Особливості структури та функції клітинних мембран при панкреатиті та дії фітопрепарату "Поліфітол-1"

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

УДК 599:539:1.047.346

03.00.04-біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ОСОБЛИВОСТІ СТРУКТУРИ ТА ФУНКЦІЙ КЛІТИННИХ МЕМБРАН ПРИ ПАНКРЕАТИТІ ТА ДІЇ ФІТОПРЕПАРАТУ "ПОЛІФІТОЛ -1"

Шевченко Людмила Юхимівна

Київ - 2002

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано на кафедрі біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Войціцький Володимир Михайлович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка професор кафедри біохімії

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Палладіна Тетяна Олександрівна, Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, провідний науковий співробітник

доктор біологічних наук Тугай Василь Андрійович, Інститут біохімії імені О.В. Палладіна НАН України, провідний науковий співробітник

Провідна установа: Національний медичний університет імені О.О. Богомольця, м. Київ

Захист відбудеться "27" січня 2003 р. о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 при Київському національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 02127, Київ, проспект Глушкова 2, корпус 12, біологічний факультет, к. 512. Поштова адреса: 01033, Київ, вул. Володимирська 64.

Спецрада Д 26.001.24, біологічний факультет.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 01003, Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розіслано "24" грудня 2002 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук О.В. Брайон

Анотації

Шевченко Л.Ю. Особливості структури та функції клітинних мембран при панкреатиті та дії фітопрепарату "Поліфітол-1". - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія, Київський національний університет імені Тараса Шевченка. - Київ. - 2002.

Дисертація присвячена визначенню основних біохімічних шляхів порушень в організмі за гострого панкреатиту та механізмів корегуючої дії при такому захворюванні фітопрепарату "Поліфітол-1", який містить біологічно-активні речовини: високомолекулярні поліфеноли, ефірні масла, флавоноїди, сапоніни тощо.

За експериментального гострого панкреатиту у щурів спостерігаються характерні деструктивні зміни підшлункової залози, печінки, нирок, легенів, збільшення судинної проникності брижейки тонкої кишки; підвищення активності панкреатичних і печінкових ферментів.

Виявлено збільшення кількості ТБК-активних продуктів та активності каталази і супероксиддисмутази; зміни структури мембран гепатоцитів і еритроцитів та їх проникності для К+, Nа+ і Са 2+, що вказує на порушення структурно-функціональних властивостей мембран за розвитку гострого панкреатиту.

Пероральне введення експериментальним тваринам фітопрепарату "Поліфітол-1" призводить до корекції досліджуваних показників. Обгрунтуванням лікувальних властивостей "Поліфітолу-1" за гострого панкреатиту є виявлені його антиоксидантні та мембраннотропні властивості, здатність до комплексоутворення з металами.

Показана доцільність використання "Поліфітолу-1" при комплексному лікуванні хворих на панкреатит.

Ключові слова: клітинні мембрани, іонна проникність, панкреатит, фітопрепарат "Поліфітол-1", підшлункова залоза.

Шевченко Л.Е. Особенности структуры и функции клеточных мембран при панкреотите и действии фитопрепарата "Полифитол-1" . - Рукопись

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04-биохимия, Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко. - Киев. - 2002.

Диссертация посвящена определению основных биохимических путей нарушений в организме при остром панкреатите и исследованию механизмов коррегирующего действия отечественного фитопрепарата "Полифитол-1". Данный фитопрепарат представляет собой 40%-ю спиртовую настойку, в состав которого входят высокомолекулярные полифенолы, эфирные масла, флавоноиды и др.

Установлено, что при развитии экспериментального острого панкреатита, который вызывали локальним охладжением поджелудочной железы крыс хлорэтилом, наблюдаются характерные для этого заболевания деструктивные изменения в поджелудочной железе, почках, легких. Переральное введение экспериментальным животным фитопрепарата приводит к уменшению вызываемого панкреатитом повышения активности в сыворотке крови амилазы, гамма-глутамил - и аланинаминотрансферази, проницаемости сосудов брижейки тонкой кишки.

При экспериментальном остром панкреатите активируются процессы ПОЛ, на что указывает увеличение ТБК-активных продуктов в крови и печени, интенсивности хемилюминисценции крови. Эти процессы сопровождаются повышением активности каталазы и супероксиддисмутазы в крови и печени. Фитопрепарат "Полифитол-1" приводит к нормализации исследуемых показателей.

В результате развития панкреатита наблюдается изменение структуры мембран гепатоцитов и эритроцитов, о чем свидетельствовали изменения характеристик связанного с мембранами флуоресцентного зонда АНС (квантовый выход, число мест и константа связывания). Полученные результаты указывают на возможные конформационные перестройки белковых молекул мембран, изменение их липидной компоненты, нарушение белок-липидных взаимодействий. Следствием структурных нарушений мембран при остром панкреатите является установленное увеличение их проницаемости для К+, Nа+ и Са 2+ . Введение per os экспериментальним животным на фоне острого панкреатита "Полифитол-1" приводило к уменьшению наблюдаемых нарушений структуры клеточных мембран, что свидетельствует о его мембранотропных свойствах. Подтверждением этого являются результаты, полученные в модельных опытах с использованием плоских искусственных фосфолипидных мембран из азолектина и системы "раствор электролита-липид", в которых показана особенность "Полифитола-1" изменять электрическое сопротивление, поверхностное натяжение и электрический потенциал. "Полифитол-1" способен модифицировать клеточные мембраны без присутствия специфических белковых рецепторов, а непосредственно взаимодействуя с липидным матриксом мембран.

Одной из особенностей действия "Полифитола-1" является его способность образовывать комплексы с рядом одно- и двухвалентных металлов, в том числе тяжелых - ртути, свинца, кадмия, стронция, цезия. Это способствует связыванию этих металлов и ускоренному выведению из организма. Подтверждением этого является опыты с 137Cs.

Полученные результаты послужили предпосылкой для использования "Полифитола-1" в качестве коррегирующего препарата при лечении больных с панкреатитом. Установлено, что назначение больным "Полифитола-1" при комплексном лечении традиционной фармакотерапией совместно с локальной гипотермией поджелудочной железы или экстракорпоральной гемосорбцией приводит к более быстрой нормализации таких клинико-биохимических показателей крови как активность амилазы и липазы, содержание аммиака, мочевой кислоты, а также снижению токсичности крови, которую оценивали парамеционным тестом. Целесообразность применения "Полифитола-1" обусловлена способностью этого фитопрепарата стабилизировать структуру клеточных мембран, образовывать комплексы с металлами, выводить токсические вещества, нормализовать окислительно-антиокислительный гомеостаз.

Ключевые слова: клеточные мембраны, ионная проницаемость, панкреатит, фитопрепарат "Полифитол-1", поджелудочная железа.

Shevchenko L.U. Peculiarity of structure and function of cell membranes at pancreatitis and action of phytodrug "Polyphytol - 1". - Manuscript.

Dissertation for a candidate degree in speciality 03.00.04 - biochemistry. - Kyiv Taras Shevchenko national university. - Kyiv. - 2002.

The dissertation work is devoted to the definition of basic biochemical paths of distribution in organism at acute pancreatitis and mechanisms of correction action at this disease by phytodrug "Polyphytol - 1", which contain, in basic, the high molecular polyphenols, ratio oils, flavonoids and saponins.

At experimental acute pancreatitis in rats characteristic for this disease distructure modification in the pancreas, kidneys, easy; increase of vessels permeability of small intestine; increase of pancreatic and liver enzyme activity are observed. The increase quantity of malonic dialdegid and catalase or superoxiddismutase activity; changes hepatocytes and enterocytes membrane structure and their permeability for K+, Na+, Ca2+ are found out, that indicate disturbance of membrane structure-function property at acute pancreatitis progress.

The introduction per os by experimental animals "Polyphytol- 1" result in correction of indexes, which were researched. The substantiation of "Polyphytol-1" medical property at acute pancreatic are its antioxidant and membraneactive properties, ability to complex formation with metals, which are found out. The reason of use "Polyphytol- 1" at complex treatment of sick by pancreatitis, which with traditional pharmakotherapy connect local hipotermy pancreas or hemsorption is shown.

Key word: cell membranes, ionic permeability, pancreatitis, phytodrug "Polyphytol- 1", pancreas.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Дослідження патологічних станів організму передбачає виявлення загального механізму, який лежить в основі зрушень цієї саморегулюючої системи. Панкреатит - поліетіологічне захворювання, що призводить до різноманітних деструктивних процесів в підшлунковій залозі та викликає взаємопов'язані зміни у функціонуванні різних органів і систем організму. панкреатит фітопрепарат печінка

Аналіз результатів сучасних досліджень показав, що одним із факторів структурно-функціональних порушень в підшлунковій залозі за гострого панкреатиту є зміни, які відбуваються у мембранах клітин [Смирнов,1990; Schulz,1999; Вашетко, 2000]. В зв'язку з цим, важливе значення має визначення біохімічних механізмів прояву цього захворювання, оскільки за інтенсивністю виявлених порушень можна верифікувати форму гострого панкреатиту, підібрати необхідні методи лікування та об'єктивно оцінити в динаміці їх ефективність.

Останнім часом велика увага приділяється біохімічним дослідженням дії природних фітопрепаратів, оскільки їм притаманна низька токсичність та комплексний оздоровчий ефект на організм. Поряд з аналізом складу цих препаратів все актуальнішими стає встановлення границю розподілу "розчин електроліту-ліпід". механізмів їх дії в клітинах. В цьому плані перспективними є дослідження механізму дії "Поліфітолу-1" - препарату природного походження, який дозволений до клінічного застосування. "Поліфітол-1" виявляє жовчогінну, спазмолітичну, протизапальну дію, посилює секрецію залоз кишково-шлункового тракту, виявляє адаптогенні властивості, які проявляються у вигляді підвищення витривалості організму до фізичних навантажень [Кава, 1998, Войтенко, 1999; Барабой та ін. 1999; Войтенко та ін., 2000].

"Поліфітол-1" містить біологічно активні речовини з трав полину гіркого і звіробою звичайного, кореневищ кульбаби лікарської, лепехи звичайної та перстача прямостоячого, кори дуба, приймочок кукурудзи, листя м'яти перцевої та квітів цмину піскового. В препараті знайдено цілий ряд мембраномодулюючих та мембраностабілізуючих речовин, зокрема каротин, аскорбінову кислоту, а також олеїнову, арахідонову, лінолеву та інші жирні кислоти, атостерол, стигмастерол та інші стероїдні сполуки, рутин тощо [Решетникова, Семчинская, 1993; Кава, 1998; Олійник, 2001], що обумовлює широкий спектр його лікувальної дії.

Таким чином, комплексне вивчення дії "Поліфітолу-1" на клітинному рівні дає можливість визначити шляхи регуляції за допомогою цього фітопрепарату метаболічних процесів, з метою профілактики і лікування ряду патологічних станів організму, в тому числі за панкреатиту.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота відповідає плану науково-дослідної роботи кафедри біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка і виконана згідно з тематичним планом НДР № 01 БФ 036-04 "Розробка наукових основ пошуку біологічно активних сполук радіозахисної дії" (№ держ.реєстрації 0101U002291) в рамках комплексної наукової програми "Здоров'я людини", а також "Клінічне та експериментальне обгрунтування ефективності деяких біологічно активних речовин" (№ держ.реєстрації 0100U003850).

Мета та задачі дослідження. Дослідження структури і функції клітинних мембран за гострого панкреатиту, визначення in vitro та in vivo мембранотропних властивостей фітопрепарату "Поліфітол-1", його корегуючих властивостей за цієї патології.

В зв'язку з цим в роботі було поставлено такі задачі:

Дослідити мембранотропні властивості фітопрепарату "Поліфітол-1" на модельних системах, які включають бішарові штучні фосфоліпідні мембрани та дослідити антиоксидантні властивості фітопрепарату "Поліфітол-1" та основних шляхів їх реалізації на експериментальній моделі гострого панкреатиту у щурів.

Виявити біохімічні показники, що характеризують протікання гострого панкреатиту у щурів та дію "Поліфітол-1" .

Оцінити мембранні порушення за експериментального гострого панкреатиту у щурів та можливість їх корекції "Поліфітол-1".

Визначити клініко-біохімічні порушення у хворих на гострий панкреатит та здатність фітопрепарата "Поліфітол-1" їх нормалізувати.

Об"єкт дослідження: біохімічні шляхи порушень в організмі за гострого панкреатиту та основи їх корекції фітопрепаратом "Поліфітол-1".

Предмет дослідження: структурно-функціональний стан клітинних мембран за гострого панкреатиту, комплексоутворюючі, антиоксидантні та мембранотропні властивості фітопрепарату "Поліфітол-1".

Методи дослідження: біохімічні, біофізичні, фізико-хімічні, спектрофотометричні, спектрофлуориметричні та математичної статистики.

Наукова новизна отриманих результатів. На основі комплексних біохімічних досліджень показано, що визначальним фактором у перебігу гострого панкреатиту є структурно-функціональні зміни клітинних мембран: модифікація їх структурного стану, накопичення продуктів ПОЛ, збільшення мембранної проникності для іонів. Встановлено, що за панкреатиту відбуваються порушення клітинних мембран, зокрема гепатоцитів та еритроцитів. Використання фітопрепарату "Поліфітол-1" на тлі протікання гострого панкреатиту призводить до стабілізації їх структурного стану. В дослідах in vitro доведено наявність у фітопрепарату "Поліфітол-1" комплексоутворюючих, антиоксидантних та мембранотропних властивостей. Науково обгрунтована доцільність використання "Поліфітолу-1" при патологіях, пов'язаних з мембранними порушеннями.

Практичне значення отриманих результатів. На експериментальній моделі гострого панкреатиту у щурів показана доцільність використання препарату "Поліфітол-1" для корекції структурно-функціональних порушень клітинних мембран. Результати проведеного комплексного лікування хворих на гострий панкреатит, яке разом із традиційною фармакотерапією полягає у проведенні зовнішньої локальної гіпотермії підшлункової залози, поряд із використанням "Поліфітолу-1", свідчить про ефективність застосування цього препарату. Отримані результати розширюють можливість використання "Поліфітолу-1" в якості лікувального засобу за панкреатиту.

Особистий внесок. Автором особисто проведено інформаційний пошук, аналіз наукової літератури за даною проблемою, ряд лабораторно-біохімічних та біофізичних досліджень, первинне опрацювання матеріалів, аналіз статистичної обробки результатів. Створення моделі гострого панкреатиту у щурів проводилось спільно з д.м.н., проф. Г.М. Войтенко, а виконання деяких біохімічних досліджень з к.б.н., доц. С.А. Олійником. Клініко-біохімічні дослідження "Поліфітолу-1" проводились на базі 1-ї міської кліничної лікарні (м. Київ) у співробітництві з д.м.н., проф. В.В. Скибою.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідались на 2-му з`їзді біофізиків Росії (Москва, 1999); четвертій міжнародній науково-практичній конференції з народної та нетрадиційної медицини (Київ,2002); науково-практичній конференції з міжнародною участю "Клінічна фармакологія метаболічних коректорів та взаємодія ліків в клінічній практиці" (Вінниця, 2002); International conference "New technologies of obtaining and application of biologically active substances" (Alushta, 2002).

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи викладено в 6 статтях та 4 тезах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 149 сторінках друкованого тексту, складається зі вступу, аналітичного огляду літератури, власних досліджень з обговоренням, заключення та висновків. Текст ілюстровано 12 таблицями та 16 рисунками. Список використаної літератури містить 166 джерел.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи досліджень

В роботі були використані щури-самці лінії Вістар масою 160-200г. Експериментальний панкреатит викликали шляхом локального охолодження підшлункової залози щурів хлоретилом (Кананян,1985). Тварини були поділені на групи (по 8-10 осіб у кожній) з декількома повторами: 1) щури, у яких моделювали гострий панкреатит локальним охолодженням підшлункової залози; 2) щури, яким перорально вводили фітопрепарат "Поліфітол-1" (40% спиртовий настій, виробництва Житомирської фабрики лікарських рослин), розведений дистильованою водою у співвідношенні 1:1, в дозі 5 мл на 1 кг маси тіла за 1 добу, а потім ще за 1 год до охолодження підшлункової залози та через 2 год після нього. Дослідження проводились через 6 та 24 год від моменту пошкодження підшлункової залози.

В дослідах використовували: плазму крові (у присутності гепарину); сироватку, яку отримували після центрифугування цільної крові при 1000 g за відсутності антикоагулянту; мембрани еритроцитів, які виділяли згідно [Климов, 2001]; мікросомальну фракцію гепатоцитів, яку отримували із гомогенної фракції шляхом диференційного центрифугування згідно [Финдлей, 1990]. Гістологічні зрізи готували згідно зі стандартною методикою [Волкова,1982]. Електронно-мікроскопічні дослідження проводили на апараті JEM 100B (Японія).

Визначення вмісту ТБК-активних продуктів, за якими оцінювали кількість малонового диальдегіду (МДА) в тканинах проводили згідно [Орехович, 1977], а в крові - за методом [Сморщок, 1986]. Активність каталази визначали за методом [Королюк, 1988], а активність супероксиддисмутази (СОД) - згідно [Дубинина, 1988]. Хемілюмінесценцію плазми крові та еритроцитів визначали при t=25^оС на хемілюмінометрі ХЛМ 1Ц-01 за методикою [Сидорик, 1989].

Біохімічні показники, що вміщують визначення загальної протеолітичної активності крові (ЗПАК), сорбційної здатності мембран еритроцитів (СЗЕ), вміст середньомолекулярних пептидів (СМП) сироватки крові, тощо визначали згідно [Базарнова, 1982]. Активність гамма-глутамілтрансферази (ГГТ), аланінамінотрансферази (АлТ) та аспартатамінотрансферази (АсТ) визначали з використанням стандартних наборів реактивів фірми "Global Biomarketing Group" (США).

Проникність мембран еритроцитів та гепатоцитів для іонів калію, натрію та кальцію оцінювали на підставі вимірювання мембранного потенціалу, який визначали методом синтетичних проникаючих іонів [Либерман и др., 1969]. Для оцінки структурного стану мембран використовували негативно заряджений зонд АНС (1-анілінонафталін-8-сульфонат) [Владимиров, Добрецов, 1980]. Інтенсивність флуоресценції АНС реєстрували при зб=380 нм та фл=490 нм. Флуоресцентні вимірюваня проводили на спектрофлуориметрі Shimadzu-RF510 (Японія) в кварцевій односантиметровій кюветі .

Експериментальну модель внутрішнього опромінення 137Cs на щурах створювали шляхом одноразового перорального введення розчину 137CsCl активністю 185 Бк в об'ємі 0,5мл. "Поліфітол-1" в такому ж об'ємі вводили протягом перших трьох діб (починаючи через 3 год після опромінення), потім 14 діб щоденно додавали в питну воду. Радіометрію тварин було здійснено на радіометрі ГТРМ-01Ц. Зміни вмісту 137Cs в організмі тварин визначали в динаміці через зазначені проміжки часу, оцінюючи у відсотках від введеної активності.

Дослідження взаємодії "Поліфітолу-1" в модельній двохфазній системі "розчин електроліту-ліпід" проводили шляхом вимірювання граничного електричного потенціалу, електричного опору і поверхневого натягу границі розділу фаз. Вивчення взаємодії "Поліфітолу-1" з бішаровими штучними фосфоліпідними мембранами (БШФМ), які формували із азолектину в н-гексані (20 мг/мл), проводили шляхом вимірювання електричного опору БШФМ .

Дослідження взаємодії "Поліфітолу-1" і екстракту звіробою з іонами металів проводили методом УФ - спектрофотометрії водних розчинів. Записи спектрів поглинання водних розчинів проводили на спектрофотометрі "Specord-M40" Кількісний показник комплексоутворення "Поліфітолу-1" чи екстракту звіробою з іонами металів - константу стійкості комплексу (Кст) розраховували згідно [Гурьянова та ін., 1973]:

Експериментальні дані оброблялись загальноприйнятими методами варіаційної статистики [Кучеренко та ін., 2001]. Розраховувалися значення середніх арифметичних величин (М), їх середньоквадратичне відхилення () і помилка середньої (m). Для визначення вірогідних відмінностей між середніми величинами використовували критерій Ст'юдента (t). Зміни показників вважали вірогідними при р0,05.

Результати досліджень та їх обговорення

Перебіг експериментального гострого панкреатиту у щурів

Патоморфологічні дослідження підшлункової залози, печінки, нирок та легенів щурів, проведені за експериментального гострого панкреатиту, вказують на наявність в цих органах деструктивних змін, які характерні для цього захворювання. Одержані результати свідчать про набряк та зростання розмірів підшлункової залози, відмічаються ділянки крововиливів, а в черевній порожнині з'являється перитонеальний ескудат. Електронно-мікроскопічні дослідження ультраструктури гепатоцитів та ацинарних клітин показують, що в процесі розвитку експериментального панкреатиту пошкоджуються мембранні структури клітин.

В черевній порожнині щурів через 6 год після охолодження підшлункової залози міститься 6,3+0,7 мл геморагічної рідини, а через 24 год - 2,9+0,5мл. В контролі перитонеального випоту не було виявлено. Введення тваринам на фоні експериментального панкреатиту препарату "Поліфітол-1" призводить до зменшення кількості перитонеального ексудату: через 6 год від моменту охолодження підшлункової залози в середньому на 37,1%, а через 24 год - на 69,4% .

Розвиток гострого панкреатиту у щурів супроводжується підвищенням активності як панкреатичних, так і печінкових ферментів (амілази, ГГТ та АлТ). Значне (майже в 10 разів) підвищення активності сироваткової амілази спостерігається вже через 6 год від початку експерименту; через 24 год активність амілази підвищується приблизно в 7 разів. Введення експериментальним тваринам з гострим панкреатитом "Поліфітолу-1" викликає менше зростання активності амілази в середньому в 4,4 раз через 6 год та в 4,1 раз через 24 год, по відношенню до контролю, а також активності АлТ та ГГТ відповідно на 23,6 та 31,7%.

Зручною моделлю для вивчення судинної проникності у щурів є брижейка тонкої кишки. Встановлено, що проникність мікроциркуляторного русла брижейки тонкої кишки у щурів на фоні розвитку панкреатиту значно підвищується, максимальне підвищення спостерігається через 24 год після охолодження підшлункової залози. Під впливом "Поліфітолу-1" у тварин з експриментальним панкреатитом спостерігається зменшення ступеню судинної проникності брижейки тонкої кишки. Таким чином, застосування "Поліфітолу-1" впливає на розвиток процесу гострого панкреатиту та вносить певні корективи в динаміку його перебігу.

Окисно-антиоксидантний статус щурів за експериментального гострого панкреатиту.

Порушення клітинного метаболізму в різних тканин організму, зокрема при гострому панкреатиті, великою мірою обумовлені активацією в них процесів вільнорадикального перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) [Лобода та ін., 1991]. Активація ПОЛ є однією із складових частин запалювального процесу різної етіології, характеризуючи гостроту і особливості його перебігу та ефективність лікування [Барабой, Сутковой, 1997].

Таблиця 1 Показники окисно-антиокислювального гомеостазу крові та печінки щурів через 24 год. експериментального гострого панкреатиту (ГП) та введенні "Поліфітолу-1" (М±m, n = 6 -7)

Умови дослідження	Плазма крові	Печінка
Вміст МДА	мкмоль/л плазми	нмоль/ мг білка
Контроль	973,5 44,2	15,2 1,7
ГП	1645,2 81,4*	22,0 2,9*
ГП + "Поліфітол-1"	1077,5 70,1	16,2 1,9
Активність каталази	мкат/л плазми	нмоль/ мг білка за хв.
Контроль	123,9 11,3	375,0 65,0
ГП	166,0 15,1*	487,0 60,0*
ГП + "Поліфітол-1"	135,1 10,5	395,0 54,0
Активність СОД	у.о./л плазми	у.о./мг білка
Контроль	12,7 1,2	5,1 0,4
ГП	15,8 1,0*	5,9 0,4*
ГП + "Поліфітол-1"	12,8 1,1	5,4 0,6
Спонтанна хемілюмінісценція	у. о..
Контроль	4.2 ±0,6	-
ГП	7,6 ±1.6*	-
ГП + "Поліфітол-1"	5,1 ± 0,8	-

*- p<0,05 по відношенню до групи контрольних тварин

Результати проведених досліджень свідчать, що при протіканні експериментального гострого панкреатиту в організмі щурів активуються процеси ПОЛ. Дослідження вмісту МДА за гострого панкреатиту проводили у печінці та крові щурів через 6 та 24 год. Кількість МДА збільшувалась із зростанням терміну дослідження і через 24 год зросла в крові в середньому на 69%, а в печінці - 45% (табл.1). На посилення процесів ПОЛ вказує також збільшення інтенсивності хемілюмінесценції плазми крові в середньому в 1,8 разів щодо контролю. Введення тваринам "Поліфітолу-1" на тлі гострого панкреатиту призводить до істотного зниження накопичення МДА в досліджуваних органах та послаблення хемілюмінесценції плазми (табл.1).

При протіканні експериментального гострого панкреатиту визначали також активність ферментів антиоксидантного захисту - СОД та каталази. Виявлено зростання (через 6 та 24 год) активності цих ферментів, причому, через 24 години активність СОД в печінці зросла на 10-15 %, а в крові - на 19-24 % (табл.1). Активність каталази підвищилась в більшій мірі - на 30 та 34% відповідно в печінці та крові. Відомо, що у ранньому періоді протікання запалювального процесу відбувається реактивне компенсаторне зростання антиоксидантної здатності, яке при тривалому запаленні може знижуватись (Блюгер, 1985). Профілактичне застосування "Поліфітолу-1" істотно зменшує активність каталази і СОД, що викликана гострим панкреатитом, в печінці та крові щурів (табл. 1).

Таким чином, фітопрепарат "Поліфітол" зменшує зумовлені гострим панкреатитом порушення окисно-антиоксидантного гомеостазу, що виявляється в нормалізації вмісту ТБК-активних продуктів, каталазної та супероксиддисмутазної активностей в печінці та крові щурів.

Структурний стан мембран еритроцитів і гепатоцитів щурів за експериментального гострого панкреатиту та введенні "Поліфітолу-1".

Оцінка структурного стану мембран гепатоцитів та еритроцитів, що були отримані через 24 год. після розвитку гострого панкреатиту у щурів, проведена на підставі вимірювання флуоресценції зв`язаного з ними від'ємно зарядженого зонда АНС, які характеризують, в основному, стан поверхневого мембранного шару [Владимиров, Добрецов, 1980].

Встановлене (табл. 2) зменшення інтенсивності флуоресценції зв'язаного з мембранами АНС та кількості місць зв'язування АНС (NАНС) за гострого панкреатиту свідчить про порушення фізичних властивостей мембрани [Добрецов, 1989].

Таблиця 2 Спектральні характеристики флуоресцентного зонду АНС, зв'язаного з мембранами гепатоцитів (А) та еритроцитів (Б) щурів за експериментального гострого панкреатиту (ГП) (М±m, n=9)

Умови досліду	Інтенсивність флуоресц. АНС, від. од.	Константа зв'язування (КАНС), 10-4 М-1	Кількість місць зв'язувань (NАНС), нмоль/мг білка	Квантовий вихід флуоресц. (Q) від.од.
Контроль	А	1.0	2.5 0.2	58.0 3.0	1.0
	Б	1.0	3.2 0.3	34.1 2.0	1.0
ГП	А	0.85 0.02*	3.8 0.4*	44.6 3.1*	0.89 0.04
	Б	0.81 0.03*	4.5 0.5 *	24.2 2.1*	0.83 0.03*
ГП+"По-ліфітол-1"	А	0.98 0.02	3.0 0.3	51.2 4.2	0.95 0.01
	Б	0.93 0.03	3.9 0.4	30.0 2.1	0.89 0.01

* - p<0,05 по відношенню до групи контрольних тварин

При цьому, величини константи зв'язування зонду (КАНС) з мембранами зростали незначно. Тобто, в основі зниження флуоресценції АНС при зв'язуванні з мембранами виступає зменшення кількості ділянок зв'язування зонда, можливо в результаті модифікації ліпідної компоненти в області полярних голівок та гліцеринових залишків фосфоліпідів, що може призводити до порушення білок-ліпідних взаємодій, а також за рахунок зростання на поверхні мембран кількості негативно заряджених груп, в результаті накопичення продуктів ПОЛ. Отримані дані є відображенням інтегральних процесів, які обумовлюють структурну модифікацію мембран в результаті протікання гострого панкреатиту. Введення тваринам "Поліфітолу-1", на тлі гострого панкреатиту, призводить до зменшення величин показників, які характеризують структурний стан еритроцитарних та мікросомальних мембран (табл. 2), що пов`язано зі стабілізацією мембранного бішару.

Проникність мембран еритроцитів та гепатоцитів щурів за експериментального гострого панкреатиту

Виявлені зміни в структурі мембран еритроцитів та гепатоцитів можуть призводити до посилення їх проникності. Порушення іонної проникності клітинних мембран є одним із ранніх проявів їх ураження при різних захворюваннях [Барабой, Сутковой, 1997]. Принциповим є порушення проникності для Ca2+, K+ і Na+, враховуючи їх фізіологічне значення для окремої клітини та організму в цілому [Котык, 1980 ].

Оцінку проникності мембран гепатоцитів та еритроцитів для Ca2+, K+ і Na+ проводили в дослідах in vitro, штучно створюючи концентраційний градієнт цих іонів на мембрані, на підставі такого положення, що при його розсіюванні виникає дифузний мембранний потенціал (МП), величина якого обумовлюється проникаючою здатністю мембрани для досліджуваного іону. Знак МП залежить від напрямку розсіювання концентраційного градієнта. Проникну здатність мембран, з урахуванням величини МП та заряду іонів, представляли у відносних одиницях. За 100% приймали проникність мембран еритроцитів чи гепатоцитів для іонів калію.

При вивченні проникної здатності для іонів мембран гепатоцитів, які були отримані із тварин за гострого панкреатиту, встановлено, що при розсіюванні концентраційного градієнту іонів калію, натрію чи кальцію на мембрані виникає дифузний МП більший, ніж в контролі. Проникна здатність мембран для К+ зроста приблизно в 2,8 рази, у порівнянні з контролем, для Na+ - в 2,2 рази, а для Са 2+ - в 1,6 рази (табл.3).

В дослідах з мембранними препаратами еритроцитів, котрі були виділені з тварин за експериментального панкреатиту, проникна здатність для Са 2+, К+ і Na+ збільшувалась в середньому в 2,6; 3,9 та 2,9 разів (табл.3). Підвищення проникної здатності клітинних мембран зростає в ряду Са 2+Na+К+.

Застосування фітопрепарату "Поліфітол-1" зменшувало, викликане панкреатитом, зростання проникності мембран для Са 2+, К+ і Na+ . Однакові величини ефекту зниження проникливості різних мембран для досліджуваних іонів свідчать про неспецифічність дії препарату на мембрани. Таким чином, в результаті протікання гострого панкреатиту порушується іонна проникність мембран, що може обумовлювати ураження систем організму.

Таблиця 3 Відносна проникна здатність мембран гепатоцитів та еритроцитів за експериментального гострого панкреатиту для К+, Na+ і Са 2+ (М m, n = 7)

Іон	Проникна здатність, %
	Контроль	Гострий панкреатит	Гострий панкреатит + "Поліфітол-1"
	Гепатоцити
К+	100	280,6 11,4*	171,4 8,7*
Na+	71,2 6,4	156,6 9,4*	98,7 6,2*
Са 2+	17,5 2,6	31,5 3,1*	21,2 2,6*
	Еритроцити
К+	100	309,6 14,8*	229,6 9,1*
Na+	67,0 5,2	194,5 8,6*	120,8 7,4*
Са 2+	16,6 2,2	43,2 3,6*	28,2 2,4*

* - р < 0,05 відносно контролю

Застосування фітопрепарату "Поліфітол-1" зменшувало, викликане панкреатитом, зростання проникності мембран для Са 2+, К+ і Na+ . Однакові величини ефекту зниження проникливості різних мембран для досліджуваних іонів свідчать про неспецифічність дії препарату на мембрани. Таким чином, в результаті протікання гострого панкреатиту порушується іонна проникність мембран, що може обумовлювати ураження систем організму.

Представлені результати свідчать, що структурно-функціональні зміни мембран можуть бути визначальним чинником при виникненні перебігу гострого панкреатиту. Використання фітопрепарату "Поліфітол-1" призводить до зменшення виявлених порушень.

Мембранотропні властивості фітопрепарату "Поліфітол - 1"

Дослідження мембранотропних властивостей "Поліфітолу-1" було проведено також in vitro на штучних фосфоліпідних мембранах, які формували із азолектину. Виявлена при цьому зміна електричного опору цих мембран при взаємодії з препаратом, вказує на можливість його вбудовування в ліпідний бішар.

Крім того, проведено дослідження взаємодії "Поліфітолу-1" в інших модельних ліпідних системах, зокрема такій, що моделює границю розділу фаз "розчин електроліту - ліпід". Такі характеристики системи, як граничний потенціал, електричний опір і поверхневий натяг, також змінюються в присутності "Поліфітолу-1", що свідчать про здатність препарату взаємодіяти з ліпідним матриксом мембран.

Аналіз результатів, отриманих в різних модельних ліпідних системах, вказує на здатність фітопрепарату "Поліфітол-1" чи/ або певних його складових вбудовуватися в ліпідний матрикс і, таким чином, модифікувати мембрани. Така взаємодія не потребує наявності специфічних білкових рецепторів, а базується на безпосередній взаємодії з ліпідним матриксом мембрани, що, можливо, обумовлює однакову мембранотропну дію фітопрепарату "Поліфітол-1" на мембрани різних клітин організму.

Комплексоутворення "Поліфітолу-1" з солями металів

В подальших дослідженнях вивчалась здатність препарату, а також одного із його компонентів (звіробою) до комплексоутворення з рядом одно- та двохвалентних металів. Визначені величини констант стійкості свідчать, що "Поліфітол-1" утворюює з катіонами металів донорно-акцепторні комплекси різного ступеню стійкості. Величини констант стійкості зростають в ряду:

Na+<Li+<K+<Rb+<Cs+<Be2+<Ca2+<Cd2+<Sr2+<Mg2+<Ba2+< Cu2+<Tl3+<Pb2+<Hg2+

Утворення комплексів "Поліфітолу-1" з катіонами токсичних металів (ртуті, свинцю, талію, барію, стронцію, кадмію, міді, берилію) сприяє їх детоксикації та виведенню з організму. Це узгоджується зі встановленим фактом зниження токсичності солей міді (ІІ) при профілактичному застосуванні "Поліфітолу-1" [Барабой та ін., 2001].

Дослідження процесу накопичення в організмі інкорпорованого 137Cs свідчить (табл.4), що його вміст складав через 1 добу після введення в середньому 70,7%. В подальшому загальний вміст 137Cs у тварин продовжував поступово знижуватися, досягаючи на кінець періоду спостереження (14 доба) 39,9% від введеної кількості. У тварин, які отримували "Поліфітол-1" вже через 1 добу після введення цього радіоізотопу його вміст складав 57,4%. В усі інші строки спостереження рівень 137Cs у тварин, які отримували "Поліфітол-1", був також нижчим щодо контролю. Виявлення факту прискорення виведення з організму радіоізотопу 137Сs при застосуванні "Поліфітолу-1" можна пояснити властивістю цього препарату до комплексоутворення з катіонами цезію.

Таблиця 4 Динаміка вмісту 137Cs у щурів (відсотки від введеної активності) (М m, n=7-8)

Термін дослідження (доба після введення 137Cs)	137Cs	137Cs + "Поліфітол-1"
1	70,62,3	57,41,6*
2	64,72,0	53,01,4*
3	58,21,6	46,71,6*
7	50,42,1	42,01,5*
9	45,32,5	36,61,5*
14	39,81,5	28,20,9*

*- p<0,05 відносно до введеної активності 137Cs

Утворення комплексів з катіонами перехідних металів також може визначати і антиоксидантні властивості "Поліфітолу-1". Цей препарат спроможний не тільки зв'язувати іони металів змінної валентності, а також гальмувати протікання вільнорадикальних реакцій. Отримані результати по дослідженні кінетики індукованої перекиснем водню хемілюмінісценції плазми крові в присутності "Поліфітолу-1" підтверджують його антиоксидантну здатність. Антиоксидантні властивості "Поліфітолу-1" можуть обумовлюватись також наявністю у молекулах його складових компонентів різноманітних за хімічною будовою груп, що здатні утворювати міжмолекулярні донорно-акцепторні комплекси різного ступеню стійкості. В фізіологічних умовах вони можуть взаємоперетворюватись, причому, в більшості випадків працюють співдружньо.

Корекція "Поліфітолом-1" порушень клініко-біохімічних показників у хворих на гострий панкреатит

Клініко-біохімічна оцінка ефективності "Поліфітолу-1" в поєднанні з фармакотерапією та зовнішньою локальною гіпотермією підшлункової залози чи гемосорбцією при лікуванні захворювань підшлункової залози стала подальшим етапом дослідження протизапальних, панкреатопротекторних та антитоксичних властивостей "Поліфітолу-1".

Спостереження були проведені на хворих з набряковою формою гострого панкреатиту, котрі поряд з консервативною терапію отримували фармакологічний препарат "Поліфітол-1" по 10 мл тричі на добу. На 1, 3, 5 та 7 добу від початку лікування у хворих всіх груп визначали в крові біохімічні показники: активність трипсину, інгібітору трипсину, амілази, ліпази, АлТ, АсТ, ГГТ; вміст аміаку, сечової кислоти та загального білірубіну; проводили парамеційний тест.

Отримані дані свідчать, що на фоні фармакотерапії в поєднанні з зовнішньою локальною гіпотермією підшлункової залози чи гемосорбцією спостерігаються позитивні зміни активності амілази крові вже на початку спостереження, тоді як наприкінці - величина цього показника знаходилася в межах норми. Було відмічено також зміни активності трипсину, ліпази, АлТ, АсТ та ГГТ, при відсутні суттєвих змін в активності інгібітору трипсину та вмісту аміаку і білірубіну. Заслуговує на увагу встановлена у даної групи хворих висока токсичність плазми крові, особливо в ранні строки спостереження (1-3 доба).

При призначенні "Поліфітолу-1" на фоні даного лікування спостерігалась нормалізація клініко-біохімічних показників: активності амілази і ліпази, вмісту аміаку, сечової кислоти, а також зниження токсичності плазми крові у даної групи хворих. Крім того, спостерігалась позитивна динаміка клінічного стану хворих: покращення самопочуття, зменшення або зникнення болі, поступове зникнення диспепсичних розладів, явищ панкреатогенної інтоксикації.

Таким чином, поряд із традиційними методами лікування на всіх етапах доцільне використання "Поліфітолу-1", який сприяє нормалізації метаболізму шляхом стабілізації клітинних мембран та структуризації ліпідного матриксу, пригніченню протікання процесів ПОЛ, комплексоутворенню з металами і посилення виведення токсичних речовин та їх метаболітів.

Висновки

Досліджено біохімічні показники та структурний стан мембран гепатоцитів і еритроцитів, а також корекція їх змін фітопрепаратом "Поліфітол-1" за гострого панкреатиту.

З використанням модельних мембранних систем встановлено наявність у "Поліфітолу-1" мембранотропних властивостей, які обумовлені змінами фізичних храктеристик ліпідного бішару (електричного опору, поверхневого потенціалу, проникливості тощо).

Показана здатність препарату "Поліфітол-1" до комплексоутворення з одно - та двохвалентними металами та до прискореного виведення радіоізотопу 137Cs із організму.

Виявлено антиоксидну активність фітопрепарату "Поліфітол-1" та корегуючий вплив препарату на показники окисно-антиоксидантного стану, порушення якого спостерігається за експериментального гострого панкреатиту.

Показано виникнення порушень структурного стану мембран гепатоцитів та еритроцитів за умов експериментального гострого панкреатиту, які обумовлені модифікацією полярних ділянок мембран та протіканням процесів ПОЛ і призводять до зростання проникності цих мембран для іонів калію, натрію та кальцію, вказують на ураження систем організму. В основі корегуючої дії "Поліфітолу-1" є структуризація ліпідного матриксу мембран.

На основі аналізу одержаних клініко-біохімічних показників доведено ефективність використання "Поліфітолу-1" в комплексному лікуванні хворих на запалювання підшлункової залози.

Cписок праць, опублікованих за темою дисертації

1. Барабой В.А., Войціцький В.М., Олійник С.А., Гуніна Л.М., Серкіз Я.І., Векслярський Р.З., Шевченко Л.Ю. Антиоксиданти як засоби корекції метаболічних зрушень у експериментальних тварин, що постійно перебували у Чорнобилі //Вісник Київського університету імені Тараса Шевченка. Біологія. - 2000. - Вип.32. - С.6-8

2. Туманов В.А., Самарська Т.Г., Гуніна Л.Г., Олійник С.А., Горчакова О., Войціцький В.М.,Векслярський Р.З., Гаврилей В.І., Шевченко Л.Ю. Прискорення виведення з організму щурів 137Сs, зміни токсичних властивостей крові та стану еритроцитарних мембран під впливом нового рослинного препарату "Поліфітол-1" // Вісник Київського університету імені Тараса Шевченка. Біологія. - 2001. - Вип.33. - С.6-9.

3. Комаренко Д.І., Олійник С.А., Войтенко Г.М., Войціцький В.М., Шевченко Л.Ю., Скиба В.В., Юрченко В.П., Василенко Л.Г. Оцінка панкреатопротекторної ефективності вітчизняних поліфенольних фітопрепаратів у хворих з запально-некротичними захворюваннями підшлункової залози // Науковий вісник Чернівецького університету. Серія "Біологія". - 2001.- Вип. 126. - С.97-101.

4. Комаренко Д.І., Войтенко Г.М., Скиба В.В., Шевченко Л.Ю., Олійник С.А. Клініко-лабораторна оцінка панкреатопротекторної ефективності вітчизняних поліфенольних фітопрепаратів у хворих з запально-некротичними захворюваннями підшлункової залози // Доповіді НАН України.-2002.- № 5.-С.200-203.

5. Войтенко Г.М., Горчакова Н.О., Олійник С.А., Шевченко Л.Ю., Войціцький В.М., Марушко Ю.В., Кучеренко М.Є. Експериментальна оцінка панкреатопротекторної активності "Поліфітолу-1"//Доповіді НАН України.-2002.-№ 7.-С.174-177.

6. Гунина Л.М., Кабан А.Б., Войцицкий В.М., Шевченко Л.Е. Изменение структурно-функционального состояния мембран эритроцитов у онкологических больных //Тезисы 2-го съезда биофизиков России. - Москва: Из-во РАН. - 1999. - С.665-666.

7. Туманов В.А., Поканевич В.В., Самарська Т.Г., Гуніна Л.М., Олійник С.А., Горчакова Н.О., Шевченко Л.Ю, Гур'янов Б.М. "Поліфітол-1" та "Фітонорм" - перспективні вітчизняні фітопрепарати в умовах радіаційного забруднення довкілля // Збірник наукових праць "Четвертої міжнародної науково-практичної конференції з народної та нетрадиційної медицини."- Київ: Інтермед.- 2002.-С.113-115.

8. Туманов В.А., Олійник С.А., Шевченко Л.Ю., Войтенко Г.М."Поліфітол-1"-фітоантиоксидант та екопротектор. Матеріали науково-практичної конференції з міжнарод. участю "Клінична фармакологія метаболічних коректорів та взаємодія ліків в кліничній практиці"// Вісник Вінницького держ. мед. ун-ту.-2002.-Т.6, №1.-С.225-226.

9. Voitsitsky V.M., Hizhnyak S.V., Shevchenko L.E., Veksklyarsky R.Z., Oleynik S.A. Membrane-modulating properties of phytodrug "Polyphytol-1" // International conference "New technologies of obtaining and application of biologically active substances", Alushta: Crimea Scientific Center.- 2002. - C.135-136

Размещено на Allbest.ru

...