Технология получения иммуноферментных тест-систем

Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

Введение

1. Основная часть

1.1 История открытия, сущность метода, возможность использования и общая характеристика технологии получения

1.2 Разработка ИФА тест-системы для диагностики ЧМЖЖ

1.2.1 Приготовление культурального антигена

1.2.2 Получение вирусоспецифических сывороток

1.2.3 Получение видоспецифических сывороток

1.2.4 Приготовление и контроль конъюгатов

1.2.5 Отработка параметров применения твердофазного ИФА

Заключение

Список использованной литературы

сыворотка иммуноферментный антитело конъюгат

Определения

Антиген - любое вещество, которое организм человека рассматривает как чужеродное или потенциально опасное и против которого начинает вырабатывать собственные антитела.

Антитела - белки сыворотки крови и других биологических жидкостей, которые синтезируются в ответ на введение антигена и обладают способностью специфически взаимодействовать с антигеном, вызвавшим их образование.

Аффинность - сила связывания(степень сродства) между отдельными участками взаимодействующих молекул.

Гипериммунизация - неоднократно повторяющаяся иммунизация организма с целью получить максимально возможный иммунный ответ.

Иммунный ответ - это сложная многокомпонентная, кооперативная реакция иммунной системы организма, индуцированная антигеном и направленная на его элиминацию.

Иммуногенность - способность антигенов индуцировать иммунный ответ.

Комплемент (система комплемента) - группа глобулярных белков сыворотки крови животных и человека, представляющих собой часть иммунной системы организма.

Коньюгат - искусственно синтезированная (химически или путем рекомбинации in vitro) гибридная молекула, в которой соединены (объединены) две молекулы с разными свойствами

Лиганды - нейтральные молекулы, ионы или радикалы, связанные с центральным атомом комплексного соединения.

Титр - максимальное или оптимальное разведение антигенов, антител или комплемента, при котором возможны регистрация положительной реакции между антигенами и антителами или стандартизация реакции по одному или обоим компонентам.

Эпитоп, или антигенная детерминанта -- часть макромолекулы антигена, которая распознаётся иммунной системой.

Обозначения и сокращения

В настоящей курсовой работе используются следующие обозначения и сокращения:

АБТС	2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновая кислота)
Аг	Антиген
Ат	Антитело
БСА	Бычий сывороточный альбумин
ЕД/мг	Единица действия на миллиграмм
ИФА	Иммуноферментный анализ
КББ	Карбонатно-бикарбонатный буфер
КЛО	Катаральная лихорадка овец
КЭО	Контагиозная эктима овец
Мкл.	Микролитр
Мл.	Миллилитр
М.	Моль
Нм.	Нанометр
С.	Секунда
РДП	Реакция диффузной преципитации
ФБС	Фосфатно-буферный солевой раствор
ЧМЖЖ	Чума мелких жвачных животных
PH	Водородный показатель

Введение

Иммуноферментный анализ является одним из наиболее активно развивающихся направлений химической энзимологии. Это обусловлено тем, что в ИФА уникальная специфичность иммунохимического анализа сочетается с высокой чувствительностью детекции ферментативной метки. В патентной и научной литературе появляется все больше сведений о рекордных пределах обнаружения веществ данным методом (вплоть до 10^-21 молей в образце). Высокие результаты достигаются благодаря использованию неограниченных возможностей ферментов -- биокатализаторов, которые позволяют создавать каскадные системы усиления различных химических сигналов.

Высокая стабильность реагентов, простота методов регистрации и многие другие достоинства метода ИФА способствовали его широкому внедрению в различные области медицины, сельское хозяйство, биологическую промышленность, охрану окружающей среды, а также в научные исследования [1].

Целью данной работы является характеристика технологии получения иммуноферментных тест-систем с использованием поликлональных антител.

Для достижения данной цели необходимо выполнить следующие задачи:

1. Дать описание метода иммуноферментного анализа.

2. Охарактеризовать общую технологическую схему получения ИФА-диагностикумов.

3. Рассмотреть технологию получения иммуноферментной тест-системы на конкретном примере.

1. Основная часть

1.1 История открытия, сущность метода, возможность использования и общая характеристика технологии получения

Метод иммуноферментного анализа был предложен в начале 70-х годов тремя независимыми группами исследователей: Engvall и Perlmann в Швеции, van Weemen и Schuur в Нидерландах и Rubenstein с сотрудниками в США [2, 6].

В середине 60-х годов для идентификации и локализации антигенов в гистохимических препаратах и выявления полос преципитации в иммунодиффузионных и иммуноэлектрофоретических методах в качестве высокочувствительной метки было предложено использовать молекулы ферментов. Являясь мощными химическими катализаторами, ферменты способны эффективно осуществлять наработку легко детектируемого продукта, что делает возможным определение ферментной метки в весьма малых концентрациях. На протяжении последних двух десятилетий иммуноферментные методы анализа интенсивно развивались как в теоретическом, так и практическом плане и к настоящему времени они сформировались в самостоятельное научное направление, имеющее важное прикладное значение. Использование твердых носителей для сорбционной или ковалентной иммобилизации антител с последующим специфическим связыванием анализируемого соединения на иммуносорбенте и выявлением образовавшихся иммунокомплексов с помощью меченных ферментами компонентов положило начало методам твердофазного (гетерогенного) иммуноферментного анализа (E. Engvall and P. Perlmann, 1971; B. K van Weemen and A. Schuurs, 1971).

Эти методы наиболее распространенные и используются для определения широкого круга как низкомолекулярных, так и высокомолекулярных соединений - антител, пептидов, вирусных и бактериальных антигенов, фармакологических препаратов.

Особую значимость для широкого внедрения твердофазного иммуноферментного анализа в практику имела разработка в качестве носителей для сорбционной иммобилизации антител и антигенов специальных полистирольных плат, содержащих 96 лунок. Факт сорбции антител на поверхности полистирола был установлен в середине 60-х годов и использован первоначально в методах радиоиммунологического анализа. Внедрение в практику иммуноферментного анализа полистирольных плат позволило упростить методическую процедуру его выполнения. Были сконструированы специальные приборы, позволяющие автоматизировать стадии добавления реагентов, промывки и осуществлять одновременную регистрацию каталитической активности фермента-метки в каждой из лунок платы [1].

Метод ИФА находится в постоянном развитии. С одной стороны, расширяется число объектов исследования, с другой - углубляются и совершенствуются методы самого анализа. Это приводит к тому, что упрощается схема анализа, сокращается время его проведения, уменьшается расход реагентов. Идет постоянный поиск все новых и новых веществ, используемых в качестве маркеров. Все возрастающее влияние на ИФА оказывают химия высокомолекулярных соединений, клеточная и генная инженерия, под влиянием которых меняются технологии получения реагентов для ИФА.

Первичным процессом в иммуноферментном (или иммунохимическом) анализе является стадия «узнавания» анализируемого соединения специфическим к нему антителом. Так как процесс образования иммунохимических комплексов происходит в строго количественном соотношении, обусловленном аффинностью, концентрациями компонентов и условиями реакции, то достаточным для определения исходной концентрации анализируемого соединения является количественная оценка образовавшихся иммунных комплексов. Для такой оценки возможно либо прямое определение концентрации образующихся иммунокомплексов (тип 1), либо количественная оценка оставшихся свободными мест специфического связывания (тип 2) (Рисунок 1).

Рисунок 1 Количественная оценка образовавшихся иммунных комплексов

Второй общей стадией любого метода иммуноферментного анализа является формирование связи меченного ферментом соединения со специфическим комплексом или свободными центрами связывания. И наконец, заключительным обязательным процессом в иммуноферментном анализе является трансформация ферментной метки в соответствующий сигнал, измеряемый каким-либо физико-химическим методом (спектрофотометрическим, флуориметрическим, люминесцентным и т.д.), что достигается путем измерения скорости превращения субстрата или количества продукта, образующегося за фиксированный промежуток времени.

Принимая во внимание вышеописанные подходы для определения специфических комплексов, дальнейшую классификацию методов иммуноферментного анализа, можно осуществить по типу реагентов, используемых на первой стадии анализа. Если на первой стадии в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические антитела), то метод является неконкурентным. Для неконкурентного анализа типа 1 оптимальным является соотношение компонентов, при котором концентрация центров связывания значительно превышает концентрацию определяемого соединения.

Необходимым условием для неконкурентного анализа типа 2 является соблюдение соотношения избытка или сравнимой концентрации определяемого соединения (антигена) и мест специфического связывания, так как в этом случае определяется разность общего числа мест связывания и числа образовавшихся иммунных комплексов. Если на первой стадии анализа в системе одновременно присутствуют анализируемое соединение и его аналог (меченное ферментом анализируемое соединение или анализируемое соединение, иммобилизованное на твердой фазе), конкурирующие за имеющиеся в относительном недостатке центры специфического связывания, то метод является конкурентным. Необходимым условием конкурентного метода является недостаток центров специфического связывания по отношению к суммарной концентрации анализируемого соединения и его аналога.

Следующим принципом классификации методов иммуноферментного анализа является их разделение по типу проводимых на каждой из иммунохимических стадий реакций. В соответствии с этим все методы можно разделить на две группы - гомогенные и гетерогенные.

Гетерогенные методы иммуноферментного анализа. Гетерогенный иммуноферментный анализ объединяет методы, в которых анализ проводится в двухфазной системе, при этом разделение на фазы может происходить на любой стадии определения. В целях удобства классификации целесообразно проводить разделение гетерогенных методов по характеру проведения первой стадии «узнавания», которая является определяющей для всего анализа. Если на первой стадии антиген или антитело используют в иммобилизованном состоянии и формирование специфического иммунокомплекса проходит на твердой фазе, то метод относится к твердофазным (англ. solid phase assay).

Если же на первой стадии анализа образование специфических иммунных комплексов происходит в растворе, а лишь затем для целей разделения используют твердую фазу с иммобилизованным реагентом, то такие методы целесообразно классифицировать как гомогенно-гетерогенные.

Многообразие методов гетерогенного иммуноферментного анализа, относящихся к типам 1 и 2, обусловлено возможностью введения ферментной метки как в молекулу антигена, так и молекулу антитела. Кроме того, для конкретной схемы анализа определяющим является, какой из реагентов - антитело или антиген, использован в иммобилизованном виде для разделения иммунохимических комплексов от несвязавшихся компонентов.

В качестве примера гетерогенного неконкурентного метода проведения иммуноферментного анализа приведем одну из самых распространенных схем(Рисунок 2) иммуноферментного анализа белков (поливалентных антигенов), основанную на использовании пары антител различной антигенной специфичности, одно из которых иммобилизовано на поверхности твердого носителя, а второе конъюгировано с ферментной меткой (например, пероксидазой хрена). Анализ проводят следующим образом: в лунки полистирольного планшета с сорбированными антителами вносят анализируемый образец, инкубируют в течение 1 часа, при этом анализируемый антиген вступает в реакцию с антителами и образует иммунокомплекс на поверхности лунок. Планшет отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом антитела.

После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена. На стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченых антител, что послужило поводом для широкого распространения в литературе названия «сэндвич»-метод (англ. sandwich). Часто в литературе встречается и другое название двуцентровой метод (англ. two-site assay). Схема может быть использована для анализа только тех антигенов, на поверхности которых существуют, по крайней мере две расположенные далеко друг от друга антигенные детерминанты, а для определения большого числа моновалентных антигенов (например, низкомолекулярные гормоны, лекарственные соединения, пестициды) метод неприемлем.

Рисунок 2 Схема «сэндвич»-метода

Конкурентный твердофазный анализ низкомолекулярных антигенов может быть реализован по следующей схеме(Рисунок 3): к иммобилизованным на носителе антителам добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген и фиксированную концентрацию конъюгата антигена с ферментом. После проведения инкубации носитель отмывают от несвязавшихся свободного и меченого антигена и регистрируют ферментативную активность на носителе, которая обратно пропорциональна концентрации определяемого антигена.

Рисунок 3 Схема конкурентного гетерогенного ИФА

Конкурентные твердофазные методы обладают меньшей чувствительностью по сравнению с неконкурентными. Предел обнаружения различных соединений для них ограничен как чувствительностью регистрации ферментной метки, так и аффинностью антител, в то время, как для неконкурентных методов, при отсутствии неспецифических взаимодействий, - только чувствительностью определения фермента. Поэтому для достижения высокой чувствительности анализа конкурентным методом необходимо использовать высокоаффинные антитела.

Гомогенные методы иммуноферментного анализа. К гомогенным относятся методы, осуществляемые в однофазной системе, и не требующие стадии механического разделения образовавшихся комплексов. Во всех схемах проведения гомогенного иммуноферментного анализа регистрируется концентрация не образующегося специфического комплекса антитело-антиген, а оставшихся свободными центров специфического связывания. Однако, в противоположность гетерогенным схемам, наблюдаемая ферментативная активность, соответствующая концентрации незанятых мест специфического связывания, может как уменьшаться, так и увеличиваться, что обусловлено различной природой воздействия связывания лигандов на ферментативную активность. Введение метки в молекулу антигена является одним из наиболее распространенных подходов в гомогенных методах иммуноферментного анализа. Все гомогенные методы относятся к конкурентным и основаны на одновременном взаимодействии с антителами анализируемого и меченого антигенов. После образования в растворе соответствующего иммунохимического комплекса проводят измерение ферментативной активности, которая пропорциональна концентрации свободного или связанного меченого лиганда.

Одним из распространенных методов является EMIT-анализ (enzyme multiplied immunoassay technique), основанный на изменении активности ферментной метки в конъюгате фермент-антиген при образовании комплекса с антителами, происходящем в результате конформационных перестроек в молекуле фермента или стерическом исключении доступности молекулы субстрата к активному центру фермента при комплексообразовании конъюгата с антителами (Рисунок 4).

Рисунок 4 Схема EMIT-анализа

На основе EMIT-анализа разработаны коммерческие наборы для определения широкого круга лекарственных соединений в сыворотке крови - дигоксина, теофиллина, метотрексата, тиобрамицина и др. Для анализа обычно требуется менее 50 мкл крови, время определения 15-45 с.

Достоинствами гомогенных методов является значительное сокращение времени проведения анализа (несколько минут), недостатками - меньшая чувствительность и возможность влияния состава анализируемого образца на результаты анализа [1, 10].

Применение ИФА. Чувствительность ИФА такова, что определение веществ в концентрациях 10^-9-10^-12 М, белка в микрограммах-нанограммах в 1 мл - это обыденное дело. Подобно тому, как глаз человека регистрирует одиночный световой квант, ИФА можно усовершенствовать так, что он с помощью каскадных систем усиления позволит обнаруживать одиночные молекулы анализируемого вещества.

Возможности увеличения чувствительности ограничиваются фоном анализируемого соединения (то есть его наличием не только в анализируемом образце, но и в используемых реактивах и растворителях), субстратной специфичностью фермента и аффинностью антител. К ограничениям ИФА относится также наличие в тестируемых образцах кофакторов, ингибиторов и стимуляторов активности ферментов. Еще один недостаток - ИФА не позволяет различать нативные белки и их биологически неактивные фрагменты, сохранившие антигенные детерминанты. Помехой для ИФА может быть изменение каталитической активности фермента при его конъюгировании с антигеном. Ограничением ИФА является его применимость лишь к хорошо изученным системам, где есть очищенные антигены и высокоспецифические антитела.

Высокая чувствительность в сочетании с быстротой анализа (от нескольких минут до нескольких часов), возможностью одновременного тестирования большого количества образцов и отсутствием особой необходимости предварительных операций по очистке и концентрированию анализируемого соединения в образце придают ИФА неоспоримые преимущества перед другими аналитическими методами. Поэтому сегодня ИФА находит широкое применение в здравоохранении, различных областях сельского хозяйства, промышленной биотехнологии, природоохранной деятельности и научно-исследовательской работе [3, 6, 10].

Таблица 1

Применение ИФА в медико-биологических исследованиях

Как можно видеть из таблицы 1, в настоящее время ИФА применяется для диагностики возбудителей гепатита А и В, вируса простого герпеса, бруцелл, сальмонелл, трепонем, трихинелл, филярий; определять наличие в крови таких сывороточных белков, как ферритин, фибронектин, гаптоглобин, иммуноглобулинов класса А, Е, G, M; определять наличие гормонов кортизона, инсулина, эстрогенов, прогестерона, тестостерона, ренина, тироксина и многих других соединений.

Любое заболевание человека и животных можно быстро и точно диагностировать путем идентификации возбудителя, его отдельных антигенных компонентов, антител к этим компонентам или веществ, не свойственных здоровому организму и синтезируемых при его патологических состояниях (рак, сердечно-сосудистые и эндокринные заболевания). Диспансеризация населения, эпидемиологические обследования, выявление отравлений, наличия наркотиков в крови, определение содержания лекарственных соединений в тканях, вирусные заболевания растений, определение антибиотиков, витаминов и других биологически активных соединений при отборе активных штаммов-продуцентов в промышленной биотехнологии, контроль за качеством медицинских препаратов из донорской крови на отсутствие вирусов-возбудителей СПИДа и гепатита B - это лишь небольшой перечень практического применения ИФА. Современные фундаментальные исследования в биохимии, клеточной физиологии и иммунологии, микробиологии, вирусологии, онкологии трудно представить без ИФА [3].

Таблица 2

Общая характеристика технологии получения иммуноферментных тест-систем

Получение антигена
Иммунизация
Получение антисывороток
Выделение и очистка антител
Оптимизация параметров ИФА
Разработка НТД

Таким образом, технология получения иммуноферментных тест-систем включает в себя выделение антигенных фракций, изучение их структуры, физико-химических и иммунобиологических свойств, которые определяют специфичность конкретного антигена; иммунизацию животных полученным антигеном; очистку полученных антител для увеличения чувствительности и специфичности анализа; тестирование антисывороток для подбора оптимальных параметров проведения анализа; разработка и оформление нормативно-технических документов (Таблица 2).

1.2 Разработка ИФА-тест системы для диагностики и мониторинга чумы мелких жвачных животных

1.2.1 Приготовление культурального антигена для ИФА при ЧМЖЖ и гипериммунизации животных

Антиген для серологических реакций и гипериммунизации животных должен обладать достаточной активностью, быть безвредным, удобным в применении и длительно сохраняться.

В связи с необходимостью приготовления единого набора для диагностики ЧМЖЖ методом ИФА были отработаны способы приготовления комплексного культурального антигена. Эти исследования проводились с использованием вакцинного штамма «G-45» и эпизоотического штамма вируса ЧМЖЖ «Темурмалик».

Из штаммов вируса ЧМЖЖ «G-45» и «Темурмалик» наиболее активным в культурах с последующим определением их биологической активности клеток оказался эпизоотический штамм «Темурмалик». Указанный штамм «Темурмалик» и культура клеток в последующем были использованы для приготовления комплексных антигенов для серологических тест-систем, а также при получении вирусоспецифических сывороток при ЧМЖЖ.

По результатам опыта наиболее активные антигены были получены из клеточной фракции, сконцентрированной в 100 раз с последующим термолизисом клеток, активность которых составляет в РДП 1:32. Антигены, приготовленные другими способами, проявляли слабую активность в РДП или давали отрицательный результат.

В дальнейшем приготовленный культуральный антиген использовался при отработке условий постановки ИФА для выявления антигена и антител к вирусу ЧМЖЖ [4].

1.2.2 Получение вирусоспецифических сывороток

Адъюванты -- это вещества, усиливающие иммунный ответ при введении одновременно с иммуногеном. Таким образом, они отличаются от иммуномодуляторов тем, что применяются для усиления конкретного иммунного ответа (например, при вакцинации) чаще всего в здоровом организме, а не для нормализации измененной иммунной реактивности, что служит основным показанием для использования иммуномодуляторов. Адъюванты широко используются также в лабораторной практике для усиления выработки антител при иммунизации животных, в частности в процессе получения гибридом.

В настоящее время широко применяются такие адъюванты, как неполный и полный адъюванты Фрейнда, иммуностимуляторный комплекс, алюминиевые квасцы, иногда с сорбированными Bordetella pertussis(Таблица 4).

Таблица 4

Наиболее широко применяемые адъюванты, принцип их действия

В реализации действия большинства из них решающую роль играет формирование депо, замедляющего рассасывание антигена и пролонгирующего его влияние. Способность формировать депо достигается в результате сорбции антигена на квасцах или включения его в жировую эмульсию. Наиболее сильные адъюванты содержат в качестве компонента микроорганизмы или извлеченные из них субстанции, назначение которых состоит в мобилизации первой линии защиты, активации макрофагов. Однако действие адъювантов на дальнейший ход иммунных процессов может существенно различаться [5, 7, 8].

В качестве антигена для гипериммунизации овец и коз использовали культуральный концентрированный антиген вируса чумы мелких жвачных животных из штамма «Темурмалик», 20%-ную органо-тканевую вируссодержащую суспензию из органов больных чумой мелкого рогатого скота, культуральную вируссодержащую суспензию вируса ЧМЖЖ.

До начала цикла гипериммунизации животных иммунизировали вакцинным штаммом «G-45» вируса ЧМЖЖ. В результате активность полученных сывороток в РДП составила 1:32, причем отрицательный результат получен с нормальным антигеном. Это показывает их невысокую специфичность.

Анализируя вышеизложенное можно заключить, что оптимальной схемой для иммунизации овец и коз является 5-кратное введение культурального антигена в возрастающей дозе 1; 3; 5; 10; 10 см³ в комплексе с равным объемом полного адъюванта Фрейнда с недельным интервалом.

1.2.3 Получение видоспецифических сывороток

Для титрования в ИФА сывороток от переболевших и вакцинированных против ЧМЖЖ животных необходим антивидовой(против глобулинов мелкого рогатого скота) иммунопероксидазный конъюгат. Таким образом, следующим шагом была отработка оптимальных схем гипериммунизации доноров видоспецифических антител (кроликов) препаратами сывороточного гаммаглобулина мелкого рогатого скота.

В качестве антигена для иммунизации кроликов использовали антиген, выделенный по методу Конам.

За неделю до начала цикла гипериммунизации подколенные лимфатические узлы кроликов сенсибилизировали неполным адъювантом Фрейнда в дозе 1 см³ на каждого кролика.

Динамику накопления титра антител в полученных сыворотках контролировали в РДП. Результаты проведенных опытов по получению антивидовых сывороток на кроликах показывают, что антивидовые сыворотки, полученные по 3 схеме, обладали высокой преципитирующей активностью от 3,63/0,12 до 4,62/0,13 log₂. Первая и вторая схемы гипериммунизации оказались малоэффективными, титры антител в сыворотках не превышали их разведения 1:3. В связи с этим третья схема была рекомендована для получения антивидовых сывороток [4].

1.2.4 Приготовление и контроль иммунопероксидазных конъюгатов для ИФА при ЧМЖЖ

Как известно, наиболее важным фактором, влияющим на чувствительность, специфичность и воспроизводимость ИФА, является качество используемых конъюгатов. В свою очередь качество конъюгатов находится в прямой зависимости от качества (чистоты, активности и специфичности) используемых для конъюгации иммуноглобулинов и антител. В связи с этим, первым этапом исследований в этом направлении была отработка условий выделения и очистки активных и специфичных иммуноглобулинов и антител из специфических и антивидовых сывороток.

Гамма-глобулиновые фракции из вирусоспецифических сывороток мелкого рогатого скота выделяли различными методами:

– Ступенчатым осаждением альбумина и иммунных глобулинов, различными концентрациями этилового спирта по методу Кона;

– Трехкратным осаждением общей глобулиновой фракции насыщенным раствором сульфата аммония при 40%, 35 % и 33% степени насыщения раствора по общепринятой методике;

– Осаждением гамма-глобулина из сыворотки крови спиртово-хлороформным методом.

Для оценки качества полученных иммуноглобулинов последние параллельно с исходными сыворотками исследовали на активность и специфичность в РДП и ИФА.

В процессе работы из выделенных специфических иммуноглобулинов наиболее активным и специфичным оказались иммуноглобулины, полученные с помощью спиртового осаждения по Кону. Осаждение иммуноглобулинов спиртово-хлороформным методом и трехкратное переосаждение общей фракции глобулинов с помощью насыщенного раствора (NH₄)2SO₄ позволяли получить иммуноглобулины с достаточно высокой активностью в РДП и ИФА, но приготовленные в дальнейшем на их основе конъюгаты давали значительное неспецифическое фоновое окрашивание, в то время как конъюгаты, приготовленные на основе иммуноглобулинов, выделенных по методу Кона были достаточно специфичными в ИФА.

Следующим этапом исследований для выделения и очистки антивидовых антител были испытаны методы:

– спиртовое осаждение гаммаглобулина по Кону;

– аффинная очистка антител по методу S.Avrameas и T.Ternynck.

Методом Кона было выделено 5 серий антивидового гаммаглобулина, преципитирующая активность приготовленных иммуноглобулинов была 1:8-1:16. Иммунопероксидазные конъюгаты, приготовленные на их основе, имели предельные титры в ИФА 1:800-1:1600 и соответственно рабочие 1:200-1:400, однако были неспецифичны до разведения 1:100-1:200, да и в своем рабочем разведении вызывали неспецифическое фоновое окрашивание при исследовании нормальных сывороток. По этому с целью повышения специфичности ИФА в дальнейших наших исследованиях был испытан метод аффинного выделения антивидовых антител на белково-глютаральдегидном иммуносорбенте. Результаты исследования доказывают, что аффинно-очищенные антитела, выделенные указанной методике, имеют высокую иммунологическую активность в РДП. В дальнейшем на основе препаратов аффинно-очищенных антивидовых антител были приготовлены иммунопероксидазные конъюгаты для ИФА. Конъюгаты обладали достаточной специфичностью и позволили выявлять антитела к вирусу ЧМЖЖ, начиная в цельном виде и с разведения сыворотки 1:10.

Таким образом, в результате проведенных исследований были подобраны оптимальные условия выделения и очистки активных и специфичных препаратов вирусоспецифических и антивидовых антител. Это позволило перейти к отработке методов конъюгации приготовленных глобулинов и антител с пероксидазой хрена.

По данным литературы наиболее эффективными методами конъюгации антител с пероксидазой хрена признаны периодатные (P.K. Nakane и A. Kawaoi; M.B. Wilson и P.K. Nakane). Исходя из этого, они были испытаны для приготовления вирусоспецифических и антивидовых конъюгатов, пригодных для ИФА при ЧМЖЖ. С применением метода P.K. Nakane и A. Kawaoi было приготовлено 4 микросерии вирусоспецифического и 3 микросерии антивидового конъюгата, методом M.B.Wilson и P.K. Nakane - 6 микросерий вирусоспецифического и 4 микросерии антивидового конъюгата. Для конъюгации использовали в основном пероксидазу хрена с Rz Степень чистоты препаратов пероксидазы характеризуется величиной RZ(Reinheitszahl), которая соответствует отношению оптических плотностей при л =403 и 275 нм. = 2,6- 3,4 и активностью по белку 650-1400 ЕД/мг. Приготовленные конъюгаты очищали от несвязавшихся реагентов методом гельфильтрации через сефадекс G-200.

Активность и специфичность приготовленных серий вирусоспецифического и антивидового конъюгатов проверяли методом их шахматного титрования в прямом и непрямом вариантах ИФА соответственно.

Таким образом, в результате проведенных исследований по приготовлению активных и специфичных иммунопероксидазных конъюгатов было установлено, что из испытанных двух периодатных методов конъюгации антител с пероксидазой хрена лучшим оказался метод M.B.Wilson и P.K. Nakane. Данный метод конъюгации позволил получить активные и специфичные иммунопероксидазные конъюгаты с титром в ИФА 1:400-1:1600, которые были активнее в 4 раза [4, 9].

1.2.5 Отработка параметров применения твердофазного ИФА для выявления специфического антигена вируса ЧМЖЖ

С целью оптимизации условий постановки прямого «Сэндвич»-варианта ИФА были проведены исследования по определению оптимальной (для сенсибилизации твердой фазы) концентрации вирусоспецифического гаммаглобулина и рабочей дозы иммунопероксидазного конъюгата, а также изучено влияние различных условий постановки ИФА на его чувствительность.

Определение оптимальной концентрации вирусоспецифических гамма-глобулинов. Определение оптимальной дозы специфических гамма-глобулинов осуществляли методом их шахматного титрования со специфическим и нормальным культуральными антигенами в «Сэндвич»-варианте ИФА. В качестве твердой фазы использовали полистироловые плоскодонные планшеты с 96 лунками. Гамма-глобулины испытывали в разведениях 1:250-1:25600, которые растворяли в 0,1М карбонатно-бикарбонатном буфере (КББ) рН 9,5. Для сенсибилизации планшетов были испытаны все варианты полученных гамма-глобулинов. Испытанные концентрации гамма-глобулинов, имеющих активность в РДП с 1:8 до 1:16, дают положительную реакцию в ИФА со специфическими антигенами, при отрицательной реакции с нормальным антигеном.

Оптимальная концентрация гамма-глобулина, которая позволяет выявить специфический культуральный антиген в его предельном титре, составляет для разных серий гамма-глобулина от 1:16000. В дальнейшей работе для сенсибилизации лунок планшетов использовали стократный оптимальный титр гамма-глобулина 1:160. Сенсибилизированные специфическим иммуноглобулином планшеты обрабатывали 1,0% раствором БСА в буферном растворе для ИФА в течение 1 часа при (37-38)°С, внося его в лунки по 200 мкл.

Определение рабочего разведения вирусоспецифического иммунопероксидазного конъюгата. Вирусоспецифические иммунопероксидазные конъюгаты предварительно титровали в «Сэндвич»-варианте ИФА со стандартным (нормальным и специфическим) культуральными антигенами. Предельным титром каждой серии конъюгата считали максимальное его разведение, которое способно выявить специфический антиген при отрицательном результате с нормальным антигеном. За оптимальное рабочее разведение конъюгата принимали его восьмикратный предельный титр.

Отработка оптимальных условий постановки ИФА («Сэндвич»-вариант). Для того чтобы получить стабильные результаты в ИФА, необходимо предварительно отработать оптимальные условия постановки этого метода, то есть выбрать оптимальные буферные растворы для разбавления компонентов реакции, время и температурный режим их взаимодействия с твердой фазой. Отработку оптимальных условий постановки «Сэндвич»-варианта ИФА проводили поэтапно. На первом этапе отрабатывали оптимальные условия сенсибилизации твердой фазы вирусоспецифическими иммуноглобулинами, взятыми в рабочей концентрации на 0,1М КББ рН 9,6. При этом контакт специфического антигена, взятого в разведении 1:100, а затем конъюгата (1:50) с твердой фазой длился в течение 240 и 90 минут соответственно при температуре 37°С. После сенсибилизации планшетов иммуноглобулинами проводилась забивка активных центров твердой фазы 1% раствором БСА. В процессе постановки ИФА было установлено, что 1% концентрация БСА является наиболее оптимальной, инкубация планшетов с раствором БСА в течение 60 минут при 37°С полностью снимает неспецифическое фоновое окрашивание в контрольных рядах при сохранении чувствительности метода.

На втором этапе отрабатывали оптимальные условия взаимодействия антигенов с иммуносорбентом (специфические гаммаглобулины, закрепленные на твердой фазе). При этом было выяснено, что применение для разбавления антигенов ФБС (0,1М, 0,01М) или физиологического раствора с добавлением в них 0,1% твин-80 дает практически одинаковую чувствительность и специфичность метода ИФА.

Опытным путем доказано, что наивысшей чувствительностью «Сэндвич»-ИФА обладает при контакте антигена с твердой фазой в течение 4 часа при 37°С, дальнейшее увеличение времени контакта не приводит к существенному повышению титра антигена. Такие же результаты получены при инкубации антигена с твердой фазой в течение 18 часов при 4°С.

В связи с этим, в дальнейшей работе антигены инкубировали с планшетом в течение 4 часов при 37°С или в течение 18 часов при 4°С.

Также доказано, что наивысшее значение оптической плотности специфического антигена достигается, при инкубации конъюгата с антигеном в течение 60 минут при 37°С. Дальнейшее увеличение времени контакта конъюгата с антигеном не приводит к существенному повышению чувствительности ИФА.

Опытным путем также установлено, что оптимальным режимом инкубации субстратов пероксидазы (АБТС) с конъюгатом для слабоположительных проб является 60 минут, а для проб с большим содержанием антигена (обычно концентрированный культуральный антиген) достаточно 30 минут контакта субстрата с конъюгатом при комнатной температуре.

Учет результатов реакции проводили на спектрофотометре марки «Multiskan Plus» при длине волны 405 нм (для АБТС).

Результат считали положительным, если оптическая плотность испытуемого антигена в 2 и более раз превышала оптическую плотность контрольного нормального антигена. Оптическая плотность положительных проб должна быть не ниже 0,15.

Эффективность применения метода твердофазного ИФА для выявления и идентификации специфического антигена вируса ЧМЖЖ. Постановку «Сэндвич»-варианта ИФА осуществляли в полистироловых плоскодонных планшетах с 96 лунками по отработанной ранее методике. Испытуемые образцы слабых в антигенном отношении 10-20% суспензий из тканевых материалов и суспензий зараженных культур клеток исследовали в ИФА в цельном виде и в последовательных двукратных разведениях до 1:2048. Контролями реакции служили: пробы патматериала взятые от клинически здоровых животных, суспензии неинфицированных культур клеток, а также стандартные специфические и нормальные культуральные антигены при ЧМЖЖ.

Таблица 4

Результаты оценки чувствительности ИФА

Из данных таблицы 4 видно, что «Сэндвич»-вариант ИФА позволяет выявлять антиген вируса ЧМЖЖ практически во всех исследованных пробах. В максимальных титрах антиген выявляется в пробах органах больных вирусом ЧМЖЖ 20%-ая суспензия органо-тканевого материала мелкого рогатого скота. Титрование в ИФА специфических культуральных антигенов при ЧМЖЖ показало, что их активность составила 1:5381,65/142,82-1:11245,69/672,38. Испытанные пробы органов от здоровых животных, нормальные культуральные антигены показали отрицательные результаты в ИФА, что говорит о высокой чувствительности данного метода.

В дальнейшем были проведены исследования по проверке специфичности ИФА с набором гомологичных и гетерологичных препаратов. Все испытанные пробы неинфицированные культуральные суспензии в цельном виде, концентрированные нормальные культуральные антигены, а также гетерологичные антигены при оспы овец, КЭО и КЛО показали отрицательный результат в ИФА, начиная с разведения 1:10. При этом культуральные вирусоспецифические и концентрированные антигены ЧМЖЖ давали положительные результаты в ИФА. Активность концентрированных антигенов вируса ЧМЖЖ составляла в ИФА-13,99/ 0,29 log₂.

Отработка оптимальных условий постановки твердофазного метода ИФА для выявления антител при ЧМЖЖ. Для диагностики ЧМЖЖ большое значение имеет серологический анализ. Применение РДП, РСК и РН для оценки сывороток от вакцинированных, переболевших и гипериммунизированных животных требует больших затрат времени и культур клеток. ИФА в этом плане является экспрессной реакцией (4-6 часов) и более чувствительной, титры антител в ИФА в 100-1000 раз выше титров в РСК и РДП и сравнимы или превосходят титры в РН. В связи с этим нами были проведены исследования по разработке и применению непрямого варианта ИФА для титрования вирусоспецифических антител в сравнении с другими серологическими реакциями.

Для отработки оптимальных условий постановки непрямого варианта ИФА необходимо подобрать оптимальные концентрации компонентов реакции, время и температуру их инкубации с твердой фазой, а также определить возможность применения этого варианта ИФА для титрования антисывороток с целью диагностики ЧМЖЖ и оценки поствакцинального иммунитета.

На первом этапе разработки непрямого варианта ИФА был проведен подбор оптимальной рабочей концентрации специфического культурального антигена для сенсибилизации планшетов.

Как известно, очень высокая концентрация антигена, используемого для сенсибилизации планшетов, приводит к неспецифическим результатам, а слишком низкая - к понижению чувствительности ИФА. Поэтому для каждой серии специфического культурального антигена необходимо определить оптимальную рабочую дозу. Для этого перед использованием каждую серию антигена предварительно титровали методом шахматного титрования со специфической и нормальной сыворотками в ИФА, конъюгат при этом использовали в рабочем разведении. Рабочей дозой каждого из испытанных антигенов считали его удвоенное разведение, в котором он максимально связывается с антителами специфической сыворотки в ее наивысшем разведении. Для сенсибилизации планшетов было испытано 10 серий специфического культурального антигена. Для обоих вариантов ИФА оптимальной рабочей дозой испытанных специфических антигенов явились их разведения, начиная с 1:50 до 1:200.

Для ресуспендирования антигенов в непрямом варианте ИФА испытывали растворы: 0,01М ФБС с рН 7,2-7,4; 0,15М NaCl с рН 6,8-7,2, а также раствор, состоящий из 0,1М КББ с рН 9,6. Существенного различия в чувствительности ИФА при применении этих буферных растворов для разбавления антигенов не замечено, поэтому в дальнейшей работе мы использовали КББ, так как он применяется для разбавления вирусоспецифического гамма-глобулина в «Сэндвич»-варианте ИФА.

Определение наиболее оптимального режима постановки непрямого варианта ИФА для титрования антител проводили поэтапно с применением диагностических антигенов и сывороток.

На первом этапе были испытаны разные временные и температурные условия инкубации антигена с лунками планшета: 1, 2, 3 часа при 37°С и 18-24 часа при 4°С.

Опытным путем установлено, что существенное увеличение оптической плотности сыворотки достигается при инкубации антигена с планшетом в течение 2 часов при 37°С, дальнейшее увеличение времени инкубации антигена не приводит к увеличению оптической плотности сыворотки. Таким образом, было установлено, что специфические культуральные антигены имеют оптимальную рабочую дозу (для сенсибилизации лунок планшета) 1:50 - 1:200, их достаточно инкубировать в течение 2 часов при 37°С или 18 часов при 4°С.

Оптимальный режим взаимодействия специфических и нормальных сывороток со специфическим культуральным антигеном определяли путем инкубирования их с лунками планшета от 15 минут до 2 часов при 37°С, время инкубирования с конъюгатом составило 60 минут при 37°С.

В процессе опыта было установлено, что чувствительность реакции возрастает в течение 1,0 часа при инкубации сывороток с антигеном. Дальнейшее увеличение времени контакта сывороток с антигеном не приводит к ощутимому повышению чувствительности непрямого ИФА.

В следующей серии опытов были отработаны оптимальные условия инкубации антивидового конъюгата с сыворотками. При этом время контакта сывороток с антигеном было постоянным и составило 1,5 часа при 37°С, а время контакта конъюгата изменялось от 20 минут до 1,5 часа при 37°С.

Более высокая чувствительность ИФА отмечена при контакте конъюгата с сыворотками в течение 50-60 минут при температуре 37°С. Поэтому в дальнейших опытах при титровании вирусоспецифических антител в непрямом варианте ИФА контакт антивидового конъюгата с испытуемыми и контрольными сыворотками проводили в течение 50-60 минут при 37°С.

Опытным путем было установлено, что оптимальное время взаимодействия рабочего раствора субстрата пероксидазы хрена (АБТС) с конъюгатом составляет 15-30 минут при комнатной температуре.

Учет результатов непрямого варианта ИФА проводили на спектрофотометре марки «Multiskan Plus» при длине волны 405 нм (для АБТС) по отношению оптической плотности испытуемой сыворотки к оптической плотности нормальной сыворотки.

Результат считали положительным, если оптическая плотность испытуемой сыворотки в 2 и более раза превышала оптическую плотность нормальной сыворотки. Оптическая плотность положительных проб должна быть не ниже 0,15.

Изучение специфичности, чувствительности и эффективности непрямого варианта ИФА. Специфичность тестов оценивали параллельным исследованием в ИФА сывороток от гипериммунных, вакцинированных, здоровых и невакцинированных животных, а также гетерологичных сывороток мелкого рогатого скота к вирусам оспы овец, контагиозной эктимы овец и катаральной лихорадки овец.

Результаты определения чувствительности и специфичности непрямого варианта ИФА представлены в таблице 5.

Таблица 5

Чувствительность и специфичность непрямого варианта ИФА при исследовании сывороток

№№ п/п	Характеристика сывороток	Количество исследованных проб	Разведения (log2)
11	Гипериммунные сыворотки ЧМЖЖ	9	13,54/0,34
22	Сыворотки от вакцинированных мелкого рогатого скота (21 суток ПВ) против ЧМЖЖ	717	6,61/0,19
33	Сыворотки от переболевших животных	3560	8,99/0,21
44	Сыворотки от здоровых и невакцинированных животных	197	-
55	Гетерологичные сыворотки: оспы овец	110	-
66	Контагиозной эктимы овец	167	-
77	Катаральной лихорадки овец	73	-

Из данных таблицы видно, что непрямой вариант ИФА позволяет обнаруживать вирусоспецифические антитела в гипериммунных сыворотках в разведениях 13,54/0,34 log₂, в сыворотках переболевших животных 8,99/0,21 log₂, а в сыворотках крови от вакцинированных животных с разведения 6,61/0,19 log₂. Исследованные пробы сывороток от здоровых мелкого рогатого скота и гетерологичные сыворотки в ИФА дали отрицательные результаты [4].

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о высокой чувствительности и специфичности непрямого варианта ИФА при исследовании проб сывороток от вакцинированных животных и о возможности их применения для экспресс - диагностики ЧМЖЖ и оценки напряженности поствакцинального иммунитета [4].

Заключение

Любое вещество, обладающее свойствами антигена, полноценного или неполноценного (гаптена), можно количественно определить с применением иммуноферментного анализа [6]. Высокая чувствительность в сочетании с быстротой анализа, возможностью одновременного тестирования большого количества образцов и отсутствием особой необходимости предварительных операций по очистке и концентрированию анализируемого соединения в образце придают ИФА неоспоримые преимущества перед другими аналитическими методами. ИФА сегодня применяется практически повсеместно для диагностики самых разных соединений в различных образцах. Весьма широко выпускаются как готовые наборы для проведения ИФА, так и отдельные компоненты, такие как антигенные препараты, сыворотки антител к тем или иным возбудителям.

В настоящее время наборы для проведения ИФА производятся многими зарубежными компаниями, такими как Thermo Fisher Scientific(США), EKF Diagnostics(Германия), R&D Systems(США), IDvet(Франция), SBH Sciences(США), Agrisera(Швеция), Diatheva(Италия), EIAab(Китай), Fujirebio(Япония) и многими другими; Российскими производителями: Эпидбиомед диагностика, DIAPROPH-MED, ДиаЛаб-Центр, НПО "Диагностические системы"; В Казахстане разработкой подобных систем занимаются "БионМедСервис", ТОО "Диамед".

Несмотря на относительно низкую стоимость получения, поликлональные антитела уступают по эффективности использования и широте применения место моноклональным антителам, получаемых от одного клона-продуцента и специфичных к определенной антигенной детерминанте.

Список использованной литературы

1. Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. 1991, Москва: Высшая школа. с. 3, с. 6-8, с. 77-117.

2. Иммунологические методы, Фримель Г., Тарасов А.П., 1987. с. 162.

3. Иммуноферментный анализ / Ред. Т.Т. Нго, Г. Ленхофф. М.: Мир, 1988.

4. Разработка ИФА тест-системы для диагностики и мониторинга чумы мелких жвачных животных. Джумаев Ш.Н. М., 2011.

5. Ярилин А.А. Основы иммунологии: Учебник. М.:Медицина, 1999.

6. Соросовский образовательный журнал №12. Иммуноферментный анализ Самуилов В.Д.

7. Галактионов В.Г. Иммунология. Издательство Московского университета, 1998.

8. Хаитов Р. М. Иммунология. Медицина, 2000.

9. Приготовление и контроль иммунопероксидазных конъюгатов для иммуноферментного анализа при чуме мелких жвачных животных / Аноятбеков М.А., Джумаев Ш.Н., Бобоев Г.Ю. и др. // Доклады Таджикской академии сельскохозяйственных наук.Душанбе. 2007. № 3. С. 48-53.

10. Дзантиев Б.Б. Современное состояние и перспективы развития иммуноферментного анализа. /Дзантиев Б.Б., Егоров A.M. // Журнал всесоюзного химического общества. 1982. т.2. №4. С. 442-449.

Размещено на Allbest.ru

...