Дія тималіну, тимогену та вілозену на клітинні та імуногенетичні показники при алергічних реакціях уповільненого типу

Размещено на http://www.allbest.ru/

Київський національний університет імені Тараса Шевченка

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

03.00.11 - цитологія, гістологія

Дія тималіну, тимогену та вілозену на клітинні та імуногенетичні показники при алергічних реакціях уповільненого типу

Тхоржевський Богдан Миколайович

Київ-2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі загальної та молекулярної генетики біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Демідов Сергій Вікторович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка завідувач кафедри загальної та молекулярної генетики

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, Зінченко Валентина Андріївна, Інститут онкології АМН України, провідний науковий співробітник лабораторії експериментальної онкології та променевої патології;

доктор біологічних наук, Квітницька-Рижова Тетяна Юріївна, Інститут геронтології АМН України, завідуюча лабораторії морфології і цитології

Провідна установа: Національний медичний університет імені. О.О. Богомольця НАН України, м. Київ.

Вчений секретар спеціалізованої ради Давидовська Т.Л.

Анотація

Тхоржевський Б.М. Дія тималіну, тимогену та вілозену на клітинні та імуногенетичні показники при алергічних реакціях уповільненого типу. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 - цитологія, гістологія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2002.

Дисертація присвячена вивченню клітинних та імуногенетичних механізмів регулювання метаболізму Т-лімфоцитів при алергічних реакціях уповільненого типу і туберкульозній інфекції та дії препаратів з тимусу на розвиток цих процесів. Встановлено, що імунізація морських свинок вакциною БЦЖ, особливо двократна вакцинація, супроводжується збільшенням кількості Т-лімфоцитів, підсиленням проліферативної та функціональної активності лімфоїдних клітин, активізацією хелперних Т-клітин. Виявлено, що інфікування мишей лінії СВА мікобактеріями туберкульозу (штам Н37Rw) супроводжується зменшенням кількості Т-лімфоцитів, зниженням проліферативної та функціональної активності лімфоїдних клітин, активізацією супресорних Т-кліти. Показано, що застосування препаратів з тимусу при алергічних реакціях уповільненого типу і туберкульозній інфекції призводить до збільшення кількості Т-лімфоцитів, підвищення проліферативної активності лімфоїдних клітин, інтенсифікації репаративного синтезу ДНК. Найбільш стимулюючим ефектом володіє тимоген, найменшим вілозен.

Ключові слова: тималін, тимоген, вілозен, Т-лімфоцити.

Summary

Thorzevsky B.N. Thymalin, thymogen and vilosen influence on cellular and immunogenetic indexes under allergic reactions of delayed type. - Manuscript.

This dissertation for competition of scientific degree of candidate of biological sciences on a speciality 03.00.11 - cytology, histology. -Taras Shevchenko Kyiv National University, Kyiv, 2002.

This dissertation is devoted to investigation of cellular and immunogenetic mechanisms of metabolism T-lymphocytes regulation under allergic reactions of delayed type and tubercular infection and thymus preparation's affection on the development of these processes. It was established, that immunization of guinea-pigs with the help BCG vaccine (especially double vaccination) is accompanied by quantity increase of T-lymphocytes, prolipherative and functional activity strengthening of lymphoid cells, activation of helpers T-cells. It was revealed, that infection of mice of CBA line with the help of tubercular mycobacterium (strain H37Rw) is accompanied by quantity decrease of T-lymphocytes, prolipherative and functional activity lowering lymphoid cells, activation of suppressor T-cells. It was shown, that thymus preparation's under allergic reactions of delayed type and tubercular infection influences on the increase of T-lymphocytes quantity rise of prolipherative activity of lymphoid cells, intensification of reparative synthesis of DNA. Thymogen has more stimulating effect, than vilosen has.

Key words: thymalin, thymogen, vilosen, T-lymphocytes.

Аннотация

Тхоржевский Б.Н. Действие тималина, тимогена и вилозена на клеточные и иммуногенетические показатели при аллергических реакциях замедленного типа. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.11 - цитология, гистология. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2002.

Диссертация посвящена изучению клеточных и иммуногенетических механизмов регулирования метаболизма Т-лимфоцитов при аллергических реакциях замедленного типа и туберкулезной инфекции и действии препаратов из тимуса на развитие этих процессов. Установлено, что иммунизация морских свинок вакциной БЦЖ, особенно двукратная вакцинация, сопровождается увеличением количества Т-лимфоцитов, усилением пролиферативной и функциональной активности лимфоидных клеток, активизацией хелперных Т-клеток. Введение тималина и вилозена увеличивает количество Т-лимфоцитов в 1,2 раза, тимогена в 1,3 раза по сравнению с ревакцинированными животными. Применение препаратов из тимуса приводит к усилению пролиферативной активности лимфоидных клеток, интенсификации репаративных процессов, в частности репаративного синтеза ДНК. Наибольшим эффектом обладает тимоген, наименьшим вилозен. При развитии аллергической реакции замедленного типа препараты из тимуса действуют разнонаправлено, это выражается в активизации тималином и тимогеном Т-хелперной субпопуляции лимфоцитов, вилозеном - Т-супрессорной, таким образом, вилозен эффективен в случае необходимости подавления аллергических реакций замедленного типа, что приводит к снижению воспалительного процесса. Выявлено, что при иммунизации морских свинок вакциной БЦЖ, параллельно с увеличением количества ДНК пропорционально увеличивается размер клеточного ядра, что, безусловно, свидетельствует про усиление функциональной активности Т-лимфоцитов. Происходит увеличение суммарной площади ядрышек, вследствие увеличения их количества в ядре. Эти параметры еще больше возрастают после введения животным тималина, вилозена и, особенно, тимогена. Установлено, что инфицирование мышей линии СВА микобактериями туберкулеза (штамм H37Rw) сопровождается уменьшением количества Т-лимфоцитов, снижением пролиферативной и функциональной активности лимфоидных клеток, активизацией супрессорных Т-клеток. Эти морфофункциональные и иммунологические показатели свидетельствуют про развитие Т-клеточной недостаточности при туберкулезной инфекции. Введение тималина увеличивает количество Т-лимфоцитов в 1,5 раз, тимогена в 1,7 раз, вилозена в 1,4 раза по сравнению с инфицированными животными. Применение препаратов из тимуса приводит к усилению пролиферативной активности лимфоидных клеток, интенсификации репаративных процессов, в частности репаративного синтеза ДНК. Наибольшим эффектом обладает тимоген, наименьшим вилозен. Влияние препаратов из тимуса на развитие туберкулезного процесса носит однонаправленный характер, активизируется Т-хелперная субпопуляция лимфоцитов.

Ключевые слова: тималин, тимоген, вилозен, Т-лимфоциты.

1. Загальна характеристика роботи

клітинний метаболізм тимус репарація

Актуальність теми. Підвищення радіаційного фону після аварії на Чорнобильській АЕС створює додаткове навантаження на організм, що призводить до значного зростання випадків первинного та набутого імунодефіцитів [Скрипка, 1995]. Незважаючи на значний прогрес у дослідженні молекулярно-клітинних механізмів виникнення алергічної реакції уповільненого типу, класичний приклад - туберкулінова алергія, яка на певних етапах супроводжується порушеннями Т-клітинної ланки, залишається відкритим питання дії імуномодуляторів у нормі та при патології, а також їх використання у комплексі з антибактеріальною терапією. Вивчення механізмів дії препаратів з тимусу є актуальною проблемою у зв'язку з необхідністю корекції великої кількості первинних та вторинних імунодефіцитних станів, пов'язаних з порушенням функції Т-клітинної системи імунітету [Серый, 1988].

Основний підхід до пояснення молекулярно-клітинних механізмів впливу імуномодулюючих препаратів складається з вивчення їх дії на внутрішньоклітинні регуляторні процеси та експресію диференцюючих антигенів на поверхні лімфоцитів [Bhalla, 1999]. Вплив препаратів на здатність лімфоцитів експресувати диференцюючи антигени дозволяє в кінцевому підсумку індивідуалізувати терапевтичні заходи при імунодефіцитних станах [Bensman, 2000].

Розуміння цих механізмів дає можливість прогнозувати вплив того чи іншого імуномодулятора на організм та об'єктивно оцінювати можливість цілеспрямованого впливу цих засобів терапії при різних імунопатологіях.

Таким чином, треба навчитися управляти імунологічною системою організму, спираючись на об'єктивні дані молекулярно-клітинного механізму дії імуномодулюючих препаратів у нормі та при патології.

Визрівання клітин до стану імунокомпетентності полягає у фенотипічному проявленні генетично детермінованої програми [Luccesi, 1999], яка реалізується при взаємодії специфічних молекул з поверхневими рецепторами лімфоїдних клітин. Як специфічні фактори при диференціації Т-лімфоцитів виступають гормони тимусу.

Не дивлячись на досягнуті успіхи в лікуванні імунодефіцитних станів, пов'язаних з порушенням функції Т-системи імунітету, вибір імуномодулюючих препаратів носить емпіричний характер. Це пов'язано з відсутністю експериментальних даних про патогенетичні механізми, що обумовлюють основні напрями дії цих препаратів, вивчення фрагментарних сторін ефекту у плані впливу на деякі цитологічні та імуногенетичні аспекти, недостатнім обгрунтуванням клінічних показань та протипоказань. Отже, комплексне вивчення дії тималіну, тимогену та вілозену на молекулярно-клітинні механізми функціонування і шляхи регуляції метаболізму імунокомпетентних клітин при алергічних реакціях та імунодефіцитних станах має велике значення для розуміння процесів, що відбуваються при цих патофізіологічних станах, та може бути використаним для профілактики і лікування вищезгаданих захворювань.

Зв'язок з науковою тематикою організації. Робота виконана у рамках теми № 01БФ036-06 “Вплив біологічно-активних речовин та еластичних напружень ДНК на будову хроматину в ядрах клітин” кафедри загальної та молекулярної генетики біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Мета та задачі дослідження. Мета роботи полягала в дослідженні молекулярно-клітинних та імуногенетичних механізмів регулювання метаболізму імунокомпетентних клітин при алергічних реакціях уповільненого типу і туберкульозної інфекції та дії препаратів з тимусу у розвитку цих процесів.

В зв'язку з цим в роботі було поставлено наступні задачі:

1. Дослідити кількість, субпопуляційний склад, проліферативну та цитотоксичну активність лімфоцитів при Т-клітинному імунодефіцитному стані, обумовленому туберкульозною інфекцією.

2. Встановити особливості дії тималіну, тимогену та вілозену на клітинному, субклітинному і генетичному рівнях при алергічних реакціях уповільненого типу та імунодефіцитному стані.

3. Вивчити процеси репарації ДНК, каріоцитометричні показники імунокомпетентних клітин при алергічних реакціях уповільненого типу та імунодефіцитному стані.

4. Дослідити вплив тималіну, тимогену та вілозену в комплексі з антибактеріальною терапією при Т-клітинному імунодефіцитному стані, обумовленому туберкульозною інфекцією.

5. Встановити за допомогою статистичних програм і регресивного аналізу особливості кількісних залежностей між імунологічними показниками у нормі та при імунопатологічних станах.

Об'єкт дослідження - вплив тималіну, тимогену і вілозену на клітинні та імуногенетичні показники.

Предмет дослідження - Т-лімфоцити селезінки морських свинок та мишей лінії СВА.

Методи дослідження - імунологічні, спектрофотометричні, спектрофлуометричні, комп'ютерний аналіз, регресивний аналіз.

Наукова новизна. Вперше дана комплексна оцінка процесів, що відбуваються при розвитку алергічних реакцій уповільненого типу та імунодефіцитному стані, обумовленому туберкульозною інфекцією, які супроводжуються зміною проліферативної активності, цитолізу клітин-мішеней Т-лімфоцитами-ефекторами, перерозподілом активності Т-клітинної субпопуляції лімфоцитів, перерозподілом співвідношення одно- та двониткової ДНК, змінами у морфометричних показниках клітин.

Встановлено особливості дії тималіну, тимогену та вілозену на клітинному, субклітинному і генетичному рівнях при алергічних реакціях уповільненого типу та імунодефіцитному стані, обумовленому туберкульозній інфекцією.

Виявлено, що препарати з тимусу сприяють підсиленню проліферативної та цитотоксичної активності, змінюють співвідношення регуляторних субпопуляцій Т-лімфоцитів, підсилюють процеси репарації генетичної інформації, змінюючи каріоцитометричні показники клітин.

Встановлено різноспрямованість дії препаратів з тимусу, при алергічних реакціях уповільненого типу, яка виявляється в активації тималіном і тимогеном Т-хелперної субпопуляції лімфоцитів, вілозеном - Т-супресорної.

Визначені кількісні взаємозв'язки між змінами імунореактивності лімфоїдних клітин і молекулекулярно-генетичними показниками, які характеризують стан Т-системи імунітету при розвитку алергічних реакцій уповільненого типу та імунодефіцитному стані, обумовленому туберкульозною інфекцією.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати комплексної дії препаратів з тимусу на стан та функціонування клітин дають можливість підвищити ефективність і надійність виявлення ступеню порушення Т-клітинного імунітету при різних алергічних процесах, що супроводжуються Т-клітинним імунодефіцитом.

З'ясовані шляхи та розроблені засоби корекції Т-клітинного імунодефіциту, викликаного вірулентними штамами мікобактерій туберкульозу (штам Н37Rw). Отримані експериментальні дані розширюють уявлення про характер змін в імунокомпетентних клітинах, генетичного апарату клітин при алергічних процесах та імунодефіцитному стані.

Розробка даного напряму, нарівні з розв'язанням загальнотеоретичних проблем, дозволить впровадити у практику принципово нові підходи у використанні препаратів з тимусу при Т-клітинному імунодефіцитному стані, обумовленому туберкульозною інфекцією.

Особистий внесок здобувача. Дисертант опрацював необхідну за темою літературу, оволодів необхідними аналітичними та статистичними методами досліджень, брав участь у виконанні експериментальних робіт і підготовці матеріалів до друку. Конкретний внесок дисертанта у роботу полягав у розробці концепції комплексної терапії Т-клітинної недостатності при імунодефіцитних станах та виконанні всіх експериментальних робіт, обговоренні одержаних результатів.

Апробація роботи. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися на I конференції імунологів, Канів - 1993, I з'їзд українського біофізичного товариства, Київ - 1994, III міжнародній конференції “Біоресурси та віруси“, Київ - 2001.

Публікація матеріалів. Основні положення і результати досліджень опубліковані у 7 роботах, з яких 5 статей у виданнях, рекомендованих ВАК України та 2 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 121 сторінках друкованого тексту, складена із вступу, огляду літератури, розділу, де викладені матеріали та методи досліджень, розділів, що відображають результати власних досліджень з обговоренням, заключної частини та висновків. Робота ілюстрована 22 таблицями та 11 рисунками. Список використаної літератури містить 166 джерел, з яких 117 вітчизняних та 49 іноземних.

2. Основний зміст роботи матеріали та методи досліджень

Дослідження проведенні на самцях морських свинок масою 250±25 г. та мишах лінії СВА 25±0,5 г.

Гіперчутливість уповільненого типу (ГУТ) відтворювали на морських свинках, яких імунізували сухою вакциною БЦЖ у дозі 0,15 мг. в 0,5 мл. фізіологічного розчину, підшкірно, у праву пахову ділянку. Через один місяць після імунізації тварин забивали. Вакцинацію БЦЖ проводили з інтервалом один місяць, препарати з тимусу вводили тваринам перорально в 0,3 мл. фізрозчину на протязі 10 днів після завершення вакцинації у дозах: тималін-0,2 мг/кг, тимоген-0,02 мг/кг, вілозен-2 мг/кг.

Тварин розділяли на групи (10-15 у кожній) в залежності від завдань експерименту:

1 група - інтактні тварини;

2, 3, 4 групи - інтактні тварини, яким вводили тималін, тимоген, вілозен;

5 група - однократно вакциновані тварини;

6, 7, 8 групи - однократно вакциновані тварини, яким вводили тималін, тимоген, вілозен;

9 група - двократно вакциновані тварини;

10, 11, 12 групи - двократно вакциновані тварини, яким вводили тималін, тимоген, вілозен;

13 група - трикратно вакциновані тварини;

14, 15, 16 групи - трикратно вакциновані тварини, яким вводили тималін, тимоген, вілозен.

Експериментальний туберкульоз у мишей лінії СВА відтворювали введенням в латеральну вену хвоста 0,25 мг. двотижневої культури мікобактерій туберкульозу (штам Н37Rw) в 0,5 мл. фізрозчину. Препарати з тимусу вводили тваринам перорально в 0,3 мл. фізрозчину на протязі 10 днів у дозах: тималін-0,2 мг/кг, тимоген-0,02 мг/кг, вілозен-2 мг/кг. Стрептоміцин та ізоніазид вводили у тому ж об'ємі з 1-го до 15-го дня зараження.

Тварин розділяли на групи (10-15 у кожній) в залежності від завдань експерименту:

1 група - інтактні тварини;

2 група - тварини, які отримували фізрозчин (контроль - інфекції);

3,4,5 групи - тварини, якім вводили тималін, тимоген, вілозен;

6,7 групи - тварини, якім вводили стрептоміцин, ізоніазид;

8 група - тварини, якім вводили тималін + стрептоміцин;

9 група - тварини, якім вводили тималін + ізоніазид;

10 група - тварини, якім вводили тимоген + стрептоміцин;

11 група - тварини, якім вводили тимоген + ізоніазид;

12 група - тварини, якім вводили вілозен + стрептоміцин;

13 група - тварини, якім вводили вілозен + ізоніазид.

Для визначення схеми вакцинації БЦЖ ми керувалися загальнобіологічним законом “доза-ефект”. Трикратна вакцинація дозволила визначити область оптимальної концентрації, при якій алергічна реакція уповільненого типу є найбільш виразною.

Інтенсивність алергічної реакції уповільненого типу оцінювали за допомогою внутрішньошкірних туберкулінових проб за формулою [Курманова, 1971]. Т-лімфоцити виділяли з застосуванням колонок з нейлоновою ватою [Julius, 1978]. Кількість Т-лімфоцитів оцінювали методом спонтанного розеткоутворення з еритроцитами кролика [Rutten, 1990]. З метою оцінки функціонального стану Т-лімфоцитів застосована реакція бласттрансформації лімфоцитів (РБТЛ) з фітогемаглютиніном (ФГА) та туберкуліном (PPD), з використанням радіоізотопного методу обліку [Киселева, 1985]. Пошкодження ДНК визначали за методом [Газиев, 1979].

Комп'ютерний аналіз зображення здійснювали за системою “ІВА-2000” (Німеччина). Статистична обробка результатів проведена за допомогою пакета прикладних програм “Кіндо” (мова реалізації “Фортран-77”) на мікро ЕВМ Р-11/23 і стандартної варіаційної статистики та регресивного аналізу.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Цитоморфометричні дослідження стану Т-лімфоцитів селезінки. Досліджено вплив препаратів з тимусу на Т-лімфоцити селезінки морських свинок, імунізованих вакциною БЦЖ. Для аналізу приймали до уваги такі параметри: площа ядра, ядерець та клітин, ядерно-ядерцеві і клітинні співвідношення, кількість ядерець.

Результати проведеного морфометричного аналізу свідчать, що вакцинація тварин БЦЖ змінює площу ядра з 24,461,97 мкм² в інтактній групі тварин до 30,00 1,26 мкм², р<0,05. Це призводить до збільшення площі Т-лімоцитів до 43,441,15 мкм² у порівнянні з 37,033,25 мкм², р<0,05 в інтактній групі тварин (табл. 1). Введення тималіну збільшує площу ядра клітини до 36,352,02 мкм², тимогену - до 40,514,96 мкм². Застосування вілозену не впливає на зміну площі ядра клітини. В той час, як препарати з тимусу збільшують площу клітини в 1,3; 1,4; 1,2 рази відповідно у порівнянні з вакцинованими тваринами.

Встановлено, що при вакцинації змінюється сумарна площа ядерець з 3,26 0,24 мкм² в інтактній групі до 4,630,33 мкм², р<0,05. Це пов'язано зі збільшенням кількості ядерець в клітинному ядрі. Введення тималіну збільшує цей параметр до 6,00,54 мкм², р<0,05 у порівнянні з 4,630,33 мкм² у вакцинованих тварин, які не отримали препаратів, тимогену - 7,330,72 мкм², р<0,05 та вілозену до 4,760,26 мкм², р<0,05. Застосування препаратів з тимусу супроводжується активізацією метаболічних процесів, збільшенням кількості ядерець в ядрі, що в свою чергу призводить до адекватного збільшення сумарної площі ядерець.

Кількість Т-лімфоцитів селезінки. Досліджено, що вакцинація БЦЖ супроводжується збільшенням кількості розеткоутворюючих Т-лімфоцитів. Максимальні значення спонтанного розеткоутворення відмічено у двократно вакцинованих тварин (21,11,2%) проти 12,00,6%, р0,05 у інтактних (табл. 2).

Після трикратної вакцинації морських свинок рівень спонтанного розеткоутворення Т-лімфоцитів (17,30,9%) практично не відрізнявся від такого у однократно вакцинованих тварин (16,51,0%).

Застосування тималіну та вілозену призводить до збільшення кількості Т-лімфоцитів в 1,2 рази, тимогену в 1,3 рази у порівнянні з двократно вакцинованими тваринами. Показано, що введення препаратів з тимусу всім групам вакцинованих тварин також збільшує цей показник.

Результати імунологічних досліджень свідчать, що розвиток туберкульозного процесу супроводжується змінами імунного статусу організму. Розеткоутворююча здатність лімфоцитів була вірогідно нижче у заражених мікобактеріями туберкульозу тварин (8,90,9%) у порівнянні з такими в інтактній групі тварин (16,21,2%, р<0,05) (табл. 3).

Введення тималіну збільшує кількість Е-РУК до 13,81,1%, р<0,05 тимогену - до 15,00,7%, р<0,05 та вілозену - до 12,10,6%, р<0,05 у порівнянні з групою тварин інфікованих мікобактеріями туберкульозу (8,90,9%).

Використання стрептоміцину та ізоніазиду призводить до збільшення кількості Е-розеткоутворюючих клітин в 1,2 і 1,3 рази відповідно у порівнянні з групою контрольних тварин. Введення препаратів з тимусу у поєднанні з стрептоміцином та ізоніазидом практично не підсилює розеткоутворюючої здатності лімфоцитів. Найбільш ефективним виявилось поєднання тимогену з ізоніазидом.

Проліферативна активність Т-лімфоцитів селезінки. Результати досліджень свідчать, що двократна вакцинація БЦЖ призводить до максимального підвищення проліферативної активності Т-лімфоцитів (табл. 4).

Включення [Н]³-тимідіну у ДНК лімфоцитів у цій групі зростало, як в спонтанній культурі (з 236454 імп/хв. до 3090235 імп/хв., р<0,05) так і в стимульованій клітинним мітогеном ФГА (з 26953979 імп/хв. до 38952397 імп/хв., р<0,05), а також і у відповідь на введення специфічного антигену PPD (з 23958723 імп/хв. до 3989289 імп/хв., р<0,05).

Двократна вакцинація в умовах дії препаратів з тимусу супроводжується значним підвищенням включення [Н]³-тимідіну в ДНК і складає при застосуванні тималіну 3284118 імп/хв., р<0,05, тимогену 4955118 імп/хв., р<0,05 та 272423 імп/хв., р<0,05 - вілозену. Підсилення проліферативної активності спостерігається при повторній вакцинації БЦЖ в реакції з ФГА, при дії тималіном 626991233 імп/хв., р<0,05, тимогеном 84121614 імп/хв., р<0,05 та 363001121 імп/хв., р<0,05 - вілозеном. Введення в культуру лімфоцитів специфічного антигену PPD також збільшує включення [Н]³-тимідіну в ДНК лімфоцитів, при використанні тималіну 4625122 імп/хв., р<0,05, тимогену 7837114 імп/хв., р<0,05 та 280725 імп/хв., р<0,05 - вілозену.

Вивчено вплив туберкульозної інфекції і препаратів з тимусу на проліферативну активність Т-лімфоцитів. Включення [Н]³-тимідіну у ДНК лімфоцитів різко знижувалось, як в спонтанній культурі (з 1924103 імп/хв до 1216184 імп/хв., р<0,05), так і у стимульованій ФГА (з 51324 1146 імп/хв до 25646 987 імп/хв., p0,05). Введення в культуру лімфоцитів специфічного антигену PPD незначно збільшує включення [Н]³-тимідіну в ДНК лімфоцитів (з 2907112 імп/хв до 4080126 імп/хв., р0,05) (табл. 5).

Встановлено, що препарати з тимусу підсилюють проліферативну активність з 1216184 імп/хв., р0,05 у інфікованих тварин до 1429169 імп/хв., р0,05 при дії тималіном, 1607148 імп/хв., р0,05 - тимогеном та 1349109 імп/хв., р0,05 - вілозеном.

Використання тимусних препаратів з клітинним мітогеном ФГА та специфічним антигеном PPD збільшує включення [Н]³-тимідіну в ДНК лімфоцитів. В реакції з ФГА, при застосуванні тималіну - 308141211 імп/хв., р0,05, тимогену - 31754874 імп/хв., р0,05 та 28868624 імп/хв., р0,05 - вілозену. Введення в культуру PPD також підвищує проліферативну активність Т-лімфоцитів, при використанні тималіну 4902 189 імп/хв., р0,05, тимогену 5072262 імп/хв., р0,05 та 4494304 імп/хв., р0,05 - вілозену.

Результати досліджень комплексної терапії свідчать, що вплив тималіну, тимогену і вілозену у поєднанні з стрептоміцином та ізоніазидом, при стимуляції культури лімфоцитів ФГА, підсилюють проліферативну активність. Така ж тенденція спостерігається і у відповідь на введення PPD, але виключенням є вілозен, який знижує включення [Н]³-тимідіну в ДНК лімфоцитів.

Функціональна активність Т-лімфоцитів селезінки. Результати дослідження впливу вакцинації на функціональну активність мітоген-індукованих регуляторних лімфоцитів свідчать, що введення вакцини БЦЖ знижує індекс супресії до 35,2 % у порівнянні з 41,2 % в інтактній групі тварин (рис. 1). Застосування препаратів з тимусу на фоні двократної вакцинації призводить до перерозподілу супресорної активності Т-лімфоцитів. Так, використання тималіну і тимогену ще більше знижує супресорну активність Т-лімфоцитів у порівнянні з інтактною групою тварин в 1,3 рази та в 1,4 рази, індекс супресії при цьому складає 31,1% і 29,0% відповідно. Введення вілозену, навпаки, підвищує супресорну активність Т-лімфоцитів в 1,5 разів, індекс супресії при цьому дорівнює 62,1%.

Показано, що дія препаратів з тимусу при розвитку алергічних реакцій уповільненого типу різноспрямована. При цьому тималін і тимоген активізують Т-хелперну субпопуляцію лімфоцитів, вілозен - Т-супресорну.

Вивчення впливу туберкульозної інфекції на функціональну активність мітоген-індукованих регуляторних лімфоцитів показало, що інфікування тварин мікобактеріями туберкульозу призводить до активації супресорних Т-клітин, при цьому індекс супресії збільшується до 72,6 % у порівнянні з 41,2 % у групі інтактних тварин (рис. 2). Це, певно, і зумовлює зниження показників Т-клітинного імунітету.

Застосування тималіну, тимогену і вілозену знижує індекс супресії до 67,4%, 65,0% та 69,2% відповідно. Вплив препаратів з тимусу на розвиток туберкульозного процесу має односпрямований характер, активується Т-хелперна субпопуляція лімфоцитів.

Цитогенетичні дослідження репарації ДНК Т-лімфоцитів селезінки.

Вакцинація тварин призводить до появи структурних аберацій хромосом (розриви, обміни), змінам у кількості хромосом [Blawat, 1997]. Крім того, імунізація призводить до з'явлення метафаз з ушкодженим розходженням хромадит по центромірі і транслокаційним перебудовам хромосом [Nichols, 1998]. Цитогенетичні порушення зумовлюють втрату здібності клітини активно функціонувати. Для виправлення порушень та забезпечення передачі спадкових властивостей і експресії генетичної інформації існує система внутрішньоклітинної репарації ДНК, яка стабілізує нормальне функціонування і підтримку життєздатності клітин.

Показано, що імунізація морських свинок вакциною БЦЖ супроводжується збільшенням кількості ДНК з однонитковими розривами з 48 1,8 % р < 0,05 в інтактній групі тварин до 58 2,4 %, р < 0,05 у вакцинованих тварин (рис. 3).

Встановлено, що введення тималіну зменшує кількість ДНК з однонитковими розривами до 44 1,3 %, р < 0,05 у порівнянні з групою тварин, які не отримали препарати (58 2,4 %, р < 0,05), тимогену - до 43 1,8 %, р < 0,05, та вілозену - до 47 1,5 %, р < 0,05.

Вакцина БЦЖ індукує структурні аберації ДНК лімфоцитів, які призводять до збільшення однониткових розривів в ДНК Т-лімфоцитів. Використання препаратів з тимусу при вакцинації сприяє активізації репараційних процесів, зокрема репараційного синтезу ДНК, забезпечує стабільність, нормальне функціонування та підтримку життєздатності клітин. Найбільший ефект має тимоген, найменший - вілозен.

Аналіз цитогенетичних відхилень в Т-лімфоцитах та показників їх імунореактивності свідчать про ураження хромосом лімфоцитів на фоні розвитку туберкульозної інфекції. Це призводить до зниження кількості Т-лімфоцитів і порушенню їх функціональних властивостей. Таким чином, пригнічення Т-клітинної системи імунітету при експериментальному туберкульозі відбувається паралельно з наростанням в лімфоцитах хромосомних аберацій. В організмі існує система внутрішньоклітинної репарації, яка забезпечує нормальне функціонування та стабільність структури ДНК.

Показано, що інфікування мишей лінії СВА мікобактеріями туберкульозу супроводжується збільшенням кількості ДНК з однонитковими розривами з 46 1,8 %, р < 0,05 в інтактній групі тварин до 61 2,2 %, р < 0,05 у інфікованих тварин.

Встановлено, що введення тималіну зменшує кількість ДНК з однонитковими розривами до 53 1,6 %, р < 0,05 у порівнянні з групою тварин, які не отримали препарати (61 2,2 %, р < 0,05), тимогену - до 52 1,4 %, р < 0,05, та вілозену - до 54 1,9 %, р < 0,05.

Туберкульозна інфекція індукує структурні аберації ДНК лімфоцитів, які призводять до збільшення однониткових розривів в ДНК Т-лімфоцитів. Використання препаратів з тимусу за умов експериментального туберкульозу сприяє активізації репараційних процесів, зокрема репараційного синтезу ДНК, забезпечує стабільність, нормальне функціонування та підтримку життєздатності клітин. Найбільший ефект має тимоген, найменший - вілозен.

Висновки

1. Алергічні реакції уповільненого типу, обумовлені вакциною БЦЖ, супроводжуються збільшенням кількості Т-лімфоцитів, підсиленням проліферативної та функціональної активності лімфоїдних клітин, підвищенням цитолізу клітин-мішеней Т-лімфоцитами-ефекторами, активізацією хелперної субпопуляції Т-лімфоцитів, збільшенням ДНК з одонитковими розривами.

2. Встановлено, що двократна вакцинація тварин призводить до максимального збільшення Е-розеткоутворюючих клітин. Введення тималіну та вілозену збільшує кількість Т-лімфоцитів в 1,2 рази, тимогену в 1,3 рази у порівнянні з двократно вакцинованими тваринами.

3. Показано, що ревакцинація морських свинок вакциною БЦЖ супроводжується підвищенням проліферативної активності Т-лімфоцитів. Застосування препаратів з тимусу збільшує включення [Н]³-тимідіну в ДНК лімфоцитів, найбільш стимулюючим ефектом володіє тимоген, найменшим вілозен.

4. Досліджено, що при вакцинації БЦЖ паралельно із збільшенням кількості ДНК пропорційно зростає розмір клітинного ядра, що безперечно свідчить про підвищення функціональної активності лімфоїдних клітин. Відбувається збільшення сумарної площі ядерець, внаслідок зростання їхньої кількості в ядрі. Ці параметри стають ще більшими після введення тваринам тималіну, вілозену і, особливо, тимогену.

5. При розвитку алергічної реакції уповільненого типу препарати з тимусу діють різноспрямовано, це виражається в активізації тималіном і тимогеном Т-хелперної субпопуляції лімфоцитів, вілозеном - Т-супресорної, тобто вілозен ефективен в разі необхідності пригнічення алергічної реакції уповільненого типу, що призводить до зниження запального процесу.

6. Розвиток туберкульозної інфекції супроводжується зменшенням кількості Т-лімфоцитів, зниженням проліферативної активності лімфоїдних клітин, збільшенням ДНК з одонитковими розривами, відбувається активізація супресорних Т-клітин. Ці морфофункціональні та імунологічні показники свідчать про розвиток Т-клітинної недостатності при туберкульозному процесі.

7. Встановлено, що введення тималіну і тимогену збільшує кількість Е-розеткоутворюючих клітин в 1,5 та в 1,7 разів відповідно, вілозену в 1,4 рази у порівнянні з інфікованими тваринами. Застосування препаратів з тимусу призводить до підсилення репаративного синтезу ДНК в Т-лімфоцитах. Вплив препаратів на розвиток туберкульозного процесу має односпрямований характер, активізується Т-хелперна субпопуляція лімфоцитів.

Список праць опублікованих за темою дисертації

1. Скрипка К.О., Демідов С.В., Тхоржевський Б.М., Рясенко В.І., Жовтенко С.М. Вплив тимогену на функціональний стан лімфоцитів селезінки норок за умов хронічного опромінення // Проблеми Чорнобильскої зони відчуження. - 1995. - Вип. 2. - С. 153-155.

2. Тхоржевський Б.М., Демідов С.В., Рясенко В.І., Храпунов С.М. Вплив тимогену на репарацію ДНК лімфоцитів селезінки норок за умов хронічного опромінення // Проблеми Чорнобильскої зони відчуження. - 1995. - Вип. 2. - С. 155-157.

3. Тхоржевський Б.М., Демідов С.В., Александрова О.І., Скрипка Е.А. Зміна морфофункціональних та імунологічних показників мишей лінії СВА під впливом препаратів із тимусу при експериментальному туберкульозі // Імунологія та алергологія. - 2001. - № 4. - С. 9-12.

4. Тхоржевський Б.М., Демідов С.В., Конопліч Л.А., Александрова О.І. Вплив тималіну і стрептоміцину на зміну морфофункціональних та імунологічних показників мишей лінії СВА за експериментального туберкульозу // Вісник Київського університету. Сер. Біологія. - 2001. - Вип. 33. - С. 72-74.

5. Тхоржевський Б.М., Демідов С.В., Александрова О.І. Вплив препаратів із тимусу на репарацію ДНК Т-лімфоцитів селезінки мишей лінії СВА за умов експериментального туберкульозу // Вісник Київського університету. Сер. Біологія. - 2001. - Вип. 34. - С. 7-8.

6. Демідов С.В., Тхоржевський Б.М. Вплив тимогену на бактеріцидну активність макрофагів при хронічному опроміненні норок в зоні ЧАЕС // І з'їзд українського біофізичного товариства. Київ, 20-24 червня. 1994. - С. 83.

7. Тхоржевський Б.М. Зміна морфофункціональних та імунологічних показників мишей лінії СВА під впливом імуномодуляторів при інфекційних процесах // ІІІ Міжнародна конференція “Біоресурси та віруси”. Київ, 10-15 вересня. 2001. - С. 56. Размещено на Allbest.ru