Роль збуджуючих амінокислот і оплатних механізмів у розвитку резистентних форм епілептичного синдрому (експериментальне дослідження)

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Одеському державному медичному університеті Міністерства охорони здоров'я України.

Науковий керівник: Доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України, Шандра Олексій Антонович, Одеський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри нормальної фізіології

Офіційні опоненти:

- доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України Гоженко Анатолій Іванович, Одеський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри загальної та клінічної патологічної фізіології;

- доктор медичних наук, доцент Кришталь Микола Васильович, Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця, м. Київ, доцент кафедри патологічної фізіології.

Провідна установа: Донецький державний медичний університет ім. М. Горького МОЗ України, кафедра патологічної фізіології.

Захист відбудеться "28" травня 2002 р. о 13:00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01 при Одеському державному медичному університеті МОЗ України (65026, м. Одеса, пров. Валіховський, 2).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Одеського державного медичного університету за адресою: 65026, м. Одеса, Валіховський пров., 3.

Автореферат розісланий "27" квітня 2002 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради к. мед. н. Соболєв Р.В.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Проблема резистентності до дії антиепілептичних впливів займає особливе місце в сучасній нейрофізіології та епілептології, вирішення якої створює передумови для підвищення ефективності лікування епілепсії (Л.А. Дзяк и соавт., 2001; H. Potschka et al., 2001).

Дослідженнями Г.Н. Крыжановского (1997), А.А. Шандры і співавт. (1999) доведено, що механізми резистентності до дії протиепілептичних препаратів забезпечуються системним характером порушень, а саме виникненням і підтриманням багатокомпонентних патологічних систем вогнищ гіперактивного збудження, які взаємодіють на основі активності детермінантного вогнища, а також із залученням численних нейрохімічних механізмів.

Одним із механізмів, які забезпечують протиепілептичну функцію мозку та підтримують належний рівень збудливості нейрональних утворень, є функціональна активність ендогенної опіатної системи (Г.Н. Крыжановский и соавт., 1991; A.L. Vaccarino, et al., 2000). Опіатна система бере участь у формуванні як про-, так і протисудорожного ефектів (Л.С. Годлевский, 1992; А.А. Олійник, 1997; G.A. Оlsоn et al., 2001). Важливо, що активація -опіатних рецепторів супроводжується протисудорожними ефектами (F.С. Tоrtеllа, 1993), тимчасом як активація m-опіатних рецепторів сприяє посиленню епілептиформних проявів (A.L. Vaccarino, et al., 2000).

У сучасних дослідженнях доведене важливе патогенетичне значення функціонального стану системи збуджуючих амінокислот у формуванні проявів віддаленого кіндлінгу - моделі форми епілептичного синдрому, резистентної до фармакологічної терапії (А.И. Брусенцов и соавт., 1998). Отже, контроль функціонального стану системи збуджуючих амінокислот є важливим аспектом терапії найбільш тяжких щодо лікування резистентних форм епілепсії (J.M. Witkin et al., 1999).

Однак, механізми взаємодії опіат-зумовлених процесів та активності агоністів рецепторів збуджуючих амінокислот, які визначають різні аспекти формування, розвитку та довготривалого існування епілептичної активності (ЕпА), залишаються недостатньо вивченими (A.L. Vaccarino, et al., 2000; D.M. Sаuсіеr et al., 1994; С.S. Wоng et al., 1996; G. Martin et al., 1997).

Найбільш перспективним напрямком у вивченні цієї проблеми є дослідження патогенетичних механізмів взаємодії ендогенної опіатної системи та системи збуджуючих амінокислот при хронічній епілептизації мозку (А.А. Шандра и соавт., 2001). При цьому важливо ураховувати структурні особливості нейрональних утворень, у яких відзначається висока наявність зазначених нейрохімічних систем мозку, зокрема гіпокампа (J.J. Wagner et al., 1997; M.L. Simmоns, et al., 1999; M.J. Denslow et al., 2001), як такої структури, в якій найбільш часто виникає патологічна детермінанта хронічного епілептичного синдрому під час кіндлінгу.

Таким чином, з'ясуванню патогенетичної ролі опіатергічних механізмів мозку при хронічній судорожній активності, що викликана агоністами збуджуючих амінокислот, присвячена ця робота.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом НДР кафедри нормальної фізіології Одеського державного медичного університету, затвердженої МОЗ України, "Вивчити механізми розвитку експериментального абстинентного синдрому на основі визначення функціональних змін, викликаних налоксоном, з метою розробки фармакологічних методів припинення проявів абстиненції" (№державної реєстрації 0196U001833).

Мета дослідження. З'ясувати роль опіатергічних механізмів у розвитку судорожної активності, викликаної агоністами системи збуджуючих амінокислот у тварин, у віддаленому періоді кіндлінгу.

Завдання дослідження.

1. Вивчити особливості судорожних реакцій, викликаних електростимуляцією мозку у тварин, у віддаленому періоді кіндлінгу на фоні активації m-,--k---і--d-опіатних рецепторів.

2. Дослідити особливості каїнат-викликаних судорог у щурів у віддаленому періоді електростимуляційного (ЕС) кіндлінгу мигдалика та пікротоксин-викликаного кіндлінгу в умовах активації різних типів опіатних рецепторів, у тому числі в окремих структурах мозку (гіпокамп, ретикулярна частина чорної речовини).

3. Дослідити динаміку вогнищевої ЕпА, викликаної за допомогою аплікацій каїнової кислоти (КК), NMDA, натрієвої солі бензилпеніциліну та азотнокислого стрихніну, в корі головного мозку кіндлінгових щурів в умовах стимуляції m-опіатних рецепторів.

4. Вивчити особливості популяційної активності пірамідних нейронів гіпокампа у віддаленому періоді ЕС-кіндлінгу мигдалика та пікротоксин-викликаного кіндлінгу в дослідах на переживаючих зрізах, а також в умовах впливу агоністів m-опіатних рецепторів та NMDA.

5. Дослідити ефективність блокування m-опіатних рецепторів налоксоном у віддаленому періоді кіндлінгу на виразність як кіндлінгових, так і викликаних КК судорог.

6. Вивчити характер взаємодії налоксону та антиепілептичних препаратів - діазепаму і вальпроату натрію - при судорожному синдромі у віддаленому періоді кіндлінгу.

Об'єкт дослідження - експериментальні моделі гострого та хронічного епілептичного синдрому.

Предмет дослідження - зміни латентного періоду судорог, тяжкості судорог, електричної активності структур мозку при експериментальному гострому і хронічному епілептичному синдромі в умовах модуляції функції опіатних рецепторів і системи збуджуючих амінокислот.

Методи дослідження. Для досягнення мети дослідження було застосовано експериментальні моделі судорожної активності, поведінкові, електрофізіологічні і статистичні методи.

Наукова новизна. Вперше встановлено, що у віддаленому періоді кіндлінгу підвищення чутливості до дії агоністів рецепторів збуджуючих амінокислот пов'язане з одночасним підвищенням чутливості до епілептогенної дії агоністів m-опіатних рецепторів (DАМGО). Доведено універсальний характер цього механізму - показано його значення як при ЕС-кіндлінзі мигдалика, так і при пікротоксин-викликаному кіндлінзі. Визначено зниження протисудорожної ефективності стимуляції центральних d---і--k-опіатних рецепторів (DADLE і динорфін А1-13) у віддаленому періоді кіндлінгу. Досліджено особливості ефектів внутрішньомозкових (внутрішньогіпокампальних та внутрішньонігральних) мікроін'єкцій агоністів різних типів опіатних рецепторів на кіндлінгову ЕпА та на ЕпА, викликану введенням КК, у щурів у віддаленому періоді кіндлінгу. Показано підвищення вогнищевої ЕпА, викликаної КК та NMDA, в структурах кори головного мозку під впливом DАМGО. Вперше досліджено спектр ритмів ЕЕГ у кіндлінгових тварин у віддаленому періоді кіндлінгу під впливом стимуляції ?-опіатних рецепторів: визначено підвищення наявності синхронізованих ритмів у корі головного мозку та структурах лімбічної системи.

Вперше досліджено особливості популяційних відповідей пірамідних клітин у зрізах гіпокампу у віддаленому періоді кіндлінгу: доведено збереженість механізмів зворотного гальмівного контролю, наявність феномену підвищеної чутливості до епілептогенних ефектів агоністів рецепторів збуджуючих амінокислот, посилення даного ефекту під впливом стимуляції m-опіатних рецепторів.

Показано протиепілептичну ефективність гальмування функції m-опіатних рецепторів за допомогою налоксону щодо віддалених кіндлінгових судорог, а також здатність налоксону потенціювати протисудорожну дію діазепаму стосовно каїнат-викликаних судорог у тварин з ЕС-кіндлінгом мигдалика і пікротоксин-викликаним кіндлінгом.

Науково-практичне значення роботи. Отримані дані являють собою патогенетичний базис щодо обґрунтування ефективності застосування невеликих доз налоксону в поєднанні з протиепілептичними препаратами з метою запобігання проявам резистентних форм епілепсії і їх лікування. Отримані результати є перспективними для з'ясування патофізіологічних механізмів резистентних форм епілепсії та патогенетичного обґрунтування відповідних засобів фармакотерапії.

Особистий внесок здобувача. Автором здійснено патентно-інформаційний пошук, підготовлено матеріали планування роботи, проведено всі експе-риментальні дослідження на тваринах, здійснено статистичну обробку отриманих результатів, сформульовано основні положення і висновки дисертаційного дослідження.

Апробація роботи. Основні положення дисертаційної роботи було викладено на засіданнях Одеського обласного товариства фізіологів (1998-2000), III Національному конгресі патофізіологів України з міжнародною участю (Одеса, 2000), республіканській конференції молодих учених "Актуальні питання діагностики і лікування невідкладних станів" (Донецьк, 2000), IV Європейському конгресі епілептологів (Флоренція, 2000), XIV Міжнародній конференції Польської антиепілептичної ліги (Варшава, 2000), II конференції Українського товариства нейронаук, присвяченій 70-річчю кафедри нормальної фізіології ДонДМУ (Донецьк, 2001), підсумкових конференціях молодих учених Одеського державного медичного університету (Одеса, 2000, 2001), конференції "Історія і сучасні досягнення фізіології в Україні" (Київ, 2001), науково-практичній конференції "Сучасні аспекти лікування епілепсії" (Одеса, 2001).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 13 наукових праць, із яких 4 статті у фахових наукових журналах, 9 тез доповідей у матеріалах конференцій та конгресів.

Обсяг і структура дисертації. Дисертацію викладено на 149 сторінках машинопису; вона складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, шести розділів власних досліджень, аналізу й узагальнення результатів, висновків, списку використаних джерел. Роботу ілюстровано 24 таблицями і 20 рисунками, яким відведено 9 повних сторінок. Список використаної літератури містить 258 джерел, з яких 29 - вітчизняні та 229 - іноземні.

Основний зміст роботи

Матеріали і методи дослідження. Експериментальні дослідження виконані на 734 щурах-самцях лінії Вістар масою 180-220 г, які утримувались в звичайних умовах віварію.

Для моделювання епілептичного синдрому під час досліду застосовували агоністи рецепторів збуджуючих амінокислот - NMDA, КК (С.А. Дамбинова, 1989; Л.Д. Ноздрачев и соавт., 1987). Внутрішньошлуночкове (в/шл) введення КК (0,3-1,5 мкг) викликало характерні судорожні прояви у вигляді типових клонічних судорог (КС) і тонічної екстензії передніх кінцівок (ТЕПК) (H.S. White et al., 1992). Визначали величину ED50 нейротоксинів, яка викликала КС і ТЕПК, а також відповідні показники в умовах введення досліджуваних фармакологічних агентів. КК (1 мкг) розчиняли в 10 мкл фосфатного буферу та вводили в/шл протягом 10-15 с за допомогою мікроін'єктора "Hаmіltоn" ("SGE", Австралія). Інтенсивність судорог вимірювали за загальноприйнятою шестибальною шкалою (А.А. Шандра, 1985).

Кіндлінг відтворювали за допомогою повторних ЕС мигдалика, а також введення підпорогових доз пікротоксину (А.А. Шандра и соавт., 1999). Тваринам контрольних груп внутрішньочеревинно (в/чер) вводили 0,9%-й розчин NаСl. Появу поодиноких епілептичних вогнищ викликали у щурів в умовах штучної вентиляції легень і м'язової релаксації (застосування d-тyбокyрарину, 0,2 мг/кг), шляхом аплікації шматочків фільтрувального паперу (2х2 мм), змочених у розчинах азотнокислого стрихніну (0,1%), натрієвої солі бензилпеніциліну (10.000 МО/мл), NMDA (10 мкг в 1 мкл), КК (5,0 мкг в 1 мкл), на лобові відділи кори мозку. Реєстрацію електричної активності здійснювали монополярно, для чого індиферентний електрод закріплювали в носових кістках черепа. Запис біопотенціалів здійснювали на 16-канальному електроенцефалографі ("Mediсоr", Угорщина). Визначали латентний період виникнення спайків, потужність епілептичної активності і тривалість існування епілептичних вогнищ.

Підготовка зрізів гіпокампа і дослідження популяційної активності пірамідних нейронів. Після декапітації тварин обидві половинки гіпокампа швидко розміщали в чашці Петрі з охолодженим до +5^оС розчином такого складу (у мМ на літр): NаCl-125; NaHСО3-26; КСl-5; МgCl2-3; глюкоза-20. Зрізи завтовшки 300-600 мкм нарізали тонким лезом, постійно зволожуючи поверхню гіпокампа. Протягом реєстрації електрофізіологічних показників здійснювали перфузію камери розчином такого складу (у мМ на літр): NаCl-135; NaHСО3-18; КСl-2,7; МgCl2-1,5; глюкоза-20 (рН 7,35-7,4). Розчини постійно насичували газовою сумішшю СО2 (95%) і О2 (5%) (М. І. Мітюшов, 1985). Повна заміна інкубаційного середовища в камері здійснювалася протягом 4 хв.

Колатералі Шаффера стимулювали парними прямокутними електричними імпульсами (тривалість 50 мкс, інтервали між імпульсами 10 і 100 мс) за допомогою біполярних електродів, виготовлених з ніхромового дроту. Джерелом електричних стимулів був електростимулятор ЕСУ-2.

Перша серія вимірювань здійснювалася в умовах інкубації зрізів гіпокампа без додавання препаратів, після чого в середовище додавали DAMGО (300 нМ) і проводили другу серію стимуляцій протягом 20 хв. Потім в інкубаційне середовище вводили NMDA (1,0 мкМ) і протягом 60 хв здійснювали стимуляції; через 20 і 40 хв від моменту введення препарату реєстрували відповідні зміни. Для кількісної оцінки ефекту від введення препаратів визначали відносну зміну амплітуди 10 послідовно усереднених популяційних спайків (Q) за формулою (V. Armand et al., 1999):

Q = (АО- АК)/АК х 100%,

де АО - амплітуда спайка в досліджуваній серії (при додаванні в інкубаційне середовище препаратів), АК - амплітуда спайків до моменту додавання препаратів в інкубаційне середовище.

Комп'ютерну обробку (запис і аналіз електричних процесів) здійснювали за допомогою АЦП LаbPC+ ("Nаtіоnаl Instruments", США) та оригінальної програми, розробленої за допомогою пакету LabView.

Всі отримані результати обробляли за допомогою загальноприйнятих у медико-біологічних дослідженнях параметричних і непараметричних методів статистичного аналізу. Для дослідження характеру взаємодії препаратів застосовували ізоболографічну методику (De Jоghn, 1961; R. F. Wallin et al., 1970). Статистичну обробку здійснювали на персональному комп'ютері за допомогою програми статистичного аналізу "SigmaStat" ("Jandel Scientific", 1994). Критерієм достовірності обирали P<0,05.

Результати досліджень та їх обговорення

1. Ефекти DAMGО, динорфіну А1-13 і DADLE на судорожну активність, викликану ЕС мигдалика у віддаленому періоді ЕС-кіндлінгу. Введення DАМGО (10 нмоль, в/шл) супроводжувалося скороченням латентного періоду виникнення судорог (P<0,01) і полегшенням розвитку судорог тяжкістю 5 балів. Локальне введення DАМGО у вентральний гіпокамп викликало доза-залежне збільшення тяжкості судорог дозами 5 і 10 нмоль (P<0,05). Введення динорфіну А1-13 і DADLE (10,0 нмоль, в/шл) супроводжувалося збільшенням латентного періоду перших судорог і запобігало розвитку генералізованих судорожних реакцій. Введення в гіпокамп динорфіну А1-13 і DADLE викликало зниження тяжкості судорог при застосуванні всіх доз (2,5; 5 і 10 нмоль) (P<0,05). Внутрішньонігральне застосування DАМGО збільшувало тяжкість судорог при введенні дози 10,0 нмоль і зменшувало латентний період перших судорог при всіх трьох дозах (P<0,01). За цих умов динорфін А1-13 дозами 5,0 і 10,0 нмоль зменшував тяжкість судорог і збільшував їх латентний період (P<0,01). Внутрішньонігральне введення DADLE супроводжувалося розвитком доза-залежного протисудорожного ефекту при дозах 5,0 і 10,0 нмоль (P<0,05). Таким чином, стимуляція активності m-опіатних рецепторів (DAMGО) у віддаленому періоді ЕС-кіндлінгу супроводжується полегшенням епілептогенезу, тимчасом як стимуляція k-опіатних рецепторів (динорфін А1-13) і, меншою мірою, d-опіатних рецепторів (DADLE) супроводжується протисудорожним ефектом.

2. Вплив DAMGО, динорфіну А1-13 і DADLE на судорожну активність, викликану агоністами збуджуючих амінокислот у інтактних і кіндлінгових тварин.

Ефекти DAMGО. Введення КК в/шл у віддаленому періоді кіндлінгу на фоні попереднього застосування DAMGО (10,0 нмоль, в/шл) дозою 0,1 мкг викликало ТЕПК у 30% кіндлінгових щурів, а дозою 1,0 мкг - у 80%. Середньоефективна доза епілептогену (ED50) становила 0,39±0,04 мкг, що було на 74,2% менше за ED50, визначену в групі тварин у віддаленому періоді кіндлінгу без введення DAMGО. В цих умовах ED50 КК, що викликає КС, склала 0,15±0,02 мкг, що було на 25,0% менше за аналогічний показник у кіндлінгових тварин без застосування DAMGO.

На фоні в/шл введення DАМGО (5,0 нмоль) у віддаленому періоді кіндлінгу КК дозою 0,6 мкг в/шл викликала КС, латентний період яких був менший, ніж такий у контролі, на 27,0% (P<0,05). В цих умовах тяжкість судорог склала 3,4±0,1 бали і була на 17,0% більшою, ніж у тварин контрольної групи (P<0,05) (рис. 1). Застосування більших доз DАМGО призводило до скорочення латентного періоду перших судорожних реакцій, який у всіх випадках був меншим за аналогічний контрольний показник (P<0,05). Також спостерігалося значне зростання інтенсивності судорожних реакцій і при введенні DАМGО максимальною дозою (50,0 нмоль) - у всіх щурів реєструвалися повторні генералізовані судороги з летальним результатом (P<0,05).

Застосування КК, що викликає ТЕПК (4,0 мкг) на фоні в/шл введення DАМGО дозою 5,0 нмоль супроводжувалося виникненням судорог, латентний період яких був меншим, ніж у контролі, на 45,3% (P<0,05). Судорожні прояви були сильнішими, ніж у контролі, на 23,0% (P<0,05). Збільшення дози DAMGО призводило до скорочення латентного періоду перших судорог, зростання виразності судорог: при введенні максимальної дози (50,0 нмоль) практично в усіх тварин відзначалися повторні судорожні реакції з летальними наслідками. В/шл введення інтактним тваринам аналогічних доз КК в умовах застосування DAMGО посилювало виразність судорожних реакцій тільки при застосуванні максимальної дози DAMGО (50,0 нмоль), при цьому судороги не набували повторного характеру і летального наслідку (рис.1).

Ефекти динорфіну А1-13. Застосування КК (0,05 мкг) на фоні попереднього введення динорфіну А1-13 (30 нмоль) викликало КС у 10% щурів, тимчасом як введення епілептогену дозою 0,5 мкг - у 60% тварин. ED50 КК збільшувалася до 0,42±0,04 мкг, що в 1,7 разу перевищувало ED50, визначену при самостійному введенні епілептогену. КК (0,5 мкг) на фоні введення динорфіну А1-13 (30 нмоль) викликала характерну ТЕПК у 10% щурів. При введенні КК (3,0 мкг) ТЕПК спостерігалася у 70% тварин. ED50 склала 2,21±0,2 мкг, що в 1,5 разу перевищувало ED50, визначену при самостійному введенні епілептогену.

Застосування динорфіну А1-13 в умовах в/шл введення інтактним щурам КК (0,6 мкг) призводило до доза-залежного подовження латентного періоду перших КС. При цьому введення препарату вже дозою 10,0 нмоль ефективно збільшувало досліджуваний показник (на 44,0%) (P<0,05). При застосуванні динорфіну А1-13 дозами 30,0 і 50,0 нмоль, КК викликала судороги, тяжкість яких була меншою, ніж у контролі (на 38,0 і 52,0% відповідно) (P<0,05). Застосування динорфіну А1-13 у тварин в умовах моделювання ТЕПК супроводжувалося доза-залежним збільшенням латентного періоду судорожних реакцій. Причому вже при дозі 5,0 нмоль латентний період судорог був вищим за такий в контролі на 37,0% (P<0,05). Введення дози динорфіну А1-13 (5,0 нмоль), мінімальної із досліджуваних, супроводжувалося зменшенням тяжкості судорог, викликаних КК (4,0 мкг), на 35,0% проти такого показника у контролі (P<0,05). Максимальна доза динорфіну А1-13 призводила до зменшення судорог, тяжкість яких складала 32,0% проти такого показника у контролі (P<0,05) (рис.2).

Аналогічне застосування динорфіну А1-13 у щурів у віддаленому періоді ЕС-кіндлінгу мигдалика супроводжувалося подовженням латентного періоду КС. При цьому тільки введення динорфіну А1-13 дозами 30,0 і 50,0 нмоль викликало збільшення латентного періоду, відповідно на 49,0 і 75,0%, проти такого показника в групі контролю (P<0,05). В жодній з досліджених доз динорфін А1-13 не викликав достовірного зниження тяжкості судорожних реакцій (P>0,05). При формуванні ТЕПК тільки в умовах використання максимальних доз пептиду (30,0 і 50,0 нмоль) відзначалося достовірне збільшення латентного періоду - відповідно на 53,0 і 75,0% проти таких у контролі (P<0,05). При застосуванні динорфіну А1-13 дозою 50,0 нмоль інтенсивність судорог була на 44,0% меншою, ніж у групі контролю (P<0,05).

Ефекти DADLE. Введення КК дозою 0,1 мкг на фоні застосування DADLE (в/шл, 30 нмоль) у віддаленому періоді ЕС-кіндлінгу супроводжувалося розвитком КС у 9,0% щурів. При введенні дозою 0,75 мкг епілептогену КС розвивалися у 58,3% щурів. ED50 КК за цих умов склала 0,63±0,05 мкг, що в 2,5 разу перевищувало аналогічний показник у кіндлінгових щурів до застосування DADLE. ED50 КК, яка викликає ТЕПК, склала 2,36±0,2 мкг, що було в 1,6 разу вище за аналогічний показник у кіндлінгових тварин без застосування DADLE.

Застосування DADLE дозами 30,0 і 50,0 нмоль із введенням КК (0,6 мкг) в/шл викликало у інтактних щурів збільшення латентного періоду перших судорог (на 46,0 і 74,0% відповідно) (P<0,05). При цьому тяжкість судорог була меншою за таку в групі контролю (на 35,0 і 45,0% відповідно) (P<0,05) (рис. 3). Аналогічне застосування DADLE у інтактних тварин із введенням КК (4,0 мкг) також супроводжувалося доза-залежним подовженням латентного періоду перших судорог, що при використанні епілептогену дозами 30,0 і 50,0 нмоль вірогідно перевищувало показник у тварин контрольної групи на 55,0 і 86,0% відповідно (P<0,05). Тяжкість судорожних проявів також доза-залежно зменшувалася: вже при в дозі 10,0 нмоль судороги були меншими за такі в контролі на 33,0% (P<0,05).

Застосування DADLE у щурів у віддаленому періоді кіндлінгу не змінювало ефекти КК (0,6 мкг) (P>0,05). Введення КК дозою 4,0 мкг, на фоні попереднього застосування DADLE (50,0 нмоль), супроводжувалося збільшенням латентного періоду перших судорог на 46,0% і зменшенням тяжкості судорожного синдрому на 30,0% проти таких показників у контролі (P<0,05). Слід зазначити, що у віддаленому періоді ЕС-кіндлінгу відзначається підвищення епілептогенних ефектів стимуляції центральних m-опіатних рецепторів під впливом DAMGО стосовно дії КК. При цьому зберігається протисудорожна ефективність динорфіну А1-13 і DADLE, однак її виразність була меншою проти такої у інтактних тварин.

3. Вплив DAMGО на вогнищеву ЕпА, викликану аплікацією епілептогенів на кору головного мозку кіндлінгових тварин. Аплікація розчину NMDA на лобові відділи кори головного мозку щурів у віддаленому періоді ЕС-кіндлінгу викликала розвиток спайкових потенціалів, латентний період виникнення яких був на 61,0% меншим, ніж у тварин контрольної групи (P<0,01). Потужність вогнищевої активності, яка визначалася до початку іктальної активності, перевищувала таку у щурів контрольної групи в 1,9 разу (P<0,001). Тривалість існування вогнищ була в 2 рази більшою, ніж в контролі (P<0,05). Аплікація розчину NMDA при завчасному застосуванні DАМGО (10,0 нмоль) викликала подальше скорочення латентного періоду виникнення розрядів, зростання потужності вогнищ, тривалості їх існування; при цьому тривалість існування вогнищ була у 1,8 разу більшою за таку у тварин дослідної групи без застосування DАМGО (P<0,05).

Аплікація КК супроводжувалася розвитком перших спайкових потенціалів, латентний період яких був меншим за такий в контролі на 35,5% (P>0,05). Потужність вогнищ була більшою, ніж у контролі, на 56,2%, а тривалість їхнього існування збільшувалась на 55,6% (Р<0,05). Аплікація КК в умовах застосування DАМGО супроводжувалася скороченням латентного періоду виникнення потенціалів на 48,1% проти такого показника у дослідній групі без застосування DАМGО (P<0,05). Максимальна потужність епілептичних вогнищ також збільшувалася порівняно з такою у інтактних щурів, а також у щурів без застосування DАМGО в 2,1 разу (P<0,01) і в 1,4 разу (P<0,05) відповідно. Показник тривалості існування вогнищ також перевищував такий у групах контролю і досліду без застосування DAMGО на 91,0 і 45,0% відповідно (P<0,05). DAMGO не впливав на вогнищеву ЕпА, викликану аплікацією розчинів пеніциліну і стрихніну в контрольній і дослідній групах.

4. Вплив DAMGO на динаміку фонової ЕЕГ у віддаленому періоді ЕС-кіндлінгу. В/шл уведення DАМGО (10,0 нмоль) супроводжувалося змінами потужності -активності, яка зменшувалася на 20,8% в гіпокампі порівняно з аналогічним рівнем до початку ЕС (P<0,05). -ритм в гіпокампі під впливом DАМGО істотно не змінювався (P>0,05), тимчасом як у всіх інших досліджених структурах мало місце помітне збільшення потужності -активності. Найбільшою мірою (у 2,2 разу) це збільшення відзначалося в лобових відділах кори мозку (P<0,05). Помітне зростання потужності активності -діапазону під впливом DАМGО відзначалося в лобових відділах кори мозку (у 2,1 разу) (P<0,05); на 38,5% даний показник зростав у гіпокампі (P>0,05). -активність збільшувалася на 52,0% (P<0,05) у лобових відділах кори мозку після застосування DАМGО. -активність збільшувалася на 60,6% у ділянці лівого мигдалика та на 47,7% - у гіпокампі (P<0,05). ЕЕГ, що реєструвалася біполярно, в ділянці стимуляції мигдалика характеризувалася тим, що до введення DАМGО активність була низькоамплітудною (20-40 мкВ), з частотою розрядів 30-80 Гц. Відразу після припинення введення DAMGО відзначався розвиток синхронізованої активності частотою від 10-20 до 40-50 Гц і амплітудою окремих потенціалів 100-200 мкВ. Подібна активність відзначалася в 18 з 27 щурів і реєструвалася протягом 20-40 с з моменту припинення введення DAMGО, а потім відновлювалися низькоамплітудні (20-40 мкВ) розряди частотою 30-80 Гц.

5. Особливості електричної активності зрізів гіпокампа в умовах формування ЕС-кіндлінгу. Стимуляція колатералей Шаффера викликала синаптичну відповідь у ділянці СА1 пірамідних нейронів гіпокампу. У віддаленому періоді кіндлінгу були відсутні відмінності між амплітудами викликаних потенціалів як при 10-мс, так і при 100-мс інтервалах порівняно з відповідними показниками в контролі (P>0,05). Введення в інкубаційне середовище DАМGО (300 нМ) разом з NMDA (1,0 мкМ) у таких кількостях, які при їх окремому застосуванні не змінювали параметри досліджуваних потенціалів, супроводжувалося зростанням амплітуди першого спайку на 47% порівняно з таким у контролі, збільшенням (у 2,7 разу) амплітуди другого спайка при 10-мс інтервалі між стимулами (P<0,05). Меншою мірою (на 22%) зростала амплітуда другого потенціалу в умовах парної ЕС з міжстимульним інтервалом 100 мс (P<0,05). За даних умов відзначався розвиток додаткових розрядів у період після другого викликаного потенціалу.

6. Особливості електричної активності зрізів гіпокампа в умовах формування пікротоксин-викликаного кіндлінгу. У ранньому періоді кіндлінгу величина стимулу, необхідного для реєстрації популяційної відповіді, становила 4,6±0,8 В у зрізах гіпокампа кіндлінгових тварин і 8,1±0,6 В - у зрізах тварин контрольної групи (Р<0,01). У віддаленому періоді кіндлінгу цей показник становив 3,1±0,4 В, що не відрізнялося від відповідного показника в щурів у ранньому періоді кіндлінгу (P>0,05). Амплітуда першого і другого спайків кіндлінгових зрізів становила 3,1±0,3 і 0,8±0,1 мВ відповідно - у ранньому періоді кіндлінгу, тимчасом як у контрольних дослідах ці показники дорівнювали відповідно 2,6±0,2 і 0,25±0,08 мВ. При цьому різниця величин ефективної амплітуди кіндлінгових і контрольних зрізів гіпокампа становила 13% (Р<0,05) для першого спайку і 67% (P<0,001) - для другого. Зазначений показник у віддаленому періоді становив відповідно 3,3±0,4 і 1,0±0,2 мВ, що не відрізнялося від показників у ранньому періоді кіндлінгу (P>0,05). Введення в інкубаційне середовище пікротоксину як у ранньому, так і у віддаленому періодах кіндлінгу супроводжувалося зростанням амплітуди популяційних спайків.

7. Ефекти дії DAMGО і NMDA. Амплітуда популяційного спайку тварин у віддаленому періоді пікротоксин-викликаного кіндлінгу становила 2,6±0,2 мВ і не відрізнялася істотно від такої у щурів групи контролю (інтактні тварини) (P>0,05). Розрахунковий коефіцієнт Q не змінювався в умовах введення в інкубаційне середовище DАМGО (300 нМ), хоча відзначалася тенденція до його збільшення в зрізах гіпокампа щурів з віддаленим кіндлінгом. Деяке зростання досліджуваного показника також мало місце у кіндлінгових щурів при додаванні в середовище NMDA (1,0 мкМ) (P>0,05). Введення в інкубаційне середовище NMDA (1,0 мкМ) на фоні завчасного введення DAMGО (300 нМ) супроводжувалося збільшенням досліджуваного показника, який протягом усього періоду спостереження перевищував відповідний показник у групах тварин з роздільним застосуванням препаратів (P<0,05). епілептичний синдром налоксон абстиненція

8. Ефективність сумісного застосування налоксону з антиепілептичними препаратами - діазепамом і вальпроатом натрію у віддаленому періоді кіндлінгу. Проведені дослідження показали, що налоксон був менш ефективним відносно каїнат-викликаних судорог у щурів з фармакологічним кіндлінгом - його ED50 у даних умовах була в 2,1 разу вищою від такого показника у щурів з ЕС-кіндлінгом. Аналогічна закономірність спостерігалася стосовно діазепаму та вальпроату натрію.

Перерахунок дози ED50 налоксону на моделі каїнат-викликаних судорог (0,6 мкг, в/шл) у віддаленому періоді ЕС-кіндлінгу показав її значне зниження в умовах сумісного введення різних доз діазепаму. Так, на фоні застосування дози діазепаму, що дорівнювала 80% від його ED50 знов розрахована доза ED50 налоксону була меншою за ED50 налоксону, визначену окремо, більше ніж у 30 разів і становила 0,005 мг/кг.

Перерахунок дози ED50 налоксону у щурів з фармакологічним кіндлінгом у віддаленому періоді його розвитку показав її значне зниження в умовах сумісного введення різних доз діазепаму. Так, на фоні застосування дози діиазепаму, що дорівнювала 20% від його ED50, знов розрахована доза ED50 налоксону була меншою за ED50 налоксону, визначену окремо, в 2 рази, а сумісно з дозою діазепаму, яка дорівнювала 60% від ED50, знов розрахована доза ED50 налоксону була меншою за ED50 налоксону, визначеної окремо, в 19 разів і становила 0,02 мг/кг.

Доза ED50 налоксону за умови сумісного введення різних доз вальпроату натрію була меншою за ED50 налоксону, визначену окремо, на 59,0% у віддаленому періоді ЕС-кіндлінгу і на 58,6% - при пікротоксин-викликаному кіндлінзі.

Висновки

У дисертації наведено узагальнення і нове вирішення проблеми вивчення механізмів взаємодії ендогенної опіатної системи й активності агоністів рецепторів збуджуючих амінокислот, які зумовлюють різні аспекти виникнення та розвитку резистентних форм епілепсії. Отримані результати свідчать, що у віддаленому періоді кіндлінгу підвищена чутливість до дії агоністів рецепторів збуджуючих амінокислот водночас пов'язана з підвищенням чутливості до епілептогенної дії агоністів m-опіатних рецепторів (DAMGО), що є важливою ланкою патогенезу резистентних форм експериментального епілептичного синдрому.

1. Віддалений період ЕС-кіндлінгу є моделлю резистентної форми епілепсії, що характеризується підсиленням виразності просудорожних ефектів, які спостерігаються при стимуляції m-опіатних рецепторів, і зниженням виразності протисудорожних ефектів, які спостерігаються при стимуляції k---і--d-опіатних рецепторів. При цьому характерним є розвиток феномену підвищення судорожної готовності до дії агоністів рецепторів збуджуючих амінокислот, підсилення виразності якого відзначається при стимуляції m-опіатних рецепторів, послаблення - під впливом стимуляції k- і d-опіатних рецепторів. Виразність просудорожних ефектів активації m-опіатних рецепторів у віддаленому періоді ЕС-кіндлінгу в порівняльному аспекті перевищує виразність протисудорожних ефектів активації k- і d-опіатних рецепторів.

2. Підсилення просудорожної дії агоністів збуджуючих амінокислот відзначається при внутрішньошлуночковому та внутрішньомозковому введенні агоністу m-опіатних рецепторів DАМGО, при аплікації КК і NMDA на лобові відділи кори головного мозку, а також при їхніх внутрішньомозкових уведеннях. Це свідчить про залучення структур старої та нової кори, ретикулярної частини чорної речовини до реалізації зазначеного ефекту.

3. Під впливом DАМGО у віддаленому періоді ЕС-кіндлінгу відзначається зміна спектральної характеристики ЕЕГ у щурів у вигляді підсилення потужності хвиль - і -діапазонів (у 2,2 і 2,1 разу відповідно), що свідчить про активацію синхронізації ЕЕГ під впливом стимуляції m-опіатних рецепторів у новій корі та лімбічній системі.

4. В основі розвитку судорожних феноменів віддаленого періоду ЕС-амігдалярного і пікротоксин-викликаного кіндлінгу лежать синаптичні зміни в сомі пірамідних нейронів гіпокампа, що проявляється підвищенням чутливості опіатних рецепторів до судорожної дії агоністів m-опіатних рецепторів, порушенням балансу ГАМК-зумовленого гальмування і збудження, що опосередковується системою збуджуючих амінокислот.

5. Блокування за допомогою налоксону (у діапазоні доз від 0,05 мг/кг до 1,0 мг/кг) m-опіатних рецепторів у віддаленому періоді ЕС і пікротоксин-викликаного кіндлінгу доза-залежно знижує інтенсивність розвитку каїнат-викликаних судорог, що проявляється зниженням тяжкості судорог на 55%.

6. В умовах застосування налоксону відзначається потенціювання протисудорожної дії діазепаму, сумація протисудорожної дії вальпроату натрію відносно каїнат-викликаних судорог у віддаленому періоді ЕС і пікротоксин-викликаного кіндлінгу.

7. Посилення епілептогенної активності агоністів рецепторів збуджуючих амінокислот, що відзначається впродовж віддаленого періоду ЕС і пікротоксин-викликаного кіндлінгу при стимуляції m-опіатних рецепторів і здійснюється за участю нейрональних утворень гіпокампа, - є важливою ланкою патогенезу фармакологічної резистентності епілептичного синдрому.

Список опублікованих праць за темою дисертації