Размещено на http://www.allbest.ru

Інститут педіатрії, акушерства та гінекології

академії медичних наук україни

14.01.01 - Акушерство та гінекологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Вміст біологічно-активних речовин у фолікулярній рідині та їх вплив на процеси запліднення ооцитів і розвиток ембріонів in vitrо при безплідності

Грищенко Микола Григорович

Київ - 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Харківському державному медичному університеті МОЗ України

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор

Щербина Микола Олександрович

Харківський державний медичний університет МОЗ України,

професор каф. акушерства та гінекології № 1

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор

Іванюта Лідія Іванівна

Інститут педіатрії, акушерства та гінекології АМН України,

завідувач відділом реабілітації репродуктивної функції жінок

доктор медичних наук, професор

Чайка Володимир Кирилович

Донецький державний медичний університет МОЗ України,

завідувач каф. акушерства, гінекології та перинатології факультету післядипломної освіти

Провідна установа:

Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика МОЗ України, кафедра акушерства та гінекології № 1

Захист відбудеться " 21 " січня 2003 року о 13.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.553.01 при Інституті педіатрії, акушерства та гінекології АМН України (04050, м. Київ, вул. Мануїльського, 8)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту педіатрії, акушерства та гінекології АМН України за адресою: 04050, м. Київ, вул. Мануїльського, 8.

Автореферат розісланий " 04 " грудня 2002 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Квашніна Л.В.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Протягом багатьох років безплідний шлюб залишається однією з актуальних проблем медицини, його загальна частота складає від 10,0 до 20,0 % (Б.М. Венцковський, 1994, Л.І. Іванюта, 1995, 1996). Неможливість мати дитину є важким випробуванням для подружньої пари. Відчуття "неповноцінності" сім'ї веде до розвитку хронічного стресу, значно знижує якість життя, працездатність чоловіка і жінки і часто приводить до дисгармонії шлюбу.

Існує велика кількість патологічних станів, при яких єдиним ефективним методом лікування безплідності є програма запліднення in vitro (ЗІВ) (В.І. Грищенко та співавт.; 1998, В.К. Чайка та співавт., 2001). На даний час програма ЗІВ отримала широке розповсюдження в усьому світі. За результатами офіційних міжнародних звітів за 1986 - 1994 рр., частота отримання вагітності при лікуванні безплідності методом ЗІВ в різних клініках досягає в середньому 20-30% у розрахунку на один переніс ембріонів. З огляду на медичну і соціальну вагомість проблеми безплідності, є актуальним пошук причин невдач програми ЗІВ із метою підвищення ефективності лікування, що зробить її також більш доступною для населення.

Одним із найважливіших факторів для запліднення в програмі ЗІВ є морфофункціональний стан яйцеклітини (А.Г. Корнацька, 1998). Фолікулярна рідина (ФР) є середовищем, що бере участь в дозріванні яйцеклітини і має регулюючі функції. У ФР преовуляторного фолікула закономірно змінюється концентрація деяких біологічно-активних речовин - значно підвищується концентрація простагландинів E₂ і F₂ (P.O. Janson, M. Brannstrom et al., 1988), зростає синтез реактивних кисневих сполук та інтенсивність перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) (Y. Menezo, J. Testart et al., 1984), досягаючи піка під час овуляції. Відомо, що метаболізм простагландинів тісно пов'язаний із процесами ПОЛ (K. Kinoshita, K. Satoh, S. Sakamoto , 1984).

Синтез простагландинів та мінімальний рівень ПОЛ є необхідними умовами для дозрівання ооцитів і взаємодії гамет (E. Cassano, L. Tosto, 1999; C. Calmels, J.J. Dubost et al., 1999). З іншого боку, присутність таких агресивних біологічно-активних речовин в ФР може вчинити негативний вплив на структурно-функціональні характеристики мембрани ооцита. Існують дані про несприятливу дію реактивних кисневих сполук на генетичний апарат клітини (M. Bras, J.W. Lens et al., 1996).

Аналіз літератури показав, що комплексного дослідження обміну простагландинів та стану процесів ПОЛ в ФР раніше не проводилось. Також серед дослідників не існує загальної уяви про значення обміну простагландинів, інтенсивності процесів ПОЛ і активності антиоксидантних ферментних систем у мікрооточенні ооциту, що свідчить про наукову новизну їх комплексного вивчення. Більш глибоке порозуміння процесів, що відбуваються в ФР, дозволить покращити прогнозування результатів, буде сприяти підвищенню ефективності лікування безплідності в програмі ЗІВ і матиме велике наукове і практичне значення.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження виконано згідно з планом науково-дослідної роботи, що проводиться на кафедрі акушерства і гінекології № 1 ХДМУ і є складовою частиною НДР ХДМУ Розробка методів діагностики, лікування, тканинної терапії при патології вагітності та порушеннях репродуктивної функції (МОЗ України, № державної реєстрації 0101U001905).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було розроблення методики оцінки функціональних властивостей ооцитів і визначення критеріїв прогнозування результатів запліднення ооцитів in vitro, розвитку повноцінних ембріонів і настання вагітності в програмі запліднення in vitro.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити слідуючи задачі:

1. Вивчити концентрацію простагландинів класів E₂ та F₂ і стан процесів перекисного окислення ліпідів у фолікулярній рідині людини в стимульованих і фізіологічних циклах;

2. Вивчити вплив різних схем стимуляції овуляції на концентрацію простагландинів класів E₂ та F₂ і стан процесів перекисного окислення ліпідів у фолікулярній рідині людини;

3. Вивчити здатність ооцитів до запліднення, морфологічні характеристики і темпи дроблення ембріонів у програмах ЗІВ в залежності від концентрації простагландинів класів E₂ та F₂ у фолікулярній рідині;

4. Вивчити вплив процесів перекисного окислення ліпідів і активності антиоксидантних систем у фолікулярній рідині на здатність ооцитів до запліднення, морфологічні характеристики і темпи дроблення ембріонів in vitro, частоту настання вагітності в програмі ЗІВ.

Об'єкт дослідження: здатність ооцитів до запліднення та розвитку ембріонів при лікуванні безплідності в програмі ЗІВ в залежності від концентрації простагландинів класів E₂ та F₂ та стану процесів перекисного окислення ліпідів у фолікулярній рідині.

Предмет дослідження: обмін простагландинів класів E₂ та F_2, інтенсивність процесів ПОЛ, активність антиоксидантних систем в фолікулярній рідині в фізіологічних циклах та в програмі ЗІВ, результати лікування в програмі ЗІВ. запліднення окислення ліпід фолікулярний

Методи дослідження: клінічні, інструментальні, морфологічні, біохімічні, математично - статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше було проведене комплексне дослідження, що включало визначення в ФР людини концентрації простагландинів E₂ і F₂, визначення вмісту продуктів перекисного окислення ліпідів, активності антиоксидантних ферментних систем у фізіологічних циклах і в програмі ЗІВ. При цьому виявлене значне підвищення інтенсивності процесів ПОЛ в ФР у програмі ЗІВ.

При порівняльному аналізі концентрації продуктів ПОЛ і активності антиоксидантних ферментних систем у циклах ЗІВ з різним відсотком запліднення ооцитів in vitro виявлене збільшення інтенсивності процесів ПОЛ і одночасна неспроможність антиоксидантних систем у випадках з незадовільними результатами лікування. В ряді спостережень отримані результати дозволили пояснити причини неефективного лікування в програмі ЗІВ.

В результаті порівняльного аналізу концентрації простагландинів E₂ і F₂ у циклах ЗІВ з різним відсотком запліднення було вперше встановлено тісний зв'язок між співвідношенням Pg E₂/F₂ і темпами дроблення ембріонів in vitro.

Виявлена залежність між активністю антиоксидантного ферменту супероксиддисмутази у ФР і морфологією ооцитів, одержаних у результаті стимуляції суперовуляції, темпами дроблення та морфологією ембріонів у програмі ЗІВ.

Практичне значення отриманих результатів. На підставі отриманих даних удосконалена система обстеження подружніх пар у програмі ЗІВ. Визначено оптимальні показники концентрації простагландинів E₂ і F₂ у ФР. Розроблено біохімічні критерії визначення стану ПОЛ у ФР, що впливає на процеси дозрівання і запліднення ооцитів, морфологічні властивості і темпи дроблення ембріонів у програмі ЗІВ. Розроблено критерії прогнозування показників ембріологічного етапу програми ЗІВ.

Запропоновані методи діагностики впроваджені в роботу клінічного пологового будинку №5 м. Харкова, відділу кріобіології системи репродукції Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, міжрегіонального центру планування родини м. Харкова, центру репродукції і генетики людини “Імплант”.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто проведено вивчення та узагальнення сучасних даних вітчизняної та зарубіжної літератури, визначено напрямок, мету та задачі дослідження.

Обстежено 210 пацієнтів. Проведено забір матеріалу для біохімічних досліджень (ідентифікація і кількісне визначення Pg E₂ і Pg F₂ , вимір концентрації малонового діальдегіду, дієнових кон'югатів, відновленого глутатіона, вивчення активності глутатіонпероксидази, глутатіонредуктази, каталази і супероксиддисмутази). Проведено клініко-лабораторний аналіз ембріологічного етапу програми ЗІВ. Підбор і обстеження пацієнтів у клінічних групах здійснювалися при активній підтримці к.м.н. В.І.Піняєва і к.м.н. Л.І.Луцької. К.м.н. Г.Г.Юрченко і к.б.н. М.І.Крамар допомагали при обстеженні чоловіків у безплідних подружніх парах. К.б.н. М.П.Петрушко і І.В.Терпяча надали допомогу при вивченні результатів ембріологічного етапу програми ЗІВ. Освоєння методик визначення концентрації простагландинів, вивчення інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів і активності антиоксидантних систем у фолікулярній рідині людини було здійснено при участі к.б.н. В.В.Рязанцева та О.Ю.Семенченка.

Дисертантом проведений статистичний аналіз та узагальнення матеріалу. Розроблено комплекс біохімічних досліджень, що включає визначення інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів, активності супероксиддисмутази, концентрації відновленого глутатіона і співвідношення Pg E₂/F₂ у фолікулярній рідині, який може бути використаний при застосуванні допоміжних репродуктивних технологій для прогнозування здатності ооцитів до запліднення і вірогідності розвитку повноцінних ембріонів. Втілено його в практику лікування.

Обґрунтовані висновки та практичні рекомендації. В процесі виконання роботи проводилася підготовка матеріалів до публікації.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень докладені на міжнародному симпозіумі “Биоэтика на пороге III тысячелетия” (Україна, м. Харків, 2000 р.); на конференції молодих вчених Харківського державного медичного університету (Харків, ХДМУ, 2000 - 2002 роки); на Харківській обласній конференції молодих вчених (2002 р.); на конференції, присвяченій підготовці лікарів - інтернів (2001, 2002 р.); на засіданні Харківського наукового товариства акушерів-гінекологів (2002 р.).

Публікації. Головні положення дисертації викладені в 12 друкованих роботах. 3 статті в фахових журналах, патент на винахід (48932А від 15.08.2002, Бюл.№8), 2 рішення про видачу патенту на винахід (заявка № 2002075609 від 08.07.2002, рішення від 28.08.2002 та заявка № 2002075611 від 08.07.2002, рішення від 28.08.2002), 6 робіт в збірниках наукових праць та тезах доповідей на наукових форумах.

Структура та об'єм дисертації. Дисертація викладена на 184 сторінках друкованого тексту. Вона складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, 4 розділів власних досліджень, аналізу й узагальнення отриманих результатів, висновків, списку літературних джерел, що містить 241 найменування, з них 157 - іноземних авторів (на 25 сторінках). Дисертація ілюстрована 9 таблицями і 12 рисунками, що займають 7 повних сторінок тексту.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ роботи

Загальна методика і основні методи дослідження. Для вирішення поставлених у роботі задач було обстежено 210 пацієнтів. Досліджено 90 подружніх пар, що звернулися з приводу безплідності і були включені в програму лікування методом ЗІВ. 30 пацієнток з фізіологічними циклами увійшли в контрольну групу.

Були виділені 4 клінічні групи. У першу групу були включені подружні пари в програмі ЗІВ у тих випадках, коли відсоток запліднення ооцитів in vitro склав 66,7 - 100% (n = 30); у другу групу - 33,4 - 66,6% запліднення ооцитів in vitro (n = 30); у третю групу - 0 - 33,3% запліднення ооцитів in vitro (n = 30);

Контрольну групу склали пацієнтки, яким були проведені лапароскопічні операції в фізіологічних циклах (n = 30). Протипоказаннями для включення пацієнток у контрольну групу були виявлені порушення гормонального гомеостазу, використання будь-яких гормональних препаратів протягом 6 менструальних циклів перед оперативним втручанням, систематичний прийом негормональних фармакологічних препаратів, патологічні зміни тканини яєчників.

Перед початком лікування всі безплідні подружні пари та пацієнтки контрольної групи були всебічно обстежені за загальноприйнятою методикою. Обстеження включало в себе збір і аналіз даних анамнезу життя, анамнезу даного захворювання, проведення клінічних, лабораторних, інструментальних досліджень обох партнерів.

Серед спеціальних методів дослідження жінкам в обов'язковому порядку здійснювали динамічне ультразвукове сканування органів малого тазу. Дослідження проводили за допомогою вагинального секторального датчика з частотою сканування 7 Мгц (Bruel & Kjaer, Данія).

Всім чоловікам у безплідних подружніх парах проводилося дослідження сперми. Воно здійснювалось згідно з рекомендаціями ВООЗ 1994-1997 рр. за загальноприйнятою методикою.

При індукції овуляції в програмі ЗІВ були використані загальноприйняті протоколи з використанням препаратів ФСГ (Metrodin, "Serono") і аналогів гонадотропін - рилізінг гормону (Suprefact, "Hoechst"). Через 34 - 35 годин після введення тригерної дози ЧХГ (Profasi, "Serono") здійснювали пункцію фолікулів і аспірацію ооцитів. Одночасно з аспірацією ооцитів у пацієнток у програмі ЗІВ здійснювалася оцінка стану ендометрію. Підготовку до аспірації фолікулів, процедуру аспірації, селекцію активно-рухливої фракції сперміїв, інсемінацію і культивування ооцитів in vitro, перенос ембріонів в порожнину матки та підтримку лютеінової фази здійснювали за загальноприйнятою методикою (Dale B., Elder K., 1997).

Відразу ж після пункції виявлені ооцити переносили з ФР у чисте середовище для культивування. Зразки ФР відбирали і кріоконсервували за оригінальною методикою (А.Г. Геродес, 1999), при використанні якої забезпечується довгострокове і надійне збереження біологічних і біохімічних (у тому числі і ферментативних) властивостей ФР.

Оцінювались слідуючи параметри ембріологічного етапу програми ЗІВ: морфологія ооцитів, відсоток запліднення ооцитів, морфологія та темпи дроблення ембріонів.

Морфологію і ступінь зрілості ооцитів оцінювали без попереднього видалення клітин cumulus. В залежності від стану комплексу ооцит-cumulus клітини класифікували, як незрілі, зрілі, перезрілі або дегенеративні (B. Dale, K. Elder, 1997).

Морфологічну оцінку ембріонів робили відповідно до критеріїв, запропонованих Erenus (1991). Оптимальними (Grade 1) вважали ембріони без ознак фрагментації, що мають рівні, чіткі, сферичні бластомери; задовільними (Grade 2) - ембріони з незначною (до 25%) фрагментацією цитоплазми і нерівномірним розвитком бластомерів; незадовільними (Grade 3) - ембріони з фрагментацією бластомерів більш 25%. Як правило, у таких ембріонах відзначалася наявність вакуолей, невідповідність розмірів бластомерів термінам культивування, ознаки дегенерації.

Ідентифікацію і кількісне визначення Pg E₂ і Pg F₂ у зразках ФР здійснювали методом високоефективної рідинної хроматографії. Для екстракції простагландинів був використаний метод Horton (1972). Аналіз вмісту простагландинів E₂ і F₂ у ФР проведений з використанням методики Inayama et al. (1980) і Wessel et al. (1988). Концентрацію простагландинів у стандартному розчині визначали методом спектрофотометрії за Л.Д. Бергельсоном (1989). Також досліджувався показник відношення концентрації Pg E₂ до Pg F₂.

Для оцінки інтенсивності процесів ПОЛ у фолікулярній рідині використовували методи, що виявляють продукти ПОЛ - малоновый діальдегід (МДА) та дієнові кон'югати. Визначення МДА здійснювали за методом В.І.Скорнякова з співавт. (1988). Концентрацію МДА розраховували відповідно до методики М.С.Гончаренка з співавт.(1985). ДК визначали за методом В.Е Каган (1986).

Для оцінки стану антиоксидантних ферментних систем ми визначали в ФР концентрацію відновленого глутатіона (GSH), активність глутатіонпероксидази (ГП), глутатіонредуктази (ГР), каталази і супероксиддисмутази (СОД).

Визначення концентрації відновленого глутатіона (GSH) здійснювали за методом Batist et al. (1986). Вивчення активності глутатіонзалежних ферментів (ГП, ГР) здійснювали за методом С.Н. Власової з співавт. (1990).

Супероксиддисмутазну активність ФР оцінювали за методом В.С. Гуревич з співавт. (1990).

Для визначення активності каталазы був використаний метод Aebi у модифікації М.А.Королюк з співавт. (1988).

Статистичну обробку одержаних результатів проводили методом Фішера - Стюдента (Бейлі, 1964) при рівні вірогідності p<0,05 та p<0,01 на ПЕВМ COMPAQ Deskpro з використанням пакету програм EXСEL. Також оцінювалася кореляційна залежність між показниками.

Результати власних досліджень та їх обговорення.

Суттєвих розходжень за віком, тривалістю та причинами безплідності в досліджуваних групах виявлено не було. У наше дослідження включалися переважно жінки, безплідність яких була обумовлена трубно - перитонеальным фактором, або подружні пари, у яких безплідність носила змішаний характер з перевагою трубно-перитонеального фактору.

Гінекологічні, соматичні та інфекційні захворювання, результати тестів функціональної діагностики та рентгенологічного дослідження в обстежених групах розподілялися рівномірно. Ми також не включали в дослідження подружні пари, у яких безплідність була обумовлена імунологічними причинами.

За кількісними і функціональними показниками спермограм достовірних розходжень між клінічними групами виявлено не було. (p>0,05).

Звертали на себе увагу результати визначення в ФР продуктів ПОЛ, що свідчили про вірогідно більш низьку інтенсивність процесів ПОЛ (p<0,01) у ФР пацієнток в фізіологічних циклах при порівнянні з пацієнтками в програмі ЗІВ (Таблиця 1).

В більшому ступені зростала концентрація МДА (концентрація достовірно вище в 1-й, 2-й і 3-й групах при порівнянні з контрольною групою). Концентрація ДК також зростала в ФР пацієнток у циклах ЗІВ, але достовірне збільшення було виявлено в 2-й (p<0,05) і, особливо, у 3-й (p<0,01) групах.

Отримані результати вказують на достовірне збільшення концентрації продуктів ПОЛ в ФР 3-й групи з найнижчим відсотком запліднення ооцитів in vitro. Можливо, саме вплив реактивних кисневих сполук на ооцити став причиною зниження відсотка запліднення в 3-й групі.

Була виявлена виражена негативна залежність між концентрацією МДА в ФР і здатністю ооцитів до запліднення in vitro (r = - 0,341). Для показника ДК вона була значно меншою (r = - 0,211).

При цьому достовірних розходжень у ступені зрілості ооцитів в залежності від концентрації продуктів ПОЛ у ФР виявлено не було. Можливо, це обумовлено переважним впливом процесів ПОЛ на фосфоліпіди клітинних мембран. Таким чином, процеси дозрівання ооцитів значно не порушуються - змінюються, переважно, функціональні властивості ооцитів, що призводить до зниження здатності ооцитів до запліднення in vitro. Також звертає на себе увагу значне збільшення кількості ооцитів з ознаками дегенерації в групі з найбільшою концентрацією продуктів ПОЛ (Рис. 1). У 3-й групі були сконцентровані більш ніж 80% усіх дегенеративних ооцитів. Можна припустити, що причиною дегенерації ооцитів був саме вплив реактивних кисневих сполук.

Спостерігалась аналогічна залежність між морфологією ембріонів і концентрацією продуктів ПОЛ в ФР (Рис. 2). Коефіцієнт кореляції між морфологією ембріонів і рівнем ДК у ФР складав - 0,298. Більш сильний кореляційний взаємозв'язок був виявлений між морфологією отриманих ембріонів і рівнем МДА в ФР - коефіцієнт кореляції складав - 0,359. Очевидно, що підвищення інтенсивності ПОЛ в ФР негативно впливає на морфологію ембріонів у програмі ЗІВ.

Слід відзначити, що незадовільні показники ембріологічного етапу ЗІВ, які спостерігалися в 3-й групі, в клінічній практиці зустрічаються рідко. Ми протягом 4 років цілеспрямовано проводили підбір і аналіз подібних випадків для з'ясування причин їх виникнення.

Результати визначення концентрації простагландинів класів E₂ і F₂ у ФР свідчать про те, що концентрація Pg F₂ у фізіологічних циклах була вірогідно нижче, ніж у програмі ЗІВ (p<0,05).

Достовірне зниження концентрації Pg E₂ (p<0,05) було виявлено тільки в 3-й групі. Слід зазначити, що концентрації Pg F₂ і Pg E₂ у 1-й і 2-й групах були значно ближчі до показників фізіологічних циклів, ніж у групі з найменшим відсотком запліднення. Звертає на себе увагу значне зниження (більш ніж у 2 рази) відношення Pg E₂/F₂ у 3-й групі.

Було встановлено, що морфологічні властивості, ступінь зрілості ооцитів і відсоток їх запліднення in vitro не пов'язані з концентрацією Pg F₂ і концентрацією Pg E₂, але був виявлений кореляційний зв'язок між здатністю ооцитів до запліднення і відношенням Pg E₂/F₂ (r = + 0,322), що свідчить про більше діагностичне значення вивчення співвідношення простагландинів у ФР.

Коефіцієнт кореляції між морфологією ембріонів і співвідношенням Pg E₂/F₂ складає + 0,360. Виражений зв'язок був виявлений між співвідношенням Pg E₂/F₂ і темпами дроблення ембріонів in vitro - коефіцієнт кореляції складає + 0,740, що свідчить про високий ступінь зв'язку між наведеними показниками (Рис. 3).

З огляду на тісний зв'язок між процесами синтезу й обміну простагландинів, генерацією реактивних кисневих сполук, наявність спільних регуляторних механізмів і синхронність подій (каскад реакцій активізується після піка ЛГ) можна припустити, що паралельне збільшення інтенсивності процесів ПОЛ і синтезу Pg F₂ у ФР пацієнток в програмі ЗІВ не є випадковим і характеризує вихід цих процесів у преовуляторном фолікулі при стимуляції суперовуляції за фізіологічні межі. Ці дані вказують на підвищену небезпеку впливу реактивних кисневих сполук на ооцити при лікуванні безплідності в програмі ЗІВ

Незважаючи на збільшення інтенсивності ПОЛ в ФР пацієнток у програмі ЗІВ, не спостерігалось пропорційного збільшення активності антиоксидантних ферментів (Таблиця 2).

Достовірних розходжень за рівнем активності ГП, ГР і каталази у виділених групах не було зареєстровано. Мова може йти тільки про тенденції до підвищення активності ГР і ГП у 3-й групі. Очевидно, відносно більш високий вміст GSH у ФР 3-й групи не був пов'язаний з активністю глутатіонзалежних антиоксидантних ферментів. Можна припустити, що в ФР більше значення мають власні антиоксидантні властивості глутатіона, а не його косубстратні функції.

Відомо, що концентрація продуктів ПОЛ в ФР значно нижча, ніж у плазмі. Можна припустити, що підвищення інтенсивності ПОЛ в ФР, обумовлене стимуляцією суперовуляції, не перевищує граничних значень, достатніх для активації глутатіонпероксидазної ферментної системи. У нашому дослідженні тільки в 3-й групі інтенсивність ПОЛ, в якійсь мірі, перевищила цей поріг.

Висока вірогідність того, що причиною підвищення інтенсивності перекисних процесів у ФР 3-й групи було збільшення концентрації супероксидного радикала. Про це свідчить зареєстроване підвищення активності СОД у 3,8 рази, тому що активність цього ферменту безпосередньо залежить від концентрації супероксид-аніону.

Існує припущення, що СОД у сполученні з ферментами, що знешкоджують перекисні продукти (ГП, каталаза), є основною ферментною захисною системою, що попереджує дію супероксидного радикалу й інших активних форм кисню на клітину. Встановлено, що СОД у тканинах яєчника виявляється тільки в theca interna і в ФР. З усіх досліджених у ФР антиоксидантних ферментів тільки активність СОД була тісно пов'язана з відсотком запліднення ооцитів in vitro (r = - 0,732). Більш того, вона також впливала на морфологію і дозрівання ооцитів - підвищення активності СОД у ФР супроводжувалося водночас збільшенням долі ооцитів з ознаками дегенерації (r = 0,335), зменшенням кількості зрілих, морфологічно повноцінних ооцитів (r = - 0,387 ). Але найбільш виразний кореляційний зв'язок був виявлений між активністю СОД і погіршенням морфології ембріонів (r = - 0,809).

З огляду на подібну високу специфічність даного ферменту для ФР, а також виявлені зміни, можна припустити, що саме СОД відіграє головну роль у підтримці інтенсивності процесів ПОЛ в ФР на оптимальному рівні, але дія його не завжди ефективна і не захищає ооцит від впливу реактивних кисневих сполук.

Комплексне визначення активності СОД, концентрації GSH і МДА, співвідношення Pg E₂/F₂ у ФР може бути використане як методика, що дозволяє оцінити ступінь перекисних впливів на ооцит. Проведення запропонованого набору досліджень дає можливість прогнозувати здатність ооцитів до запліднення in vitro, розвиток морфологічно повноцінних ембріонів, придатних для переносу в порожнину матки при лікуванні безплідності в програмі ЗІВ. Використання цих методів у комплексі дозволить більш точно прогнозувати результати лікування і, можливо, збільшити ефективність лікування безплідності в програмі ЗІВ. Показники, що були досліджені в роботі, вигідно відрізняються від відомих тим, що вони можуть використовуватись безпосередньо після пункції фолікулів. Отже, вони можуть бути використані для більш раннього прогнозування ефективності лікування в програмі ЗІВ.

Ми пропонуємо дослідження активності СОД у ФР як експрес-метод визначення здатності ооцитів до запліднення in vitro. При виявленні підвищеної активності цього ферменту, нам здається доцільним рекомендувати застосування технології intracytoplasmic sperm injection (ICSI) навіть при відносно задовільних характеристиках сперми. Це дозволить уникнути додаткового впливу на ооцит реактивних кисневих сполук, що виробляють спермії при стандартній процедурі ЗІВ. Вагомим аргументом до застосування методу ICSI є дані про те, що в результаті впливу продуктів ПОЛ, в першу чергу, страждають біологічні мембрани. Стан клітинної стінки ооциту визначає успішний процес запліднення. Використання процедури ICSI в умовах, коли функціональна повноцінність клітинної стінки ооциту викликає сумніви, дозволить запобігти розвитку поліспермії і знизить вірогідність відсутності запліднення, обумовленого мембранним фактором. Варто нагадати, що процедура реінсеминації ооцитів in vitro, до якої доводиться звертатися у випадках з низьким відсотком запліднення, характеризується вкрай низькою ефективністю і високим ризиком поліспермії.

На нашу думку, профілактичне застосування процедури ICSI в таких випадках дозволить уникнути незадовільних результатів лабораторного етапу програми ЗІВ і, можливо, буде сприяти збільшенню ефективність лікування безплідності з використанням ДРТ.

Той факт, що в стимульованих циклах у програмі ЗІВ в порівнянні з фізіологічними циклами значно зростає інтенсивність процесів ПОЛ, свідчить про підвищену небезпеку впливу реактивних кисневих сполук на ооцити при лікуванні безплідності в програмі ЗІВ. З огляду на літературні дані про здатність ПОЛ безпосередньо впливати на ДНК клітини, ми вважаємо доцільним акцентувати увагу на випадках, коли виявляється значне підвищення інтенсивності процесів ПОЛ в ФР. Можливо, ця група хворих має потребу в більш пильному обстеженні і медико-генетичному консультуванні в випадках, коли вагітність наступила.

ВИСНОВКИ

З метою підвищення ефективності лікування безплідності методом запліднення in vitro було проведене комплексне біохімічне дослідження фолікулярної рідини людини після стимуляції овуляції та в фізіологічних циклах, що дозволило уточнити деякі важливі аспекти, які впливають на результати лікування безплідності в програмі ЗІВ, і розробити ряд прогностичних критеріїв.

Встановлено, що в фолікулярній рідині, отриманій в програмі ЗІВ, інтенсивність процесів перекисного окислення ліпідів і синтезу Pg F₂ значно перевищує відповідні показники у фолікулярній рідині пацієнток у фізіологічних циклах, що свідчить про вихід цих процесів у преовуляторному фолікулі при стимуляції суперовуляції за фізіологічні межі. Ці дані вказують на підвищену небезпеку впливу реактивних кисневих сполук на ооцити при лікуванні безплідності в програмі ЗІВ.

При зіставленні результатів виміру у фолікулярній рідині концентрації простагландинів, продуктів перекисного окислення ліпідів та активності антиоксидантних ферментних систем у стимульованих циклах встановлено, що вибір схеми стимуляції суперовуляції не впливає на досліджені показники.

Виявлено достовірний взаємозв'язок між станом процесів перекисного окислення ліпідів у фолікулярній рідині і здатністю ооцитів до запліднення in vitro. Підвищення інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів у фолікулярній рідині негативно впливає на морфологічні й, у великій мірі, функціональні характеристики ооцитів, що проявляється в тенденції до збільшення кількості клітин з ознаками деградації, а також у достовірному зниженні їх здатності до запліднення, погіршенні морфологічних властивостей ембріонів.

Підвищення інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів у фолікулярній рідині найбільш виражене в групах з найменшим відсотком запліднення ооцитів і з більшою фрагментацією ембріонів. Про це свідчить підвищений вміст продуктів перекисного окислення ліпідів (малонового діальдегіду і дієнових кон'югатів) у фолікулярній рідині.

У фолікулярній рідині при підвищенні інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів відзначається достовірне збільшення концентрації відновленого глутатіона і супероксиддисмутазної активності. Збільшення активності супероксиддисмутази в 3,8 рази у групі з найменшим відсотком запліднення свідчить про значення супероксидного радикала, як найбільш небезпечної реактивної кисневої сполуки у фолікулярній рідині.

Достовірних змін активності глутатіонпероксидази, глутатіонтрансферази і каталази у фолікулярній рідині в зв'язку зі змінами інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів не виявлено.

Збільшення інтенсивності перекисного окислення ліпідів значною мірою впливає на обмін простагландинів у фолікулярній рідині. Надмірний вплив реактивних кисневих сполук приводить до зміни концентрації простагландинів у фолікулярній рідині - зростає концентрація Pg F₂ при відносному зниженні концентрації Pg E₂. У більшому ступені змінюється співвідношення Pg E₂/F₂ ;

Запропонований комплекс біохімічних досліджень, що включає визначення інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів, активності супероксиддисмутази, концентрації відновленого глутатіона і співвідношення Pg E₂/F₂ у фолікулярній рідині, може бути використаний при застосуванні допоміжних репродуктивних технологій для прогнозування здатності ооцитів до запліднення і вірогідності розвитку повноцінних ембріонів.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. З огляду на відсутність критеріїв для оцінки інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів у фолікулярній рідині пацієнток в програмі ЗІВ до пункції й аспірації ооцитів, є рекомендованим максимально скоротити перебування ооцитів у фолікулярній рідині після аспірації фолікулів. Для досягнення цієї мети є оптимальною система активної аспірації з використанням промивних середовищ у процесі пункції. Ця методика сприяє більшому розведенню фолікулярної рідини на момент аспірації і мінімізації впливу компонентів фолікулярної рідини на ооцит.

2. Метод дослідження активності супероксиддисмутази у фолікулярній рідині є швидким, методично простим, неінвазивним, високоінформативним і є рекомендованим як експрес-метод для визначення здатності ооцитів до запліднення in vitro.

3. Комплекс методів в обсязі визначення у фолікулярній рідині активності супероксиддисмутази, концентрації малонового діальдегіду, дієнових кон'югатів, відновленого глутатіона, співвідношення Pg E₂/F₂ може бути використаний для більш точного прогнозування здатності ооцитів до запліднення і вірогідності розвитку повноцінних ембріонів у програмі ЗІВ.

4. При виявленні підвищеної активності супероксиддисмутази у фолікулярній рідині, нам здається, можна ставити питання про застосування процедури intracytoplasmic sperm injection навіть при відносно задовільних характеристиках сперми. Це дозволить попередити додатковий вплив на ооцит реактивних кисневих сполук, що виробляють спермії при стандартній процедурі ЗІВ, і підвищити відсоток запліднення ооцитів in vitro.

5. З огляду на дані про здатності реактивних кисневих сполук безпосередньо впливати на генетичний апарат клітини, доцільно акцентувати увагу на випадках, в яких виявляється підвищення інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів у фолікулярній рідині. Імовірно, ця група хворих має потребу в більш пильному спостереженні і медико-генетичному консультуванні в тих випадках, коли настала вагітність в результаті лікування безплідності в програмі ЗІВ.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗДОБУВАЧА ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Использование фолликулярной жидкости человека на этапе культивирования гамет и эмбрионов в программе ЭКО // Проблемы репродукции. - М., - 1999. - № 6. - С. 43-47 (співавт.: Грищенко В.И., Геродес А.Г., Петрушко М.П., Пиняев В.И.; огляд літературних джерел).

2. Влияние интенсивности процессов перекисного окисления липидов в фолликулярной жидкости человека на оплодотворение ооцитов и развитие эмбрионов при лечении бесплодия методом оплодотворения in vitro // Медицина сьогодні і завтра. - Харків, - 2000. - № 1. - С. 102 - 104 (співавт.: Рязанцев В.В.; збір матеріалу та його аналіз, огляд літературних джерел, підготовка до друку).

3. Роль антиоксидантных ферментных систем фолликулярной жидкости в процессах оплодотворения ооцитов при лечении бесплодия с использованием вспомогательных репродуктивных технологий // Медицина сьогодні і завтра. - Харків, - 2001. - № 3. - С. 102 - 104 (співавт.: Петрушко М.П., Піняєв В.И., Рязанцев В.В.; збір матеріалу, огляд літературних джерел, статистична обробка, підготовка до друку).

4. Процеси перекисного окислення ліпідів, антиоксидантні ферментні системи фолікулярної рідини та процеси запліднення ооцитів in vitro при використанні допоміжних репродуктивних технологій // Педіатрія акушерство та гінекологія. - 2002. - № 2. - С. 104-107 (співавт.: Петрушко М.П., Піняєв В.И., Рязанцев В.В.; огляд літератури, збір та аналіз матеріалу, підготовка до друку).

5. Патент 48932А Україна, МПК 7, G01N33/00. Спосіб прогнозування запліднення ооцитів при лікуванні безплідності в програмі запліднення in vitro / (Україна). - № 2002075610; Заявлено 08.07.2002; Опубл. 15.08.2002, Бюл.№8. (співавт.: Петрушко М.П., Піняєв В.И., Рязанцев В.В.; огляд літератури, пошук прототипів, збір та аналіз матеріалу, підготовка заявки).

6. Заявка № 2002075609 Україна, МПК 7 G01N33/00 від 08.07.2002 на “Спосіб прогнозування запліднення ооцитів при лікуванні безплідності в програмі запліднення in vitro”, рішення на видачу патенту від 28.08.2002.

7. Заявка № 2002075611 Україна, МПК 7 G01N33/00 від 08.07.2002 на “Спосіб прогнозування запліднення ооцитів при лікуванні безплідності в програмі запліднення in vitro”, рішення на видачу патенту від 28.08.2002.

8. Морально-этические проблемы вспомогательных репродуктивных технологий // Тези доповідей міжнародного симпозіуму ''Біоетика на порозі III тисячоліття". - Харків, - 2000. - С. 98 - 99 (співавт.: Грищенко В.И., Петрушко М.П., Пиняев В.И., Юрченко Г.Г.; огляд літератури, збір матеріалу).

9. Влияние активности антиоксидантных ферментов в фолликулярной жидкости человека на оплодотворение ооцитов и развитие эмбрионов при лечении бесплодия с использованием вспомогательных репродуктивных технологий // Збірник тез конференції молодих вчених “Медицина третього тисячоліття”. - Харків, - 2001. - Т. 3. - С. 48 (співавт.: Петрушко М.П., Піняєв В.И., Рязанцев В.В.; збір матеріалу, огляд літературних джерел, статистична обробка, підготовка до друку).

10. Оптимизация программы экстракорпорального оплодотворения путем использования биологически активных сред // Збірник наукових праць. Асоціація акушерів - гінекологів України. - К.: “Фенікс”, 2001. - С. 173 - 175 (співавт.: Грищенко В.И., Геродес А.Г., Петрушко М.П., Пиняев В.И.; огляд літературних джерел).

11. Влияние интенсивности перекисного окисления липидов в фолликулярной жидкости человека на развитие эмбрионов при лечении бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения // Збірник тез конференції молодих вчених “Медицина третього тисячоліття”. - Харків, - 2002. - С. 113 (співавт.: Петрушко М.П., Піняєв В.И., Рязанцев В.В.; огляд літературних джерел, збір матеріалу та його аналіз, підготовка до друку).

12. Интенсивность процессов перекисного окисления липидов в фолликулярной жидкости в естественных менструальных циклах и в программе оплодотворения in vitro // Збірник наукових праць Асоціації акушерів - гінекологів України. - К.: “Інтермед”, 2002. - С. 163 - 165.

АНОТАЦІЯ

Грищенко М.Г. Вміст біологічно-активних речовин у фолікулярній рідині та їх вплив на процеси запліднення ооцитів і розвиток ембріонів in vitrо при безплідності. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.01 - акушерство та гінекологія. Харківський державний медичний університет МОЗ України, Харків, 2002.

Дисертаційна робота присвячена вивченню обміну простагландинів, стану процесів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) і антиоксидантних ферментних систем у фолікулярній рідині (ФР) у фізіологічних менструальних циклах і при лікуванні безплідності в програмі запліднення in vitro (ЗІВ). Проведено комплексне дослідження, що включало визначення в ФР концентрації простагландинів E₂ і F₂, вмісту продуктів перекисного окислення ліпідів, активності антиоксидантных ферментних систем у фізіологічних циклах і в програмі ЗІВ. Для вирішення поставлених в роботі задач було обстежено 210 пацієнтів. Обстежили 90 подружніх пар, що звернулися для лікування безплідності і були включені в програму ЗІВ. Контрольну групу (n=30) складали пацієнтки в фізіологічних циклах, яким у плановому порядку було показано оперативне лікування з приводу захворювань, не пов'язаних з патологічними змінами тканини яєчників.

У результаті досліджень виявлено, що в ФР, отриманій в програмі ЗІВ, інтенсивність процесів ПОЛ і синтезу Pg F₂ значно перевищує відповідні показники в зразках пацієнток у фізіологічних циклах, що свідчить про вихід цих процесів у преовуляторному фолікулі при стимуляції суперовуляції за фізіологічні межі. Ці дані вказують на підвищену небезпеку впливу реактивних кисневих сполук на ооцити при лікуванні безплідності в програмі ЗІВ

При аналізі результатів визначення концентрації продуктів ПОЛ і активності антиоксидантных ферментних систем у циклах ЗІВ із різним відсотком запліднення ооцитів in vitro виявлено збільшення інтенсивності процесів ПОЛ і одночасна неспроможність антиоксидантных систем у випадках з незадовільними результатами лікування. В ряді спостережень отримані результати дозволили уяснити причини неефективного лікування в програмі ЗІВ. Виявлено певний зв'язок між співвідношенням Pg E₂/F₂ і темпами дроблення ембріонів in vitro. Вперше виявлена залежність між активністю антиоксидантного ферменту супероксиддисмутазы у ФР і морфологією ооцитів, отриманих у результаті стимуляції суперовуляції, темпами дроблення і морфологією ембріонів у програмі ЗІВ.

На підставі отриманих даних удосконалена система обстеження подружніх пар у програмі ЗІВ, визначені оптимальні показники концентрації простагландинів E₂ і F₂ у ФР, розроблені критерії прогнозування результатів ембріологічного етапу програми ЗІВ.

Ключові слова: безпліддя, фолікулярна рідина, запліднення, простагландини, перекисне окислення ліпідів, антиоксидантні ферменти.

АННОТАЦИЯ

Грищенко Н.Г. Содержание биологически-активных веществ в фолликулярной жидкости и их влияние на процессы оплодотворения ооцитов и развитие эмбрионов in vitro при бесплодии. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности - 14.01.01 - акушерство и гинекология. Харьковский государственный медицинский университет МЗ Украины. Харьков, 2002.

Диссертационная работа посвящена изучению обмена простагландинов, состояния процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантных ферментных систем в фолликулярной жидкости (ФЖ) в физиологических менструальных циклах и при лечении бесплодия в программе оплодотворения in vitro (ОИВ). Проведено комплексное исследование, включающее определение в ФЖ человека концентрации простагландинов E₂ и F₂, содержания продуктов перекисного окисления липидов - малонового диальдегида (МДА) и диеновых конъюгатов (ДК), активности антиоксидантных ферментов - каталазы, глутатионпероксидазы (ГП), глутатионредуктазы (ГР), супероксиддисмутазы (СОД), концентрации восстановленного глутатиона (GSH) в естественных циклах и в программе ОИВ. Для решения поставленных в работе задач было обследовано 210 пациентов. Обследовали 90 супружеских пар, которые обратились для лечения бесплодия и были включены в программу ОИВ. Контрольную группу (n=30) составили пациентки в естественных циклах, которым в плановом порядке было показано оперативное лечение по поводу заболеваний, не связанных с патологическими изменениями ткани яичников.

В результате проведенных исследований обнаружено, что в ФЖ, полученной в программе ОИВ, интенсивность процессов перекисного окисления липидов и синтеза Pg F₂ значительно превышает соответствующие показатели в образцах от пациенток в естественных циклах, что свидетельствует о выходе этих процессов в преовуляторном фолликуле при стимуляции суперовуляции за пределы физиологических границ. Эти данные указывают на повышенную опасность воздействия реактивных кислородных соединений на ооциты при лечении бесплодия в программе ОИВ.

При анализе результатов определения концентрации продуктов перекисного окисления липидов и активности антиоксидантных ферментных систем в циклах ОИВ с различным процентом оплодотворения ооцитов in vitro обнаружено увеличение интенсивности процессов ПОЛ и одновременная несостоятельность антиоксидантных систем в случаях с неудовлетворительными результатами лечения. Полученные результаты в ряде наблюдений позволили объяснить причины неэффективного лечения в программе ОИВ.

При сопоставлении результатов измерения в ФЖ концентрации простагландинов, продуктов перекисного окисления липидов и активности антиоксидантных ферментных систем в стимулированных циклах - было установлено, что выбор схемы стимуляции суперовуляции не оказывает влияния на исследованные показатели.

Обнаружена выраженная связь между соотношением Pg E₂/F₂ и темпами дробления эмбрионов in vitro. Впервые выявлена зависимость между активностью антиоксидантного фермента СОД, концентрацией GSH в ФЖ, морфологией ооцитов, получаемых в результате стимуляции суперовуляции, темпами дробления и морфологией эмбрионов в программе ОИВ.

Комплексное определение активности СОД, концентрации GSH, МДА и ДК, соотношения Pg E₂/F₂ в ФЖ предложено в качестве методики, позволяющей оценить степень перекисных воздействий на ооцит. Проведение указанного набора исследований даст возможность прогнозировать способность ооцитов к оплодотворению in vitro, развитие морфологически полноценных эмбрионов, пригодных для переноса в полость матки при лечении бесплодия в программе ОИВ. Использование предложенных методов в комплексе позволит значительно более точно прогнозировать результаты лечения и, возможно, увеличить эффективность лечения бесплодия в программе ОИВ.

Установлено, что исследование активности СОД в фолликулярной жидкости является быстрым, методически простым, неинвазивным, высокоинформативным методом, что позволяет рекомендовать его в качестве экспресс-метода для определения способности ооцитов к оплодотворению in vitro

Таким образом, на основании полученных данных усовершенствована система обследования супружеских пар в программе ОИВ, определены оптимальные показатели концентрации простагландинов E₂ и F₂ и продуктов перекисного окисления липидов в ФЖ, разработаны критерии прогнозирования результатов эмбриологического этапа программы ОИВ.

Ключевые слова: бесплодие, фолликулярная жидкость, оплодотворение, простагландины, перекисное окисление липидов, антиоксидантные ферменты.

SUMMARY

Grishchenko N.G. Content of biologically active substances in human follicular fluid and their effect on fertilization process and in vitro embryo development by sterility. - Typescript.

Thesis for candidate's degree by specialty 14.01.01 - obstetrics and gynecology.- Kharkov State Medical University, 2002.

Since the birth of Louise Brown in 1978, there are today more then 300000 children all over the world, who have been born after in-vitro fertilization procedure (IVF). Technology in assisted human reproduction keep developing; starting from the first pregnancy using frozen embryos in the early 1980s to sex-selection of embryos and the microinjection of spermatozoa (ICSI) to treat male sterility at the end of the 20th century.

At present, the efficiency of infertility treatment with IVF procedure reaches 20 - 30 % per one attempt. High morphological and functional quality of oocyte is necessary for normal fertilization and embryo development.

Follicular fluid is formed by a gradual influx of fluid derived from blood and by compounds synthesized and secreted by theca and granulosa cells. Therefore, its composition reflects both the plasma composition and the secretory activity of theca and granulosa cells. Follicular fluid contacts with oocyte during the whole process of its maturation. Intensified peroxidation in the Graafian follicle can probably be a factor compromising the normal development of the oocytes and embryos.

The purpose of this research was to study concentrations of two oxidative stress markers (thiobarbituric acid-reactive substances and conjugated dienes); as well as certain compounds of antioxidant enzyme systems and prostaglandins E₂ and F_2a content in preovulatory follicular fluid of women attending an in-vitro fertilization program.

There was found certain dependence between concentration of oxidative stress markers in follicular fluid and capacity of oocytes to fertilization in vitro.

There was also detected some strong relationship between Pg E₂/F_2a ratio, SOD - activity, reduced glutathione concentration in human follicular fluid and ability of oocytes for fertilization in vitro.

The rising intensity of lipid peroxidation in follicular fluid influences negatively morphological and functional characteristics of oocytes as well as embryo quality. Determination of Pg E₂/F_2a ratio, oxidative stress markers, SOD - activity and reduced glutathione concentration in follicular fluid may be used as prognosticating criterion of oocytes' ability to fertilize by using assisted reproductive technologies.

Key words: infertility, follicular fluid, fertilization, prostaglandin, lipid peroxidation, antioxidant enzymes.

Перелік умовних скорочень

ДРТ - допоміжні репродуктивні технології

ГП - глутатіонпероксидаза

ГР - глутатіонредуктаза

ГТ - глутатионтрансфераза

ДК - дієнові кон'югати

МДА - малоновий діальдегід

ЗІВ - запліднення "ін вітро"

ПОЛ - перекісне окислювання ліпідів

РКС - реактивні кисневі сполуки

СОД - супероксиддисмутаза

ФР - фолікулярна рідина

GSH - відновлена форма глутатіона

ICSI - intracytoplasmic sperm injection

Pg - простагландин

Размещено на Allbest.ru

...