Обгрунтування шляхів корекції аутофлори шкіри дітей хворих на атопічний дерматит

Размещено на http://www.allbest.ru/

Обгрунтування шляхів корекції аутофлори шкіри дітей хворих на атопічний дерматит

Атопічний дерматит (АД) є важливою медико-соціальною проблемою, значимість якої визначається значним поширенням -- на нього страждає від 3% до 25% дитячого населення у всьому світі. Відзначається постійна тенденція до збільшення числа хворих на АД, переобтяження перебігу його зі збільшенням площі ураження шкіри аж до розвитку еритродермії, зростання питомої ваги хворих, у яких лікування зазнає невдачі, а прогноз погіршується. Збільшилося число дітей із важким перебігом АД, що приводить до інвалідності. Особливістю клінічного перебігу АД в останні 10-15 років є частіший перехід гострих форм у хронічні, нерідко важкі, на тлі наростання первинної хронічної патології внутрішніх органів, важких розладів нервової системи, порушень імунітету ?T.L. Diepgen 1998, Н.П. Торопова с соавт., 1998, И.И. Балаболкин, 1998, В.А. Ревякина 1999, Н.В.Кунгуров, 2000?. Такі фактори як розповсюдженість АД, тяжкість процесу, часті загострення та недостатня ефективність терапії складають актуальність даної проблеми.

Згідно з сучасною концепцією, АД відносять до захворювань мультифакторної природи, де провідна роль належить імунним порушенням, нейровегетативним розладам на тлі генетично-детермінованих дефектів у функціонуванні систем організму. Незважаючи на чисельність робіт, присвячених АД, розробці різних ланок патогенезу, проблема не є вирішеною ?I. Ahmed., J. Berth-Jones, 1997, M. Junger et al., 1998, P. Postales et al., 1998, B. Zurbriggen, 1999, Ю.С. Бутов с соавт., 2000?. Тому виявлення нових аспектів патогенезу АД та, особливо, взаємодії між ними, являють собою практичний та теоретичний інтерес.

У розвитку багатьох алергічних процесів велике значення надається мікробним антигенам. Є вірогідні дані, що суперантигени, які виділяють мікроорганізми, що знаходяться на шкірі при запальних шкірних захворюваннях, можуть погіршувати і підтримувати запалення шляхом активації мастоцитів, базофілів та інших клітин ?D.Y.M. Leung et al., 1993 A., Kenneth et al., 1996, Т.П. Осолодченко,1997?. Стан аутофлори шкіри може бути використаний для судження про здоров'я макроорганізму. Від стану макроорганізму залежить якісний і кількісний склад аутофлори, а мікроорганізми аутофлори можуть викликати і підтримувати запалення в шкірі, що у свою чергу погіршує стан макроорганізму. У зв'язку з цим при вивченні патогенезу алергодерматозів велика увага приділяється визначенню мікрофлори шкірного покриву.

В існуючих дослідженнях стан мікрофлори шкіри у хворих на АД пов'язують тільки зі S. aureus. Не вивчалась раніше мікрофлора шкіри хворих на АД в залежності від форми, ступеня активності і тяжкості перебігу захворювання, яка може стимулювати складні явища в його патомеханізмі. Також немає даних про вивчення складу мікрофлори шкіри при різних методах лікування АД, на підставі чого можливо розробити показання до застосування в комплексній терапії АД препаратів, які регулюють склад мікрофлори.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційна робота є фрагментом науково-дослідної роботи кафедри дерматовенерології Київської медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика “Патогенез та лікування хронічних дерматозів” (№ держреєстрації -- 0198UО06009), самостійним виконавцем якого є дисертант.

Мета дослідження -- удосконалення методів лікування АД з врахуванням показників, які характеризують склад аутофлори шкіри у дітей хворих на атопічний дерматит.

Задачі дослідження:

Вивчити стан мікрофлори шкіри у вогнищах ураження хворих на АД у зв'язку з віком хворих, формою АД, ступенем активності і тяжкістю перебігу процесу в порівняні зі складом мікрофлори видимо здорової шкіри у хворих на АД.

Оцінити стан мікрофлори шкіри при перебігу АД без вторинних ускладнень порівняно зі станом мікрофлори шкіри при наявності бактеріальних ускладнень шкіри.

Вивчити спектр чутливості до антимікробних препаратів, виділених зі шкіри мікроорганізмів.

Вивчити показники імунологічного статусу в хворих на АД.

Виявити зв'язок між імунологічними показниками і показниками стану мікрофлори шкіри хворих на АД.

Оцінити вплив різних методів терапії на нормалізацію стану мікрофлори шкіри.

Об'єкт дослідження: хворі на АД діти у віці від 3 до 16 років.

Предмет дослідження: мікрофлора шкіри хворих на АД у період загострення процесу у взаємозв'язку з віком хворих, формою АД, ступенем активності і тяжкістю перебігу процесу, відсутністю або наявністю бактеріальних ускладнень на шкірі; мікрофлора шкіри хворих на АД у період ремісії; зміни у мікрофлорі шкіри хворих на АД в залежності від метода лікування; імунний стан хворих на атопічний дерматит.

Методи дослідження:

Клінічні -- постановка діагнозу, визначення форми захворювання, ступеня тяжкості та активності процесу, контроль за ефективністю терапії.

Бактеріологічні -- визначення загальної кількості мікроорганізмів та якісного складу мікрофлори шкіри.

Імунологічні -- визначення показників клітинного та гуморального імунітету.

Статистичні -- оцінка вірогідності і визначення кореляційних зв`язків між отриманими даними.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше визначені закономірності змін складу мікрофлори шкіри у дітей хворих на АД у період загострення та ремісії хвороби, в різних ділянках шкіри, в залежності від віку хворого, ступеня активності і ступеня тяжкості захворювання, відсутності та наявності бактеріальних ускладнень. Встановлено взаємозв'язок цих змін зі станом імунної системи. Вивчено біологічні властивості мікрофлори шкіри у дітей з АД та на цій основі обгрунтоване удосконалення методів лікування хворих на АД.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані в результаті досліджень дані про стан мікрофлори шкіри у хворих на АД розширюють уявлення про роль умовно-патогенної флори шкіри у складних патологічних механізмах розвитку АД. Зміни мікрофлори шкіри при різних методах лікування АД обгрунтовують доцільність включення в комплексну терапію АД препаратів, спрямованих на корекцію цих порушень. Розроблено і впроваджено застосування препарату “Тримістин-Дарниця” в комплексний метод лікування АД, що сприяє нормалізації якісного та кількісного стану мікрофлори шкіри.

Результати дослідження впроваджені в практику роботи Київської міської шкірно-венерологічної лікарні, що підтверджується актом впровадження.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто здійснено розробку теоретичних та практичних досліджень роботи, проведено аналіз літературних даних, зібрано та опрацьовано необхідну інформацію з теми дослідження. Самостійно обстежено 113 хворих на АД та проведені дослідження мікрофлори шкіри і імунологічного стану при безпосередній участі дисертанта. Автором самостійно обгрунтовані мета і задачі дослідження. Дисертант самостійно здійснила інтерпретацію всіх зібраних даних, статистичну обробку результатів дослідження, написала всі розділи дисертації і зробила наукові висновки. Підготувала наукові праці до друку.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації повідомлені й обговорені на науково-практичній конференції у Київській міській шкірно-венерологічній лікарні (Київ, 1999р.), VII з'їзді дерматовенерологів України (Київ, 1999р.), науково-практичній конференції молодих вчених і лікарів дерматовенерологів, присвяченій впровадженню наукових розробок у практику охорони здоров?я (Київ, 1999р.), науково-практичних конференціях “Вікові аспекти дерматовенерології. Захворювання придатків шкіри” (Київ, 2001р.) та “Токсикодермії та алергічні захворювання шкіри” (Київ, 2002).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 публікацій: 5 наукових робіт у фахових медичних виданнях, рекомендованих ВАК України, 2 статті і 8 тез доповідей у збірниках матеріалів наукових конференцій (5), з'їздів (2), конгресу (1).

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури (Розділ І), опису матеріалів та методів дослідження (Розділ ІІ), власних досліджень (Розділи ІІІ-VІІ), аналізу та обговорення отриманих результатів, висновків і списку використаних джерел, який включає 247 джерела, в тому числі 146 українською та російською мовами та 101 -- англійською та іншими європейськими мовами.

Дисертація викладена на 159 сторінках машинописного тексту, включає 33 таблиці (одна з них займає цілу сторінку) та 2 рисунка.

Матеріали і методи дослідження. Нами обстежено 113 дітей хворих на АД у віці від 3 до 16 років, які лікувалися стаціонарно в дитячому шкірно-венерологічному відділенні й амбулаторно в Київській міській шкірно-венерологічній лікарні в період 1996-2000р.р. Контрольну групу склали 18 практично здорових дітей аналогічного віку, що перебували на фізіотерапевтичному прийомі у спеціалізованій дитячій консультативній поліклініці “Охматдит” м. Києва, які не страждають на алергічні захворювання, у їхніх батьків і найближчих родичів алергічні захворювання також відсутні. Всі пацієнти до початку лікування піддавалися комплексному клініко-лабораторному обстеженню, анамнестичному, генеалогічному аналізу. Досліджували стан поверхні шкіри і видимих слизових оболонок, периферичних лімфатичних вузлів. За показаннями діти консультувалися педіатром, невропатологом, гастроентерологом (робили ультразвукове дослідження органів черевної порожнини), оториноларингологом, стоматологом, ендокринологом, окулістом. Для кількісного визначення тяжкості перебігу дерматозу при первинному огляді й у динаміці спостереження за хворими застосовували систему бальної оцінки ступеня тяжкості АД -- індекс SCORAD.

Стан мікрофлори шкіри у вогнищах АД та видимо здорової шкіри у дітей хворих на АД оцінювали за якісним і кількісним складом мікроорганізмів мікрофлори шкіри шляхом висівання проб на елективні поживні середовища. Матеріал зі шкіри забирати методом відбитків згідно “Методическим рекомендациям по оценке иммунологической реактивности людей на основании аутофлоры кожи и полости рта” (Москва, 1978г.). Мікробіологічну ідентифікацію мікроорганізмів шкіри проводили згідно додатку №1 до наказу №535 МОЗ СРСР від 22.04.85р. “Методические указания про унификацию микробиологических (бактериологических) методов исследования, используемых в клинико-профилактических учреждениях” і “Определителя бактерий Берджи”. Проводилися культуральні, бактеріоскопічні дослідження та ідентифікація виділених культур за їх ферментативними властивостями на класичних диференційно-діагностичних середовищах. Проводилася ідентифікація наступних бактерій: бактерій роду Staphylococcus: S. aureus, S. epidermidis, S. saprophitycus; родів Micrococcus, Sarcina, Bacillus, Streptococcus, дріжджеподібні і цвілеві гриби, а також типувались інші мікроорганізми, які висівались. Насамкінець робили перерахування числа вирослих колоній із кожної колонієутворюючої одиниці (КУО) на 1 см2. Бактеріологічне дослідження проводили на базі лабораторії мікробіології та вірусології Інституту урології АМН України (керівник лабораторії д.м.н., професор Руденко А.В.).

Кількість Т-лімфоцитів визначали методом спонтанного Е-розеткоутворення (Е-РУК) з еритроцитами барана за Jondal et al. (1972). Визначення теофілінчутливих і теофілінрезистентних Т-лімфоцитів проводили за методом Limatibul et al. (1978). Кількість В-лімфоцитів визначали методом спонтанного М-розеткоутворення (М-РУК) з мишачими еритроцитами за Dolen (1970). Кількість імуноглобулінів G, A, M у сироватці крові визначали методом радіальної дифузії за G.A. Mancini et al. (1965). Визначення загального імуноглобуліну Е в сироватці крові людини проводили шляхом імуноферментної тест-системи з моноклональними антитілами. Для визначення рівня циркулюючих імунних комплексів у сироватці крові ми використали метод N. Digeon et al. (1977) у мікромодифікаціях. Дослідження показників імунного статусу проводили на базі лабораторного відділення Київської міської шкірно-венерологічної лікарні (завідуюча відділенням Савкіна Н.І.).

Статистичне опрацювання результатів проводили за допомогою стандартних комп'ютерних пакетів програми Quattro Pro для Windows, версія 5.00, 1993 р. і пакета “Аналіз даних” Microsoft Excel для Windows 1995, версія 7.0а, 1996 р. параметричними та непараметричними методами за допомогою критеріїв Вілкоксона-Манна-Уітні, Колмогорова-Смирнова, Стьюдента, коефіцієнта кореляції Спірмена для виявлення залежності між перемінними. Обчислено значення середнього арифметичного (М), середнього квадратичного відхилення (), помилки визначення середнього квадратичного (m), рівня вірогідності розбіжностей (р), коефіцієнта кореляції (r).

Результати роботи та їх обговорення. Серед обстежених хворих на атопічний дерматит число дівчаток (60,2 %) значно превалювало над кількістю хлопчиків (39,8 %), як загалом так і по кожній віковій групі (у віці від 3 до 7 років -- 11 та 5 дітей, від 8 до 11 років -- 25 та 17 хворих, від 12 до 16 років -- 32 дівчинки та 23 хлопчика). Еритематозно-сквамозна форма АД спостерігалася у 12 дітей (10,6 %), еритематозно-сквамозна з ліхеніфікацією форма була у 53 дітей (46,9 %), ліхеноїдна форма відзначалася у 39 дітей (34,5 %), пруригоподібна форма -- у 4 хворих (3,6 %) і атипову форму АД по типу “екзема кистей” спостерігали у 5 дітей (4,4 %). Локалізований процес відзначався у 11 хворих (9,7 %), поширений -- у 97 хворих (85,9 %), універсальне ураження (еритродермія) -- у 5 пацієнтів (4,4 %). Серед дітей з мінімальним ступенем активності процесу було 17 хворих (15,0 %), з помірним -- 69 хворих (61,1 %), з високим -- 27 хворих (23,9 %) (із них 5 дітей (4,4 %) з максимальним ступенем активності процесу). За ступенем тяжкості перебігу АД хворих розподілили: легкий перебіг АД відзначався у 17 дітей (15,0 %), середньоважкий -- у 49 пацієнтів (43,4 %), важкий перебіг -- у 47 хворих (41,6%). За кількісною оцінкою тяжкості SCORAD -- 50,0 ? 2,0.

Оцінюючи сімейний анамнез виявили, що при наявності в родоводі обстежуваних пацієнтів матерів або найближчих родичів по материнській лінії, які страждають на захворювання алергічної природи, захворювання наступало в 2,3 рази частіше, ніж коли в сім'ї на захворювання алергічної природи страждав батько дитини. При оцінці стану здоров'я дітей у сім'ях, де двоє дітей і обидві дитини мають позитивну історію алергічного захворювання, аналіз спадкоємності показав, що у старших дітей це виявляється у вигляді алергічних реакцій на харчові продукти, цвітіння рослин або екземою кистей, а молодші діти страждають на АД. Очевидний той факт, що друга дитина має значно більш загальне алергічне захворювання, ніж перша.

При дослідженні стану аутофлори шкіри у дітей хворих на АД виявили, що з 1 см2 шкіри патологічного вогнища висівається 617,14 ± 100,48 КУО, що вірогідно перевищує показники контрольної групи (4,58 0,89 КУО/см2, р<0,05). Зміни стосуються не тільки кількості мікроорганізмів на шкірі, але і якісного складу аутофлори шкіри. У мікробному пейзажі переважає золотистий стафілокок (60,01 % ± 6,11 %), який у дітей контрольної групи ні разу не висівався.

Проведене дослідження аутофлори шкіри патологічних вогнищ за віковими групами показало, що у хворих на АД дітей у будь-якому віці зі шкіри патологічних вогнищ виділяється велика кількість мікроорганізмів, яка поступово збільшується з віком. Найбільше обсіменіння шкіри відзначається у віковій групі 12-16 років (557,56 ± 141,36 КУО/см2), яке вірогідно перевищує показник загального вмісту мікроорганізмів у групі 3-7 років (187,96 39,51 КУО/см2, р<0,05) та може бути порівняне з обсіменінням шкіри мікроорганізмами у групі 8-11 років (372,15 ± 89,45 КУО/см2, р>0,05). Мікрофлора шкіри патологічних вогнищ дітей у віці 3-7 років подана в основному епідермальним стафілококом (141,85 ± 25,93 КУО/см2 шкіри), тоді як в інших вікових групах основне місце в мікрофлорі займає золотистий стафілокок (у групі 8-11 років 236,85 ± 19,61 КУО/см2, а в групі 12-16 років 440,57 ± 136,94 КУО/см2), середній вміст його в цих групах вірогідно перевищує відповідний показник в групі дітей 3-7 років (33,20 ± 5,68 КУО/см2, р<0,05).

Дослідження стану мікробного пейзажу шкіри в патологічних вогнищах АД при різних клініко-морфологічних формах виявило, що високе, вірогідно вище за контроль (р<0,05), обсіменіння шкіри патологічних вогнищ спостерігається при всіх клініко-морфологічних формах АД, особливо при процесі з ліхеніфікацією (при еритематозно-сквамозній з ліхеніфікацією формі висівалось 643,77 ± 159,79 КУО/см2 шкіри і ліхеноїдній -- 625,86 ± 124,73 КУО/см2 шкіри), яки вірогідно (р<0,05) перевищують показники обсіменіння при інших клініко-морфологічних формах. Відповідно, золотистий стафілокок в найбільшій кількості зустрічаються при цих же формах (574,27 ± 124,61 КУО/см2 шкіри у вогнищах при еритематозно-сквамозній з ліхеніфікацією формі і 400,67 ± 110,54 КУО/см2 при ліхеноїдній формі).

При розгляді вмісту мікроорганізмів на 1 см2 шкіри в патологічних вогнищах при різних ступенях активності АД відзначили, що навіть при мінімальному ступені активності процесу кількість мікроорганізмів вірогідно (р<0,05) перевищує показники контрольної групи. При збільшенні ступеня активності АД кількість мікроорганізмів у патологічних вогнищах збільшується (при мінімальному ступені активності процесу 82,14 ± 22,45 КУО/см2, що вірогідно менше ніж при помірному ступені активності -- 619,85 ± 142,12 КУО/см2, р<0,05 і при високому ступені -- 865,71 ± 213,48 КУО/см2 шкіри, р<0,05). Також зі збільшенням ступеня активності процесу йде збільшення числа золотистого стафілокока на 1 см2 шкіри у вогнищі патологічного процесу, а при високому ступені активності АД вірогідно (р<0,05) збільшене мікробне число епідермального стафілокока (125,44 ± 33,26 КУО/см2), мікроорганізмів роду мікрококів (36,19 ± 4,37 КУО/см2) і роду бацил (131,60 ± 5,74 КУО/см2) у порівняні з показниками при інших ступенях активності.

Вивчаючи стан мікробного біоценозу шкіри при різних ступенях тяжкості перебігу АД у дітей, відзначали вірогідне перевищення кількості мікроорганізмів у контрольної групи при всіх ступенях тяжкості. При збільшенні ступеня тяжкості перебігу АД збільшується кількість мікроорганізмів на шкірі патологічних вогнищ (при легкому ступені перебігу АД висівається 113,05 ± 23,02 КУО/см2, при середньоважкому перебігу -- 278,62 ± 72,53 КУО/см2, а при важкому перебігу -- 787,40 ± 160,84 КУО/см2 шкіри, що вірогідно (р<0,05) переважає показник при легкому ступені перебігу АД). Мікробне число золотистого стафілокока має тенденцію до зростання по мірі переобтяження процесу. При важкому перебігу АД значно перевищені показники кількості умовно-патогенних мікроорганізмів (середня кількість епідермального стафілокока 268,95 36,16 КУО/см2, мікроорганізмів роду мікрококів 42,45 5,46 КУО/см2 та роду бацил 67,48 10,76 КУО/см2), що може приводити до реалізації їх патогенних властивостей і викликати ускладнення шкіри.

Ділянки видимо здорової шкіри дітей хворих на АД теж значно колонізовані мікроорганізмами (27,26 ± 5,58 КУО/см2 шкіри), що вірогідно перевищує обсіменіння шкіри живота у дітей контрольної групи (9,53 ± 1,65 КУО/см2, р<0,05). Основу мікрофлори видимо здорової шкіри дітей хворих на АД складають мікроорганізми роду мікрококів і епідермальний стафілокок, питома вага цих мікроорганізмів у загальній мікрофлорі 23,50 % ± 6,89 % і 23,38 % ± 6,24 % відповідно. Висівається з ділянок видимо здорової шкіри золотистий стафілокок (2,41 ± 0,26 КУО/см2), що вірогідно перевищує показники контрольної групи. Таким чином, можна відзначити, що навіть ділянки видимо здорової шкіри дітей хворих на АД значно колонізовані мікроорганізмами, їх число в 2-4 рази перевищує кількість мікробів на шкірі дітей контрольної групи. Спостерігається якісний дисбаланс мікробів, поява і превалювання мікроорганізмів не характерних для здорової шкіри, де основу мікрофлори шкіри живота дітей контрольної групи складає сапрофітний стафілокок (50,0 % ± 15,08 %), а шкіри передпліччя -- епідермальний стафілокок (32,03 % ± 10,53 %).

Дослідження стану шкіри у дітей хворих на АД при перебігу процесу з бактеріальним ускладненням шкіри і без нього вірогідних розходжень між показниками обсіменіння шкіри як у вогнищах ураження так і видимо здоровій шкіри не виявили (таблиця 1).

мікрофлора шкіра атопічний дерматит

Таблиця 1. Кількість мікроорганізмів на 1 см2 шкіри дітей хворих на АД при відсутності та наявності бактеріального ускладнення шкіри

Примітки:

р0,05 - вірогідність розходжень у порівнянні з контролем шкіра передпліччя;

р10,05 - вірогідність розходжень у порівнянні з контролем шкіра живота;

* - (р0,05) вірогідність розходжень у порівнянні з показниками у вогнищі АД при наявності ускладнення;

** - (р0,05) вірогідність розходжень у порівнянні з показниками поза вогнищем АД при наявності ускладнення;

* - (р0,05) вірогідність розходжень у порівнянні з показниками поза вогнищем АД при відсутності ускладнення;

** - (р0,05) вірогідність розходжень у порівнянні з показниками поза вогнищем АД при наявності ускладнення.

З 1 см2 шкіри патологічних вогнищ при АД без ускладнень висівається 509,55 ± 119,99 КУО, а при наявності бактеріального ускладнення шкіри у перебігу АД -- 663,17 ± 163,59 КУО/см2. З 1 см2 шкіри видимо здорових ділянок шкіри дітей хворих на АД при наявності піодермії висівається 44,38 ± 17,33 КУО, а при відсутності ускладнень -- 22,69 ± 4,34 КУО/см2. Шкіра патологічних вогнищ вірогідно (р<0,05) сильніше колонізована мікроорганізмами ніж ділянки видимо здорової шкіри. Однак слід зазначити, що при наявності бактеріального ускладнення шкіри у перебігу АД обсіменіння патологічних вогнищ і видимо здорової шкіри відбувається у взаємозв'язку, коефіцієнт кореляції +0,98, а при неускладненому перебігу АД кореляційний зв'язок середній, коефіцієнт кореляції +0,39.

При відсутності ускладнень шкіри у перебігу АД у патологічних вогнищах значно збільшена кількість золотистого стафілокока (461,36 ± 109,81 КУО/см2), а при перебігу процесу з бактеріальним ускладненням шкіри значно збільшено мікробне число не тільки золотистого стафілокока (154,88 ± 20,32 КУО/см2), а і епідермального стафілокока (324,09 ± 39,41 КУО/см2), мікроорганізмів роду мікрококів (165,78 ± 53,76 КУО/см2) та роду бацил (222,80 ± 44,37 КУО/см2), кількість яких вірогідно (р<0,05) перевищує аналогічні показники при неускладненому перебігу АД. І можна говорити про те, що причиною і підтримуючою силою піодермій при АД є асоціації умовно-патогенних мікроорганізмів.

Проведене дослідження чутливості й стійкості до антимікробних препаратів мікроорганізмів мікрофлори шкіри дітей хворих на АД показало, що шкіра хворих дітей контамінована штамами мікроорганізмів досить стійкими до антимікробних препаратів (відсоток резистентних та помірностійких мікроорганізмів складає від 25,0 % до 62,5 %), особливо до тих, які давно і широко використовуються в медичній практиці (S. aureus стійкий до ко-тримоксазолу у 69,57 % випадків, до ампіциліну -- у 50,0 %, до хлорамфеніколу -- у 23,81 %, до бензилпеніциліну -- у 40,0 % і тетрацикліну -- у 22,22 %).

Дослідження стану мікрофлори шкіри дітей з АД у період ремісії, показало, що навіть у період ремісії шкіра обстежуваних значно колонізована мікроорганізмами як у типових місцях ураження, так і поза ними (із 1 см2 шкіри розгинальної поверхні передпліччя висівалось 78,78 ± 14,78 КУО, р<0,05 а зі шкіри живота -- 10,32 ± 1,51 КУО/см2, р0,05), ніж у контрольній групі. Слід зазначити, що обсіменіння шкіри передпліччя у пацієнтів з АД у період ремісії вірогідно (р<0,05) перевищує обсіменіння шкіри живота, хоча в контрольній групі навпаки, обсіменіння шкіри живота більше. Мікробний пейзаж шкіри у дітей з АД у ремісію хоча і поданий в основному епідермальним стафілококом (шкіра передпліччя -- 52,65 ± 2,98 КУО/см2; шкіра живота -- 9,98 ± 2,14 КУО/см2 шкіри) і мікроорганізмами роду мікрококів (21,33 ± 2,27 КУО/см2 і 5,25 ± 0,74 КУО/см2 шкіри відповідно), усе ж носить патогенний характер, тому що в мікрофлорі зустрічається золотистий стафілокок (19,25 ± 1,59 КУО/см2 шкіри передпліччя та 0,80 ± 0,05 КУО/см2 шкіри живота), що при довготривалому їх зберіганні на шкірі є прогностично негативною ознакою та може призводити до рецидивів АД.

Проведене дослідження показало, що мікрофлора шкіри дітей з АД істотно відрізняється від мікрофлори шкіри здорових дітей. Шкіра дітей хворих на АД у період загострення й у період ремісії, у вогнищах ураження і поза ними значно колонізована не тільки золотистим стафілококом, але й умовно-патогенними мікроорганізмами: епідермальним стафілококом, мікроорганізмами роду мікрококів і роду бацил. Високе обсіменіння шкіри патологічних вогнищ відзначається при всіх клініко-морфологічних формах АД, особливо при процесі з ліхеніфікацією і не залежить від віку пацієнта. Зі збільшенням ступеня активності і ступеня тяжкості перебігу АД кількість мікроорганізмів у патологічних вогнищах збільшується, також йде збільшення золотистого стафілокока. При високому ступені активності і важкому перебігу АД на шкірі значно перевищені показники кількості епідермального стафілокока, мікроорганізмів роду мікрококів та роду бацил, що може привести до реалізації їх патогенних властивостей і викликати вторинні ускладнення шкіри. Спостерігається високе обсіменіння шкіри у хворих з АД навіть без вторинних ускладнень. При неускладненому процесі у патологічних вогнищах АД значно збільшена кількість золотистого стафілокока, а при перебігу процесу з бактеріальним ускладненням шкіри -- значно збільшене мікробне число епідермального стафілокока, мікроорганізмів родів мікрококів та бацил. Можна припустити, що причиною і підтримуючою силою піодермій у перебігу АД є співдружність умовно-патогенних мікроорганізмів. У процесі дослідження було встановлено, що шкіра хворих на АД дітей контамінована штамами мікроорганізмів досить стійкими до антимікробних препаратів, які достатньо давно використовуються в медичній практиці.

Якісний дисбаланс мікробів в аутофлорі шкіри хворих на АД дітей, який спостерігається нами, збільшення числа мікроорганізмів та наявність гемолітичних форм свідчать про порушення складу мікробіоценозу шкіри, що може призводити до зниження антимікробної резистентності організму.

Дослідження показників клітинного імунітету за допомогою методу розеткоутворення виявило у обстежених хворих вірогідне зниження відносної й абсолютної кількості Т-лімфоцитів (Е-РУК -- 33,5 1,3 %; 798,5 43,9 х 106/л) у порівнянні з контрольною групою (Е-РУК -- 64,3 1,4 %; 1524,3 132,8 х 106/л, р<0,05). Відносний й абсолютний вміст теофілінрезистентних Т-лімфоцитів (Т-р) (Т-р -- 22,1 0,9 % і 520,4 29,0 х 106/л) і теофілінчутливих Т-лімфоцитів (Т-ч) (Т-ч -- 11,4 0,7 % і 274,0 21,5 х 106/л) у порівнянні з контрольною групою (Т-р -- 39,9 1,2 %; 921,4 78,6 х 106/л, р<0,05 та Т-ч -- 25,3 0,7 %; 602,9 57,3 х 106/л, р<0,05) також вірогідно знижений.

Дослідження показників, які характеризують гуморальну ланку імунітету, в обстежених хворих виявило вірогідне зниження рівня відносних та абсолютних ЕАК-РУК (ЕАК-РУК -- 29,1 % 1,3 %; 667,8 39,8 х 106/л) у порівнянні з контрольною групою (ЕАК-РУК -- 46,9 2,3 %; 1122,9 119,6 х 106/л, р<0,05). Проведений аналіз рівня імуноглобуліну Е у хворих на АД показав його вірогідне підвищення (152,0 24,2 КЕ/л) у порівняні з контрольною групою (38,3 9,3 КЕ/л, р<0,05). У пацієнтів спостерігалося вірогідне зниження рівня IgА (1,55 0,05 г/л) і вірогідне підвищення рівнів IgМ (1,68 0,05 г/л) та IgG (9,71 0,17 г/л) у порівнянні з контрольною групою (IgА -- 2,67 0,11 г/л, р<0,05; IgМ -- 1,15 0,08 г/л, р<0,05; IgG -- 6,08 0,61 г/л, р<0,05).

Також було вірогідно підвищене середнє значення ЦІК у хворих (100,63 4, 87 од.опт.щільн.) у порівнянні з контрольною групою (59,00 4,68 од.опт.щільн., р<0,05).

Дослідження імунологічних показників в залежності від наявності або відсутності бактеріального ускладнення шкіри у перебігу АД виявило, що пригнічення Е-РУК відзначається поза залежністю від наявності або відсутності піодермії у перебігу процесу, але всі показники вірогідно нижчі за контроль.

Дослідження показників, які характеризують гуморальний імунітет, свідчать про вірогідне перевищення абсолютного вмісту В-лімфоцитів при перебігу АД ускладненому піодермією (837,50 64,31 х 106/л) над вмістом В-лімфоцитів при перебігу процесу без бактеріального ускладнення (634,44 38,27 х 106/л, р<0,05), вірогідних розходжень з показниками контрольної групи не виявлено (780,12 55,10 х 106/л, р>0,05). Показники вмісту IgМ (1,80 0,07 г/л) і рівень IgG (10,07 0,25 г/л) у сироватці крові у хворих дітей при перебігу АД без ускладнень вірогідно перевищують аналогічні показники в групі з перебігом АД при наявності бактеріального ускладнення (IgМ 1,47 0,06 г/л, р<0,05 і IgG 9,16 0,19 г/л, р<0,05).

Аналіз рівня IgЕ в залежності від наявності бактеріального ускладнення показав, що при перебігу процесу з ускладненням піодермією рівень IgЕ (230,72 62,58 КЕ/л) вірогідно перевищує вміст IgЕ (123,64 19,83 КЕ/л, р<0,05) при неускладненому перебігу АД, що може свідчіть про наявність специфічних IgЕ до мікроорганізмів, які викликають бактеріальні ускладнення.

Вміст ЦІК у дітей з ускладненням при АД може бути порівняний з вмістом ЦІК при не ускладненому перебігу процесу.

Таким чином, при АД у дітей спостерігаються виражені порушення імунного статусу, які характеризуються дефіцитом Т-лімфоцитів, дисбалансом субпопуляцій, вираженою дисімуноглобулінемією, що виявляється в підвищенні рівнів IgЕ, IgМ та IgG, зниженні вмісту IgА і підвищенні рівня ЦІК. Порушення клітинної та гуморальної ланок імунітету найбільш виражені при перебігу АД без ускладнень, за виключенням вмісту IgЕ, який вірогідно вищий при процесі з наявністю бактеріального ускладнення шкіри.

Аналізуючи зв'язки показників обсіменіння шкіри з показниками імунної системи, виявили, що збільшення мікроорганізмів на шкірі патологічного вогнища пропорційно збільшенню вмісту в сироватці крові дітей хворих на АД абсолютного числа теофілінчутливих і В-лімфоцитів. Характер зв'язків між показниками системи імунітету та показниками стану мікрофлори шкіри залежить від роду мікроорганізму -- збільшення кількості на шкірі дітей з АД золотистого стафілокока йде паралельно зі збільшенням IgE, а збільшення мікроорганізмів роду мікрококів і роду бацил на шкірі патологічного вогнища збільшується паралельно з показниками, які характеризують клітинну ланку імунітету. Аналізуючи взаємозв'язки між імунологічними показниками і показниками стану мікрофлори в залежності від наявності бактеріального ускладнення шкіри, виявили, що при перебігу АД без ускладнень показники імунітету корелюють із кількістю золотистого стафілокока, а ускладнення при АД обумовлені умовно-патогенними мікроорганізмами (епідермальним стафілококом, мікроорганізмами родів мікрококів та бацил).

Була відібрана група пацієнтів у кількості 54 дітей хворих на АД. Всім дітям призначалася загальна традиційна терапія: дієта з виключенням облігатних алергенів, антигістамінні препарати (діазолін, супрастин), заспокоюючі засоби (препарати валеріани), десенсибілізуючі засоби (тіосульфат натрію), жовчогінні засоби (алохол, сульфат магнію), вітамінні препарати (тіаміну хлорид, піридоксину гідрохлорид), імунокоректори (спленін). Місцева терапія у хворих кожної групи була різна.

З них у 21 дитині хворої на АД без вторинних ускладнень (1-а група), проводилася традиційна місцева терапія з застосуванням кортикостероїдних мазей “Преднизолоновая” і “Гидрокортизоновая” (виробництва “Нижфарм”).

У 2-у групу ввійшли 15 дітей хворих на АД з наявністю бактеріального ускладнення шкіри. Цим дітям крім загальної традиційної терапії був призначений антибіотик для системного застосування ампіокс або гентаміцин. Антибіотик активний у відношенні грампозитивних і грамнегативних мікроорганізмів. Призначали ін'єкції 2 рази на день у віковому дозуванні. Зовнішня терапія включала мазі тетрациклінову і еритроміцинову 2 рази на день протягом 10 днів.

3-ю групу (18 дітей) склали діти хворі на АД без вторинних ускладнень (12 дітей) і з бактеріальним ускладненням шкіри (6 дітей). Зовнішня терапія містила нанесення на патологічні вогнища АД мазі “Тримістин-Дарниця” 2 рази на день 10 днів. Мірамістин -- антисептик широкого спектру антимікробної дії, у поєднанні з триамцинолоном ацетонідом на водорозчинної гелієвої основі має високу антибактеріальну і антифунгальну активність у відношенні збудників інфекційних процесів. Мазь має виражену епітелізуючу дію, відновлює нормальний кровотік і проникність капілярів, відновлює колагенові та еластичні волокна, не викликає порушення функцій кори надниркових залоз навіть при нанесенні на значну уражену поверхню шкірних покривів. Рекомендована для використання при лікуванні алергодерматозів.

Оцінку результатів лікування в групах проводили на підставі скарг пацієнтів, змін дерматологічного статусу за системою SCORAD, показників стану мікрофлори шкіри патологічних вогнищ.

Методика лікування пацієнтів 3-ї групи за об'єктивними і суб'єктивними даними інтенсивності шкірного процесу виявилася більш ефективною, ніж у 1-й і 2-й групах, що привело до зникнення гіперемії і папульозних висипань, екскоріацій і кірочок, а інтенсивність таких ознак як ліхеніфікація і сухість шкіри виявилася найменшою (1,17 ± 0,11 і 0,83 ± 0,12 у пацієнтів 3-ї групи проти 1,21 ± 0,14 і 0,95 ± 0,14 у 1-й групі і 1,30 ± 0,21 і 1,20 ± 0,20 у 2-й групі). У результаті лікування в пацієнтів 3-ї групи нормалізувався сон, а інтенсивність шкірного свербежу (1,00 ± 0,17) вірогідно нижча, ніж у 1-й (1,58 ± 0,22, р<0,05) і 2-й (2,00 ± 0,21, р<0,05) групах. Все це забезпечило найменшу кількісну оцінку тяжкості перебігу АД, індекс SCORAD у пацієнтів 3-ї групи (7,33 ± 1,13) вірогідно нижчий, ніж у 1-й (10,16 ± 1,09, р<0,05) і 2-й (12,8 ± 2,14, р<0,05) групі. Відсоток клінічного одужання у пацієнтів 3-ї групи більш високий (83,33 % проти 76,19 % у пацієнтів 1-ї групи і 73,33 % у 2-й групі) і були відсутні рецидиви протягом півроку.

Аналіз динаміки стану мікрофлори шкіри патологічних вогнищ після лікування виявив більшу ефективність методики у пацієнтів 3-ї групи в порівнянні з загальноприйнятими методами лікування. Якщо в результаті традиційного способу лікування у пацієнтів 1-ї групи відзначається вірогідне зменшення мікроорганізмів після лікування (18,17 ± 1,44 КУО на 1 см2 шкіри, р<0,05) у порівнянні з початковими показниками (366,78 ± 68,88 КУО на 1 см2 шкіри патологічного вогнища) і показником обсіменіння шкіри в період ремісії (78,78 ± 14,78 КУО на 1 см2 шкіри), але все ж склад мікрофлори шкіри залишається патогенним, тобто є гемолітичні форми мікроорганізмів (кількість золотистого стафілокока 14,49 ± 1,27 КУО/см2 шкіри).

Застосування системної антибактеріальної терапії у пацієнтів 2-ї групи помітно корегує мікрофлору шкіри патологічних вогнищ і після лікування ми виявляли вірогідне зниження кількості мікроорганізмів на шкірі у вогнищах ураження (56,98 ± 10,69 КУО/см2 шкіри, р<0,05) у порівнянні з початковими даними обсіменіння вогнищ (722,23 ± 134,27 КУО/см2 шкіри) і може бути порівняна з показником обсіменіння шкіри в період ремісії (78,78 ± 14,78 КУО/см2, р>0,05). Однак у результаті проведеної антибіотикотерапії в мікробному пейзажі шкіри майже не залишилося епідермального стафілокока (1,93 ± 0,27 КУО/см2 шкіри), який складає основу нормальної мікрофлори шкіри. В основному мікрофлора патологічних вогнищ подана мікроорганізмами роду мікрококів (38,62 ± 7,83 КУО/см2 шкіри), що не характерно для шкіри передпліччя здорової дитини.

У пацієнтів 3-ї групи після лікування кількість мікроорганізмів мікрофлори шкіри патологічних вогнищ (23,18 ± 3,95 КУО/см2, р<0,05) вірогідно нижча за вихідні дані обсіменіння (642,41 ± 110,99 КУО/см2 шкіри) і за показники обсіменіння шкіри в період ремісії (78,78 ± 14,78 КУО/см2). І мікробний пейзаж шкіри поданий мікроорганізмами, які складають основу нормальної мікрофлори шкіри: стафілококами епідермальним і сапрофітним, мікроорганізмами роду мікрококів і бацил. Причому кількісне вираження цих мікроорганізмів відповідає такому в пацієнтів контрольної групи, тобто визначається найбільша кількість епідермального стафілокока (17,32 ± 1,98 КУО/см2 шкіри), потім дещо менше сапрофітного стафілокока (7,74 ± 0,69 КУО/см2 шкіри) і ще менше мікроорганізмів роду мікрококів (5,13 ± 0,96 КУО/см2 шкіри).

Проведене лікування в кожній досліджуваній групі корегує мікробний пейзаж шкіри у пацієнтів з АД. Слід зазначити, що у всіх випадках після лікування обсіменіння вогнищ патологічного процесу вірогідно перевищує обсіменіння шкіри в пацієнтів контрольної групи, а у пацієнтів 1-ї і 3-ї групи вірогідно нижче, ніж обсіменіння шкіри в період ремісії. В результаті проведеного лікування у пацієнтів 1-ї групи висівалась найменша кількість мікроорганізмів із шкіри патологічних вогнищ, але аутофлора шкіри цих пацієнтів носить патогенний характер, тому що у своєму складі має гемолітичні форми мікроорганізмів (золотистий стафілокок). Кількість мікроорганізмів мікрофлори шкіри пацієнтів 2-ї групи може бути порівняна зі вмістом мікроорганізмів у мікрофлорі в пацієнтів у період ремісії і представлена тільки умовно-патогенними мікроорганізмами. Однак якісне співвідношення цих мікроорганізмів (тут переважає рід мікрококів) не відповідає співвідношенню мікроорганізмів у нормальній мікрофлорі шкіри, де є співдружність епідермального, сапрофітного стафілококів і мікроорганізмів роду мікрококів. У пацієнтів 3-ї групи кількість мікроорганізмів з 1 см2 шкіри патологічного вогнища після лікування вірогідно вища, ніж у контрольній групі, але вірогідно нижча, ніж при ремісії АД. А якісний склад аутофлори шкіри нормалізувався в процесі лікування і відповідає співвідношенню мікроорганізмів нормальної мікрофлори шкіри.

Таким чином, введення у комплексну терапію хворих на АД поза залежністю від наявності або відсутності бактеріального ускладнення шкіри зовнішніх препаратів, здатних справляти антибактеріальну дію, сприяє значному клінічному одужанню хворих (83,33 % в 3-й групі проти 76,19 % та 73,33 % в 1-й та 2-й групах), забезпечує найменшу кількісну оцінку тяжкості перебігу АД (індекс SCORAD 7,33 1,13, який вірогідно нижчий, ніж у пацієнтів 1-й і 2-й груп), нормалізує кількість мікроорганізмів та якісний склад мікрофлори шкіри дітей хворих на АД.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведене теоретичне та практичне узагальнення і нове рішення наукової задачі, що полягає в підвищенні ефективності лікування хворих на атопічний дерматит дітей шляхом застосування в загальній терапії препаратів здатних справлять антимікробну дію на основі виявлених особливостей змін у складі мікрофлори шкіри обстежених дітей.

В результаті клінічного дослідження 113 дітей хворих на атопічний дерматит встановлено поширене ураження шкіри у 97 (85,8 %) пацієнтів в помірному та високому ступенях активності процесу (у 83,2 % хворих) з середньоважким (у 43,4 % хворих) та важким (у 41,6 % хворих) перебігом АД, на тлі хронічної патології внутрішніх органів (ураження шлунково-кишкового тракту в 75,2 %).

У дітей хворих на атопічний дерматит виявлені достовірні зміни складу мікробіоценозу шкіри в порівнянні з контрольною групою, які проявляються не тільки в кількісному збільшенні числа мікроорганізмів як у патологічних вогнищах (617,14 ± 100,48 КУО/см2 шкіри, р0,05), так і поза ними (27,26 ± 5,58 КУО/см2 шкіри, р0,05), але і в порушенні якісного складу аутофлори шкіри, коли превалює золотистий стафілокок (60,01 % 6,11 %); встановлені зміни асоційовані із ступенями активності та тяжкості процесу і найбільше проявлені при еритематозно-сквамозній з ліхеніфікацією (643,77 159,79 КУО/см2, р0,05) та ліхеноїдній формі (625,86 124,73 КУО/см2, р0,05).

Встановлено, що при відсутності ускладнень в перебігу атопічного дерматиту на шкірі значно збільшена кількість золотистого стафілокока (461,36 109,81 КУО/см2, р0,05), а при наявності бактеріального ускладнення шкіри у перебігу атопічного дерматиту -- збільшено мікробне число умовно-патогенних мікроорганізмів (S. epidermidis (154,88 20,32 КУО/см2, р0,05), Micrococcus spp. (165,78 53,76 КУО/см2, р0,05), Bacillus spp.(222,80 44,37 КУО/см2, р0,05)).

Показано, що у період ремісії у хворих на атопічний дерматит дітей зберігаються виявлені зміни аутофлори шкіри в бік збільшення загальної кількості мікроорганізмів (78,78 14,78 КУО/см2 шкіри передпліччя і 10,32 1,51 КУО/см2 шкіри живота, р0,05) та порушення якісного складу мікрофлори, коли виявляються гемолітичні форми мікроорганізмів (S. aureus 19,25 1,59 КУО/см2 шкіри передпліччя і 0,80 0,05 КУО/см2 шкіри живота, р0,05).

Атопічний дерматит супроводжується змінами імунологічних показників, що в першу чергу виявляється дефіцитом Т-лімфоцитів, дисімуноглобулінемією за рахунок підвищення IgЕ, IgМ, IgG та зниженням IgА, паралельно зі зниженням кількості В-клітин; характер зв'язків між системою імунітету та станом мікрофлори шкіри залежить від особливостей мікрофлори шкіри.

Обгрунтовано застосування в комплексній терапії дітей хворих на атопічний дерматит антимікробної мазі “Тримістин-Дарниця”, яка сприяє якісній нормалізації аутофлори шкіри та кількості її мікроорганізмів, що приводить до клінічного одужання хворих (у 83,33 % пацієнтів), знижує рецидиви атопічного дерматиту.

Література

мікрофлора шкіра атопічний дерматит

Калюжная Л.Д., Руденко А.В., Мурзина Э.А., Волощук Е.М. Аутофлора кожи больных с атопическим дерматитом // Український медичний часопис. - 1999. - 4 (10). - С. 13-19.

Мурзіна Е.О. Шляхи корекції мікробного біоценозу шкіри при атопічному дерматиті // Зб. наукових праць співробітників КМАПО ім. П.Л. Шупика. - Київ - 2000. - вип.9. - кн.2 - С.331-335.

Мурзина Э.А. Микробный биоценоз кожи при атопическом дерматите и пути его коррекции // Дерматовенерология, косметология, сексопатология. -2000. - 2 (3). - С.105-110.

Калюжна Л.Д., Мурзіна Е.О., Тауфик Ю. Антибактеріальна резистентность шкіри дітей при атопічному дерматиті // Зб. наукових праць співробітників КМАПО ім. П.Л. Шупика. - Київ - 2001. - вип.10. - кн.2 - С. 220-227.

Калюжна Л.Д., Руденко А.В., Савкіна Н.І., Волощук О.М., Мурзіна Е.О. Імунологічний статус та антибактеріальна резистентність при атопічному дерматиті // Зб. наукових праць співробітників КМАПО ім. П.Л. Шупика. - Київ. - 2002. - вип.11. - С. 59-68.

Мурзина Э.А. Изучение гомеостаза больных атопическим дерматитом детей с целью обоснования состояния аутофлоры кожи // Зб. наукових праць співробітників КМАПО по закінчених та перехідних НДР за 1990-1996 роки. Київ - 1997. - С.442-444.

Калюжная Л.Д., Бойко С.Ю., Мурзина Э.А. Состояние аминокислотного и углеводного обмена у больных атопическим дерматитом // Тезисы докладов VII Российского съезда дерматологов и венерологов. - Казань, 1996г. - ч.1. - С. 36.

L.D. Kalyuzhnaya, E.A. Mourzina Levels of C-peptide and insulin in the serum of AD patients // 6th International symposium on AD.- Denmark, 1996. - Р. 70.

Мурзина Э.А. Генеалогический анализ атопического дерматита // Актуальные вопросы дерматовенерологии. - Днепропетровск-Хмельницкий, 1997г. - выпуск №10. - С. 118.

Мурзина Э.А. Роль микробных ассоциаций в клинике атопического дерматита // Актуальные вопросы дерматовенерологии. - Днепропетровск-Хмельницкий, 1997г. - выпуск №10. - С. 119.

Калюжная Л.Д., Савкина Н.И., Мурзина Э.А. Иммунология и аутофлора кожи у больных атопическим дерматитом // Тези доповідей VIІ Укр. зїзду дерматовенерологів. - Київ, 1999. - С.21-22.

Калюжная Л.Д., Мурзина Э.А. Аутофлора кожи детей, больных атопическим дерматитом // Матеріали межд. конф. “Атопический дерматит - 2000”. - Екатеринбург, 2000. - С.39.

Мурзіна Е.О. Клінічна характеристика дітей хворих на атопічний дерматит // Тези до науково-практичної конференції “Токсикодермії та алергічні захворювання шкіри” 26-27 березня 2002. - С. 24-28.

Руденко А.В., Мурзіна Е.О. Мікрофлора шкіри хворих на атопічний дерматит дітей у період ремісії // Додаток до тез до науково-практичної конференції “Токсикодермії та алергічні захворювання шкіри” 26-27 березня 2002. - С.29-30.

Калюжна Л.Д., Уваренко О.А., Мурзіна Е.О., Тауфік І. Атопічний дерматит, пошук обгрунтованих патогенетичних підходів // Зб. наукових праць співробітників КМАПО ім. П.Л. Шупика. - Київ. - 2002. - вип.11. - С. 68-73.

Размещено на Allbest.ru