Главная Коллекция "Revolution" Медицина Пристосування в організмі щурів-пухлиноносіїв

Пристосування в організмі щурів-пухлиноносіїв

Вивчення поняття канцерогенезу - багатостадійного процесу накопичення мутацій, які призводять до порушення регуляції клітинного циклу, апоптоза, руху і морфогенетичних реакцій клітини. Розгляд методів та результатів проведеного експерименту на щурах.

Рубрика Медицина
Вид курсовая работа
Язык украинский
Дата добавления 26.05.2014
Размер файла 277,1 K
рефераты на заказ со скидкой

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Страница:

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство освіти, науки, молоді та спорту України

Дніпропетровській національний університет імені Олеся Гончара

Факультет біології, екології та медицини

Кафедра біохімії та біофізики

Курсова робота

Пристосування в організмі щурів-пухлиноносіїв

Виконавець:

студентка гр. БХ-04-6 Тимбай О. С.

Науковий керівник:

асистент кафедри біохімії

та біофізики Воронкова Ю. С.

Дніпропетровськ 2011

Вступ

В останні роки дуже гостро стоїть проблема злоякісних новоутворень. На сьогодні відомо багато шляхів ідентифікації та боротьби з цими хворобами. Провідне місце в лікуванні онкологічних захворювань поряд з оперативним втручанням та променевою терапією займає хіміотерапія. Це метод лікування хворих із злоякісними новоутвореннями препаратами, які здатні гальмувати проліферацію пухлинних клітинклітин або призводити до їх апоптозу. Не зважаючи на успіхи в хіміотерапії пухлин, використання багатьох препаратів обмежується значною системною токсичністю їх для організму. Для проникнення лікарських препаратів у пухлинну тканину та запобігання їхній деградації під час транспортування в організмі, а також зменшення токсичної дії на інші органи, використовують ліпосомні форми препаратів.

При вивченні біологічної активності хімічних речовин особливе значення здобувають відомості про вплив їх на систему крові, котра являється важливою складовою частиною внутрішнього середовища організму. Завдяки своїй реактивності, вона грає основоположну роль у резистентності та розвитку адаптації при дії на організм як різних зовнішніх подразників, так і при порушеннях внутрішнього середовища організму. Відомо, що розвиток новоутворень супроводжується анемією, що може відігравати провідну роль у процесі лікування та його ефективності.

Перелік скорочень

Hb - гемоглобін

HbF - фетальний гемоглобін

HbA - „дорослий” гемоглобін

HbA1c - глікозильований гемоглобін

HbP - первинний гемоглобін

ГК - глікоконьюганти

ЗН - злоякісні новоутворення

1. Канцерогенез

1.1 Поняття канцерогенезу

Поява пухлини є результатом взаємодії канцерогенних факторів й організму. Важливу роль при цьому грають різні екзогенні та ендогенні модифікуючи фактори [2]. Канцерогенез - це багатостадійний процес накопичення мутацій та інших генетичних змін, які призводять до порушення регуляції клітинного циклу, апоптоза, дифференціровки, руху і морфогенетичних реакцій клітини, а також контролю цілісності генома. Все це у свою чергу забезпечує те, що клітина разом з її властивостями, такими як самодостатність проліферативних сигналів, підвищення міграційних здібностей, нечутливість до ростоінгібуючих впливів, відсутність реплікативного старіння, збільшення життєздатності при несприятливих умовах навколишнього середовища чи внутріклітинних ушкодженнях, генетична нестабільність і т.д., які детермінують непластичну трансформацію й подальшу пухлинну прогресію [14].

Злоякісні новоутворення з'являються в результаті необмеженої проліферації клітинного клону, виходячого за межі власної тканини й здатного до росту на територіях інших тканин. Злоякісні клітини починають процес розділення при неповному дозріванні (атипізм), причому ця властивість передається генетичним клітинам-нащадкам. Чим раніше клітина пухлини починає своє розділення, тобто чим менше вона диференційована, тим злоякісніше пухлина, що важливо для її верифікації [3]. Поява сукупності перерахованих властивостей зв'язано з порушенням у сигнальних шляхах, які контролюють реакцію клітини на екзогенні та ендогенні регулюючі фактори. Головну роль у їхній появі відіграють зміни регуляції клітинного циклу, апоптоза, міграції та деяких інших базових процесів життєдіяльності клітини [14].

Незважаючи на залучення мільйонних інвестицій, проблема профілактики та пошуку ефективних методів лікування хворих на злоякісні новоутворення залишається далекою від остаточного вирішення. Сьогодні великі надії покладаються на новітні технології діагностики, лікування та профілактики раку.

1.2 Особливості карциноми Герена (пухлини Т8)

Карцинома Герена ( пухлина Т8). Карцинома отримана в 1934 році перевивкою епітеліальної пухлини матки в щурів лінії Wistar [33,35]. Ця пухлина виникла спонтанно в щура та була типовою аденокарциномою. На сьогодні карцинома Герена пройшла велику кількість генерацій та досить широко використовується в різноманітних дослідженнях. Прививаємість коливається від 50 до 90%, складаючи в середньому 75%.

Пухлина перевивається взвіссю популяції клітин безпорідним щурам. Лікування починають на 3-7 добу після трансплантування пухлини. Параметром ефекту є заторможення росту пухлини.

Латентний період появи пухлини, яка пальпується (7-8 мм у діаметрі) дорівнює 7-10 днів. Однак деякі пухлини набувають цієї величини лише на 14-16-ий день, хоча далі вони ростуть швидко. У карциноми Герена досить чітко виражена двохфазність росту (повільний та нерівномірний ріст протягом перших 10-14 днів і швидкий ріст у наступні два тижня). На 14-16-й день пухлина має діаметр 15-18 мм, а на 24-30-й день - 30-37 мм. Середня вага пухлини на 24-29-му дні у різних дослідах дорівнює від 7,4 до 41,7 г.

У підшкірній клітчатці пухлина має вигляд м'яких вузлів, які відмежовані дуже тонкою сполучнотканиною капсулою [33] .

Пухлина складається з тяжів та суцільних полів клітин середньої величини, з відносно великим ядром та вузьким обідком базофільної протоплазми. Ядра кулькообразні, з невеликою кількістю хроматину, який розміщується у вигляді тонкої сітки в клітинній оболонці; є 2-4 добрі виражених ядерця. Встановлено, що ріст трансплантованої карциноми Герена в щурів проходить на тлі зниження гістоноспецифічної активності в клітинах ядра печінки та пухлини та не призводить до зміни специфічності, гідролізу окремих фракцій гістонів цих клітин. У процесі росту пухлини спостерігається активація нейтральних та пригнічення активності кислих цитоплазматичних протеїназ печінки; під час росту карциноми Герена активність нейтральних цитоплазматичних протеїназ ракових клітин не змінюється, а кислих - знижується. [36]

Характерним для карциноми Герена є розташування клітин у вигляді дрібних осередків та невеликих тяжів, які відмежовані тонкими, але добре вираженими прошарками сполучної тканини. Також характерним є спостереження численних ділянок некробіозу (пікноз ядер, каріорексис, каріолізис та ін.)

Злоякісна пухлина в організмі інтенсивно поглинає глюкозу й діє як гіпоглікемічний фактор. Зі збільшенням маси пухлини зменшується маса тварин, а нерідко й онкологічні хворі гинуть при кахексії. При досягненні маси пухлини 15г та більше, з'являються значні ділянки некрозу. [31]

1.3 Терапія цисплатином

Цисплатин є одним з найбільш загальновживаних препаратів у лікуванні солідних пухлин [42]. Однак ефективне застосування цисплатину в клініці часто лімітуєтъся токсичністю препарату та розвитком резистенстності до нього. Резистентність до цисплатина має комплексний характер і пов'язана з рядом особливостей пухлинних клітин, включаючи зміни в проникності цитоплазматичної мембрани, підвищення активності детоксикуючих та репаративних систем клітини, порушення експресії генів р53, тdm2, bсl-2 та інші. Порушення біохімічних сигнальних шляхів апоптозу також можуть бути основою для розвитку резистентності.

В основі протипухлинної активності комплексних сполук платини лежить пряма цитотоксична дія на пухлинні клітини як самих препаратів, так і продуктів їхнього метаболізму. Однак платидіам накопичується не лише в пухлинах, а циркулює по всьому організму, і його токсичний вплив поширюється на нормальні тканини. Результатом цього процесу, як побічна дія препарату, є нефротоксичность, зниження слуху (особливо у дітей), нейропатії, електролітичні порушення, імунодепресія, зворотне пригнічення кровотворення та гепатотоксичність. [38]

При внутрішньовенному введенні цисплатин швидко і у значної кількості потрапляє в нирки, шлунково-кишковий тракт, печінку, яєчники; виявляється в шкірі, м'язах, кісткової тканині. Через гематоенцефалічний бар'єр не проникає. У значній кількості (90%) зв'язується з білками плазми. Повільно виводиться нирками: у невеликій кількості в перші години та приблизно 40% - після 5 днів введення [9,19].

Розуміння молекулярних основ дії цисплатина та механізмів розвитку резистентності до нього дозволяє значно покращити результатати клінічних випробувань препарату.

Транспорт цисплатину. Взаємодія цисплатина з плазматичною мембраною є першим кроком до багатостадійного процесу реалізації цитотоксичного ефекту препарату. Ступінь пошкодження мембран цитостатиком залежить від текучості їх ліпідної компоненти, яка визначається швидкістю процесів перекисного окиснення ліпідів. [34]

На сьогодні існують дві гіпотези поглинання препарату пухлинною клітиною Більш аргументована гіпотеза пасивного транспорту, заснована на фактах відсутності інгібування переносу цисплатина за допомогою структурних аналогів та проникнення цисплатина в клітину без насичення до межі його розчинності в культуральному середовищі. [43] Але ряд вчених відстоює ідею існування активного транспорту.[10]

Внутрішньоклітинною мішенню цисплатина є ДНК, з якою препарат ковалентно зв'язується. Біфункціональні продукти взаємодії цисплатина з ДНК блокують реплікацію, транскрипцію й, як наслідок, - клітинну проліферацію. [41]

1.4 Токсична дія цисплатину

У практику лікування онкологічних хворих досить широко увійшов цисплатин, який є представником нового класу протипухлинних препаратів - комплексних сполук платини [34].

Однак в 10-40% пацієнтів спостерігається анемія [38]; причини цієї анемії є мультифакториальними, наприклад, загальна токсична дія на червоний кістковий мозок або зниження активності еритропоетину.

До патогенезу анемії при ракових захворюваннях залучається комбінація зменшення загального життя еритроцитів при циркуляції та нездатність червоного кісткового мозку збільшувати продукцію червоних кров'яних клітин. Це може відбуватися шляхом зменшення діяльності ретикулоендотеліальної системи, через недостатню еритропоетинову відповідь на анемію або підвищену продукцію цитокінів, які можуть інгібувати еритропоез. Багато цих цитокінів можуть інтерферувати з продукцією ериторопоетину в нирках, приводячи до недостатнього рівню еритропоетину в сироватці крові, що спостерігається у всіх пацієнтів із твердими пухлинами.

Параметри гострої токсичності цисплатину дуже низькі. Так, летальна доза для гризунів складає 12-14 мг/кг, для собак - близько 2,2 мг/кг. Хіміотерапевтичний індекс препарату теж низький - порядку 4-8. Біологічний ефект комплексів платини залежить від дози, що можна віднести до недоліків препарату. [22]

Накопичений клінічний досвід і знання про нові протипухлинні препарати дозволяють класифікувати побічні дії цитостатиків за локалізаційним та патогенетичним принципами з урахуванням години виникнення реакцій і ступеня їх прояву. [19] Помірна анемія, яка відмічається після застосування цисплатину не пов'язана з прямою токсичною дією на циркулюючі ретикулоцити, а, як вважають, обумовлена мієлосупресивною та аутоімунною дією препарату. Цитостатична терапія може супроводжуватися широким спектром системних побічних ефектів, з яких найбільш розповсюдженими є мієлодепресія, а саме - лейко- і тромбоцитопенія. Ще частіше виникає анемія, яка не завжди має цитотоксичний генез та виявляється, як правило, вслід за лейко- і тромбоцитопенією [28].

2. Гемоглобін як показник крові

2.1 Структура гемоглобіну

Гемоглобін, відноситься до класу хромопротеїдів, складається з безбарвного білку, глобіну, і зв'язаною з ними простетичної групи - забарвленого залізопорфиринового комплексу гема. Гем надає гемоглобіну характерний червоний колір, є найважливішим об'єктом спектру фотометричного аналізу, який лежить в основі більшості методів кількісного виявлення гемоглобіну. [31,16]

Гем займає усього лише 4 % й представлений комплексом протопорфирину IX (порфірин, у якого в положеннях 1, 3, 5, 8 знаходяться - СН3 групи, у положеннях 2, 4 - вінильні групи, у положеннях 6, 7 - залишки пропіонової кислоти) з залізом [9,26]. До складу глобінів ссавців звичайно входити 140 - 150 амінокислотних залишків, які утворюють a - та b - ланцюги; в окремих випадках їх кількість різко виходить за межі вказаних коливань. Цілий ряд положень є інваріантним. В утворенні тетраметру приймають участь два ланцюга одного та два ланцюга іншого, тобто молекула гемоглобіну вміщує чотири поліпептидних ланцюга (ППЛ) та чотири гема. Слід зазначити, що гем може бути простетичною групою не тільки гемоглобіну, а й міоглобіну, а також дихальних ферментів клітини - каталази, пероксидази та системи цитохромів. [26] Приєднання гему до глобіну викликає зміни в структурі молекули, які відображаються в збільшенні кількості залишків, які, у свою чергу, переходять від менш упорядкованого до спірального стану.

Біологічна роль гемоглобіну відображається в транспортуванні оксигену від легень до тканин та вивільненні у зворотному напрямку З2 . Оксиформа гемоглобіну більш стійка, ніж дезоксиформа [9].

Похідні гемоглобіну. Поняття загальний гемоглобін включає різні форми гемоглобіну, які присутні в крові здорових людей, або ж проявляються при патології:

· Відновлений гемоглобін

· Ферогемоглобін

· Оксигемоглобін

· Метгемоглобін

· Феригемоглобін

· Карбоксигемоглобін

· Сульфгемоглобін

· Гемоглобінцеаніт

· Нітрозогемоглобін

· Нітрозобензолгемоглобін

· Метгемальбумін

У фізіологічних умовах у крові знаходяться здебільшого оксигемоглобін і відновлений гемоглобін, а також у слідових кількостях метгемоглобін і карбоксигемоглобін. Метгемоглобін - це сполука, що виникає при паталогічних станах, наприклад при отруєнні сильними окисниками (біуретовою сіллю, перманганатом калію тощо), утворюється міцна сполука гемоглобіну з киснем, у якій відбувається окиснення заліза, і воно стає трьохвалентним. У наслідок чого гемоглобін втрачає властивість віддавати кисень тканинам , що може призвести до загибелі організму. В особливих умовах гемоглобін може вступати в сполуки з іншими газами. Сполука гемоглобіну з чадним газом (СО) називається карбоксигемоглобін. Карбоксигемоглобін є міцною сполукою, гемоглобін блокований у ньому чадним газом і нездатний здійснювати перенос кисню. Спорідненість гемоглобіну до чадного газу вище його спорідненості до кисню, тому навіть невелика кількість чадного газу в повітрі є небезпечною для життя. [44]

2.2 Рівень гемоглобіну при патологічних станах організму

У процесі індивідуального розвитку організму при функціональній перебудові його тканин та органів, а також при переході від нормального

стану до патологічного відбувається зміна якісного набору білків, що є результатом диференційній активності генів. В еритроцитах ссавців винайшли субодиниці глобіну, які є продуктами структурних генів і приймають участь в утворенні різних типів гемоглобіну. Їх кількісний вміст у крові значно змінюється протягом онтогенезу організму, а також при розвитку патологічного стану [8].

У клінічній картині багатьох злоякісних новоутворень (ЗН) нерідко спостерігаються симптоми чи синдроми, які носять другорядний неспецифічний характер, тобто безпосередньо не зв'язані з локалізацією самої пухлини та її метастазів. У подібних випадках вони суттєво впливають на характер клінічних виявленнях основного захворювання, ускладнюючи його розпізнання, а інколи випереджують у часі специфічні ознаки онкологічного захворювання. Одним з таких симптомів є помірна нормо- чи гіпохромна анемія, супінь тяжкості якої корелює зі стадією онкозахворювання. При цьому в IV стадії спостерігається важка гіпохромна анемія з мікро- або нормоцитозом [12,26].

При патогенезі анемії при злоякісних новоутвореннях спостерігається порушення дозрівання клітин еритроїдного ряду, зниження його реакції на гіпоксію, гальмування синтезу гемоглобіну в еритронормобластах та виходу якісно неповноцінних еритроцитів у кровяне русло. При цьому година існування зрілих еритроцитів у хворих зі злоякісними новоутвореннями скорочується, що пояснюється підвищеною гемолітичною активністю клітин ретикуло-ендотеліальної системи. Крім того, відомо про наявність серйозних порушень у метаболізмі заліза, еритропоетичної функції кісткового мозку та в периферичній крові. [30] Дефіцит сивороточного заліза, що виявляється при онкологічних захворюваннях пояснюється тим, що металофільні ретикулярні клітини печінки, селезінки, кісткового мозку активно захоплюють залізо з подальшим порушенням його звільнення в плазму. З іншого боку, через зниження залізозв'язуючої здатності плазми крові підвищується його виділення з сечою. Таким чином, дефіцит заліза в плазмі обмежує його надходження в кістковий мозок для еритропоеза.

Деякі з пухлин посилено адсорбують залізо, а також продукують сивороточний феритин, рівень якого знаходять підвищеним в 80-98% хворих з ЗН [26].

Показники норми нижньої межі концентрації гемоглобіну, рекомендовані Міжнародним комітетом із стандартизації в гематології (ICST, 1989), для чоловіків не менше 130 г/л, для жінок - 120 г/л, були встановлені відповідно до методик визначення його концентрації у венозній крові.

В онкологічних хворих у залежності від типу захворювання можуть розвиватися порушення внутриеритроцитарного протеолізу гемоглобіну, які призводять до збільшення вмісту окремих пептидних компонентів; зміни вмісту окремих пептидів пов'язані з локалізацією пухлини, а не з її гістологічною характеристикою. Було показано, що фрагментація гемоглобіну в еритроцитах призводить до утворення більшого набору порівняно коротких (менш ніж 20 амінокислотних залишків) біологічно активних секретуємих пептидів. Для таких пептидів встановлена наявність вираженого антипроліферативного ефекту в культурі трансформованих клітин. Порушення фрагментації гемоглобіну, які знайдені при лімфогранулематозі, лімфосаркомі та раку легень, можуть призводити до руйнування механізмів протипухлинного захисту. [25]

Багато патологій, які пов'язані з порушенням окиснювально-відновного стану організму супроводжуються анеміями, тобто зниженням концентрації гемоглобіну в крові. Встановлено, що при анемії та перебуванні організму в умовах зміненого газового середовища спостерігається зсув фракційного складу гемоглобіну як у периферичній крові, так і у кровотворних органах. За даними, при розвитку анемії у тварин не змінюється характер формування гетерогенної системи гемоглобіну в процесі утворення еритроцитів. Значно змінюється лише інтенсивність синтезу окремих гемоглобінів [8,10].

В інтактних щурів мітози еритроїдних клітин кісткового мозку дорівнюють 2,49%. Введення сироватки контрольної тварини майже не змінює кількість мітозів. Сироватка крові щурів з фенилгідразиновою анемією має чітку еритропоезстимулюючу дію. Аналогічний ефект відмічається й у дослідах з сироваткою тварин, адаптованих до гіпоксії в умовах газового середовища, яка складається з 10% оксигену та 90% нітрогену. Тобто при фенилгідразинованій анемії та гіпоксії в крові щурів підвищується рівень еритропоетичних факторів, що узгоджується з даними літератури про вміст еритропоетину й інтенсивності еритропоезу при вказаних станах тварин [10].

2.3 Патологічні форми гемоглобіну

У зв'язку з наявністю декількох нормальних типів гемоглобіну, а також появою в крові при деяких захворюваннях аномальних гемоглобінів різноманітного походження, особлива увага приділяється визначенню кількісного складу гемоглобіну еритроцитів. Так виявлення підвищених кількостей гемоглобіну наприклад фетального (НbF) і глікозильованого (HbA1c) характерно для багатьох форм патогенезу.[27]

Підвищенний вміст HbF спостерігається при таких гематологічних хворобах як гострий лейкоз, апластична анемія, гемоглобінурія, а також при інфекційному гепатиті при безсимптомному спадковому персистуванні фетального гемоглобіну, при вагітності, при злоякісних новоутвореннях.

В онтогенезі у людини виділяється зміна різноманітних типів нормальних гемоглобінів. У плода (до 18 тижнів) виявляють первинний, або примітивний, HbР. Наступним періодом є синтез переважно гемоглобіну F. Синтез „дорослого” гемоглобіну HbA різко ідентифікується в період кістковомозкового кровотворення. [4] Гемоглобін A2 є іншим компонентом гемоглобіну А. [15] Вміст HbF у новонародженої дитини складає до 70-90 % від загальної кількосі гемоглобіну. До кінця першого року життя концентрація HbF знижується до 1 - 2 % , і відповідно підвищується вміст HbA. [4] У дорослої людини, у нормі, на частку гемоглобіну А припадає 95 %, гемоглобін А2 - 3,5 %, гемоглобін F - 1 - 1,5%.[15]

Глікозилювання (приєднання цукру) є різновидом посттрансляційної модифікації білків. У процесі глікозилювання відбуваються зміни стереохімічної конфігурації життєво важливих макромолекул - глікоконьюгантів (ГК), що призводить до модифікації міжклітинного впізнання, порушенню імунної відповіді, асоціації та агрегації окремих клітин, появи новоутворень.[21]

Встановлено, що до ГК відносяться транспортні білки, ферменти, гормони, антитіла, інші біологічні важливі речовини. Важливе клініко-діагностичне значення серед їх має глікозильований гемоглобін - (HbA1c). Вважається, що за своєю властивістю негативно впливати на біохімічні процеси глікозилювання він подібний до дії вільних радикалів. Вивчення цих питань сприяє уточненню патогенезу різноманітних захворювань, і тому вдосконаленню діагностики та лікування. [10,21]

Глікозилювання може відбуватися у вигляді як ферментативного, так і не ферментативного процесу. У перебудовах глікоконьюгантів приймають участь в певній послідовності сотні різноманітних ферментів. Зміна активності одного з них у ланцюгу ферментативних реакцій може призвести до порушення в цих процесах. Більшість ферментів відносяться до класів трансфераз і гідролаз.

Неферментативне глікозилювання призводить до появи різноманітних токсичних продуктів, які беруть участь в розвитку патогенезу. [32] Неферментативне глікозилювання гемоглобіну являє собою двоступінчастий процес конденсації глюкози і інших груп вуглеводів з вільними аміногрупами білків. Перший етап полягає в утворенні нестабільного альдиміна ( лабільного гемоглобіна А1с, або прегемоглобіна А1с) - зворотної реакції між карбонільною групою глюкози та N-кінцевим валіном b-ланцюга гемоглобіна. Утворення лабільного гемоглобіну А1с прямо пропорційне концентрації глюкози в крові. Друга стадія реакції, внаслідок якої лабільний альдимін перетворюється в стабільний кетоамін, є незворотною („перетворення Аматорі”), і тому рівень глікозильованого гемоглобіну в пацієнта залежить від концентрації глюкози в крові й тривалості періоду напіврозпаду гемоглобіну. Неферментативного глікозилювання зазнають багато білків, однак для діагностики порушень вуглеводного обміну найбільше поширення отримало визначення глікозильованого гемоглобіну[18].

Рівень глікозильованого гемоглобіну (HbА1c) підвищується у хворих у важкому стані. При цьому виявлений зв'язок цього параметру з основними показниками, які відображають стан метаболізму, реологічні властивості сироватки та ендогенну інтоксикацію.[17]

Доведене значення рівня HbА1c для контролю цукрового діабету, оцінки кардіоваскулярного ризику захворювання, наявності злоякісних новоутворень, передбачення прогресування мікросудинної патології, оцінки ефективності лікування, потребує широкого використання даного показника в практичній медицині. Розроблено багато методів визначення Hb1c , провідними з яких в останній час вважають хроматографічні та імуноферментні. [18]

Найчастіше визначення глікозильованого гемоглобіну проводять з використанням методу високоефективної колоночної хроматографії. Умови аналізу дозволяють проводити повне розділення таких фракцій гемоглобіну, як HbА1c, HbА0, HbА2, HbF. Розрахунок вмісту фракції HbA1c проводиться за методом нормалізації за допомогою спеціалізованої програми для обробки хроматографічних даних [32].

2.4. Морфологічні характеристики крові

Визначення кількісного вмісту і якісного складу гемоглобіну використовується в комплексі з іншими гематологічними показниками (кількість еритроцитів, їх морфологія тощо) для діагностики ряду патологічних станів червоної крові. При патологічних станах вміст гемоглобіну й кількість еритроцитів не завжди змінюється паралельно. Це знаходить відображення в класифікації анемій (розрізняють нормо-, гіпо- і гіперхромні форми анемії ) [4]. Кількісний вміст еритроцитів у нормі для жінок складає 4,5, для чоловіків - до 5 мільйонів у куб. мм (інколи більше, до 6 мільйонів) [5].

Еритроцити складають основну масу формених елементів крові. В нормі зрілі еритроцити людини позбавлені ядра, мають двояковігнуту форму, що збільшує поверхню зіткнення гемоглобіну з плазмою і полегшує процес переносу кисню і вуглекислоти. Еритроцити такої форми називаються дискоцитами. При такій формі еритроцит має більшу здатність до зворотної деформації при проходженні крізь вузькі капіляри. У процесі старіння еластичність еритроцитів зменшується. Також еластичність зменшується у еритроцитів зі зміненою формою (наприклад, у сфероцитів, серповидних еритроцитів), що є однією з причин затримки і руйнування їх у ретикулярній тканині селезінки [1].

Серед морфологічних форм трансформації еритроциту найбільш показовою є ехіноцит, оскільки це остання зворотна форма еритроциту. Якщо зменшити дію гемолітику, то можна повернути еритроцит у його дискоцитарну форму. Якщо зміна форми еритроциту досягає сфероциту, то далі процес руйнування клітини вже не можливо зупинити, навіть при відсутності гемолізуючого агента [5].

Основними функціями еритроцитів є:

1) перенос кисню від легень до тканин і вуглекислоти - від тканин до легень (основна функція);

2) участь у гомеостазі, переважно на мікроциркуляторному рівні, зв'язана зі здатністю еритроцитів визначати реологічні властивості крові;

3) участь еритроцитів в імунних (у тому числі аутоімунних) реакціях організму;

4) участь у регуляції кислотно-лужної рівноваги організму, перешкоджаюча зрушенню рН крові у бік ацидозу чи алкалозу;

5) участь еритроцитів у численних ферментних реакціях;

6) участь еритроцитів у регуляції іонної рівноваги плазми.

Показано, що крім своїх основних функцій еритроцити здійснюють перенос нуклеотидів, патогенних вірусів, пухлинних і трансплантаційних агентів [23].

Різні патологічні процеси, в основі яких знаходяться аутоіммунні розлади, інтоксикації, гіпоксії і порушення клітинного метаболізму, відбиваються саме на функціональних і морфологічних властивостях еритроцитів. Зміна форми цих клітин може служити деякою інформацією про ступінь розвитку і природи патологічного процесу [1].

2.5. Анемії, їх причини та наслідки

Анемія - група захворювань, що характеризуються зменшенням кількості еритроцитів та (або) гемоглобіну в одиниці об'єму крові нижче нормального для даного віку і статі, що поєднується з якісними змінами еритроцитів. [37]

Діагностика анемії полягає головним чином на результатах лабораторних досліджень, у першу чергу - на показниках клінічного дослідження крові з визначенням концентрації гемоглобіну.

За патогенезом анемії поділяють на 3 групи:

1) постгеморагічні - внаслідок крововтрати;

2) гемолітичні - внаслідок посиленого руйнування еритроцитів;

3) анемія - внаслідок порушення ериторпоезу. [44]

Анемія не може бути самостійним захворюванням, вона завжди вказує на порушення в організмі. Причиною розвитку анемії може бути втрата еритроцитів внаслідок гемолізу або кровотечі, або ж недостатнє утворення еритроцитів у кістковому мозку, або при поєднанні цих факторів. За основним патогенічним механізмом розрізняють анемії, викликані крововтратою (постгеморагічні залізодефіцитні), обумовлені порушеннями метаболізму в кровотворних тканинах (сидероархистичні - залізонасичені, В12 - і фолієводефіцитні, анемії при кістковомозгової недостатності) і обумовлені підвищенним кроворуйнуванням - гемолітичні анемії. [6]
Основною ознакою гемолитических анемій є підвищений розпад еритроцитів й укорочення тривалості їхнього життя.

Різні види анемій виявляються в 10-20% населення, у більшості випадків у жінок. Найбільше часто зустрічаються анемії, пов'язані з дефіцитом заліза (близько 90% всіх анемій), рідше анемії при хронічних захворюваннях, ще рідше анемії, пов'язані з дефіцитом вітаміну В12 або фолієвої кислоти (мегалобластні), гемолітичні й апластичні. Необхідно пам'ятати, що анемія може мати складне походження. Можливе сполучення залізодефіцитної й В12 - дефіцитної анемій.

2.5.1 Види анемій

Всі гемолитичні анемії діляться на дві великі групи: спадкоємні й набуті .

Придбані гемолітичні анемії. Аутоімуна гемолітична анемія є найбільш поширеним захворюванням серед придбаних гемолітичних анемій. Вона обумовлена появою в організмі хворого антитіл до власних еритроцитів, які аглютинуються й піддаються розпаду в клітинах ретикулогістиоцитарної системи.

Симптоматичні аутоімунні анемії виникають на тлі різних захворювань, що супроводжуються порушеннями в імунокомпетентній системі. Найчастіше вони зустрічаються при хронічному лімфолейкозі, лимфо-гранулематозі, парапротеїнемічних гемобластозах, системній червоній вовчанці, ревматоїдному артриті, хронічних гепатитах і цирозах печінки.[45]

Серед лабораторних ознак підвищеного гемолізу відзначаються збільшення змісту непрямого білірубіна, підвищена екскреція стеркобіліна з калом. [44]

Залізодефіцитна анемія - широко розповсюджений патологічний стан, що характеризується зниженням кількості заліза в організмі (у крові, кістковому мозку й депо), при якому порушується синтез гема, а також білків, що містять залізо (міоглобін, залізовмісні тканевые ферменти). Залізодефіцитна анемія іноді, особливо в грудному й літньому віці, розвивається при інфекційних і запальних захворюваннях, опіках, пухлинах, внаслідок порушення обміну заліза при збереженні його загальної кількості [45].

Залізодефіцитна анемія (ЗДА) є актуальною проблемою сучасної медицини у світі. Як показало вивчення стану метаболічних процесів, у хворих із ЗДА на фоні анемічної гіпоксії та сидеропенії виникають значні вторинні розлади обміну деяких біологічно активних сполук, насамперед гістаміну, серотоніну, гепарину, молочної, піровиноградної кислот, змінюються показники енергетичного та мікроелементного обміну, порушується вміст у крові універсальних маркерів метаболічної інтоксикації середньомолекулярних пептидів [7,8].

Класифікація анемії за ферокінетичними параметрами дає уявлення про багатофакторну модель кінетики заліза в організмі, відображає дисбаланс цього елементу й не може претендувати на універсальність [7].

2.5.2 Зміни еритроцитів при гемолітичних анеміях

У фізіологічних умовах тривалість життя еритроцитів становить 100-120 днів. Старіючі еритроцити піддаються секвестрації в синусах селезінки, а також у кістковому мозку. При гемолітичних анеміях внаслідок посиленого руйнування еритроцитів тривалість їх життя коротшає до 12 - 14 днів.

Таблиця 1. Зміни еритроцитів при гемолітичних анеміях

Морфологічні зміни

Причина

Захворювання

Мікросфероцити

Втрата частини мембрани

Спадкоємний микросфероцитоз, аутоімунна гемолітична анемія з тепловими антитілами

Мішенеподібні

Збільшення відносини площі поверхні еритроцита до його обсягу

Гемоглобінопатії (талассемии, гемоглобінопатії S, З, інші), хвороби печінки

Шизоцити

Травматичний розрив мембрани

Мікроангіопатична гемолітична анемія, протезовані клапани серця й протези посудин

Серповидні

Полімеризація гемоглобіну S

Серповидноклеточная анемія, HbS-b-талассемия, гемоглобинопатияЗС

Шпоровидні (акантоцити)

Зміна ліпідного складу мембрани

Цироз печінки (шпороклітинна анемія)

Аглютинація

IgM-антитіла до еритроцитів

Аутоімуна гемолітична анемія з холодовими антитілами

Тільця Гейнца

Денатурація гемоглобіну

Нестабільні гемоглобіни, дія окислювачів

Патологічний гемоліз може бути переважно внутрішньоклітинним або внутрішньосудинним. Внутрішньоклітинний розпад еритроцитів відбувається в клітинах ретикулогістоцитарної системи, головним чином у селезінці, і супроводжується підвищенням у сироватці змісту вільного білірубіна, збільшенням екскреції уробіліну із сечею й калом, схильністю до утворення каменів у жовчному міхурі та протоках. При внутрішньосудинному гемолізі гемоглобін надходить у підвищеній кількості в плазму й виділяється із сечею в незмінному виді або у вигляді гемосидерина. Останній може відкладатися у внутрішніх органах (гемосидероз). [39,40]

2.6 Визначення загального білку як діагностичний параметр патогенезу

Білки входять до складу всіх біологічних рідин, але насамперед білки плазми крові найчастіше досліджують для встановлення діагнозу. Більше 100 білків виконують у плазмі визначенні фізіологічні функції. Оскільки при багатьох захворюваннях спостерігаються зміни в складі окремих білків, з'ясування загального білка в сироватці крові широко застосовується в клінічній практиці для діагностики різноманітних захворювань.[20] Необхідність і важливість встановлення його концентрації багато в чому обумовлена його багатогранною і важливою фізіологічною роллю, яку відіграють білки плазми в організмі. Завдяки їм підтримується в'язкість, текучість крові, формується її об'єм у судинному руслі, а формені елементи підтримуються у взвішеному стані. Білки плазми здійснюють транспорт багатьох екзо- і ендогенних речовин, так як беруть участь у зв'язуванні гормонів, мінеральних компонентів, пігментів та інших біологічно активних компонентів. Так як білки крові є амфотерними поліелектролітами, вони відіграють важливу роль у регуляції кислотно-основного стану організму, є факторами звертання крові, антитілами. Тому їх зміна приводить до порушення гомеостазу. [15]

Найбільш розповсюдженим методом визначення загального білка є біуретовий метод. На сьогодні широке розповсюдження в клінічних лабораторіях отримали відчизняні набори для визначення загального білку в сироватці крові біуретовим методом. [29]

Концентрація білку в плазмі залежить головним чином від синтезу та розпаду двох основних білкових фракцій - альбуміна й глобуліна. Кількісні зміни інших білків плазми крові не спричиняють суттєвої зміни концентрації загального білку. Альбуміни, фібриноген синтезуються головним чином у печінці, а глобуліни - у лімфоцитах. Розпад білків плазми відбувається у всіх тканинах пропорційно їх метаболічної активності.

Рівень загального білка та окремих його фракцій може бути обумовлений багатьма причинами, причому це стосується як кількісного, так і якісного складу білків. Ці зміни не є специфічними, а відображають загальний патологічний процес (запалення, некроз, новоутворення), динаміку і тяжкість захворювання. За допомогою них можна оцінити ефективність лікування. [46]

Склад загального білка (а також білкових фракцій) є дуже важливим діагностичним параметром при цілому ряді захворювань, особливо пов'язаних з вираженими порушеннями метаболізму. Фізіологічна гіпопротеїнемія (патологічне зниження білка) може спостерігатися у дітей раннього віку, у жінок під час вагітності (особливо в третьому триместрі), при лактації, при тривалому постільному режимі. [29]

Рівні загального білка в нормі для людини ( можуть варіювати залежно від використовуваних тест-систем й устаткування): 64 - 85 г/л.

Підвищення рівня загального білка (гіперпротеїнемія):

· Дегідратація в результаті втрати частини внутрішньосудинної рідини (при травмах, великих опіках, холері, диареї у дітей)

· Гострі й хронічні інфекції

· Аутоімунізационні захворювання (системна червона вовчанка, ревматоїдний артрит, ревматизм)

· Парапротеїнемічні гемобластози

· Міеломна хвороба (поява в крові патологічних білків - парапротеїнів)

· Хвороба Вальденстрема

· Лимфогрануломатоз

· Саркоїдоз

· Активний хронічний гепатит

· Цироз печінки без вираженої печінковоклітинної недостатності

· Зневоднення (гіпогідратация).

Зниження рівня загального білка (гіпопротеїнемія):

· Недостача білків у раціоні харчування (тривале голодування, тривале дотримання безбілкової дієти)

· Ентерити, ентероколіти, панкреатити

· Синдром мальабсорбції

· Захворювання печінки (гепатити, цироз, атрофія, токсичне ушкодження, новоутворення)

· Тривале лікування кортикостероїдами

· Нефротичний синдром

· Гломерулонефрит

· Цукровий діабет

· Асцит, плевральні ексудати, транссудати

· Кровотечі

· Тиреотоксикоз

· Тривалі гарячкові стани

· Новоутворення [45]

3. Матеріали та методи

3.1 Об'єкти дослідження

Експеримент був виконаний на щурах лінії vistar, вагою 100-180 г. Щури знаходились в однакових умовах, на звичайному раціоні.

Тварин було поділено на VI груп. Критерієм, за яким формувалися ці групи, виступали сполуки, що вводилися щурам (табл. 3.1).

3.2 Відбір матеріалу та проведення експерименту

Всі біохімічні досліди проводили на цільній крові. В якості антикоагулянта було обрано цитрат натрію ( 2г цитрату на 100 мл дистильованої води ). Розрахунки проводилися з урахуванням коефіцієнтів розведення.

Суспензія ракових клітин була отримана у тварини - донора такого ж виду безпосередньо до трансплантації за наступною схемою. Донора з пухлиною на 19-й день після інокуляції пухлини декапітували, вилучаючи пухлину. Отримували гомогенат пухлинних клітин: 20% суспензія клітин у фізіологічному розчині. Отриманий гомогенат клітин карциноми Герена інокулювався тваринам підшкірно.

Введення цисплатину проводили на 9-й день після інокуляції пухлини в дозі 8 мг/кг тіла тварини.

3.3 Методи

3.3.1 Геміглобінціанідний метод визначення гемоглобіна крові з використанням ацетонціангідрину

Для визначення рівня гемоглобіну у крові використовували геміглобінціанідний метод з застосуванням ацетонціангідрину.

Принцип методу:

Гемоглобін при взаємодії з залізосинеродистим калієм (червона кров'яна сіль) окиснюється в метгемоглобін (гемоглобін), який утворює з ацетонціангідріном забарвлений ціанметгемоглобін (геміглобінціанід), інтенсивність забарвлення якого пропорційна вмісту гемоглобіну.

Реактиви:

1. Трансформуючий розчин:

ацетонцінгідрин-0,5 мл

калій залізосинеродистий (червона кро'яна сіль)-200 мг

натрій двовуглекислий (бікарбонат натрію)-1 г

дистильована вода-до 1 л

1. Трансформуючий розчин. Трансформуючий розчин є стабільним в зберіганні у посуді з темного скла при кімнатній температурі протягом декількох місяців. При появі осаду або знебарвленні розчин не придатний до використання.

2. Стандартний розчин геміглобінціаніду. Концентрація гемиглобінцианіду у цьому стандартному розчині - 59,75 мг%, що відповідає концентрації гемоглобіна крові 150 г/л при розведенні крові в 251 раз. Зазначений стандартний розчин відповідає міжнародному еталонному розчину геміглобінціаніду. Стандартні розчини зберігають у холодильнику при +4єС у захищеному від світла місці (застерігати від замерзання).

Хід досліду:

1. Аналізуємий матеріал (суцільна кров) у кількості 0,02 мл додають до 5 мл трансформуючого розчину, добре перемішують та залишають на 10 хвилин.

2. Отримані розчини вимірюють на фотоелектроколориметрі при довжині хвилі 540 нм (кювети з довжиною оптичного шляху 5 або 10мм). Вимірювання проводять проти холостої проби (трансформуючий розчин та дистильована вода).

3. Стандартний розчин вимірюють при тих же умовах, що і дослідну пробу.

Розрахунок вмісту гемоглобіну роблять за формулою:

Hb, г/л = 150 * Едосл/Ест * Кр,

де Едосл - екстинкція дослідної проби;

Ест - екстинкція стандартного розчину;

Кр - коефіцієнт розведення крові.

Вимірюють екстинкцію калібрувального розчину геміглобінціаніду проти трансформуючого розчину (оптична густина відповідає пробі крові з вмістом гемоглобіну 150 г/л).

Вимірювання проводять проти холостої проби.

Нормальні величини гемоглобіну крові у щурів :

Венозна кров - 7,94-11,91 ммоль/л (128-192 г/л), середнє значення - 9,93 ммоль/л (160 г/л).

Периферична кров - 7,76 ± 0,35 ммоль/л (весна), 7,51 ± 0,062 ммоль/л (літо). канцерогенез мутація щур

Клініко-діагностичне значення. Зниження концентрації гемоглобіна у крові зустрічається при анеміях різної етиології.

Завищення концентрації гемоглобіна у крові відмічається при еритремії та симптоматичних реактивних еритроцитозах.

4. Результати та їх обговорення

4.1 Визначення концентрації гемоглобіну в крові здорових щурів та щурів з карциномою Герена

В ході експериментальної роботи досліджували рівень гемоглобіну крові. Дані приводяться у таблиці та на рисунку

В нормі рівень гемоглобіну складає г/л (табл. 4.1, рис. 4.1).

У контрольній групі спостерігається низький рівень гемоглобіну (88,3 г/л). Вивчення літературних джерел показало, що порушення гемо- та еритропоезу є постійною ознакою онкозахворювань, що може вказувати на злоякісність пухлинного росту. Особливо різкого ступеня анемія досягає тоді, коли має місце кровотеча пухлин. Ріст та розвиток карциноми Герена супроводжується некротичними явищами, особливо на кінцевих етапах прогресії пухлини.

Таблиця 4.1 Визначення концентрації гемоглобіну в крові у здорових щурів та у щурів з карциномою Герена під впливом комплексних сполук ренію з органічними лігандами та цисплатину, г/л

№

Сполука

№ щура

Вміст гемоглобіну

I.

Control

72

175,0

73

79,2

74

133,7

II.

T8

2

108,3

10

102,5

12

137,5

22

162,5

16

141,6

14

127,1

III

c - Pt

4

99,9

6

138,3

9

112,5

15

116,6

17

105,8

60

100,0

61

158,3

IV

T-8+Re-acetic P

38

210,8

39

227,1

40

212,5

43

226,2

46

124.9

51

97,9

52

231,2

V

T8+Re-acetic P+c-Pt

49

170,8

65

199,9

68

175,0

69

241,6

70

245,8

71

214,6

VI

T8+Re-propion

42

145,3

44

70,0

47

134,2

48

130,8

50

120,8

VII

T8+Re- propion+c Pt

41

202,1

45

189,6

VIII

T8+Re adaman

53

195,8

54

184,6

55

191,6

56

154,2

57

137,5

63

54,2

64

91,7

IX

T8+Re-adaman + c-Pt

58

139,6

59

79,2

62

162,5

66

227,1

67

208,3

X

T8+Re isobut

1

112,5

3

129,1

5

137,5

7

135,4

8

176,6

11

183,3

13

143,7

XI

T8+Re isobut (1:4)

20

160,4

23

170,8

25

171,6

28

165,8

29

151,2

30

209,1

31

193,7

32

192,9

33

212,5

XII

T8+Re isobut t(1:8)

18

195,3

19

203,3

21

199,2

24

192,2

26

227,5

27

192,2

34

155,4

35

144,6

36

197,9

37

195,5

Таблиця 4.1.1 Визначення концентрації гемоглобіну в крові у здорових щурів та у щурів з карциномою Герена під впливом комплексних сполук ренію з органічними лігандами та цисплатину, г/л

№ групи

Назва групи

Рівень гемоглобіну

Відхилення

I

Control

162,6

8,11

II

T8

129,9

6,49

III

c - Pt

118,7

5,93

IV

T-8+Re-acetic P

190,0

9,5

V

T8+Re-acetic P+c-Pt

207,9

10,39

VI

T8+Re-propion

120,2

6,01

VII

T8+Re- propion+c Pt

195,8

9,79

VIII

T8+Re adaman

144,2

7,21

IX

T8+Re-adaman + c-Pt

163,3

8,16

X

T8+Re isobut

145,4

7,27

XI

T8+Re isobut (1:4)

180,8

9,04

XII

T8+Re isobut t(1:8)

190,3

9,51

Таблиця 4.2 Визначення концентрації глікозильваного та фетального гемоглобіну в крові у здорових щурів та у щурів з карциномою Герена під впливом комплексних сполук ренію з органічними лігандами та цисплатину, г/л

№

Сполука

№ Щура

А 1 С

F

IV

T-8+Re-acetic P

38

4,7

39

4,9

40

4,2

43

4,0

46

4,8

51

4,4

0,3

52

4,2

V

T8+Re-acetic P+c-Pt

49

6,6

VI

T8+Re-propion

44

4,3

42

4,0

47

6,3

48

4,1

50

4,0

VII

T8+Re- propion+c Pt

45

5,2

0,3

Людина

1

5,6

2

9,3

Групи

Рівень гемоглобіну A1c

Відхилення

IV

4,4

0,22

VI

4,5

0,23

Таблиця 4.4 Визначення концентрації окремих фракцій гемоглобіну в крові у здорових щурів та у щурів з карциномою Герена під впливом комплексних сполук ренію з органічними лігандами та цисплатину, г/л

№

Сполука

№ Щура

А 1 А

L A 1 C / ChВ1

P3

A0

A 1 В

Unknown

IV

T-8+Re-acetic P

38

2,3

1,0

7,8

41,7

39

2,2

0,6

8,4

41,9

40

2,3

0,6

10,5

46,2

43

2,1

1,2

8,4

42,0

46

1,9

0,5

7,9

40,2

0,3

51

3,2

0,2

9,0

43,7

0,4

52

2,3

1,3

6,8

46,6

V

T8+Re-acetic P+c-Pt

49

1,9

0,6

9,6

44,4

0,2

VI

T8+Re-propion

44

2,3

0,4

6,1

47,3

42

2,2

0,4

-

47,8

0,2

Страница:


Подобные документы

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.

© 2000 — 2023, ООО «Олбест» Все права защищены