Размещено на http://www.allbest.ru/

Академія медичних наук України

Інститут фармакології та токсикології

УДК 615.272.4.014.425:544.792+547.856

Пошук речовин з антирадикальною і антиперекисною активністю серед похідних хіназолону-4 та 4-амінохіназоліну

14.03.05 - фармакологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Бухтіярова Ніна Вікторівна

Київ 2003

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано на кафедрі фармакології Запорізького державного медичного університету МОЗ України

Науковий керівник: Заслужений діяч науки і техніки України, доктор медичних наук, професор Дунаєв Віктор Володимирович, Запорізький державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри фармакології

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Мохорт Микола Антонович, Інститут фармакології та токсикології АМН України, завідувач відділу фармакології серцево-судинних засобів

доктор медичних наук, професор Степанюк Георгій Іванович, Вінницький національний медичний університет ім. М.І. Пирогова МОЗ України, завідувач кафедри фармакології

Провідна установа: Одеський державний медичний університет МОЗ України, кафедра фармакології

Захист відбудеться “ 19_” _листопада_ _ 2003 року о _13-00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 в Інституті фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Е. Пот'є, 14.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Е. Пот'є, 14.

Автореферат розісланий “_16_” ___листопада______2003 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

Д 26.550.01

кандидат біологічних наук І.В. Данова

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. В останні роки все більше привертають увагу фармакологів такі поняття, як антиоксиданти, антиоксидантна дія ліків, ліки-антиоксиданти (Ю.І. Губський та ін., 1998; М.В. Биленко, 1989). І це не випадково, як показали дослідження останніх років: більшість розповсюджених захворювань людини, зокрема патології серцево-судинної системи, дихальних шляхів, злоякісні новоутворення та ін. у своєму патогенезі мають достатньо чітко виражену вільнорадикальну фазу (А.Л. Базилевич, 1996; Є.Л. Левицький та ін., 1993; В.А. Малахов та ін., 2001; Cao W. Et al., 1998).

Утворення надлишкової кількості високореакційних радикалів (супероксиданіон-, гідроксилрадикал тощо) викликає окисну модифікацію ліпідів, білків, нуклеїнових кислот і, як наслідок, приводить до деструкції мембран і загибелі клітин [Ю.І. Губський та ін., 2000; В.Л. Козловський, 1990; J.D. Adams et al, 1991).

Здатність антиоксидантів інгібувати вільнорадикальне окиснення (ВРО), стабілізувати структуру і функції клітинних мембран, і завдяки цьому створювати оптимальні умови для гомеостазу клітин і тканин, дає патогенетичне обґрунтування до застосування їх в кардіологічній, неврологічній, офтальмологічній, геронтологічній практиці для профілактики та лікування атеросклерозу, гепатиту, інфаркту міокарда, мозкових інсультів тощо (А.А. Болдырев, 2000; Веселинський І.Ш. та ін., 1997; Ю.И. Губский и др., 1993).

На сьогоднішній день у клінічній практиці знайшли застосування такі антиоксиданти як емоксипін, мексидол, дибунол, похідні -токоферолу, тіотриазолін, ліпін та ін. (В.В. Дунаєв та ін., 2002; Г.Г. Коновалова и др., 2000; И.А. Мазур и др., 2002). Однак, незважаючи на застосування у клінічній практиці як класичних антиоксидантів, так і препаратів, що проявляють антиоксидантну дію, вибір засобів антиоксидантної терапії обмежений внаслідок їх недостатньої ефективності та наявності побічних дій (Д. Кригер, 1998). Тому пошук нових високоефективних антиоксидантних засобів, що діють на ініціальних етапах ВРО, а також засобів, що реактивують антиоксидантну систему та гальмують основні шляхи утворення вільних форм кисню, є актуальною задачею сучасної фармакології.

Достатньо перспективними у цьому плані є похідні хіназоліну, що мають широкий спектр біологічної активності, зокрема антиоксидантну (Р.С. Синяк и др., 1986; И.А. Мазур и др., 1988; В.В. Дунаєв та ін., 2002). Дослідженнями співробітників Запорізького державного медичного університету і Національного фармацевтичного університету (м. Харків) виявлена антиоксидантна активність серед похідних 4-амінохіназоліну.

Насьогодні антиоксидантна активність у ряду N-(4-хіназоліл)-аміноалкіл(арил)карбонових і 2-R²-6-R³-8-R⁴-(3H)-хіназолон-4-іл-3-()-алкілкарбонових кислот та їх водорозчинних солей не вивчена.

Вищенаведене обумовлює перспективність пошуку речовин з антиоксидантною дією серед похідних хіназоліну.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Представлена дисертаційна робота виконана як фрагмент планових науково-дослідних робіт кафедр фармацевтичної хімії та фармакології Запорізького державного медичного університету “Синтез нових функціональних заміщених п'яти-, шестичлених моно- і анельованих азагетероциклічних систем та їх біологічна активність” (№ державної реєстрації 0196 U 13916, шифр ІН 15.00.05.96) та " Цілеспрямований пошук біологічно активних речовин у ряду п'яти- і шестичлених азагетероциклів та створення на їх основі лікарських препаратів" (№ державної реєстрації 0102 U 002863, шифр ІН 15.00.02.01).

Мета і задачі дослідження. На основі скринінгових досліджень встановити наявність антиоксидантної дії похідних хіназоліну та виявити найбільш активні сполуки.

Згідно з метою дослідження вирішувалися наступні задачі:

Провести пошук речовин з антиоксидантною активністю у ряду N-(4-хіназоліл)аміноалкілкарбонових кислот, N-(4-хіназоліл)аміноарилкарбо-нових кислот, 2-R²-6-R³-8-R⁴-3H-хіназолон-4-іл-3-()-алкілкарбонових кислот та їх солей у дослідах in vitro при ферментативному і неферментативному ініціюванні ВРО та по інгібуванню супероксидрадикалу;

Виявити серед досліджуваних сполук закономірності "структура-дія", визначити фрагменти молекул, що визначають антиоксидантну дію;

Вивчити нейропротективну активність речовин, що проявляють високу антиоксидантну дію на різних моделях експериментальної ішемії головного мозку.

Провести поглиблене вивчення антиоксидантної і церебропротективної дії моноетаноламонієвої солі 6-нітро-(3H)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти ("Нітрокол") у порівнянні з пірацетамом та дибунолом.

Обєкт дослідження. Білі щури та собаки з ішемією головного мозку, тканини головного мозку, кров щурів та собак.

Предмет дослідження. Антиоксидантні і нейропротективні властивості у ряду N-(4-хіназоліл)аміноалкілкарбонових кислот, N-(4-хіназоліл)аміно-арилкарбонових кислот, 2-R²-6-R³-8-R⁴-(3H)-хіназолон-4-іл-3-()-алкілкар-бонових кислот та їх солей.

Методи дослідження. Фармакологічні, біохімічні, токсикологічні та статистичні. антиоксидантний пірацетам хіназолін нейропротекторний

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше отримані дані про антиоксидантну активність похідних N-(4-хіназоліл)аміноалкіл(арил)-карбонових кислот, 2-R²-6-R³-8-R⁴-(3H)-хіназолон-4-іл-3-()-алкілкарбоно-вих кислот. В дослідах in vitro встановлено, що із 42 сполук 5 речовин виявляють антиоксидантну активність і по ступені зниження МДА та супероксидрадикалу перевищують еталонні антиоксиданти (дибунол, -токоферол, метіонін та сечовину), а моноетаноламонієва сіль 6-нітро-(3Н)-хінолон-4-іл-3-оцтової кислоти ("Нітрокол") проявляє найбільш високу антиоксидантну дію.

Пошук антиоксидантної активності проводили серед 42 сполук, які мають наступну хімічну структуру: N-(4-хіназоліл)аміноалкілкарбонові кислоти (1.1-1.4), N-(4-хіназоліл)аміноарилкарбонові кислоти (2.1-2.5), 2-R²-6-R³-8-R⁴-3(Н)-хіназолон-4іл-3-б(в)-карбонові кислоти (3.1-3.9), солі N-(4-хіназоліл)аміноарилкарбонових кислот (4.1-4.18), солі 2-R²-6-R³-8-R⁴-3(Н)-хіназолон-4-іл-3-б(в)-карбонових кислот (5.1-5.6, схема 1).

Скринінгові дослідження in vitro показали, що при ферментативному ініціюванні ВРО більшість вивчених сполук виявляють АОА. Так, N-(4-хіназоліл)аміноалкілкарбонові кислоти (1.1, 1.2, 1.3, 1.4) проявляють прооксиданту активність (1.1,1.2, 1.4) і лише деякі з них АОА (1.3).

Заміна в положенні 4 хіназолінового циклу аміноалкільного радикалу на аміноарильний і одержання відповідних N-(4-хіназоліл)аміноарилкарбоно-вих кислот приводить до збільшення АОА при ферментативному ініціюванні ВРО in vitro. Так, проведені дослідження in vitro серед N-(4-хіназоліл)аміноарилкарбонових кислот показали, що всі сполуки (2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5) проявляють АОА. Cила антиоксидантної дії в цьому ряді сполук залежить від розташування замісника в фенільному залишку. Так, наявність карбоксилу в мета- та пара-положенні фенільного залишку приводить до посилення АОА в умовах ферментативного ініціювання ВРО у сполук (2.2, 2.3). Введення метиленової групи між пара-карбоксифенільним радикалом і 4-амінохіназоліном приводить до зниження АОА (2.4), а заміна атому водню в орто-положенні пара-карбоксильного радикалу на гідроксигруппу (2.5) приводить до посилення АОА.

Пошук речовин з АОА серед 2-R²-6-R³-8-R⁴-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-б(в)-карбонових кислот при ферментативному ініціюванні ПОЛ показав, що всі 9 сполук проявляють АОА, яка по силі дії дорівнює або перевищує еталонну. АОА залежить від характеру карбоксилу в положенні 3 хіназолінового циклу. Найбільшу активність мають сполуки, які містять залишки оцтової та пропіонової кислоти. Так, введення залишку оцтової кислоти і одержання відповідної (3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти (3.1) приводить до появи АОА, яка порівняна по силі з активністю унітіолу.

Модифікація досліджених сполук введенням радикалів в положення 2, 6 і 8 хіназоліну також впливає на значення АОА. Так, введення, метильної групи в положення 2 хіназолону-4 і одержання 2-метил-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти посилює АОА, а введення в положення 6 нитрогрупи приводить до появи найбільш високої АОА в цьому ряді сполук (3.6). Бромування (3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти приводить до деякого підвищення АОА у відповідної 6,8-дибром-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти (3.9).

В результаті дослідження нами були відібрані N-(4-хіназоліл)-аміноарилкарбонові кислоти (2.2, 2.3, 2.5) і дві 2-R²-6-R³-8-R⁴-(3Н)-хіназо-лон-4-іл-3-карбонові кислоти (3.1, 3.6), які мають найбільш високу АОА при ферментативному ініціюванні ВРО і достовірно (р0,05) перевищує дію унітіолу та метіонину. З метою підвищення АОА нами були одержані водорозчинні солі цих кислот (4.1-4.18; 5.1-5.6). Дослідженями серед солей цих кислот показано, що всі одержані сполуки проявляють АОА, яка по силі дії перевищує активність як еталонів порівняння (унітіол), так і АОА відповідних кислот. Так, найбільшу АОА проявляють натрієва, моноетаноламонієва, морфолінієва солі цих кислот.

Дослідженнями in vitro при неферментативному ініціюванні ВРО було виявлено, що N-(4-хіназоліл)аміноалкілкарбонові кислоти проявляють низьку АОА або прооксидантну дію. Введення в положення 4 хіназолінового циклу аміноарилкарбоксильної групи приводить до помітного підвищення АОА, причому у всіх сполук АОА перевищує б-токоферол. Сила АОА залежить від розташування карбоксильної групи у фенильній субституенті і максимальна при її розташуванні в мета- і пара-положенні.

Дослідження в ряді 2-R²-6-R³-8-R⁴-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-карбонових кислот показали, що всі сполуки (3.1-3.9) проявляють АОА і по силі дії перевищують активність дибунолу і б-токоферолу. Сила АОА в цьому ряді залежить від характеру карбоксиалкільної групи у положенні 4 хіназоліну. Найбільша АОА виявлена у речовин, які мають залишок оцтової кислоти. Модифікація сполук введенням замісників в хіназолінове кільце також приводить до зміни АОА, яка найбільша при введення нітро-групи в положення 6.

Для подальшого пошуку речовин, які б проявляли більш високу АОА нами були досліджені водорозчинні солі найбільш активних кислот (2.1, 2.2, 2.3, 3.5, 3.1, 3.6). Солі 2-[N-(хіназоліл-4')]-амінобензойної кислоти проявляють більш високу АОА ніж сама кислота і еталони порівняння (дибунол, б-токоферол). Найбільшу активність виявляє натрієва і метиламонієва солі.

Скриніг АОА серед солей N-(4-хіназоліл)аминосаліцилової кислоти показав перспективність подальших досліджень АОА в цьому ряді. Всі досліджені сполуки (4.14-4.18) проявляють високу АОА, яка по силі дії перевищує або порівняна з активністю дибунола і б-токоферола. Серед солей 6-нітро-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти виявлено також декілька сполук, активність яка перевищує таку еталонів порівняння. Це натрієва (5.1) та моноетаноламонієва (5.2) солі (3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти.

Дослідження in vitro по інгібуванню супероксидрадикалу серед N-(4-хіназоліл)аміноалкілкарбонових кислот показали, що у цих сполук зникає прооксидантний ефект. Серед 4-хіназоліламіноарилкарбонових кислот найбільшу АОА проявляють сполуки, в яких є залишки амінобензойної і аміносаліцилових кислот. 2-R²-6-R³-8-R⁴-(3Н)-хіназолон-4іл-3-б(в)-карбонові кислоти також виявляють значну АОА на цій моделі.

В умовах моделі ініціювання супероксидного радикалу нами був проведений також пошук речовин з антиоксидантною активністю серед водорозчинних солей найбільш активних кислот (2.2, 2.3, 2.5, 3.1, 3.6). В результаті дослідження було виявлено, що всі солі 2-[N-(хіназоліл-4')]амінобензойної кислоти проявляють АОА. Так, активність натрієвої (4.1) та метиламонієвої (4.3) солей цієї кислоти можна порівняти з АОА сечовини. По здатності інгібувати утворення супероксидрадикалу в дослідах in vitro найбільш активними виявились моноетаноламонієва і натрієва солі 6-нітро-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти.

Порівнюючи результати фармакологічного скринінгу у досліджених рядах сполук на трьох моделях ініціювання вільнорадикальних процесів in vitro, а також фізико-хімічні властивості даних сполук, нами було відібрано 5 сполук для подальшого вивчення їх активності в умовах модельної патології. Це натрієва сіль 2-[N-(хіназоліл-4')]амінобензойної кислоти (4.1), моноетиламонієва сіль (4.10), монопропіламонієва сіль 4-[N-(хіназоліл-4')]аміно-саліцилової кислоти (4.17), моноетаноламонієва сіль (3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти (5.2) і моноетаноламонієва (5.5) сіль 6-нітро-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти.

При вивченні гострої токсичності було встановлено, що сполуки 4.1, 4.10, 4.17, 5.2, 5.5 відносяться до класу малотоксичних і практично нетоксичних речовин при внутрішньоочеревинному введенні щурам (ЛД₅₀ 280-2800 мг/кг).

Дані сполуки були досліджені в умовах моделювання експериментального ГПМК, яке відтворювали однобічною перев'язкою загальної сонної артерії. Дана модель ГПМК характеризується типовими біохімічними змінами - активацією процесу гліколізу, гальмуванням активності реакцій в циклі Кребса, зміною фонду макроергічних фосфатів, пригніченням активності антиоксидантних ферментів і зниженням рівня ендогенних антиоксидантів, підвищенням активності реакцій ВРПО, вираженою гіперферментемією, що відповідає клініко-біохімічним змінам, що спостерігаються в хворих з ішемічними інсультами (В.В. Дунаєв та ін., 2001, Б.Б. Іринханов, 1989).

Експериментальні дослідження показали, що похідні хіназоліну (4.1, 4.10, 4.17, 5.2, 5.5) виявляють високу АОА в умовах експериментальної ішемії головного мозку, при цьому всі сполуки по силі антиоксидантної дії перевищують ефективність як б-токоферолу, так і дибунолу. Курсове призначення тваринам з експериментальним ГПМК в гострий період досліджуваних сполук приводило до значної реактивації ферментів антиоксидантного захисту і гальмуванню активності ВРО в ішемізованій тканині головного мозку. АО ефект даних сполук реалізувався на ініціальних етапах ВРО за рахунок реактивації антиоксидантних ферментів (СОД, каталази, глутатіонпероксидази) і захисту ендогенного фонду б-токоферолу, що вигідно відрізняє їх від стандартних антиоксидантів - дибунолу, вітаміну Е. Найбільшу активність мають сполуки 5.5, 5.2 і 4.17. В основі механізму антиоксидантної дії даних сполук лежить їх здатність інгібіювати активні форми кисню, а саме супероксидрадикалу, за рахунок відновлювальних властивостей нітрогрупи, а також за рахунок гальмування основних шляхів утворення активних форм кисню і ліпідних радикалів, завдяки нормалізації порушення окремих ланок метаболізму при ішемії. Так, сполуки 5.5, 5.2, 4.17 сприяли нормалізації деяких показників вуглеводно-енергетичного обміну. Так, сполуки 5.5 і 5.2, що є моноетиламонієвою і натрієвою солями 6-нітро-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти збільшують енергетичний потенціал клітин мозку за рахунок інтенсифікації аеробних і компенсаторно-анаеробних шляхів окислення. При цьому сполуки 5.5 і 5.2 збільшують вміст АТФ на фоні збільшення його попередника АДФ і зниження АМФ, який виявляє прооксидантну дію. Сполука 4.17 (моноетаноламонієва сіль 4-N-(хіназоліл)аміносаліцилової кислоти збільшує утворення АТФ тільки за рахунок активації аеробного окислення. Всі досліджувані сполуки мають значний церебропротективний ефект, про що свідчить зниження гіперферментемії ВВ-КФК. Причому всі сполуки по силі дії перевищували пірацетам (р0,05).

Порівнявнюючи антиоксидантну і протиішемічну дію в умовах експериментального порушення мозкового кровообігу досліджуваних сполук і референс-препаратів (пірацетам, дибунол, б-токоферолу ацетат) нами було відібрано моноетаноламонієву сіль 6-нітро-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти (5.5) для подальших поглибленних досліджень.

Дослідження показали, що найбільш ефективною дозою для сполуки 5.5 (робоча назва "Нітрокол") при внутрішньоочеревинному введенні щурам з однобічною перев'язкою загальних сонних артерій і внутрішньомозковим крововиливом є доза 50 мг/кг.

Курсове призначення нітроколу в дозі 50 мг/кг щурам з одно- і двобічною перев'язкою загальних сонних артерій і внутрішньомозковим крововиливом приводило до нормалізації неврологічного статусу (тремор кінцівок, гіпертонус м'язів, рухова активність) і підвищувало виживаність у всіх експериментальних групах. Так, у групі тварин з одно- і двобічною перев'язкою загальних сонних артерій виживаність підвищилася на 40% і 50% відповідно до контролю (р0,05), а в групах тварин, що одержували пірацетам виживаність підвищилася на 20% відносно контролю. При призначенні нітроколу тваринам з внутрішньомозковим крововиливом виживаність підвищувалася на 40% (р0,05), а при призначенні пірацетама - на 20% відносно контролю.

Курсове призначення нітроколу протягом 4 діб тваринам з одно- і двобічною перев'язкою загальних сонних артерій і внутрішньомозковим крововиливом приводило до гальмування реакцій ВРО, реактивації антиоксидантної системи захисту, нормалізації систем біоенергетики в тканинах мозку і зниженню гіперферментемії ВВ-КФК. Так, при введенні нітроколу тваринам з одно- і двобічною перев'язкою загальних сонних артерій рівень АТФ підвищувався на 60,2% і 47,6% відповідно у головному мозку, а в мозку тварин з внутрішньомозковим крововиливом на 55,2% відносно контролю.

Нітрокол приводив до інтенсифікації аеробних процесів синтезу АТФ (зниження лактату, збільшення малату). У групах тварин, що одержували пірацетам, показники біоенергетики (АТФ, лактат, малат) статистично не відрізнялися від таких у групах, що одержували нітрокол.

Важливим моментом у механізмі нейропротективної дії нітроколу є його антиоксидантний ефект. Так, у головному мозку тварин з одно- і двобічною перев'язкою загальних сонних артерій і внутрішньомозковим крововиливом, що отримували нітрокол на протязі 4-х діб, спостерігалося зниження продуктів ВРО в головному мозку, ДК на 43,5-57,7%, ТК - 42,1-53,6% і МДА - 43,7-52,0% відносно контролю (р0,05).

Одним з механізмів антиоксидантної дії нітроколу є його здатність реактивувати антиоксидантні ферменти в умовах ішемії головного мозку. Так, введення нітроколу тваринам з перев'язкою загальних сонних артерій і внутрішньомозковим крововиливом підвищувало активність у головному мозку СОД на 153,5-308,0%, ГПР - 71,4-97,5% і каталази - 140-185% відносно контролю (р0,05).

Введення тваринам з ГПМК і внутрішньомозковим крововиливом дибунола протягом 4-х діб у дозі 50,0 мг/кг було менш ефективним, ніж введення нітроколу. Так, за впливом на такі показники антиоксидантної системи мозку, як активність СОД, ГПР, каталази нітрокол достовірно (р0,05) перевищував дію дибунолу на 150-300%, а по зниженню продуктів ВРО ДК і МДА - на 25-30%.

Підтвердженням нейропротективної дії нітроколу було зменшення гіперферментемії ВВ-КФК у крові тварин із ГПМК і внутрішньомозковим крововиливом. Нітрокол по цьому показнику у 2-2,5 рази достовірно (р0,05) перевищував активність пірацетаму.

Курсове призначення нітроколу в дозі 25,0 мг/кг на протязі 4-х діб собакам з однобічною перев'язкою загальних сонних артерій приводило до зниження в корі головного мозку ДК на 41,0%, ТК - 39,4%, МДА - 45,1%, підвищенню активності СОД на 198,4%, ГПР - 90,0%, каталази - 183,8% відносно контролю (р0,05). Призначення нітроколу приводило до збільшення продукції АТФ на 46,1% на фоні збільшення рівня малату (20,0%) і пірувату (20,0%) у лобній корі мозку експериментальних собак. Введення нітроколу собакам із ГПМК знижувало гіперферментемію ВВ-КФК на 42,7%, а застосування пірацетаму знижувало цей показник на 19,1%.

Призначення нітроколу собакам у дозі 25,0 мг/кг перед окклюзією сонних артерій і перед реперфузією приводило до гальмування реакцій ВРО у крові та головному мозку.

Так, введення нітроколу перед оклюзією сонних артерій призводило, на 30 хвилині перев'язки, до зниження ДК в артеріальній крові на 42,0%, в венозній - на 45,0%, ТК - на 64,5% і 16,6%, МДА - на 43,2% і 25,0% відповідно. При цьому спостерігалось підвищення, в порівнянні з контрольними значеннями, рівня б-токоферолу в артеріальній крові на 37,4%, а в венозній - на 21,9%. На 30 хвилині реперфузії нітрокол знижував вміст ДК на 70,8% і 51,0% ТК - 75,0 і 60,8%; МДА - на 44,2% і 20,2%, рівень -токоферолу підвищувався на 30,4% і 25,0% відповідно в артеріальній і венозній крові. У тварин, які отримували безпосередньо перед окклюзією і реперфузією пірацетам, ці зміни були менші.

Таблиця

Вплив нітроколу на показники антиоксидантно-оксидантного гомеостазу головного мозку собак з ГПМК (однобічна перев'язка загальной сонної артерії) на 4 добу експерименту

Примітка: ^о - р0,05 по відношенню до дибунолу;

* - р0,05 по відношенню до контролю.

Підтвердженням вираженої захисної дії нітроколу в період гострої ішемії та реперфузії є нормалізація показників енергетичного обміну і стану антиоксидантної системи в тканинах головного мозку тварин на 3 добу після оперативного втручання. В тканинах головного мозку тварин, які отримували нітрокол, спостерігалась нормалізація основних показників вуглеводно-енергетичного обміну, підвищення активності антиоксидантної системи, зниження продуктів ВРО. Так, підвищувався рівень АТФ на 15,5% на фоні зниження рівня лактату на 16,6% і підвищення малату на 16,0%, що свідчить про виражений вплив нітроколу на аеробні процеси окислення.

Призначення в період операції нітроколу викликало і підвищення активності антиоксидантних ферментів в тканинах мозку на 3 добу після операції. Так, активність СОД була вище контрольних значень на 30,5%, каталази на 51,0%, ГПР - на 32,0% (р0,05), рівень б-токоферолу був вище контрольного значення на 15,5%. При призначенні пірацетаму активність антиоксидантної системи змінювалась менше.

Таким чином, нітрокол (моноетаноламонієва сіль 6-нітро-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти) виявляє значний нейропротективний ефект на різних моделях експериментальної ішемії і ішемії-реперфузії головного мозку, який перевищує дію референс-препаратів (пірацетам, дибунол).

Захисна дія нітроколу, можливо, реалізується за рахунок вираженого впливу на антиоксидантну систему організму (СОД, ГПР, каталаза), нормалізації деяких ланок біоенергетики при ішемії і власного антирадикального ефекту. Подібне ствердження про можливу дію нітроколу є експериметальним обґрунтуванням для подальших поглиблених доклінічних досліджень з метою створення нового ефективного нейропротективного засобу з антиоксидантною дією.

Висновки

Вперше в результаті досліджень in vitro та in vivo у ряду похідних N-(4-хіназоліл)аміноалкіл(арил)карбонових кислот і 2-R²-6-R³-8-R⁴-(3Н)-хіназо-лон-4-іл-3-карбонових кислот виявлена речовина моноетаноламонієва сіль 6-нітро-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти яка проявляє виражену антиоксидантну і нейропротективну дію.

Фармакологічним скринінгом антиоксидантної активності в дослідах in vitro серед 42 похідних N-(4-хіназоліл)аміноалкіл(арил)карбонових кислот і 2-R²-6-R³-8-R⁴-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-карбонових кислот було відібрано 5 речовин (4.1, 4.10, 4.17, 5.2, 5.5), які за силою антиоксидантної дії перевершували (р0,05) еталони порівняння (-токоферол, дибунол, метіонін, унітіол, сечовина) для подальших досліджень.

Аналіз взаємозв'язку "структура-дія" серед 42 досліджуваних речовин показав, що наявність і сила антиоксидантної активності залежить від функціональних заступників у 3, 4 і 6 положеннях гетероциклу (хіназолін). Так, введення у положення 6 хіназолінового циклу нітрогрупи та у положення 3 або 4 карбоксиметильних, карбоксифеніламиних замісників призводить до посилення антиоксидантної активності.

При вивченні гострої токсичності було встановлено, що сполуки 4.1, 4.10, 4.17, 5.2, 5.5 відносяться до класу малотоксичних і практично нетоксичних речовин при внутрішньочеревинному введенні щурам (ЛД₅₀ 280-2800 мг/кг).

Солі N-(4-хіназоліл)амінобензойних (4.1, 4.10, 4.17), (3Н)-хіназолон-4-іл-3- (5.2) і 6-нітро-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтових (5.5) кислот у дозі 1/50 ЛД₅₀ при внутрішньочеревинному введенні щурам з експериментальною ішемією головного мозку знижують накопичення продуктів ВРО (ДК, ТК, МДА), підвищують активність СОД, каталази, ГПР, посилюють енергопродукцию АТФ і знижують гіперферментемію ВВ-КФК у головному мозку (р0,05).

Найбільш виражені антиоксидантні властивості в дослідах in vivo проявляє сполука 5.5 - моноетаноламонієва сіль 6-нітро-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти ("Нітрокол"). Введення нітроколу щурам (50 мг/кг) і собакам (25 мг/кг) з експериментальною ішемією головного мозку і внутрішньомозковим крововиливом призводило до зниження ДК (41,1-57,7%), ТК (40,0-57,7%) і МДА (30,0-52,0%), підвищенню активності СОД (153,5-307,9%), каталази (140,0-186,0%), ГПР (71,4-97,5%) у тканинах головного мозку відносно контролю (р0,05).

Нітрокол підвищує продукції АТФ (46,1%-60,01%) за рахунок інтенсифікації аеробних процесів у головному мозку і знижує гіперферментемію ВВ-КФК (42,7-56,8%) у крові щурів та собак з експериментальною ішемією головного мозку і внутрішньомозковим крововиливом відносно контролю (р0,05).

Механізм дії нітроколу обумовлений вираженим впливом на антиоксидантну синтему захисту організму (СОД, каталаза, ГПР), інгібуванням активних форм кисню.

Нітрокол перевершує по силі антиоксидантної і нейропротективної активності дибунол (50,0 мг/кг) і пірацетам (250,0 мг/кг) за такими показниками як активність СОД, каталази і ГПР у головному мозку (р0,05 відносно дибунолу), гіперферментемія ВВ-КФК (р0,05 відносно пірацетаму) на різних моделях ішемії і ішемії-реперфузії головного мозку.

Перелік робіт опублікованих за темою дисертації

Изучение фармакологического действия нового антиоксиданта “Нитрокол” при моделировании ишемических и реперфузионных повреждений мозговой ткани / И.Ф. Беленичев, Н.В. Бухтиярова, В.В. Дунаев, С.И. Коваленко, И.А. Мазур, В.А. Дмитряков, В.Л. Яцун // Фармакологічний вісник. 2000. №5. С. 24-27. (Особливий внесок здобувача: вивчення антиоксидантної та протиішемічної активності, аналіз та узагальнення результатів, участь у написанні статті).

Дослідження фармако-біохімічних механізмів антиоксидантної дії N-(4-хіназоліл)-аміноарилкарбонових кислот та їх солей за умовою ініціювання вільно радикальних процессів in vitro та моделювання ішемії головного мозку / И.Ф. Беленічев, С.І. Коваленко, В.В. Дунаєв, Н.В. Бухтіярова, В.В. Яцун // Ліки. 2000. №3-4. С. 86-91. (Особливий внесок здобувача: вивчення антиоксидантної та протиішемічної активності, аналіз та узагальнення результатів, участь у написанні статті).

Синтез, фізико-хімічні властивості та антиоксидантна активність солей N-(4-хіназоліл)-аміноалкілкарбонових кислот / С.І. Коваленко, І.А. Мазуром, І.Ф. Бєленічевим, Р.С. Синяк, Н.В. Бухтіярова, О.Р. Пряхіним, О.Є. Пашко, О.В. Карпенко, В.О. Нікітіним // Фармацевтичний журнал. 2001. №1. С. 81-86. (Особливий внесок здобувача: вивчення антиоксидантної активності, аналіз та узагальнення результатів, участь у написанні статті).

Деякі аспекти антиоксидантної та протиішемічної дії нового потенційного препарату “Нітрокол” в умовах моделювання ішемічного і геморагічного пошкодження головного мозку / І.Ф. Бєленічев, С.І. Коваленко, В.В.Дунаєв, І.А. Мазур, Н.В. Бухтіярова, В.Р. Стець, В.О. Дмитряков // Клінічна фармація. 2001. Т.5, №2. С. 68-72. (Особливий внесок здобувача: вивчення антиоксидантної та протиішемічної активності, аналіз та узагальнення результатів, участь у написанні статті).

Експериментальні дослідження загальнотоксичної дії субстанції “Нітрокол” / І.Ф. Бєленічев, В.О. Туманський, С.І. Коваленко, Н.В. Бухтіярова, В.В. Дунаєв, В.О. Дмитряков // Современные проблемы токсикологии. 2001. №3. С. 76-82. (Особливий внесок здобувача: вивчення гострої токсичності, впливу препарату на склад періферичної крові, серцево-судинну систему, аналіз та узагальнення результатів, участь у написанні статті).

Синтез, фізико-хімічні властивості та антиоксидантна активність похідних 6,8-дибром-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти / С.І. Коваленко, І.Ф. Бєленічев, І.А. Мазур, Н.В. Бухтіярова, О.В. Гончаров // Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики.Запоріжжя, 1999. Вип. 5. С. 261-267. (Особливий внесок здобувача: вивчення антиоксидантної активності, аналіз та узагальнення результатів, участь у написанні статті).

Синтез та біологічна активність 2-метил-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти та її похідних / С.І. Коваленко, І.Ф. Бєленічев, І.А. Мазур, Н.В. Бухтіярова, В.В. Дунаєв // Актуальні питаня фармацевтичної та медичної науки та практики.-Запоріжжя, 2000. Вип. VI. С. 23-30. (Особливий внесок здобувача: вивчення антиоксидантної активності, аналіз та узагальнення результатів, участь у написанні статті).

Бухтиярова Н.В. Противоишемические эффекты антиоксидантов N-(4-хиназолил)аминоарилкарбоновых кислот при экспериментальном нарушении мозгового кровообращения // Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики.Запоріжжя, 2003. Вип. X. С. 261-267.

Вплив (3,4-дигідрохіназолон-4-іл-3)-б,в-карбонових кислот на мембранну проникність в умовах гострої церебральної гіпоксії / І. Мазур, С. Коваленко, І. Бєленічев, Р. Синяк, Н. Бухтіярова, Г. Литинська // Тез.докл. I конгр. світ. федер. укр. фарм. товариств. Львів, 1994. С. 328-329. (Особливий внесок здобувача: вивчення антиоксидантної активності).

Производные хиназолина - перспективные антиоксидантные средства / С.И. Коваленко, И.А. Мазур, И.Ф. Беленичев, Р.С. Синяк, В.В. Дунаев, Н.В. Бухтиярова // Мат. V нац. з'їзду фармацевтів України “Досягнення сучасної фармації та перспективи її розвитку у новому тисячолітті. Харків, 1999. С. 590. (Особливий внесок здобувача: вивчення антиоксидантної та протиішемічної активності).

Нітрокол - новий потенційний препарат протиішемічної і антиоксидантної дії для терапії мозкових інсультів / І.Ф. Бєленічев, Н.В. Бухтіярова, С.І. Коваленко, І.А. Мазур, В.В. Дунаєв, В.О. Туманський // Мат. наук.-практ. конф. “Вчені України - вітчизняній фармації”. Харків, 2000. С. 214. (Особливий внесок здобувача: вивчення антиоксидантної та протиішемічної активності).

Церебропротективні ефекти антиоксиданту “Нітрокол” за умов експериментальної ішемії головного мозку // І.Ф.Бєленічев, В.В.Дунаєв, С.І.Коваленко, Н.В. Бухтіярова, О.В.Гончаров // Тез. докл. II з'їзду фармакологів України “Фармакологія 2001-крок у майбутнє”. Дніпропетровськ, 2001. С. 18. (Особливий внесок здобувача: вивчення антиоксидантної та протиішемічної активності).

Анотація

Бухтіярова Н.В. Пошук речовин з анти радикальною і антиперекисною активністю серед похідних хіназолону-4 та 4-амінохіназоліну. -Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.05- фармакологія. - Інститут фармакології та токсикології АМН України, Київ, 2003.

Дисертація присвячена проведенню первинного скринінгу антиоксидантної активності 42 нових похідних хіназоліну та вивчення їх нейропротекторної дії в умовах експериментальної ішемії головного мозку. Скриніногові дослідження цих сполук дозволили вивчити взаємозв'язок “структура-дія” та показали, що рівень антиоксидантної активності залежить від розташування і характеру функціональних замісників у хіназоліновому циклі.

В дослідах in vitro найбільшу АОА виявили солі N-(4-хіназоліл)-амінобензойних, (3Н)-хіназолон-4-іл-3- та 6-нітро-(3Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтових кислот. Подальші їх дослідження на моделях експериментального ГПМК показали, що ці сполуки інгібують процеси ВРО, мають позитивний вплив на антиоксидантну систему та процеси обміну в тканинах головного мозку при ішемії. В результаті порівняльного аналізу антиоксидантної та протиішемічної активності досліджених сполук з референс-речовинами (пірацетам, дибунол) біла відібрана та досліджена моноетаноламонієва сіль 6-нітро-3(Н)-хіназолон-4-іл-3-оцтової кислоти (“Нітрокол”).

Було встановлено, що курсове призначення нітроколу тваринам з експериментальними моделями ішемічного та геморагічного пошкодження головного мозку, а також на моделі ішемії-реперфузії призводить до зниження реакцій ВРО, нормалізації більшості показників вуглеводно-енергетичного обміну, зменшення гіперферментемії, підвищення активності ферментів АО-захисту, причому, ефективність його перевершує ефективність препаратів порівняння - дибунолу та пірацетаму.

Нейропротективна дія нітроколу, вірогідно, реалізується за рахунок активного впливу на антиоксидантну систему та нормалізації біоенергетичних процесів (гліколіз, окислення в циклі Кребса, енергетичний фонд).

Ключові слова: вільнорадикальне окислення, ішемія, головний мозок, антиоксидантна дія, хіназолін.

Аннотация

Бухтиярова Н.В. Поиск веществ с антирадикальной и антиперекисной активностью среди производных хиназолона-4 и 4-аминохиназолина. -Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.05 - фармакология. - Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины, Киев, 2003.

Диссертация посвящена проведению первичного скрининга антиоксидантной активности среди 42 новых производных хиназолина с последующим изучением их нейропротективного действия в условиях экспериментальной ишемии. Исследованы соединения следующих химических структур :N-(4-хиназолил)аминоалкилкарбоновые кислоты, N-(4-хиназолил)аминоарилкар-боновые кислоты и их соли, 2-R²-6-R³-8-R⁴-(3H)-хиназолон-4-ил-3б(в)-карбоновые кислоты и их водорастворимые соли. Скрининговые исследования этих соединений in vitro на трех моделях инициировании СРО (ферментативное, неферментативное инициирование и по ингибированию супероксидрадикала) показали, что большинство из них обладает АОА, сила которой зависит от расположения и характера функционального заместителя в фенильном остатке. Так, перемещение его из орто- в мета- или пара- положение приводит к усилению АОА, а введение гидроксила - повышает.

Экспериментальные исследования наиболее активных соединений (соли N-(4-хиназолил)аминобензойных, (3Н)-хиназолон-4-ил-3- и 6-нитро-(3Н)-хиназолон-4-ил-3-уксусных кислот) на моделях острого нарушения мозгового кровообращения показали, что все они проявляют высокую АОА в условиях ишемии, причем по силе антиоксидантного действия превосходят эффективность б-токоферола и дибунола. Антиоксидантный эффект данных соединений реализовывался на инициальных этапах СРО за счет реактивации антиоксидантных ферментов (СОД, каталазы, глутатионпероксидазы) и защиты эндогенного фонда б-токоферола, что выгодно отличает их от стандартных антиоксидантов - дибунола, и витамина Е.

Проведено доклиническое изучение наиболее перспективного соединения - моноэтаноламмониевой соли 6-нитро-(3Н)-хиназолон-4-ил-3-уксусной кислоты в качестве антиоксидантного и нейропротективного средства (рабочее название “Нитрокол”). Определена эффективная доза (50мг/кг), изучена острая токсичность и эффективность на моделях ишемического и геморрагического инсульта и ишемии-реперфузии. Исследования показали, что курсовое назначение нитрокола приводило к увеличению содержания АТФ (на 60,2%), АДФ (на 50,5%) и снижению АМФ (на 31,5%) в тканях мозга по сравнению с группой нелеченых животных. В группах животных, получавших пирацетам, показатели биоэнергетики статистически не отличались от таковых в группах с нитроколом.

Под влиянием нитрокола снижался уровень гиперферментемии (ВВ-КФК на 55,8%), уменьшалось содержание основных продуктов СРО (ДК на 52,0%; ТК - 43,3%; МДА - 50,0%), увеличивалась активность антиоксидантных ферментов (СОД на 267,0%; ГПР - 97,5%; каталазы - 162,8%) и уровень эндогенного б-токоферола на 38,8%. Назначение нитрокола усиливало процессы биоэнергетики за счет активации анаэробных путей окисления и некоторого усиления анаэробных процессов, о чем свидетельствовало увеличение уровня малата на 70,5%, пирувата на 55,5% и снижения уровня лактата на 33,2% в тканях мозга. По эффективности влияния на основные показатели углеводно-энергетического обмена нитрокол конкурирует с пирацетамом.

Назначение нитрокола непосредственно перед окклюзией сонных артерий и реперфузией приводило к нормализации реакций СРО, выравниванию артериовенозного индекса, позитивному влиянию на углеводно-энергетический обмен и антиоксидантную систему. Таким, образом, нитрокол проявляет значительный нейропротективный эффект, который, вероятно, реализуется за счет позитивного влияния на биоэнергетические процессы (гликолиз, окисление в цикле Кребса, энергетический фонд) и выраженного активирующего влияния на антиоксидантную систему организма. Подобное утверждение о возможном механизме действия нитрокола является экспериментальным обоснованием для создания на его основе нейропротекторного средства с антиоксидантным механизмом действия.

Ключевые слова: Свободнорадикальное окисление, ишемия головной мозг, антиоксидантное действие, хиназолин.

Annotation

Buhtiyarova N.V. Search of substances with antiradical and antiperoxide activity among quinazolone -4 and 4-aminoquinazoline derivatives. - The manuscript.

The dissertation on reception of a scientific degree of the candidate of medical sciences on a speciality 14.03.05-pharmacology. - Institute of pharmacology and toxicology AMS of Ukraine, Kiev, 2003.

The dissertation is devoted to carrying out initial screening of antioxidative activity of 42 new quinazolines derivatives and studying of their neuroprotective action in conditions of the experimental ischemia of a brain.

Screening researches of these substaces have allowed to study the interrelation "structure-action" and have shown, that the level of antioxidative activity depends on type of substituents and their locating in quinazoline cycle.

Experiments of antioxidative activity in vitro showed salts of N-(4- quinazolile)aminobenzoic, (3H)-quinazolone-4-il-3 - and 6-nitro-(3H)- quinazo-lone-4-il-3 -acetic acids to be the most active. Further researches on models of experimental ischemia have shown, that these substaces inhibit FRO processes, have positive influence on antioxidative system and methabolism of a brain.

As a result of comparative analysis of antioxidative and antiischemic activity of investigated compounds with the reviewer substance (Pyracetamum, Dibunolum) salt of monoethanolammonium 6-nitro-(3H)-quinazolone-4-il-3-acetic acid (“Nitrocolum”) was selected and investigated.

It was establshed, that course assignment of Nitrocolum to animals in experimental models of ischemic and hemorrhagic damage of a brain, and also on model of an ischemia - reperfusion get downstroke results of FRO reactions, normalization of the majority of indexs of carbohydrate - energy methabolism, decreasing of hyperfermentation, rising of AO-protection enzymes activity, and its efficacy urpasses the efficacy of drugs of comparison - Dibunolum and Pyracetamum.

Neuroprotective action of Nitrocolum, authentically, is realized due to active influence on antioxidative system and normalization of biopower processes (a glycolysis, oxidations in a tricarbonic acid cycle, power fund).

Key words: free-radical oxidation, ischemia, brain, antioxidative action, quinazolines.

Размещено на Allbest.ru