Вплив факторів навколишнього середовища на епідемічний процес при холері та на біологічні властивості збудника

Размещено на http://www.allbest.ru/

АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕПІДЕМІОЛОГІЇ ТА ІНФЕКЦІЙНИХ ХВОРОБ

ім. Л.В. ГРОМАШЕВСЬКОГО

УДК 616.932+579.843] (047.1)

Вплив факторів навколишнього середовища

на епідемічний процес при холері

та на біологічні властивості збудника

14.02.02. - епідеміологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Дронова Ірина Юріївна

Київ - 2002



Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Українському науково-дослідному протичумному інституті ім. І.І. Мечнікова та в Інституті епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України

Науковий керівник: доктор медичних наук, старший науковий співробітник Алексеєнко Володимир Васильович, Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України, завідувач лабораторією вібріозів

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Колесников Михайло Михайлович Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця, професор кафедри епідеміології

доктор медичних наук Доброштан Євген Васильович Український інститут громадського здоров`я МОЗ України, завідувач відділення організації санітарно-епідеміологічної служби

Провідна установа: Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика МОЗ України

Захист відбудеться “15” жовтня 2002 р. о 12.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.614.02 при Інституті епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України (02038, м. Київ - 38, узвіз Протасів Яр, 4).

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України (02038, м. Київ - 38, узвіз Протасів Яр, 4)

Автореферат розісланий “14” жовтня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат медичних наук С.І. Доан



АНОТАЦІЯ

Дронова І.Ю. Вплив факторів навколишнього середовища на епідемічний процес при холері та на біологічні властивості збудника. - Рукопис. холера епідемічний біологічний пандемія

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за фахом 14.02.02 - епідеміологія. - Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України, м. Київ, 2002 р.

Дисертацію присвячено вивченню особливостей епідемічного розповсюдження холери та її збудника на території України в період 7-ї пандемії та виявленню факторів довкілля, що впливають на епідемічний процес при холері та на біологічні властивості збудника. Виявлена залежність інтенсивності епідемічного прояву холери від клімато-географічних характеристик місцевості. Надані рекомендації щодо визначення обсягу та спрямованості лабораторних досліджень об`єктів довкілля на присутність холерних вібріонів на територіях, що належать до різних клімато-географічних зон України. Експериментально виявлена можливість тривалого співкультивування холерних вібріонів з оксегенічною культурою синьо-зелених водоростей Synechocystis PCC в середовищі з підвищеною місткістю NaCl. У таких самих умовах культивування виявлена інгібуюча дія зелених водоростей Platimonas viridis на процеси життєдіяльності холерних вібріонів. Розроблена принципово нова методика визначення експресії генів патогенності у холерних вібріонів на культурі клітин HeLa. В експерименті вивчені строки збереження та показана експресія гена ctx у V. cholerae О1 за розробленою методикою.

Ключові слова: холера, епідеміологічний нагляд, V. cholerae, токсигенність, синьо-зелені зелені водорості.



Дронова И.Ю. Влияние факторов окружающей среды на эпидемический процесс при холере и на биологические свойства возбудителя. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.02.02 - эпидемиология. - Институт эпидемиологии и инфекционных болезней им. Л.В.Громашевского АМН Украины, Киев, 2002 г.

Диссертация посвящена изучению особенностей эпидемического распространения холеры и ее возбудителя на территории Украины в период 7-й пандемии и выявлению факторов окружающей среды, влияющих на эпидемический процесс при холере и на биологические свойства возбудителя. Установлена зависимость интенсивности эпидемического проявления инфекции от климато-географических характеристик местности. Выявлена четкая тенденция в проявлении эпидемического процесса холеры лишь в южном регионе Украины, состоящему из шести приморских областей и АР Крым. При этом, крупные эпидемии развивались только в городах и населенных пунктах, расположенных на берегах открытых водоемов, загрязняемых необеззараженными стоками хозяйственно-фекальной канализации. Дана эпидемиологическая оценка эффективности и целесообразности проводимого лабораторного контроля внешней среды на территориях страны, относящихся к разным климатическим зонам. В Украине выделяют 6 основных климатических зон. Причем, V и VI зоны являются зонами вертикальной климатической поясности и не относятся к зонам риска по холере. Установлено, что регионы эпидемического распространения инфекции соответствуют III и IV климатическим зонам, которые отличаются по таким основным климатическим характеристикам от других зон: количество солнечных часов на территориях III и IV зон в среднем на 27% превышает значение этого показателя для I и II зон; средние температуры июля - на 12%; длительность периода со среднедневной температурой выше 10°С - на 10%; длительность безморозного период - на 20%. Анализ распространения холерных вибрионов в окружающей среде по климатическим зонам показал, что подавляющее большинство штаммов холерных вибрионов также выделяли на территориях, относящихся к III и IV климатическим зонам. Сделан вывод, что климатогеографические условия III и IV климатических зон более благоприятны для сапрофитического существования холерных вибрионов как О1, так и не О1 группы, чем условия I и II зоны. Даны рекомендации для определения объема и направленности лабораторных исследований объектов окружающей среды на наличие холерных вибрионов на территориях, которые относятся к разным климато-географическим зонам Украины.

Результаты данной работы позволят сократить объем проводимых бактериологических исследований объектов окружающей среды на наличие холерных вибрионов, что предотвратит необоснованные траты сил персонала, и будет способствовать оптимизации эпидемиологического надзора за инфекцией. Основные положения настоящего исследования положены в основу приказа Министерства здравоохранения Украины №178 от 17.05.2001 г. “Об изменении объема исследований на холеру”.

Экспериментально выявлена возможность длительного сокультивирования холерных вибрионов с оксегеничной культурой сине-зеленых водорослей Synechocystis PCC в среде с повышенным содержанием NaCl, что может иметь место в условиях солоноватых водоемов. В таких же условиях культивирования выявлено ингибирующее действие зеленых водорослей Platimonas viridis на процессы жизнедеятельности холерных вибрионов.

Разработана принципиально новая методика определения экспрессии генов патогенности у холерных вибрионов на культуре клеток HeLa (патент на изобретение “Способ определения токсигенности холерных вибрионов” по заявке № 2001128460 от 10.12.2001 г.). Данная методика позволяет повысить точность, информативность и чувствительность определения токсигенности штаммов холерных вибрионов и обеспечивает выявление изменений структуры ядра и цитоплазмы клеток-мишеней при отсутствии непосредственного контакта клеток-мишеней с микробами. Впервые описаны структурно-функциональные изменения клеток культуры HeLa, характерные для действия холерогена, продуцируемого одной колонией штамма холерных вибрионов.

В эксперименте изучены сроки сохранения и показана экспрессия гена ctx у V. cholerae О1 с помощью разработанной методики.

Ключевые слова: холера, эпидемиологический надзор, V. cholerae, токсигенность, сине-зеленые зеленые водоросли.



Dronova I.Yu. Influence of environmental factors on epidemic process of cholera and on biological properties of the agent. - Manuscript.

Thesis for degree of Candidate of Medical Sciences in speciality 14.02.02 - Epidemiology. - Lev Gromashevskiy Institute of Epidemiology and Infectious Diseases, Kyiv, 2002.

Thesis is devoted to studying of features of epidemic distribution of cholera and its agent in Ukraine during the 7th pandemic and to revealing of some factors of the environment influencing for cholera epidemic process and on biological properties of its agent. Dependence of intensity of epidemic spreading of infection on climatic and geographical characteristics of district is revealed. Recommendations for volume and direction of laboratory researches of environment in territories that concern to different climatic zones of Ukraine are given. The opportunity of long-term persistence of Vibrio cholerae O1 with blue-green alga Synechocystis PCC in the environment with increased contents of NaCl is experimentally revealed. In the same conditions it is revealed the pressing action of green alga Platimonas viridis on vital processes of Vibrio cholera. The new technique of definition of toxigenicity of V. cholerae on culture of cells HeLa is developed. Terms of preservation and expression of ctx gene of V. cholerae are experimentally investigated with the help of the developed technique.

Key words: cholera, surveillance, V. cholerae, toxigenicity, blue-green green algae.



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність роботи. Холера, cьома пандемія якої почалася в 1961 р. та не припиняється вже протягом 40 років, залишається гострою міжнародною медико-соціальною проблемою. До епідемічного процесу вже втягнено понад 140 країн та майже всі континенти, за виключенням Австралії, де, однак, неодноразово реєстрували занесення інфекції, і Антарктиди. На території України холера та її збудник присутні щорічно з 1970 року по цей час, що проявлялося в окремі роки невеликими спалахами або масовим епідемічним розповсюдженням, або поодинокими випадками захворювань та вібріононосійства, або лише виділенням V. cholerae О1 з об`єктів довкілля.

За даними Всесвітньої організації охорони здоров`я (ВООЗ) з початку 7-ї пандемії холери вже зареєстровано більш ніж 5 млн. випадків цієї хвороби. Однак, експерти ВООЗ та інші вчені вказують на те, що кількість захворювань значно більша за рахунок асимптомного перебігу інфекції, представлення неповних даних щодо їх реєстрації та інших недоліків у системі нагляду за холерою (Wkly Epidem. Rec. WHO. Geneva, 1970 - 2002).

Світовий досвід свідчить, що на цей час появленню холери в тій чи іншій країні, незалежно від її політичного та економічного статусу, не можна запобігти. Однак, у межах окремої країни масштаби епідемічного розповсюдження інфекції визначаються своєчасністю та адекватністю профілактичних та протиепідемічних заходів, які розроблені з урахуванням важливіших досягнень у вивченні холери (Наркевич М.І., 1991; Ломов Ю.М., 1992; Оніщенко Г.Г., 1994; Могілевський Л.Я., 1997).

Дослідження останніх десятиріч значно розширили уявлення щодо епідеміології цієї інфекції. Разом з тим, залишаються не повністю розкритими такі важливі питання, як пристосованість холери до певних регіонів, умови збереження збудника в міжепідемічний період, а також ступінь мінливості біологічних властивостей в процесі тривалого перебування в об`єктах довкілля. Усе це визначає актуальність проблеми холери та необхідність її подальшого вивчення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана в рамках науково-дослідних робіт лабораторії епідеміології особливо небезпечних інфекцій Українського науково-дослідного протичумного інституту (УНДПЧІ) ім. І.І. Мечнікова “Удосконалення заходів щодо санітарної охорони території України від заносу та розповсюдження карантинних захворювань та висококонтагіозних геморагічних лихоманок Ебола, Марбург і Ласа” (№ держреєстрації 0100U003880), “Патогенні особливості штамів холерних вібріонів, ізольованих на території України в різні роки” (№ держреєстрації 0100U003882) та лабораторії вібріозів Інституту епідеміології та інфекційних хвороб АМН України ім. Л.В. Громашевського “Розробка системи протихолерних заходів на підставі вивчення особливостей збудника на молекулярно-генетичному рівні” (№ держреєстрації 0199U000700).

Мета роботи - виявити вплив факторів довкілля на епідемічний процес при холері та біологічні властивості збудника і вдосконалити епідеміологічний нагляд за інфекцією.

Для реалізації вказаної мети було поставлено такі задачі:

Визначити особливості епідемічного процесу при холері в різних регіонах України в період 7-ї пандемії.

Виявити умови, які сприяють епідемічному розповсюдженню холери в Україні.

Вивчити розповсюдженість холерних вібріонів в об`єктах довкілля та оцінити епідеміологічну ефективність лабораторного контролю довкілля на територіях країни, які відносяться до різних кліматичних зон.

Надати рекомендації щодо удосконалення епідемічного нагляду за холерою в Україні.

В експерименті вивчити вплив оксегенічних культур різних видів водоростей (на прикладі синьо-зелених та зелених) на процеси виживання та розмноження холерних вібріонів при спільному культивуванні.

В експерименті встановити строки збереження та експресії гена ctx у V. cholerae О1, який відповідає за синтез холерогену.

Об'єкт дослідження: : епідемічний процес при холері в Україні у період 7-ї пандемії.

Предмет дослідження: звітні матеріали та донесення санітарно-епідеміологічних закладів України, матеріали УНДПЧІ ім. І.І. Мечнікова, які присвячені опису ліквідації епідемічних ускладнень з холери, офіційні звіти та довідки обласних санітарно-епідемічних станцій України (форми №№ 2, 18, 36, 85), штами холерних вібріонів з колекції УНДПЧІ ім. І.І. Мечнікова, штами водоростей з колекції Одеського Національного університету ім. І.І. Мечнікова.

Методи дослідження: епідеміологічні, бактеріологічні, молекулярно-генетичні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше виявлені особливості епідемічного прояву холери на різних територіях України в залежності від клімато-географічних характеристик місцевості. Вперше розроблені основні принципи організації бактеріологічних досліджень об`єктів довкілля на присутність холерних вібріонів на територіях, які відносяться до різних клімато-географічних зон України. Експериментально виявлена можливість тривалого співкультивування холерних вібріонів з оксегенічною культурою синьо-зелених водоростей Synechocystis PCC в середовищі з підвищеною місткістю NaCl та інгібіруюча дія зелених водоростей Platimonas viridis на процеси життєдіяльності холерних вібріонів. Вперше описані структурно-функціональні зміни клітин культури HeLa, які характерні для дії холерогену, що продукується однією колонією штаму холерних вібріонів. В експерименті вивчені строки збереження та показана експресія гена ctx у V. cholerae О1 за розробленою методикою.

Практичне значення одержаних результатів. Теоретичне обґрунтування диференційованого підходу щодо визначення обсягу та спрямованості лабораторних досліджень довкілля буде сприяти оптимізації епідеміологічного нагляду за холерою і відверне необґрунтовані витрати сил та коштів. Розроблено рекомендації щодо удосконалення протихолерних заходів, які лягли в основу наказу МОЗ України № 178 від 17.05.2001 р. “Про зміни обсягу досліджень на холеру”.

Розроблена принципова нова методика визначення експресії генів патогенності у холерних вібріонів на культурі клітин HeLa (деклараційний патент на винахід “Спосіб визначення токсигенності холерних вібріонів” за заявкою № 2001128460 від 10.12.2001 р.).

Особистий внесок автора. Автором узагальнений та здійснений аналіз первинної документації, проведено лабораторні дослідження щодо співкультивування холерних вібріонів з різними типами водоростей та встановлення строків збереження і експресії гена ctx у V. cholerae О1 (кількість досліджень, виконаних особисто автором, становила 22 серії дослідів). Самостійно здійснено узагальнення матеріалу, статистичну обробку отриманих даних, інтерпретацію результатів, сформульовано висновки. Здобувач приймав безпосередню участь у підготовці наказу МОЗ України № 178 від 17.05.2001р. “Про зміни обсягу досліджень на холеру”.

Апробація результатів дисертації. По темі дисертації було опубліковано 11 робіт, із них 5 - у фахових журналах.

Основні положення дисертаційної роботи було висвітлено на науково-практичній конференції “Санитарная охрана территории Украины и профилактика особо опасных инфекций” (м. Одеса, 1997 р.); міжнародній конференції “Стратегия и тактика борьбы с инфекционными заболеваниями” (м. Харків, 1998 р.); семінарі-нараді з проблем санітарної охорони території України від заносу та розповсюдження карантинних та інших особливо небезпечних інфекцій (м. Іллічівськ, 2000 р.); всеукраїнській науково-практичній конференції молодих вчених “Актуальні проблеми профілактичної медицини” (м. Київ, 2000 р.); міжнародному семінарі та спільних навчаннях держав-учасниць СНД з особливо небезпечних інфекцій (м. Іллічівськ, 2001 р.).

Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, 4 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів, висновків та списку використаних джерел, викладена на 140 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 13 таблицями та 15 малюнками. Список використаної літератури включає 236 джерел (158 вітчизняних та 78 зарубіжних).

Висловлюємо щиру подяку фахівцям лабораторії епідеміології особливо небезпечних інфекцій, бактеріологічної лабораторії та лабораторії цитопатології та морфології мікроорганізмів Українського науково-дослідного протичумного інституту ім. І.І. Мечникова, лабораторії вібріозів Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України, лабораторії біохімії Одеського Національного університету ім. І.І. Мечнікова, а також відділів особливо небезпечних інфекцій обласних та міських санітарно-епідеміологічних станцій України за спільну працю та допомогу при виконанні роботи.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Робота виконана з комплексним застосуванням епідеміологічних, бактеріологічних, молекулярно-генетичних та статистичних методів дослідження.

Вивчені офіційні звіти та довідки санітарно-епідеміологічних станцій України за період з 1989 р. до 1999 р. (81 звітна форма №85; 270 форм №36; 189 форм №2; 27 форм №18).

В роботі використовували 26 штамів V. cholerae О1 (№№ 21, Р-145, 752, 396, 404, 459, 476, 477, 478, 481, 339, 486, 496, 487, 498, 499, 501, 511, 610, 611, 613, 627, 735, 752, 703, 752) із колекції УНДПЧІ ім. І.І. Мечнікова та оксегенічні штами водоростей Platimonas viridis і Synechocystis PCC із колекції Одеського Національного університету ім. І.І. Мечнікова.

Особливості епідемічного розповсюдження холери та вібріонів ельтор в об`єктах довкілля в Україні вивчали за допомогою методу епідеміологічного аналізу.

Для співкультивування представників фітопланктону та холерних вібріонів застосовували бактеріологічні методи. Використовували поживне середовище “С” (Столетов В.Н. та співавт., 1965). Готували 2 ряди середовищ з різною концентрацією NaCl (0,5 ммоль та 20 ммоль). Водорості та холерні вібріони вирощували в окремих колбах у режимі постійного трясіння на шутель-апараті при 150 кач/мін з цілодобовим освітленням лампами денного світла, при температурі 28?С.

При досягненні стаціонарної фази росту холерних вібріонів у дослідні колби вносили водорості, концентрацію яких визначали за хлорофілом (Гавриленко В.Ф. та співавт., 1975). З певною періодичністю робили висіви з дослідних та контрольних колб на пляшки з лужним агаром та визначали рН середовища. Всього було поставлено 16 серій дослідів з синьо-зеленими водоростями, 8 серій дослідів з зеленими водоростями та виділено 592 субкультур холерних вібріонів. При відсутності в прямих висівах на лужному агарі колоній вібріонів, робили висіви щодо виділення L-форм вібріонів та одержання реверсії змінених клітин у похідний стан (Методические рекомендации по выделению и идентификации морфологически атипичных форм холерных вибрионов из объектов внешней среды: Утв. Гл. упр. карантин. инфекц. М-ва здравоохр. СССР 24.10.1977).

Дослідження щодо вивчення строків збереження гена ctx у штамів холерних вібріонів проводили з дотриманням протиепідемічного режиму в спеціально устатковуваному приміщенні, відкритому для дії зовнішніх атмосферних факторів та недоступному для людей. Реєстрували температуру повітря в день та в ночі. Холерні вібріони культивували у 1% пептонной і лужній мінеральній воді, рН 7,8, у флаконах обсягом 250 мл. Нагляд проводили протягом 90 днів з періодичним висівом культур кожні 7 днів. Ізольовані культури вивчали за загальноприйнятими методиками (Інструкція по організації та проведенню протихолерних заходів, клініці та лабораторній діагностиці холери: Затв. наказом МОЗ України №167 від 30.05.97). Було поставлено 4 серії дослідів та виділено 44 субкультури холерних вібріонів.

Наявність гена ctx визначали за допомогою методу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Реакцію ампліфікації здійснювали відповідно інструкції до тест-системи для визначення гена ctx (“Медбіосервіс”, м. Київ), результати оцінювали електрофоретичним методом у 2% агарозном гелі візуально.

Рівень токсиноутворення досліджуваних штамів холерних вібріонів визначали на культурі клітин HeLa за розробленою методикою (деклараційний патент на винахід “Спосіб визначення токсигенності холерних вібріонів” за заявкою № 2001128460 від 10.12.2001 р.).

Статистичну обробку проводили на ПК за допомогою програми MExcel 2000.

Результати досліджень та їх обговорення.

Розповсюдженість холери ельтор на різних територіях України в період 7-ї пандемії. Епідеміологічний аналіз розповсюдження холери в Україні за період з 1970 р. до 2000 р. показав, що масові епідемічні ускладнення мали місце лише у південному регіоні країни, до якого відносяться 5 приморських областей та АР Крим. При цьому, епідемічне розповсюдження інфекція набувала лише в окремих містах та населених пунктах, розташованих у пониззі річок Дунай, Південний Буг, Дніпро, а також на узбережжі Чорного та Азовського морів. Зареєстровані спалахи були обумовлені водним фактором передачі збудника - використанням населенням для питних, господарсько-побутових та рекреаційних цілей води цих водоймищ.

Таким чином, особливості розповсюдження холери в Україні в 7-му пандемію підтвердили роль водного фактора у формуванні епідемічного неблагополуччя при холері. На інших територіях країни, у містах та населених

пунктах, розташованих у середній течії та верхів`ях зазначених річок, а також на других водних артеріях і водоймищах, холера не набувала епідемічного розповсюдження. Разом з тим, численні факти заносу збудника на такі території підтверджуються неодноразовими виявленнями серед населення поодиноких випадків захворювання та вібріононосійства, а також виділенням холерних вібріонів із об`єктів довкілля, у тому числі і з води водоймищ.

Таким чином, не дивлячись на реально існуючи передумови, епідемічний процес на цих територіях не реалізовувався. Таке нерівномірне розповсюдження інфекції в країні з практично однотипними соціальними, демографічними та культурними умовами життя населення на більшості територій свідчить про необхідність виявлення факторів, які впливають на інтенсивність епідемічного процесу при холері в різних регіонах держави.

Через те, що інтенсивність епідемічного процесу при кишкових інфекціях багато в чому визначається клімато-географічними особливостями місцевості, на якій циркулює збудник, ми поставили задачу виявити можливий зв`язок між інтенсивністю епідемічного процесу при холері та основними факторами, які визначають особливості клімату різних регіонів країни, а саме температурним режимом і рівнем інсоляції. В Україні виділяють 6 основних кліматичних зон.

У зв`язку з тим, що V та VI кліматичні зони є зонами гірської вертикальної кліматичної поясності та характеризуються низькою щільністю населення, ми не розглядали дані території як зони високого ризику по холері та не включили їх до розробки. Встановлено, що регіони епідемічного розповсюдження холери в Україні відповідають III та IV зонам. При вивченні цього явища виявлено, що кількість сонячних годин на територіях III і IV кліматичних зон в середньому на 27% перевищує значення цього показника для І та ІІ зон; середні температури липня - на 12%; тривалість періоду з середньодобовою температурою вище 10?С - на 10%; тривалість безморозного періоду - на 20%.

Аналіз даних щодо виділення холерних вібріонів із об`єктів довкілля за період 1989-1999 рр., на котрий припадає 67% усіх захворювань на холеру, зареєстрованих в Україні у 7-му пандемію, показав, що переважна більшість штамів збудника холери також ізольована в областях, які відносяться до III і IV кліматичних зон. Тут частота виділення холерних вібріонів була в середньому в 5,3 рази вищою, ніж на територіях, які відносяться до І та ІІ кліматичних зон.

У зв`язку з викладеним, можна зробити висновок, що клімато-географічні умови III та IV зон більш сприятливі для переживання холерних вібріонів у довкіллі. Посереднім підтвердженням цьому є також дані про виділення із об`єктів довкілля холерних вібріонів не О1 групи, які на територіях, розташованих в III та IV кліматичних зонах, виділяли у середньому в 2,3 рази частіше, ніж на територіях І та ІІ кліматичних зон.

При порівнянні даних щодо виділення холерного вібріону О1 групи із об`єктів довкілля на територіях І і ІІ та на територіях ІІІ і IV кліматичних зон за допомогою ч<sup>2</sup> - критерію Пірсона виявлена високовірогідна різниця між двома групами (ч<sup>2</sup> = 326,22, помилка < 1%). При порівнянні даних щодо виділення вібріонів не О1 групи на цих самих територіях також виявлена високовірогідна різниця (ч<sup>2</sup> = 21693,81, помилка < 1%). При статистичній обробці встановлена пряма кореляція високого ступеня між виділенням холерних вібріонів О1 групи із об`єктів довкілля в різних кліматичних зонах та такими кліматичними показниками, як кількість сонячних годин (коефіцієнт кореляції - 0,76±0,21) та тривалість безморозного періоду (коефіцієнт кореляції - 0,79±0,18).

Зважаючи на те, що основну кількість штамів холерних вібріонів із води відкритих водоймищ виділяють під час великих епідемічних ускладнень, можна зробити висновок, що існує пряма кореляційна залежність між кліматичними факторами та інтенсивністю епідемічного процесу.

Отже, схематично механізм формування епідемічних ускладнень по холері в Україні в період 7-ї пандемії у зазначених регіонах можна представити таким чином: більш високі температури повітря призводять до прогрівання води відкритих водоймищ і тим самим сприяють створенню оптимальних умов для збереження та розмноження холерних вібріонів. У свою чергу, накопичення останніх у воді призводить до зараження населення, яке користується водою цих водоймищ для господарсько-побутових цілей, та виникнення розгорнутих епідемій холери.

Вивчення біологічних властивостей холерних вібріонів в експериментальних умовах. Для виявлення впливу зелених та синьо-зелених водоростей на процеси виживання та розмноження холерних вібріонів були проведені експериментальні дослідження з їх спільного культивування на середовищах з концентрацією NaCl 0,5 та 20,0 ммоль/л. Використовували штам V. cholerae eltor O1 №21, серовар Огава, ctx+.

Встановлено, що при співкультивуванні з зеленими водоростями у середовищі з 20 ммоль/л NaCl протягом 5 - 14 діб відбувалось різке пригнічення росту вібріонів до повного їх зникнення (рис. 2). Ріст вібріонів оцінювали за кількістю колонієутворюючих одиніць в 1 мл (КУО/мл).

Терміни виділення вібріонів з мікрокосму залежали від концентрації водоростей. У дослідах із меншою кількістю водоростей (0,3 мг/л) ріст вібріонів реєстрували в середньому на 9 діб довше. Ріст у контролях відмічали протягом періоду спостереження (30 діб) на рівні 10⁴ мікробних клітин в 1 мл (м.к./мл). У мікрокосмах з більшою концентрацією зелених водоростей (3 мг/л) значення рН середовища починало різко підвищуватись після додавання водоростей та досягало максимальних значень 9,57 - 9,79 до кінця терміну спостереження. У мікрокосмах з меншою концентрацією водоростей підвищення рН відбувалось повільніше, але також досягало високих значень (9,32).

При співкультивуванні з синьо-зеленими водоростями ріст вібріонів у середовищі з 0,5 ммоль/л NaCl реєстрували в середньому протягом 19 діб.

Ріст вібріонів у контрольних колбах реєстрували протягом усього періоду спостереження (45 діб). Значення рН середовища в контролі знижувалося до 6,79, тоді як у дослідних колбах значно підвищувалося та досягало 10,96. У середовищі з підвищеною концентрацією NaCl (20 ммоль/л) ріст холерних вібріонів у дослідних колбах реєстрували постійно протягом усього терміну спостереження (90 діб).

Значного зниження концентрації мікроорганізмів відмічено не було (рис. 4), тоді як в контрольних колбах ріст вібріонів реєстрували останній раз на 82-у добу на рівні 10 м.к./мл. У контрольних колбах відмічали зниження рН середовища до 6,93 - 7,01. У дослідних колбах після додавання водоростей було відмічене підвищення рН середовища до 9,3 - 10,7. Під впливом обох типів водоростей значно змінювались морфологічні властивості вібріонів.

В експерименті з зеленими водоростями після закінчення виділення холерних вібріонів класичним методом вдалося виділити на третьому тижні культивування форми вібріонів, що не культивуються. Була здійснена реверсія клітин у початковий стан. У дослідах із синьо-зеленими водоростями пошук форм, що не культивуються, результатів не дав.

Субкультури холерних вібріонів, що виділені під час співкультивування з двома типами водоростей, на протязі всього періоду спостереження перевіряли на наявність гена ctx. В усіх випадках результати були позитивними.

Базуючись на отриманих результатах, можна допустити, що синьо-зелені водорості можуть сприяти тривалому збереженню холерних вібріонів в умовах солонуватих водоймищ, а також можуть стати фактором розповсюдження інфекції за ланцюгом “вода відкритих водоймищ - водорості - риба та інші гідробіонти - людина”.

Пригнічення росту вібріонів у мікрокосмах з зеленими водоростями, мабуть, було пов`язано із виділенням цими водоростями інгібіторів росту. Виявлення антагоністичної дії зазначеного виду зелених водоростей на холерні вібріони дозволяє припустити, що певні водорості можуть бути фактором очищення водоймищ від патогенних вібріонів.

Вивчення строків збереження гена ctx у 23 токсигенних штамів за методом ПЛР, які зберігали протягом 6 років в умовах музею, показало, що у жодного штаму не було утрати вказаного гена. Однак, метод ПЛР дозволяє визначити лише наявність чи відсутність досліджуваного гену. У зв`язку з цим, нами була розроблена методика, яка дозволяє визначати рівень токсиноутворення, тобто експресію генів патогенності холерних вібріонів на культурі клітин.

В основу винаходу була поставлена задача підвищити точність, інформативність і чутливість способу визначення токсигенності та рівня токсиноутворення штамів холерних вібріонів, котрий забезпечив би виявлення змін структури ядра та цитоплазми клітин-мішеней, характерних для дії холерогену й/або інших цитотоксинів, які продукує одна бляшка або колонія досліджуваного штаму холерних вібріонів за відсутністю безпосереднього контакту клітин-мішеней з мікробами.

В експерименті визначали наявність характерних для дії холерогену змін структури ядра клітин-мішеней (крупноглибчата агрегація хроматину) і цитоплазми (формування крупних вакуолей), гніздність однотипових пошкоджень. Для підтвердження специфічності продукованого холерогену в інші флакони за 30 хвилин до внесення ділянки агару з вібріонами вносили антитоксичну сироватку. Наявність типових пошкоджень клітин HeLa тільки на препаратах без додавання сироватки до середовища співкультивування була доказом продукції холерогену і підставою для висновку про токсигенність досліджуваного штаму холерного вібріону.

Для визначення рівня токсиноутворення порівнювали гніздність пошкоджень (їх кількість на число типово пошкоджених клітин в осередках) через 8 та 24 години співкультивування клітин-мішеней та вібріонів. При вивченні пошкоджуючої дії токсигенних субстанцій, секретованих різними штамами V. cholerae, виявлені та охарактеризовані раніше невідомі ознаки пошкодження клітин HeLa холерним екзотоксином та іншими біологічно активними речовинами.

Вивчення рівня токсиноутворення показало його відсутність при наявності гена ctx у деяких штамів. У штама №21 в процесі тривалого співкультивування з водоростями відмічене різке зниження рівня токсиноутворення.

Усі штами, які зберігались в близьких до природних умовах, втратили ген ctx в середньому на протязі місяця. Спостерігали наявність гемолітичної активності ще до втрати зазначеного гена. Під кінець терміну експерименту у штама №Р-145 ферментативна активність на стандартних діагностичних середовищах не відмічалась. Були відмічені перехресні реакції з аглютинуючою сироваткою типу Інаба у двох штамів.

Це може свідчити про те, що несприятливі зовнішні умови, перш за все, зниження температури повітря, призводить до пригнічення життєдіяльності та подальшої загибелі вібріонів, що, певною мірою, пояснює зменшення інтенсивності та ліквідацію епідемічного потенціалу в зимовий період.

Основні принципи організації бактеріологічного контролю об`єктів довкілля в Україні на підставі клімато-географічного районування. Відповідно діючої “Інструкції з організації та проведення протихолерних заходів...” (1997 р.) територія України поділена на три типи. Обсяг бактеріологічних досліджень об`єктів довкілля визначається типом території. Проведений на підставі клімато-географічного районування аналіз даних щодо виділення холерних вібріонів із об`єктів довкілля за період з 1989 по 1999 рр. показав, що у зазначений період у країні було проведено 981413 дослідження. При цьому виділено 1058 штамів холерних вібріонів О1 групи. Позитивні дослідження складали 0,1±0,003%.

Виділення збудника холери з об`єктів довкілля за цей період відмічено в усіх областях, що належать до ІІІ та ІV кліматичних зон. На більшості територій, що належать до І та ІІ кліматичних зон, на які припадало в різні роки від 19 до 28% усіх досліджень у країні, взагалі не було виділено жодного штаму холерного вібріону О1 групи.

Аналіз даних щодо виділення холерних вібріонів свідчить, що з води господарсько-фекальної каналізації було виділено 340 штамів. Основна їх частина (93,5%) ізольована на територіях ІІІ та ІV кліматичних зон в періоди епідемічних ускладнень, які супроводжувались масовою захворюваністю. Позитивні результати в цьому випадку були дуже низькими - 0,3% (рис. 5). На інших територіях країни, де проведено майже 40% усіх досліджень стічних вод господарсько-фекальної каналізації, холерні вібріони не виділяли навіть при реєстрації хворих на холеру. У зв`язку з цим, слід вважати цю роботу недоцільною, як за епідеміологічними, так і за економічними міркуваннями.

При дослідженні проб, які були відібрані в місцях скидання стічних вод господарсько-фекальної каналізації у відкриті водоймища, виділені 206 штамів холерних вібріонів в усіх областях, що відносяться до ІІІ та ІV кліматичних зон, й у двох областях, які розташовані в І та ІІ кліматичних зонах (Харківська та Львівська області). На решті територій результати досліджень були негативними. Таким чином, на більшій частині території України робота з виявлення холерних вібріонів у воді відкритих водоймищ у місцях скидання стічних вод господарсько-фекальної каналізації не дозволила виділити їх, не дивлячись на значні фізичні та економічні витрати. У регіонах, в яких виділяли холерні вібріони, низькі позитивні результати свідчать про завищуваний обсяг досліджень.

В особливо великому обсязі була проведена робота з дослідження проб, відібраних у місцях рекреаційного водокористування. Всього було досліджено 509839 проб та виділено з них 491 штам холерних вібріонів (позитивні дослідження - 0,1%). 90% штамів були виділеними на територіях ІІІ та ІV кліматичних зон. На територіях І та ІІ зон у більшості областей дослідження були проведені з негативним результатом, і тільки в 6 областях в окремі роки виділяли поодинокі штами збудника. Ці дані також свідчать про завищуваний обсяг досліджень.

Слід відзначити, що практично в усіх випадках збудника холери виділяли вже після виявлення хворих серед населення, тобто на фоні розвинутої епідемії. Таким чином, проведення цих досліджень у період епідемічного благополуччя не є оперативним заходом, їх результати можуть бути використаними лише для ретроспективного аналізу. В епідемічний період ці дані можуть свідчити про можливість активізації в епідемічному процесі водного фактору.

Низька ефективність досліджень об`єктів довкілля на наявність холерних вібріонів на всій території України свідчить про епідеміологічну недоцільність проведення таких досліджень в існуючому обсязі та про необхідність перегляду розділу діючої “Інструкції з організації та проведення протихолерних заходів ...”, яка регламентує цю роботу.



ВИСНОВКИ

1. Виявлена чітко виражена тенденція щодо прояву епідемічного процесу при холері лише у південних областях України, які розташовані на територіях III та IV кліматичних зон. У північних та центральних областях країни, які належать до I та II кліматичних зон, реєстрували тільки спорадичну захворюваність. Встановлено, що епідемічне розповсюдження на територіях III та IV кліматичних зон інфекція приймала, головним чином, лише в населених пунктах, які розташовані на берегах відкритих водойм, де водний фактор передачі був головним.

2. Частота виділення холерних вібріонів О1 та не О1 груп з об`єктів довкілля на територіях, які належать до III та IV кліматичних зон, в середньому була відповідно у 5,3 та 2,3 рази вищою, ніж на територіях, які належать до I та II кліматичних зон. Ці данні свідчать про те, що кліматогеографічні умови III та IV зон є більш сприятливими для сапрофітичного існування холерних вібріонів як О1, так і не О1 груп у воді відкритих водойм.

3. Встановлено, що значення основних кліматичних показників для регіонів епідемічного розповсюдження холери відрізняються від значень для регіонів зі спорадичною захворюваністю: кількість сонячних годин на територіях III та IV зон у середньому на 27% перевищує значення цього показника для I та II зон; середні температури липня - на 12%; тривалість періоду зі середньодобовою температурою вище 10°С - на 10%; тривалість безморозного періоду - на 20%.

4. Обсяг та спрямованість досліджень об`єктів довкілля, які передбачені діючою “Інструкцією з організації та проведення протихолерних заходів ...”, потребують перегляду з позиції епідеміологічної доцільності, що дозволить запобігти необґрунтованих витрат сил і коштів та буде сприяти оптимізації епідеміологічного нагляду за інфекцією.

5. Виявлений різний вплив синьо-зелених та зелених водоростей на процеси життєдіяльності холерних вібріонів в експериментальних умовах. Синьо-зелені водорості Synechocystis PCC (оксегенічна культура) сприяли більш тривалому переживанню холерних вібріонів у середовищі з підвищеним вмістом NaCl (20 ммоль/л), що, певною мірою, може мати місце в умовах солонуватих водоймищ. У дослідах із зеленими водоростями Platimonas viridis відбувалося швидке пригнічення росту холерних вібріонів аж до повного їх зникнення, що може свідчити про те, що певні типи водоростей можуть служити фактором очищення водоймищ від патогенних вібріонів.

6. Встановлено, що штами холерних вібріонів, які культивували в умовах, близьких до природних, втрачали ген ctx в середньому протягом одного місяця. При спільному культивуванні в лабораторних умовах штамів V. cholerae з синьо-зеленими та зеленими водоростями відмічене різке зниження рівня токсиноутворення при збереженні вказаного гена.

Рекомендації

1. Проведення досліджень об`єктів довкілля на наявність холерних вібріонів на територіях, які належать до І, ІІ, V та VI кліматичних зон, є недоцільним. На територіях ІІІ та ІV кліматичних зон обґрунтованим є проведення цих досліджень у відкритих водоймищах, які підлягають забрудненню незнезараженими господарсько-фекальними стоками та використовуються в рекреаційних цілях. Кратність досліджень повинна визначатись епідемічною ситуацією. Вважаємо за доцільне для прийняття оперативних заходів щодо запобігання епідемічних ускладнень використовувати показники забруднення водоймищ, що визначаються загальноприйнятими методами бактеріологічного контролю якості води (колі-титр, колі-індекс, загальне мікробне число).

2. Розроблена методика визначення рівня токсиноутворення на культурі клітин HeLa дозволяє підвисити точність, інформативність та чутливість визначення токсигенности штамів холерних вібріонів. Вона забезпечує виявлення змін структури ядра і цитоплазми клітин-мішеней, які характерні для дії холерогену й/або інших цитотоксинів, продукуємих однією бляшкою або колонією досліджуваного штаму холерного вібріону, за відсутності безпосереднього контакту клітин-мішеней з мікробами. Методика може застосовуватися в науково-дослідній практиці.



Перелік робіт, що були опубліковані за темою дисертації

1. Могілевський Л.Я., Лукашевич Н.В., Дронова І.Ю. Організація лабораторного контролю за холерою // Лабораторна діагностика. - 2002. - №2. - С.33-36.

Зроблено аналіз та узагальнення матеріалів щодо лабораторного контролю за холерою та особливостей епідемічного процесу в Україні в період 7-ї пандемії, оформлення роботи.

2. Алексеєнко В.В., Лисенко З.А., Бріт І.С., Петренко О.В., Ралко Н.М., Дронова І.Ю., Лукашевич Н.В., Вишнякова Г.В., Мурашко Е.В., Федорів О.М. Епідеміологія сучасної холери // Сучасні інфекції. - 2000. -№4. - С. 62-64.

Проведено огляд іноземної літератури щодо епідемічного розповсюдження холери у світі, зроблено висновки.

3. Дронова И.Ю., Могилевский Л.Я. Влияние климатогеографических факторов на эпидемический процесс при холере и интенсивность циркуляции V. cholerae в Украине // Вестник морской медицины. - 2002. - №1. - С.80-84.

Зроблено аналіз епідемічного процесу в Україні в період 7-ї пандемії на підставі клімато-географічного районування.

4. Дронова И.Ю. К вопросу об экологических особенностях холерного вибриона // Епідеміологічний нагляд за карантинними і паразитарними захворюваннями та їх профілактика в Україні. Матер. наради-семінару з питань сан. охор. територ. України від заносу і розповсюдження карантинних та інших особливо небезпечних інфекцій. Іллічівськ, 23 - 25 травня 2000 р. - С. 88 - 95.

Проведено огляд вітчизняної та іноземної літератури щодо екології холерних вібріонів, зроблено узагальнення матеріалів та висновки.

5. Дронова И.Ю., Пушкина В.А., Броун И.И., Каракис С.Г. К вопросу взаимодействия холерного вибриона эльтор с зелеными и синезелеными водорослями // Бюлетень інституту сільськогосподарської мікробіології УААН. - 2000. - №7. - С.57-58.

Проведено лабораторні дослідження щодо спільного культивування холерних вібріонів з водоростями, проведено обробку результатів та зроблено висновки.

6. Дронова И.Ю. Значение некоторых экологических факторов в формировании зон эпидемического распространения холеры (обзор литературы) // Сучасні інфекції. - 2000. - №4. - С. 96-99.

На основі огляду та аналізу вітчизняної та іноземної літератури зроблено висновки щодо впливу деяких екологічних особливостей території на формування зон епідемічного розповсюдження холери.

7. Алексеенко В.В., Даниленко И.И., Лысенко З.А., Брит И.С., Вышнякова А.В., Мурашко Е.В., Ралко Н.М., Петренко Е.В., Дронова И.Ю., Альянаки Л.Н. Изучение изменений биологических свойств холерных вибрионов in vivo // Лабораторная диагностика. - 2001. - №2. - С. 30-35.

Підготовлено матеріали з огляду літератури, участь у проведенні лабораторних досліджень.

8. Стопчанская А.Г., Пушкина В.А., Винник В.Д., Алексеенко В.В., Дронова И.Ю., Ковбасюк Е.В. Структурно-функциональные изменения клеток культуры HeLa под воздействием токсических субстанций vct+ и vct- штаммов V. cholerae О1 // Холера и патогенные для человека вибрионы. Мат. проблемной комиссии межведомств. научн. совета по сан.-эпид. охране террит. Российской Федерации. Р.-на-Д., 2001- Вып. 14. - С. 39-41.

Проведення лабораторних досліджень, оформлення роботи.

9. Могілевський Л.Я., Карпова Н.В., Хабло З.А., Дронова І.Ю., Ігнатенко В.А. Організація бактеріологічного обстеження населення в умовах епідемічного розповсюдження холери // Актуальні проблеми мікробіології, епідеміології, паразитології та інфекційних хвороб. Мат. XIII з`їзду Укр. наукового товариства мікробіологів, епідеміологів та паразитологів ім. Д.К. Заболотного. Київ - Вінниця, 9 - 11 жовтня 1996 р. - С. 56.

Проведено статистичну обробку матеріалів санітарно-епідеміологічних установ України щодо виділення холерних вібріонів з об`єктів довкілля у період епідемічних ускладнень з холери.

10. Могилевский Л.Я., Хабло З.А., Лауген Э.А., Дронова И.Ю. Холера Эль-Тор в Украине. // Санитарная охрана территории Украины и профилактика особо опасных инфекций. Мат. научно-практич. конференции, посвящ. 60-летию УкрПЧС. Одесса, 30 - 31 октября 1997 г. - С. 116.

Проведено збір та статистична обробка звітних матеріалів санітарно-епідеміологічних установ України щодо епідемічного прояву холери.

11. Могилевский Л.Я., Хабло З.А., Егорова Е.А., Лауген Э.А., Дронова И.Ю. К вопросу об организации эпиднадзора за холерой в Украине. // Санитарная охрана территории Украины и профилактика особо опасных инфекций. Мат. научно-практич. конференции, посвящ. 60-летию УкрПЧС. Одесса, 30 - 31 октября 1997 г. - С. 126.

Проведено збір матеріалів щодо бактеріологічного обстеження населення та довкілля на холеру у різних регіонах України.

Размещено на Allbest.ru

...