних судом, що провокуються тіосемикарбазидом і стрихніном, істотно не змінювало показників судомних реакцій у дослідній групі тварин порівняно з контрольною, що узгоджується з уявами про переважну участь ГАМКергічної системи мозку в реалізації ефектів ліквору.

В окремій серії експериментальних досліджень нами було вивчено вплив КЦСР на активність епілептичних вогнищ, що створюються у корі головного мозку кішок. При місцевому використанні на різних ділянках кори мозку експериментальних тварин конвульсанти можуть створювати тимчасове епілептичне вогнище. Віддалене за часом, але витриваліше епілептичне вогнище у корі можна одержати за допомогою аплікації 0, 1% розчину стрихніну. В умовах аплікації фільтрувального паперу, змоченого у лікворі при температурі +37 оС, здійсненої на стадії генерування у вогнищі стійких за амплітудою і частотою судомних потенціалів, відмічалося зменшення кількості генералізованих розрядів у 2-5 разів порівняно з початковим фоном; даний ефект реєструвався через 3-7 хв від початку аплікації КЦСР. Одночасно відбувалося зниження амплітуди епілептичних розрядів, котра в цей період складала від 0, 5 до 1, 5 мВ, і частоти їхнього генерування до 10-12 за 1 хв. Прогягом наступних 5-10 хв у вогнищі відзначалося повне пригнічення генерування судомних розрядів, які не відновлювалися самостійно впродовж наступних 30 хв безперервного спостереження. Таким чином, загальна тривалість існування епілептичних вогнищ в умовах аплікації на зону епілептичного вогнища КЦСР складала від 11 до 24 хв і була достовірно меншою порівняно з такою ж у тварин контрольної групи (Р<0, 05).

Результати даної серії експериментів засвідчили виражений інгібуючий ефект ксеногенної цереброспинальної рідини на активність епілептичних вогнищ, що характеризується зменшенням кількості генерованих розрядів у 2-5 разів порівняно з початковим фоном з подальшим зниженням їхньої амплітуди і повним пригніченням активності епілептичних розрядів, а також зменшенням часу існування вогнища.

ВИСНОВКИ

1. В дисертації наведено теоретичне узагальнення експериментальних результатів змін стану судомної активності у лабораторних тварин і показників епілептичної активності за даними електроенцефалограми реєструємої з різних відділів головного мозку під дією прижиттєво взятої ксеногенної цереброспинальної рідини корів (кріоконсервованої, гамма-стерилізованої, центрифугованої), що стало основою для вирішення наукового завдання, яке полягало у виявленні протисудомних властивостей ксеногенної цереброспинальної рідини і розробці технології одержання нового біопрепарату з ліквору корів для комплексного лікування епілепсії.

2. Ксеногенна цереброспинальна рідина володіє антиепілептичними властивостями на моделях гострих, хронічних і вогнищевих форм епілептогенезу. Виявлені нами антиконвульсивні властивості ксеногенної цереброспинальної рідини, мабуть, пов'язані з наявністю в лікворі здорових тварин біологічно активних речовин, які є учасниками регуляції різних систем організму та діють безпосередньо і опосередковано через нейрогуморальну систему організму.

3. Під дією ксеногенної цереброспинальної рідини відбувається пригнічення як клінічних, так і електроенцефалографічних показників епілептичної активності. Це виражалось у збільшенні тривалості перших судомних здригань, повній затримці або пом'якшенні розвитку генералізованих клоніко-тонічних судомних пароксизмів, зниженні тяжкості та інтенсивності приступів, запобіганні летальності лабораторних тварин. Даний ефект був підтверджений електроенцефалограмою, знятою з різних відділів головного мозку щурів і кішок, що є одним з критеріїв її антиепілептичних властивостей.

4. Протисудомний ефект ксеногенної цереброспинальної рідини стосовно судом, що провокуються введенням антагоністів гама-аминомасляної кислоти (бікукулліну, пікротоксину, коразолу), вказує, що її дія реалізується шляхом переважного впливу на ГАМКергічні структури головного мозку, оскільки судоми, викликані стрихніном (антагоністом гліцину), майже не змінювалися під дією ліквору.

5. Антиепілептичний ефект ксеногенної цереброспинальної рідини при інтрацеребральному введенні у щурів і внутрішньоочеревинному у мишей починався через 2-6 г і був максимально виражений через 24 г. Вираженість ефекту при курсовому введенні ліквору була більшою, ніж при одноразовому застосуванні і зростала зі збільшенням числа ін'єкцій. Це свідчить про здатність ксеногенної цереброспинальної рідини забезпечувати стабільний ефект при повторних прийомах через прийнятні проміжки часу, тобто задовольняти вимогам антиепілептичних препаратів.

6. Антиепілептичний ефект ксеногенної цереброспинальної рідини на моделі хронічної епілептизації мозку у щурів, при гострих генералізованих формах епілепсії у мишей і на вогнищеву епілептичну активність у головному мозку кішок свідчить про її видонеспецифічну дію.

7. Ефективність антиепілептичної дії ксеногенної цереброспинальної рідини не залежить від шляхів її введення і залишається достатньо високою як при інтрацеребральному введенні в лікворну систему мозку щурів, при внутрішньоочеревинному застосуванні у мишей, так і при аплікації на головний мозок кішок.

8. Нами розроблена технологія послідовної обробки і стандартизації прижиттєво взятої ксеногенної цереброспинальної рідини шляхом кріоконсервування, гама-стерилізації і фільтрації, що може бути основою для подальшої розробки і виробництва нових лікарських біопрепаратів.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Результати досліджень можуть бути використані лікарями клінічних спеціальностей - невропатологами, психіатрами, нейрохірургами для розробки нового способу антиконвульсивної терапії епілепсії.

2. Прижиттєво взяту ксеногенну цереброспинальну рідину великої рогатої худоби (лактуючих корів) можна рекомендувати як початкову лікарську сировинну базу для одержання як нових біологічно активних речовин, так і речовин з вже відомими антиконвульсивними властивостями (мелатонін, серотонін тощо).

3. Вдосконалена нами методика послідовної технологічної обробки і зберігання прижиттєво взятої ксеногенної цереброспинальної рідини великої рогатої худоби відрізняється простотою, не вимагає складного обладнання, що дорого коштує, може бути застосована на станціях переливання крові або біозаводі й використана при виготовленні нових лікарських біопрепаратів з ліквору різних видів ссавців.

4. Пропонується надалі продовжувати вивчати протисудомну дію ксеногенної цереброспинальної рідини великої рогатої худоби на основі комплексу сучасних інформативних методів дослідження ліквору з метою визначення більш тонких механізмів дії ксеногенної цереброспинальної рідини і різних рівнів реалізації її протисудомного ефекту при різних формах епілепсії.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Богадельников И. В., Ткач В. В. (мл), Ткач В. В., Прохорова Н. С., Фомочкин И. И. Экспериментальное изучение противосудорожных свойств инъекционного биопрепарата “Ликворина” // Сб. науч. тр. Крым. мед. ин-та. “Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения”: - Симферополь, 1995. - Т. 131. - С. 74 - 77.

2. Ткач В. В. (мл). Влияние биопрепарата “Ликворин” на активность эпилептогенных очагов в коре головного мозга кошек // Сб. науч. тр. Крым. мед. ин-та. “Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения”: - Симферополь, 1997. - Т. 133. - С. 207-212.

3. Ткач В. В., Кубышкин А. В., Ткач В. В. (мл.). Влияние ксеногенной цереброспинальной жидкости на генерализованную судорожную активность у крыс // Таврический медико-биологический вестник. - 1999. - № 1 - 2. - С. 66-69.

4. Ткач В. В. вплив інтрацеребрального введення лікворину на генералізовану судомну активність у щурів // Фізіологічний журнал. - 2000. - Т. 46, № 5. - С. 71-76.

5. Ткач В. В. (мл). Влияние биопрепарата “Ликворина” при внутрижелудочковом введении на судорожную активность у крыс в условиях пикротоксинового киндлинга // Сб. науч. тр. Крым. мед. ин-та. “Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения”: - Симферополь, 1997. - Т. 133. - С. 213-219.

6. Ткач В. В. (мол.), Кубишкін А. В., Ткач В. В., Самсонова А. В. Антиконвульсивні впливи ксеногенної спинномозкової рідини при численних введеннях на судомну активність у мишей // Фізіологічний журнал. - 2000. - Т. 46, № 2 (додаток). - С. 148.

АНОТАЦІЯ

Ткач В. В. Протисудомні властивості ксеногенної цереброспинальної рідини на різних моделях епілептогенезу. Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14. 03. 04 - патологічна фізіологія, Тернопільська державна медична академія ім. І. Я. Горбачевського МОЗ України, Тернопіль, 2001.

Дисертація присвячена експериментальним дослідженням ліквору корів на гострих, хронічних і вогнищевих моделях епілептогенезу. Роботу проведено на 193 білих щурах, 220 мишах, 10 кішках. Вивчено вплив ЦСР на судоми, що провокуються у тварин введенням різних конвульсантів. Установлено, що ЦСР володіє видонеспецифічною дією і пригнічує клінічні і ЕЕГ прояви епіактивності. Ефект ЦСР не залежить від шляхів її введення і наростає при її повторному застосуванні. Протисудомні властивості ліквору корів пов'язані з наявністю в його складі нейропептидів, гормонів, медіаторів та інших БАР та їхньою здатністю впливати на ГАМКергічні структури головного мозку.

Ключові слова: ліквор корів, протисудомний ефект, модель, епілепсія, конвульсанти, лабораторні тварини.

АННОТАЦИЯ

Ткач В. В. Противосудорожные свойства ксеногенной цереброспинальной жидкости на различных моделях эпилептогенеза. Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14. 03. 04 - патологическая физиология, Тернопольская государственная медицинская академия им. И. Я. Горбачевского МЗ Украины, Тернополь, 2001.

Диссертация посвящена экспериментальным исследованиям ликвора коров на острых, хронических и очаговых моделях эпилептогенеза. Работа проведена на 193 белых крысах, 220 мышах, 10 кошках.

В своих исследованиях мы использовали прижизненно взятую цереброспинальную жидкость коров, которая подвергалась последующей обработке (криоконсервация, гамма-стерилизация, фильтрация).

В результате проведенных комплексных исследований впервые установлены особенности динамики противосудорожного действия ксеногенной цереброспинальной жидкости в течение двух суток. Доказано, что эффект регистрируется после 2 часов с момента ее введения (интрацеребрально - крысам, внутрибрюшинно - мышам) и был максимально выражен через 24 часа. Это выражалось в увеличении латентного периода первых судорог, полной задержке или смягчении развития генерализованных клонико-тонических судорожных пароксизмов, снижении тяжести и интенсивности приступов, предотвращении летальности животных. Повторные (курсовые) введения ликвора (3; 5 инъекций) оказывали более выраженное антиэпилептическое действие, чем однократные.

Под влиянием ксеногенной цереброспинальной жидкости происходило угнетение как клинических так и ЭЭГ проявлений судорожных реакций у крыс в условиях пикротоксинового киндлинга. Эти данные являются критерием эффективности и целесообразности ксеноликворотерапии, поскольку удовлетворяют требования к антиэпилептическим препаратам. Под влиянием ксеногенной цереброспинальной жидкости происходило угнетение как клинических так и ЭЭГ проявлений судорожных реакций у крыс в условиях пикротоксинового киндлинга. Эти данные являются критерием эффективности и целесообразности ксеноликворотерапии, поскольку удовлетворяют требования к антиэпилептическим препаратам.

В экспериментальных исследованиях мы использовали ряд конвульсантов с разными механизмами действия (бикукуллин, пикротоксин, коразол, стрихнин и тиосемикарбазид). В экспериментальных исследованиях мы использовали ряд конвульсантов с разными механизмами действия (бикукуллин, пикротоксин, коразол, стрихнин и тиосемикарбазид).

Антиконвульсивный эффект ксеногенной цереброспинальной жидкости был максимально выражен в условиях введения антагонистов ГАМК. Так, в условиях бикукуллин-индуцированных судорог первые судороги появлялись значительно позже и протекали легко, их тяжесть была в 2, 5 раза меньше, чем в контрольной группе, у всех животных отсутствовали генерализованные припадки и летальный исход. Это указывало на то, что действие ликвора реализуется путем преимущественного влияния на ГАМКергические структуры головного мозга. Антиконвульсивный эффект ксеногенной цереброспинальной жидкости был максимально выражен в условиях введения антагонистов ГАМК. Так, в условиях бикукуллин-индуцированных судорог первые судороги появлялись значительно позже и протекали легко, их тяжесть была в 2, 5 раза меньше, чем в контрольной группе, у всех животных отсутствовали генерализованные припадки и летальный исход. Это указывало на то, что действие ликвора реализуется путем преимущественного влияния на ГАМКергические структуры головного мозга.

Ксеногенная цереброспинальная жидкость обладает выраженным ингибирующим действием на эпилептическую активность очагов в коре головного мозга кошек, под ее влиянием происходило уменьшение количества генерированных разрядов в 2-5 раз с последующим снижением и полным угнетением эпилептической активности, а также сокращение времени существования очага. Ксеногенная цереброспинальная жидкость обладает выраженным ингибирующим действием на эпилептическую активность очагов в коре головного мозга кошек, под ее влиянием происходило уменьшение количества генерированных разрядов в 2-5 раз с последующим снижением и полным угнетением эпилептической активности, а также сокращение времени существования очага.

Эффективность антиконвульсивного действия ликвора не зависела от путей его введения (интрацеребральный, внутрибрюшинный, аппликационный) и являлась видонеспецифической. Эффективность антиконвульсивного действия ликвора не зависела от путей его введения (интрацеребральный, внутрибрюшинный, аппликационный) и являлась видонеспецифической.

Противосудорожные свойства ликвора коров связаны с наличием в его составе нейропептидов, гормонов, медиаторов и других БАВ и их способностью влиять на ГАМКергические структуры головного мозга.

Ключевые слова: ликвор коров, противосудорожный эффект, модель, эпилепсия, конвульсанты, лабораторные животные.

SUMMARY

Tkach V. V. Auticonvulsive properties of xenogenic cerebrospinal fluid on different models of epileptogenesis. Manuscript. Thesis for scientific degree of Candidate of Medical Sciences in speciality 14. 03. 04 - Pathologic Physiology. Ternopol State Medical Academy. Health Ministry of Ukraine, Ternopol, 2000.

The dissertation is denoted to the experimental study of cattle Liquor on acute, chronic and focal models of epileptogenesis. The study was carried out on 193 white rats, 220 mice, 10 cats. The influence of CSF on convulsions initiated in animals by introducing of different convulsants was studied.

It was determined that the CSF has species non-specific action and depresses clinical and EEGmanifestations of epiactivity. The effect of CSF doesn't depend on its introducing and grows in repeated use. The anticonvulsive properties of cattle Liquor are connected with the presence in its composition of neuropeptids, hormons, media-tors and other BAS and their property to effect on GABAergic structures of the brain.

The Key words: cattle Liquor, anticonvulsive effect, model, epilepsy, convulsants, laboratory animals.

Размещено на Allbest.ru

...