Фармакологічний аналіз швидкооборотних ефектів лігандів ГАМК-рецепторного комплексу

Размещено на http://www.allbest.ru/

Анотація

ліганд рецепторний медіаторний

Силантьев С.А. Фармакологический анализ быстрообратимых эффектов лигандов ГАМК-рецепторного комплекса. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 14.03.05 - фармакология. Одесский национальный университет им. И.И. Мечникова, Одесса, 2002.

Диссертация посвящена экспериментальному изучению и структурно-функциональному моделированию механизмов рецепторно-лигандных взаимодействий, осуществляющихся в организме, на основании исследования динамики минимальных эффективных доз лигандов ГАМК_А-медиаторной системы ЦНС и обоснованию путей оптимизации применения этих лигандов. Содержание производных 1,4-бенздиазепина в биофазе действия (головной мозг) линейно зависит от вводимых доз. Исходя из этого, на основании определения их модулирующего действия на фармакологические эффекты лигандов ГАМК-рецептора, обоснована возможность использования инфузии физиологически активных веществ и их смесей для определения механизмов функционирования рецептора. Показано, что при реализации фармакологического и токсического эффектов лиганда на одной рецепторной системе организма, величина терапевтического индекса (критерий безопасности лекарства), определяемая как отношение доз вещества, вызывающих 50% токсический эффект к дозам, вызывающим 50% фармакологический эффект, не зависит от константы диссоциации рецепторно-лигандного комплекса, а только от величины его внутренней активности. При реализации фармакологического и токсического эффектов на разных рецепторных системах величина терапевтического индекса равна отношению констант диссоциации рецепторно-лигандных комплексов. Исследование изобол (изодинамических диаграмм) минимальных эффективных доз, полученных при совместном введении лигандов ГАМК-рецептора - бикукуллина, пикротоксина, пентилентетразола, бемегрида - показало, что пороговые показатели их действия реализуются на одном типе ГАМК-рецепторно-ионофорного комплекса. Также показано, что в целостном организме образование комплекса лиганда с одной из субъединиц ГАМК-рецептора приводит к модуляции функций всего комплекса, и данный рецептор функционирует в соответствии с "псевдоконкурентным" механизмом, который описывается сложной оккупационной моделью. Для противосудорожного эффекта феназепама характерно ограниченное гиперболическое возрастание минимальных эффективных доз пентилентетразола и бикукуллина, и линейное - пикротоксина при введении феназепама в возрастающих дозах. Для этанола характерно неограниченное гиперболическое возрастание минимальных эффективных доз пентилентетразола и линейное - пикротоксина и бикукуллина в зависимости от возрастающих доз. Эффекты феназепама и этанола могут быть описаны при помощи аллостерической и поликонформационной оккупационных фармакологических моделей. На основании анализа эффектов совместного действия лигандов ГАМК-рк можно предположить существование ГАМК-рк как минимум в 4 различных функционально-активных состояниях. В работе обоснованы методы анализа и выведены уравнения общего вида, позволяющие рассчитать терапевтический индекс лекарственной смеси. Показаны различные возможности оптимизации терапевтического индекса лекарственной смеси. На основании анализа и математического моделирования эффектов феназепама, 3-оксифеназепама, тетрагидрофеназепама, диазепама, бромнордиазепама, гидазепама, циназепама показано, что наиболее адекватным параметром, характеризующим фармакологические эффекты ГАМК-рецептора, является ED_max его лигандов.

Ключевые слова: ГАМК-рецептор, 1,4-бенздиазепины, минимальные эффективные дозы, терапевтический индекс, лекарственные смеси, оккупационные фармакологические модели, изоболы.

Аннотация

Силантьєв С.О. Фармакологічний аналіз швидкооборотних ефектів лігандів ГАМК-рецепторного комплексу. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.03.05 - фармакологія. Одеський національний університет, Одеса, 2002.

Дисертація присвячена експериментальному дослідженню та структурно-функціональному моделюванню механізмів рецепторно-лігандних взаємодій, що здійснюються в організмі на основі дослідження динаміки мінімальних ефективних доз лігандів ГАМК_А-медіаторної системи ЦНС, та обґрунтуванню шляхів оптимізації застосування цих лігандів. На основі вивчення та математичного моделювання судомних ефектів лігандів ГАМК-рк - пікротоксину, бікукуліну, пентилентетразолу, бемегріду, а також їхніх сумішей, визначено, що утворення однією з субодиниць ГАМК-рецептору комплексу з лігандом моделює функції всіх його субодиниць. Результати дослідження та математичного моделювання ефектів феназепаму, етанолу, барбітала натрію, пентилентетразолу, пікротоксину, бікукуліну дозволяють говорити про існування ГАМК-рк як мінімум в 4 функціонально-активних конформаціях. На основі аналізу та математичного моделювання ефектів феназепаму, 3-оксіфеназепама, тетрагідрофеназепаму, діазепаму, бромнордіазепаму, гідазепаму, циназепаму показано, що найбільш адекватним параметром, що характеризує фармакологічні ефекти ГАМК-рецептора, є ED_max його лігандів. Обґрунтовані методи аналізу та виведені рівняння загального вигляду, що дозволяють розрахувати терапевтичний індекс (показник безпеки застосування) лікарської суміші та оптимізувати його на основі дослідних даних.

Ключові слова: ГАМК-рецептор, 1,4-бенздіазепіни, мінімальні ефективні дози, терапевтичний індекс, лікарські суміші, окупаційні фармакологічні моделі, ізоболи.

Annotation

Sylantiev S.O. Pharmacological Analysis of Fast-Reversible Effects of Ligands of GABA-Receptor Complex. - Typescript.

Dissertation for kandidat of biological sciences in speciality 14.03.05 - Pharmacology. Odesa National University, Odesa, 2002.

The Dissertation is devoted to experimental study and structural & functional modelling of receptor - ligand interaction mechanisms taking place in an organism, carried out on the basis of investigation of the dynamics of minimum efficient doses of GABA_A-mediatoric system of CNS ligands, as well as to grounding the ways to optimise the ligands' use. Based on investigation and mathematical modelling of convulsive effects of GABA-rc ligands - picrotoxine, bicuculline, pentilentetrazole, bemegride, as well as their mixtures, it was discovered, that when one of sub-units of GABA-receptor formed a complex with ligand, the formation modeled the functions of all its sub-units. The results of studies and mathematical modelling of effects of phenazepame, ethanol, natrium barbital, pentilentetrazole, picrotoxine, bicuculline permit us to state the existence of GABA-rc in minimum four functional-active conformations. On the basis of analysis and mathematical modelling of the effects of phenazepame, 3-oxyphenazepame, tetrohydrophenazepame, diazepame, bromnordiazepame, hydazepame, cinazepame it is shown that the most adequate parameter characterising pharmacological effects of GABA-receptor is ED_max of its ligands. Methods of analysis and derivation of general form equation enabling us to calculate therapeutic index (indicator of safety of use) of the medicinal mixture and optimise it on the basis of experimental data are substantiated.

Key words: GABA-receptor, 1,4-benzodiazepines, minimal efficient doses, therapeutic index, medicinal mixtures, occupational pharmacological models, isoboles.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Широке використання фармакотерапевтичних методів для корекції патологічних станів ЦНС поставило перед сучасною фармакологією завдання створення нових лікарських сполук чи їхніх сумішей, яким притаманна задана цілями терапії спрямованість дії та мала можливість прояву побічних ефектів (Kenakin T., 1990). Виконання подібного завдання можна здійснювати двома шляхами:

а) створенням нових лікарських сполук, що мають різні особливості взаємодії з медіаторними системами ЦНС;

б) оптимізацією шляхів раціонального використання ліків та їхніх сумішей на основі поглибленого знання про механізми їхньої дії, зокрема, про особливості рецепторно-лігандних взаємодій в біосистемах in vivo.

Нині вивчення молекулярних механізмів взаємодії екзогенних лігандів та рецепторів медіаторних систем ЦНС здійснюється переважно в дослідах in vitro (Kenakin T., 1997) та не повністю забезпечене методами, що дозволяють проводити достовірну кількісну оцінку та прогнозування параметрів функціонування системи "організм - ліки" (Feuerstein T. et al., 1999). У зв'язку з цим актуальним завданням є розробка методів моделювання та аналізу, пошук експериментальних фармакологічних моделей, що дозволяють взаємопов'язати кінетику процесів утворення рецепторно-лігандних комплексів в ефекторних компартментах організму з динамікою "пострецепторних" наслідків процесів, а саме - зі зміною параметрів функціонування цілісної біосистеми, тобто фармакологічних ефектів.

Рецепторні макромолекули можуть перебувати в кількох функціонально активних станах (Leff P., 1997). Фундаментальним питанням стає те, наявність якої кількості рецепторів у активних конформаціях обумовлює фармакологічний ефект, особливо після того, як було виявлено, що один тип рецепторів може виявляти різні типи реакції з агоністами (Scaramelini C., 1997). У зв'язку з цим потребують удосконалення методики вивчення in vivo дії агоністів, зворотних агоністів та антагоністів (Scaramelini C., 1997).

Окрім того, деякими лігандами (модуляторами) можуть бути індуковані такі конформаційні стани рецептора, які виявляють свою присутність не у вигляді безпосередньої фізіологічної відповіді, а іншим чином. Агоністи ж, завдяки селективній афінності відносно різних конформацій, можуть ці конформації перерозподіляти. Зокрема, багато дослідних даних свідчить про те, що ГАМК-рецептор має агоніст- та антагоніст-афінні конформації при зв'язуванні (Maksay G., 1996). Отже, окупаційні фармакологічні моделі можуть сприяти просуванню в рецепторній фармакології (Kenakin T., 1997).

Якщо при впливі ліганду на рецептор характеристичний час зміни його вмісту в біофазі дії набагато більший, ніж характерний час рецепторно-лігандної взаємодії, взаємодія може бути інтерпретована як "швидкооборотна". Тоді кінетика функціонування рецепторно-лігандної системи однозначно визначається фармакокінетичними характеристиками препарату. В рамках такого підходу функціонування ГАМК-медіаторної системи може бути дослідженим in vivo на підставі дослідження фармакодинаміки бенздіазепінів та судомних агентів - модуляторів їхньої взаємодії з рецептором (Smith G., Olsen R., 1995).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Матеріали дисертації є фрагментом роботи в рамках проекту 5.4/511 "Механізми функціонування хімічних синапсів і їх регуляція нейротропними засобами у нормі та патології", що виконується згідно з договором №Ф4/1737-97 між Одеським національним університетом ім. І.І. Мечникова та Міністерством України у справах науки та технологій.

Мета та завдання роботи. Вивчення та структурно-функціональне моделювання рецепторно-лігандних взаємодій, що відбуваються в організмі, на основі розробки підходів із дослідження динаміки мінімальних ефективних доз лігандів ГАМК_А-медіаторної системи ЦНС та обґрунтування шляхів оптимізації їхнього використання.

Для досягнення мети роботи були поставлені наступні завдання:

Визначити співвідношення між дозами, що вводяться, та вмістом у головному мозку ряду мічених екзогенних лігандів ГАМК-рецепторно-іонофорного комплексу (ГАМК-рк). Обґрунтувати граничні умови (обмеження та область застосування) ізодинамічного аналізу мінімальних ефективних доз ліків для дослідження механізмів їхньої дії in vivo.

Вивчити динаміку зміни мінімальних ефективних доз судомних агентів - лігандів ГАМК-рк, що вводяться в сумішах з різним співвідношенням компонентів. Здійснити аналіз механізмів їхньої взаємодії на основі розробки ізодинамічних окупаційних моделей.

Дослідити динаміку зміни мінімальних ефективних доз конвульсантів - лігандів ГАМК-рк в умовах різних схем введення їхніх антагоністів з різними механізмами модуляції рецепторно-медіаторного комплексу ЦНС. Здійснити розробку конформаційно-алостеричної ізодинамічної моделі, що описує особливості взаємодії ГАМК-рк з його лігандами в цілісному організмі.

Визначити показники фармакодинаміки ряду похідних 1,4-бенздіазепіну різної структури, проліків, ліків та їхніх метаболітів.

Обґрунтувати параметри взаємозв'язку деяких фундаментальних фармакологічних характеристик досліджуваних сполук, що визначають можливості та шляхи оптимізації їхнього використання індивідуально та в лікарських сумішах.

Об'єкт дослідження - ГАМК-медіаторна система у мишей.

Предмет дослідження - ефекти лігандів ГАМК-рецепторного комплексу.

Методи дослідження - інструментально-аналітичний (фармакодинамічний), радіометричний (фармакокінетичний), статистичний, математичний аналіз даних.

Наукова новизна роботи:

Розроблений формальний апарат визначення механізмів взаємодії екзогенних лігандів та рецепторів у цілісній біосистемі, що ґрунтується на вивченні зміни величин ізодинамічних (мінімальних ефективних) доз цих лігандів.

Метод базується на розвитку уявлень ізобольного аналізу у сполученні з розробленим у роботі аналізом та моделюванням молекулярних рецепторно-лігандних взаємодій, що здійснюються in vivo.

Викладений в роботі підхід є альтернативним класичним в експериментальній фармакології дослідженням залежностей "доза-ефект", "концентрація-ефект", та дозволяє здійснювати вивчення механізмів швидкооборотних фармакологічних ефектів без необхідності визначення параметрів їхньої динаміки (незалежним шляхом) та в умовах in vivo.

Вивчена динаміка мінімальних ефективних доз судомних агентів - лігандів ГАМК-рк, що вводяться в сумішах з різним співвідношенням компонентів, та здійснено аналіз механізмів їхньої взаємодії на основі розробки ізодинамічних окупаційних моделей.

Вперше здійснено розробку конформаційно-алостеричної ізодинамічної моделі, що описує особливості взаємодії ГАМК-рк та його екзогенних (агоністів, антагоністів, зворотних агоністів) лігандів у цілісному організмі.

Вперше на основі дослідження мінімальних ефективних доз лігандів обґрунтовані параметри взаємозв'язку деяких фундаментальних фармакологічних характеристик досліджуваних сполук, що визначають можливості та шляхи оптимізації їхнього використання індивідуально та в лікарських сумішах.

Практичне значення отриманих результатів. Розроблена модель функціонування ГАМК-системи ЦНС in vivo; з'ясовані механізми взаємодії її судомних та протисудомних екзогенних лігандів та етанолу з означеним рецепторно-іонофорним комплексом.

Розроблені алгоритми визначення співвідношення компонентів лікарських сумішей, яким притаманна безпечна (задана цілями лікарського впливу) величина терапевтичних індексів.

Обґрунтований взаємозв'язок терапевтичних індексів лігандів з різними механізмами дії та фундаментальними показниками їхньої біокінетики, що дозволяє оптимізувати пошук нових ефективних лікарських засобів.

Результати виконаної роботи є теоретичним та практичним обґрунтуванням використання ізодинамічного аналізу для визначення можливостей застосування лікарських засобів та меж їхнього безпечного використання, напрямків пошуку нових фармакологічно активних речовин та оптимізації сумішей ліків.

Особистий внесок здобувача. Автор здійснив інформаційний пошук, визначив мету та завдання дослідження, опрацював дослідні моделі, провів експериментальні дослідження. Було також виконано статистичну обробку результатів, проведено оформлення таблиць та графіків, сформульовані висновки роботи, опубліковані головні положення результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи знайшли позитивну оцінку на Міжнародній конференції студентів та аспірантів "Ленинские горы - 95" (Москва, 1995), Дев'ятій конференції молодих вчених з органічної хімії та біохімії (Prague, Czechia, 1995), Четвертій конференції "Focus on Epilepsy" (Ste-Adиle, Canada, 1997), Шістнадцятій конференції з проблем нервової системи (Boston, USA, 1997), П'ятнадцятому з'їзді Українського фізіологічного товариства (Донецьк, 1998), Європейському форумі з проблем нервової системи (Berlin, Germany, 1998).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 9 робіт (з них 4 статті у фахових наукових журналах, 5 тез доповідей - у збірниках наукових робіт).

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 156 сторінках машинопису, вона складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, п'яти розділів власних досліджень, обговорення результатів досліджень, висновків та списку використаних джерел. Робота проілюстрована 28 рисунками, 7 таблицями та 13 схемами. Бібліографія включає 158 джерел (54 вітчизняних та 104 зарубіжних).

2. Основний зміст дослідження

Матеріали та методи дослідження. В ході роботи використовувались похідні 1,4-бездіазепіну та їхні метаболіти: гідазепам, бромнордіазепам, феназепам, тетрагідрофеназепам, 3-оксіфеназепам, діазепам, циназепам. Сполуки були синтезовані в ПНДЛ-5 Одеського національного університету ім. І. І. Мечникова та в Фізико-хімічному інституті НАН України ім. А. В. Богатського. Досліди були проведені роздiльно на 1372-х мишах обох статей лінії СВА, масою 15-25 г.

Досліджувані водорозчинні речовини вводилися внутрішньочеревинно, в 0,9% розчині NaCl. Похідні 1,4-бенздіазепіну вводилися внутрішньочеревно в емульсії Tween-80 фізіологічного розчину NaCl. Контрольним групам тварин вводився у відповідних об'ємах фізіологічний розчин або твінова емульсія. Для визначення мінімальних ефективних доз (МЕД), що викликають показники судомного нападу, які реєструються в досліді: клоніко-тонічні судоми (ДКС) та тонічну екстензію (ДТЕ), - тваринам внутрішньосудинно в хвостову вену вводили з швидкістю 0,01 мл за секунду розчини судомних агентів: бікукулін (Бк) (0,01%), пікротоксин (Пк) (0,01%), пентилентетразол (коразол, Пт) (1%), бемегрід (Бм) (0,1%) на фоні попереднього введення різних доз бенздіазепінів, барбіталу натрію та етанолу за 30, 60 та 120 хвилин. Барбітурати вводилися внутрішньочеревинно, етанол - внутрішньочеревинно та інтрагастрально до інфузії судомних агентів. Для визначення типів взаємодії лігандів ГАМК-рк вводили суміші розчинів судомних агентів з співвідношенням компонентів від 1:14 до 14:1.

Одночасно з реєстрацією протисудомної дії екзогенних лігандів проводили визначення вмісту їхніх ¹⁴С-аналогів та їхніх метаболітів у головному мозку тварин. Безпосередньо після реєстрації судомної дії судомних агентів тварин декапітували, відпрепаровували головний мозок та визначали вміст у ньому загального радіоактивного матеріалу. Визначення проводили на сцинтиляційному лічильнику "Ruck-" (США). Обробка результатів досліджень проводилася з використанням програмного пакету "Statistics".

Регресійний аналіз даних проводили згідно з модифікованим методом зважених середніх групових величин (Лакін Г. Ф., 1990; Корніш-Боуден Е., 1979; Гланц С., 1999).

Обґрунтування внутрішньосудинного введення ліків. Фармакотерапевтичні впливи (ФТВ) на організм - це наслідки цілеспрямованого введення в його внутрішнє середовище хімічних речовин (ліків). Після ФТВ для визначення основних типів процесів, що спостерігаються, способів їхнього взаємозв'язку, а також для розробки критеріїв їхньої оцінки, скористуємося найбільш загальною, орієнтовною схемою "ліки-організм" (Схема1). Визначимо критерії оцінки ФТВ як вихідні, щоб у схемі процесів взаємодії ліків та організму можна було визначити закономірності (ступінь та характер) їхньої трансформації. Біофазу дії необхідно вичленити як окрему підсистему системи "ліки-організм", оскільки в ній проходять процеси істотно відмінні від фармакокінетичних. З іншого боку, якою б не була природа фармакологічного ефекту цілісного організму,

в основі його лежить взаємодія рецепторів (R) та лігандів (A) з утворенням рецепторно-лігандних комплексів: R+АRА. При введенні ліків у внутрішнє середовище організму, якщо їхня кінетична схема розподілу лінійна, то для всіх її компартментів існує лінійне співвідношення між вмістом препарату в будь-який довільний момент часу після введення будь-яким способом та дозою, що вводилася.

Виконане дослідження залежності вмісту ¹⁴С-похідних 1,4-бенздіазепіну в біофазі їхньої дії (головному мозку) демонструє лінійну залежність від доз, що вводяться. За деяких умов внутрішньовенної інфузії ліків (Жук О.В., 1996) можливе досягнення лінійного співвідношення між часом інфузії, дозою, що вводилася, концентрацією в центральній камері кінетичної схеми розподілу та в біофазі дії.

Нами обґрунтована низка умов, що дозволяє використовувати інфузію фізіологічно активних речовин та їхніх сумішей для визначення механізмів взаємодії з рецепторно-ефекторними системами організму. Це можливо на підґрунті визначення їхньої модулюючої дії на фармакологічні ефекти фізіологічно активних речовин, що вводяться внутрішньосудинно. Якщо умови розвитку фармакологічного ефекту дозволяють реєструвати порогові (альтернативні) показники (Е_пор<Е_max), ми можемо припустити, що вони спостерігаються при утворенні граничної долі (а_пор.<1) рецепторно-лігандних комплексів ([RA]_пор).

Наведені висновки, забезпечені відповідним математичним апаратом, дозволяють концептуально та кількісно зіставити граничні показники фармакологічної дії ліків (наприклад, терапевтичної та токсичної) один з одним та з концентраціями лігандів в біофазах дії, що викликають розвиток цих ефектів, а також оцінити особливості взаємозв'язку деяких фундаментальних характеристик системи "організм-ліки".

Використання терапевтичних індексів речовин для визначення механізмів дії. Як основні показники, що є критерієм безпеки фармакологічно активних сполук, використовують їхні терапевтичні індекси (ТІ), що визначаються як відношення доз чи концентрацій речовини, які викликають 50% токсичний ефект, до доз (концентрацій), що викликають 50% фармакологічний ефект. У роботі розроблено математичний апарат, що взаємопов'язав ТІ та такі фундаментальні показники, як константа дисоціації та коефіцієнт внутрішньої активності рецепторно-лігандного комплексу. Коли фармакологічний та токсичний ефекти ліганду реалізуються на одній рецепторній системі організму, величина ТІ не залежить від констант розпаду рецепторно-лігандного комплексу, а залежить тільки від коефіцієнту внутрішньої активності комплексу. Це є достатньо істотною особливістю, так як звичайно у фармакології пошук нових лікарських засобів ведеться в напрямку синтезу високоактивних речовин, яким притаманна максимальна спорідненість з рецептором. Але для лігандів з описаним механізмом виникнення терапевтичних та токсичних ефектів, наприклад, для похідних 1,4-бенздіазепінів, одночасно із зростанням ефективності зростають і величини побічних ефектів, що не дозволяє оптимізувати фармакологічні властивості нових ліків. Якщо ліганд взаємодіє з двома та більше типами рецепторів, і його фармакологічний та токсичний ефекти є результатом взаємодії з різними рецепторними системами, то його ТІ дорівнює відношенню рівноважних констант дисоціації рецепторно-лігандних комплексів, і не залежить від комплексів. Були досліджені ТІ зворотних агоністів ГАМК-рк: Бк, Пк, Пт, Бм на фоні впливу зростаючих доз феназепаму. Всі досліджені ліганди є речовинами, що взаємодіють з різними субодиницями постсинаптичного ГАМК-рк. Показниками для оцінки фармакологічного та токсичного ефектів були МЕД судомних сполук, що викликали у мишей ДКС та ДТЕ при внутрішньосудинній інфузії. Результати дослідження наведені в табл. 1.

Таблиця 1. ТІ та зміна мінімальних ефективних доз зворотних агоністів (мг/кг), що викликають клоніко-тонічні судоми (ДКС) та тонічну екстензію (ДТЕ) при введенні феназепаму у зростаючих дозах

Р 0,05=2,23; Р 0,01=3,17; Р 0,001=4,59

Для віднесення фармакологічно активної речовини до одного з двох типів необхідно in vivo визначити його ТІ в умовах впливу зростаючих доз. ТІ сполук, у яких механізм прояву терапевтичного та токсичного ефектів полягає у взаємодії лігандів з однією рецепторною системою, будуть мати однакову величину при будь-якій кількості модулятора, що вводиться. У речовин другого типу на тлі введення зростаючих доз модулятору, що взаємодіє тільки з однією з рецепторних систем, або з двома, але з різними механізмами дії, ТІ повинен монотонно змінюватись: зростати або зменшуватись.

Як видно з наведених даних (табл. 1), введення феназепаму призводило до лінійного (Пк, Бк) чи гіперболічного (Пт, Бм) зростання досліджуваних показників судомної активності - дози, що викликають клоніко-тонічні судоми та дози, що викликають тонічну екстензію (ДКС та ДТЕ). ТІ, що визначалися як ДТЕ/ДКС, були стабільними та не мали достовірних відмінностей незалежно від структури зворотніх агоністів та модуляторів. Таким чином, показано, що обидва граничних показника є результатом одного і того самого процесу, який визначається взаємодією судомних агентів з одним типом ГАМК_А2-рецепторно-іонофорного комплексу.

Ізодинамічний аналіз мінімальних ефективних доз лігандів ГАМК-рецепторного комплексу в рамках простої та складної окупаційних моделей. У попередні роки розповсюдженим методом вивчення дії сумішей (звичайно двох) лікарських речовин був "ізодинамічний аналіз" - аналіз ізодинамічних діаграм (ізобол) (Петков В., 1977). Для аналізу ізобол нами запропоновані окупаційні фармакологічні моделі (ОФМ), що поступово ускладнюються. Вони є ієрархічним математичним описом - кожна попередня модель є частковим випадком наступної. При аналізі результатів дослідження дослідні дані формалізувалися відповідно до найпростішої достатньої для їхнього опису моделі.

Ізодинамічні діаграми Пк та Бк по показниках ДКС та ДТЕ лінійні та паралельні. Тобто або обидва ліганди ГАМК-рк є повними агоністами (_Бк=_Пк=1), або величини їхньої внутрішньої активності однакові. Так як Пк - блокатор хлорного каналу ГАМК-рк, а Бк - конкурентний антагоніст ГАМК, перше припущення виглядає більш правдоподібним. Механізми дії та місця рецепції Бк та Пк на субодиницях ГАМК-рк різні. Отже, лінійні зміни МЕД (рис. 2) сумішей Пк та Бк з різним співвідношенням компонентів є наслідком їхньої "псевдоконкурентної" взаємодії.

Підтвердженням функціонування ГАМК-рк відповідно до "псевдоконкурентного" механізму, який може бути описаний складною окупаційною моделлю, є лінійні ізоболи, що реєструються при спільному введенні Пт та Бк, Пт та Пк. В останньому випадку (Пт+Пк) коефіцієнти регресії ізобол по показниках клонічних судом та тонічної екстензії достовірно відрізнялися. Це припускає меншу внутрішню активність комплексу [ГАМК-рк - Пт] порівняно з [ГАМК-рк - Пк]. Це, в свою чергу, дозволяє визначити дію Пт як частковий агонізм, на відміну від Пк та Бк - повних агоністів. У подальшому було виявлено лінійне зростання доз Пк, Бк та Пт, що викликають КТС та ТЕ на тлі попереднього введення зростаючих доз конкурентного антагоніста Пк - барбіталу натрію. Дія барбіталу на цілісний організм була інтерпретована як частковий антагонізм ефектам Пк, Бк, Пт.

Аналітичний апарат ОФМ при ізодинамічному аналізі МЕД є ефективним інструментом визначення порядку процесів рецепторно-лігандної взаємодії: якщо проходять (схема 2) процеси 1-4 взаємодії m та n молекул лігандів А₁ та А₂ з рецептором, при протіканні тільки процесів 1 та 2 зміни МЕД складатимуть:

(1).

При n=m залежність (1) лінійна, а при n, m>1 - описує випуклу криву, що не лінеаризується, та позначається в термінах ізодинамічного аналізу як "антагоністична дія речовин" (Петков В., 1977; Colquhoun D., 1987). Якщо ж у системі здійснюються процеси 1-4, залежність при n=m має форму гіперболи першого порядку. Наведене дослідження динаміки МЕД екзогенних лігандів ГАМК-рк дозволяє визначити, що в цілісному організмі функціонування ГАМК-рк здійснюється таким чином, що утворення рецепторно-лігандного комплексу однією з його субодиниць призводить до модуляції функцій всього комплексу, що, як наслідок, детерміновано віддзеркалюється на значеннях величин МЕД по показниках ДКС та ДТЕ.

Ізодинамічний аналіз мінімальних ефективних доз лігандів ГАМК-рецепторного комплексу в рамках алостеричної та поліконформаційної окупаційних моделей.

На відміну від складної окупаційної моделі, що припускає тільки конкурентну взаємодію лігандів А₁ та А₂ з рецептором R, регуляторно-алостерична модель (РАМ) функціонування рецептору припускає також і існування процесів утворення рецепторно-лігандного комплексу RA₁A₂ з рівноважними константами його розпаду до RA₁ та RA₂. При цьому припускається, що внутрішня активність притаманна всім трьом типам рецепторно-лігандних комплексів.

Нами була досліджена динаміка МЕД Бк, Пт та Пк на фоні введення агоністів цієї системи (феназепам, етанол). Отримані результати свідчать про те, що для етанолу та феназепаму характерне збільшення протисудомної активності при їхньому введенні у зростаючих дозах. У комбінації етанол-Пт спостерігалося нелінійне необмежене зростання МЕД Пт, а в комбінації етанол-Пк та Бк - лінійне. Для протисудомної дії феназепаму характерне гіперболічне (обмежене) зростання величин МЕД Пт та Бк та лінійне зростання МЕД Пк. Був виявлений лінійний характер залежності "доза агоніста - мінімальна ефективна доза конвульсанта". Це підтверджує, що механізми взаємодії лігандів з рецептором відповідають РАМ. Якщо ж у досліді спостерігалася лінійна (що відповідає конкурентній формі взаємодії) зміна МЕД агоніста (А₁) на фоні паралельного впливу на систему іншого агоніста (А₂) чи зворотного агоніста (антагоніста), це може бути наслідком двох процесів: а) А₁ та А₂ взаємодіють з однією формою рецептора, не утворюючи комплексу RA₁A₂ - наприклад, ГАМК та Бк; б) А₁та А₂ утворюють комплекси 'RA₁ та ''RA₂, але не утворюють 'RA₂, ''RA₁, 'RA₁A₂, ''RA₁A₂, що відповідає типу взаємодії Бк та Пк. Тоді для опису конкурентної форми взаємодії Пк, Бк та Пт при спільному введенні, враховуючи конкурентні відношення ГАМК та Бк, слід припустити, що ГАМК-рк існує як мінімум в 4 функціонально різних конформаціях - 'R, ''R, '''R, ''''R.

Гіперболічна зміна МЕД Пт при введенні зростаючих доз етанолу дозволяє припустити взаємодію Пт тільки з '''R. Неконкурентний тип взаємодії феназепаму з Бк та Пт, але не з Пк, дозволяє припустити можливість утворення ним комплексів з низькою внутрішньою активністю з ''R, '''R, ''''R. Таким чином, результати проведених досліджень підтверджують існування як мінімум 4 різних функціональних станів ГАМК-рк in vivo.

Оцінка ефективності лікарських сумішей з використанням терапевтичних індексів

Для оптимізації фармакологічного впливу на організм найчастіше здійснюють введення двох чи більше лікарських речовин у сумішах (лікарські суміші - ЛС) чи роздільно.

Нині бґрунтуванням доцільності використання ЛС звичайно є результати аналізу ізоболограм, що виявляють достовірне "потенціювання" (увігнуті криві ізобол).

Наслідком такого підходу до оптимізації фармакотерапевтичного впливу на організм є те, що заданий цілями фармакотерапії фармакологічний ефект досягається при використанні менших доз екзогенних сполук (компонентів ЛС), тобто мета використання ЛС полягає в мінімізації впливу ксенобіотиків на внутрішнє середовище організму.

Доцільність викладеного напрямку досліджень безсумнівна. Але основні вимоги до фармакотерапевтичного впливу на організм полягають в його ефективності та безпеці, а узагальнюючим критерієм їхньої оцінки є терапевтичний індекс речовини.

Тому для раціоналізації оцінки ЛС необхідно:

Обґрунтувати критерій їхньої ефективності та безпеки суміші ліків - терапевтичний індекс суміші ліків (ТІЛС);

Визначити характер зміни ТІЛС залежно від механізмів взаємодії компонентів ЛС з рецепторними системами організму та співвідношення компонентів в ЛС;

Визначити підходи та можливості оптимізації складу (співвідношення компонентів) ЛС та їхніх доз, що забезпечують при їхньому застосуванні як мінімізацію впливу на внутрішнє середовище організму, так і максимальну безпеку застосування (максимальний ТІЛС). Окрім того, слід враховувати додатковий критерій оцінки ЛС - час ефективного впливу суміші на організм.

У роботі обґрунтовані методи аналізу та виведені рівняння загального вигляду, що дозволяють розраховувати ТІЛС, виходячи з дослідних даних. Показано, що можливості оптимізації ТІЛС залежно від типів взаємодії компонентів ЛС різні; в ряді випадків ця оптимізація неможлива - якщо один з компонентів суміші неактивний, та якщо обидва компоненти є конкурентними (псевдоконкурентними) агоністами. В інших випадках оптимізація ТІЛС суміші, що складається з речовин А₁ та А₂, можлива за деяких умов:

Коли А₂ є конкурентним чи псевдоконкурентним антагоністом А₁, повинна виконуватись умова А_02Т>А_02Ф, тобто при зростанні кількості А₂ в ЛС ТІЛС має зростати.

Якщо компоненти суміші - агоністи, що діють по неконкурентному чи безконкурентному механізму, розрахункове значення співвідношення компонентів суміші, що забезпечує максимальну величину ТІЛС, повинно бути додатнім.

Якщо А₂ - неконкурентний антагоніст А₁, та мінімальні ефективні дози А₁ обмежено зростають, то ТІЛС зростає при збільшенні вмісту А₂ в суміші за умови А_01Т/А_01Ф<А_1МТ/А_1МФ, де А_01Т, А_01Ф - дози компоненту суміші, що викликають токсичний та фармакологічний ефекти за відсутності другого компонента, А_1МТ, А_1МФ - максимальні можливі дози А₁, що викликають фармакологічний та токсичний ефекти при А₂.

Якщо А₂ - неконкурентний антагоніст А₁, і мінімальні ефективні дози А₁ необмежено зростають, можливості оптимізації ЛС залежать від кінетичних характеристик процесу елімінації компонентів суміші та співвідношення величин мінімальних ефективних доз по токсичному та фармакологічному показникам.

Використання фармакодинамічних параметрів для оцінки дії фармакологічно активних речовин. Було проведене (табл.2) порівняльне дослідження фармакодинаміки похідних 1,4-бенздізепіну - феназепаму, 3-оксіфеназепаму, тетрагідрофеназепаму, діазепаму, бромнордіазепаму (ліків) та циназепаму, гідазепаму (проліків). У всіх випадках отримані гіперболічні криві "доза-ефект" є обмежено зростаючими, тому вони були проаналізовані в термінах регуляторно-алостеричної моделі. Визначення параметрів регресії графіків цих функцій проводилося відповідно до алгоритму МНК для подвійних зворотних величин. Це дозволило визначити фармакодинамічні параметри даного процесу - ED_max та ED₅₀. В цьому випадку значення ED₅₀ (х₀) визначається як точка перетину прямої з віссю абсцис, ED_max-ED_c - як точка перетину з віссю ординат. Величини ED₅₀ визначалися з рівняння прямої як b/a, (ED_max-ED_c) - як 1/а. При введенні судомних агентів на фоні введення бенздіазепінів спостерігалося зростання МЕД судомного агента до деякої величини - ED_max. Відношення величин ED_max до МЕД різних судомних агентів в контрольних дослідах (ED_c) - (Еd_max/ED_c) максимальне для блокатора Cl^- іонофору - Пт. Це визначило вибір Пт як тестового агента для дослідження фармакодинамічних параметрів похідних 1,4-бенздіазепіну (табл. 2).

Таблиця 2. Параметри зміни МЕД пентилентетразолу по показникам КТС та ТЕ на тлі попереднього внутрішньочеревного введення бенздіазепінів, розраховані виходячи з рівнянь лінійної регресії (y=a+bx) для подвійних зворотних величин

Одним з найважливіших фармакодинамічних параметрів дії фармакологічно активних речовин, i їхньої порівняльної оцінки, є ED_max. У зв'язку з цим для зручності порівняння даних, отриманих при дослідженні речовин бенздіазепінового ряду, використовувались величини їхніх ED_max нормовані відносно контрольних значень: (ED_m-ED_c)/ED_c.

Найбільший інтерес представляв порівняльний аналіз фармакодинамічних показників ліків з такими їхніх активних метаболітів в парах гідазепам (проліки) - бромнордіазепам (метаболіт) та циназепам (проліки) - 3-оксіфеназепам (метаболіт). При такому порівнянні у випадку гідазепаму спостерігалися достовірно більш низькі значення ДКС та ДТЕ коразолу, аніж у його метаболіту (табл. 2). В парі циназепам - 3-оксіфеназепам по ДКС та ДТЕ коразолу значення ED₅₀ циназепаму було в обох випадках значно та достовірно вище, ніж у його метаболіту, а їхні значення (ED_m-ED_c)/ED_c по обох показниках практично рівні (табл. 2). Це припускає вплив процесів біотрансформації проліків у ліки на показники динаміки результуючого фармакологічного ефекту.

Для вибору найбільш адекватного параметра, що характеризує фармакологічний ефект лігандів ГАМК_А-рк, розраховувався ступінь кореляції величин ED₅₀ та ЕD_max-ED_c у різних сполученнях. У випадку дослідження співвідношень (ED_m-ED_c)/ED_c та ED₅₀, а також (ED_m-ED_c)/ED_c та 1/ED₅₀ кореляції відмічено не було. При дослідженні ж співвідношень по показниках ТЕ і КС, величина (ED_m-ED_c)/ED_c та ED₅₀ спостерігалася висока та високодостовірна (Р<0,001) кореляція. Однак величина ED₅₀ залежить від параметрів біокінетики препарату в організмі (швидкість всмоктування, MRT, кліренс, метаболічні константи тощо.) і відповідно не є базовою характеристикою досліджуваної речовини. Величина ж ED_max визначається виключно таким параметром, як значення коефіцієнту внутрішньої активності рецепторно-іонофорного комплексу, тобто є фундаментальною характеристикою взаємодії ліків та організму, тому її використання має перевагу.

Висновки

У дисертації наведене теоретичне узагальнення та приклади вирішення проблеми оптимізації використання фізіологічно активних речовин та їхніх сумішей, які впливають на рецепторні системи головного мозку. Отримані результати використані для обґрунтування такої оптимізації та опису шляхів її впровадження.

1. Ізодинамічний аналіз мінімальних ефективних доз екзогенних лігандів може бути використаним як метод оцінки механізмів функціонування рецепторних комплексів in vivo. Із застосуванням його показано, що модуляція функцій ГАМК-рк барбітуратами, пентилентетразолом, пікротоксином, бікукуліном, бенздіазепінами здійснюється лінійно або відповідно гіперболі першого порядку, без прояву кооперативності ефектів.

2. За допомогою розробленого математичного апарату опису ієрархічних фармакологічних моделей, що віддзеркалюють динаміку зміни МЕД лігандів ГАМК-рк, показано, що барбітал натрію псевдоконкурентно взаємодіє з судомними агентами - лігандами ГАМК-рк; бікукулін та пікротоксин є повними псевдоконкурентними агоністами ГАМК-рк, пентилентетразол - частковим.

3. Співвідношення "доза-концентрація" феназепаму, тетрагідрофеназепаму, бромнор-діазепаму в тест-об'єкті (плазма крові) та біофазі дії (головний мозок) є лінійним, що дозволяє об'єднати центральний кінетичний відсік (плазма крові) та біофазу дії в єдину кінетичну камеру та інтерпретувати ефекти 1,4-бенздіазепінів як "концентраційно-центральні".

4. У випадку реалізації фармакологічного та токсичного ефектів на різних рецепторних системах терапевтичний індекс ліганду визначається відношенням констант дисоціації рецепторів з цією сполукою. Якщо ж фармакологічний та токсичний ефекти є наслідком взаємодії сполуки з однією рецепторною системою, терапевтичний індекс залежить тільки від коефіцієнту внутрішньої активності. Порогові показники ефектів лігандів ГАМК-рк - пікротоксину, бікукуліну, пентилентетразолу та бемегріду - результат взаємодії з одним типом ГАМК-рк.

5. Кількісний опис функціонування ГАМК-рецептору in vivo може бути здійснено за допомогою формального апарату регуляторно-алостеричної або складної окупаційної фармакологічної моделі. З використанням цих моделей показане існування ГАМК-рк in vivo як мінімум в чотирьох функціонально активних станах. Феназепам формально взаємодіє з усіма функціонально активними станами рецептора, етанол та пентилентетразол - з рецептором в одному і тому ж стані, пікротоксин, бікукулін та барбітурати - з рецептором в одному з 3 різних функціонально активних станів.

6. Розроблений алгоритм визначення оптимального співвідношення компонентів лікарської суміші по параметру її безпеки - величині терапевтичного індексу. Така оптимізація можлива для сумішей лігандів з різними типами взаємодії з рецепторними системами, окрім випадків, коли один з компонентів неактивний або компоненти є конкурентними чи псевдоконкурентними агоністами.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Головенко Н.Я, Зиньковский В.Г., Жук О.В., Силантьев С.А. Изодинамический анализ минимальных эффективных доз экзогенных лигандов ГАМК-рецепторного комплекса как метод оценки механизмов их взаимодействия с медиаторной системой головного мозга // Журнал АМН Украины. - Т. 6. - 2000. - № 2. - С. 219-234.

2. Силантьєв С.О., Жук О.В., Зіньковський В.Г, Слизький А.В. Молекулярна модель взаємодії лігандів і рецепторів ГАМК_А-медіаторної системи in vivo // Нейрофізіологія. - Т. 32. - 2000. -№ 3. - С. 224-225.

3. Зиньковский В.Г., Головенко Н.Я., Жук О.В., Силантьев С.А. Особенности взаимосвязи основных фундаментальных характеристик системы "Организм-лекарство" // Журнал АМН Украины. - Т. 7. - 2001. -№ 1. - С. 22-32.

4. Зіньковський В.Г., Силантьєв С.О., Жук О.В., Головенко М.Я. Алостерична та поліконформаційна моделі ГАМК-рецепторного комплексу та алгоритм ізодинамічного аналізу мінімальних ефективних доз екзогенних лігандів // Клінічна фармація. - Т. 5. - 2001. - № 1. - С. 58-63.

5. Силантьєв С.О., Жук М.С., Зіньковський В.Г., Головенко М.Я. Ізодинамічний аналіз прояву фізіологічного антагонізму, конкурентної та алостеричної взаємодії ефектів лігандів медіаторних систем ЦНС. - Фізіологічний журнал. - Т. 44. - 1998. - № 3.- С. 13.

6. M.S. Zhuk, V.P. Chehovsky, S.A. Silantiev. Kinetic-Dynamic Modelling of Tranquillizers and Ethanol. Prague, Czechia, 9-13 October, 1995: Abstracts of IX^th Conference on Organic Chemistry & Biochemistry of Young Scientists. - 1995. - P. 37.

7. Zhuk O.V., Zinkovsky V.G., Silantiev S.A., Zhuk M.S. Search for Antiepileptic Drugs on the Basis of Modelling of Pharmacodynamics of GABA-Mediator System. Ste-Adиle, QC, Canada, 26-29 August, 1997: Abstracts from the conference "Focus on Epilepsy IV". - Ste-Adиle, 1997. - P. 32.

8. Zhuk M., Silantiev S., Tokar G., Slisky A., Schukin S. Kinetic Model of Interaction of Exogenic Ligands GABA_A-System in Normal and Pathological States. Berlin, Germany, 27 June - 1 July, 1998: Abstract Book of Forum of European Neuroscience. - European Journal of Neuroscience. - Vol. 10, 1998. - P. 186.

9. Zhuk M., Tokar G., Silantiev S. Modelling of the Effects of GABA_A and Glycine Receptor Ligands on the Dynamics of Paroxysmal States and the Neural Network's Stability: Abstracts of the 16^th ISN/28^th ASN Meeting, Boston, Massachusetts, USA. - Journal of Neurochemistry. - Vol. 69, Supplement. - Lippincont-Raven Publeshers, 1997. - P. 217.

Размещено на Allbest.ru