Функціональна активність та імуногенність тропоміозин-тропонінового комплексу кардіоміоцитів при дилатаційній кардіоміопатії

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут молекулярної біології і генетики

Автореферат

Функціональна активність та імуногенність тропоміозин-тропонінового комплексу кардіоміоцитів при дилатаційній кардіоміопатії

Федоркова Ольга Михайлівна

Київ - 2003

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор,

академік НАН України

Мацука Геннадій Харлампійович,

Інститут молекулярної біології і генетики

НАН України,

Почесний директор.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Козлов Едуард Андрійович,

Інститут молекулярної біології і генетики

НАН України,

провідний науковий співробітник відділу

механізмів трансляції генетичної інформації;

доктор біологічних наук, професор

Мірошниченко Микола Степанович,

Київський національний університет імені Тараса

Шевченка, завідувач кафедри біофізики.

Провідна установа: Інститут біохімії імені О.В. Палладіна НАН України, м.Київ.

Захист дисертації відбудеться "28" жовтня 2003 року о 10.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.237.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України (м.Київ 03143, вул. Заболотного, 150).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: м.Київ 03143, вул. Заболотного, 150.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Перспективним напрямком молекулярної біології сьогодні є вивчення структурно-функціональних порушень білків при розвитку патологій. Патології серцево-судинної системи - одна з основних причин смертності. Останнє десятиріччя характеризується бурхливим вивченням молекулярно-генетичних основ серцевих хвороб людини. Геномні дослідження дилатаційної кардіоміопатії (ДКМП) та інших кардіоміопатій лягли в основу "генетичної кардіології" - генетичного картування, що включає пошук кандидатних генів при цих патологіях. Встановлено, що близько 20-30% випадків ДКМП пов'язані з мутаціями в генах саркомерних та цитоскелетних білків кардіоміоцитів (Kelly, 1994; Berko, 1987; Olson, 1998; Kamisago, 2000). Проте причини виникнення й розвитку ДКМП у переважної більшості хворих до цього часу остаточно не встановлені. Саме тому молекулярні основи порушень функціонування міокарда є важливим пріоритетом у дослідженні ДКМП.

ДКМП - найрозповсюдженіша серед інших кардіоміопатій. Хвороба характеризується дилатацією (розширенням) та погіршенням здатності до скорочення лівого або двох шлуночків серця, прогресуючим погіршенням симптомів серцевої недостатності, зниженням фракції викиду крові до 15-20 % від норми та є однією з основних причин для пересадки серця (Mestroni, 1994). При ДКМП виявлено цілий ряд антигенів, до яких у сироватці крові хворих підвищується рівень аутоантитіл (Limas, 1997). Одним із головних аутоантигенів вважається кардіоспецифічна ізоформа міозину міокарда - основного скоротливого білка саркомера, але практично немає даних щодо регуляторних білків міофібрили - тропоміозину (ТМ) та тропонінового комплексу (ТН). Відомо, що порушення регуляції скорочення міофібрили може призводити до різних патологічних станів організму людини і що при ДКМП різко падає скорочувальна здатність міокарда (Report of 1995 WHO/ISFC,1996). Оскільки ТМ-ТН білковий комплекс є основним ланцюгом у регуляції скорочення міофіламентів м'язових клітин міокарда, то питання щодо прояснення молекулярних механізмів його функціонування є актуальним для встановлення причин розвитку ДКМП у людини.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано за бюджетною темою 2.2.4.26 ”Дослідження особливостей розвитку аутоімунних процесів при деяких серцево-судинних захворюваннях” відділу структури та функцій нуклеїнових кислот ІМБіГ НАН України 1996-2000 рр. (№ держреєстрації 0196U005250).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було вивчення молекулярних основ функціональної активності та виявлення особливостей імуногенності тропоміозин-тропонінового регуляторного комплексу міокарда людини при розвитку ДКМП.

Для досягнення мети необхідно було вирішити такі завдання:

виділити функціонально активні білки - ТМ і ТН - із міокарда людини, яка загинула внаслідок захворювання на ДКМП;

- з'ясувати можливі порушення функції регуляторного комплексу при ДКМП, шляхом дослідження його впливу на АТРазну активність кардіального актоміозину (АМ) за умов присутності та відсутності кальцію;

- порівняти імуногенність ТМ таТН, виділених із міокарда хворого на ДКМП з такими ж білками, виділеними із міокарда практично здорової людини; міокард кардіоміопатія кардіоміоцит білок

- дослідити вплив антитропонінових аутоантитіл з сироваток хворих на ДКМП на АТРазну активність кардіального АМ;

- проімунізувати піддослідних лабораторних тварин (миші лінії Вalb/с) найбільш імуногенними з досліджуваних білків для того, щоб спробувати індукувати ДКМП-подібне захворювання у піддослідних тварин та дослідити вплив імунізації на розвиток очікуваного індукованого аутоімунного ураження міокарда;

- визначити кількісний вміст шаперону Hsp70 як одного з головних факторів згортання білка в кардіоміоцитах при ДКМП у людини.

Об'єкт дослідження - молекулярні механізми, що призводять до розвитку ДКМП у людини.

Предмет дослідження - кардіальні регуляторні білки - ТМ та ТН, виділені із міокарда людини.

Методи дослідження - метод електрофорезу білків у поліакриламідному гелі (ПААГ) в денатуруючих умовах було використано для перевірки чистоти отриманих білкових препаратів. Твердофазний імуноферментний аналіз та імуноблотинг було застосовано для порівняльного дослідження імуногенності регуляторних білків із дилатаційного та здорового міокардів. Методом імуноблотингу визначали кількісний вміст шаперону Hsp70 у цитоплазмі кардіоміоцитів людини на останній стадії розвитку ДКМП. Метод реконструкції скоротливого апарату із його складових структурних та регуляторних компонентів використовували для вивчення функціональної активності регуляторного блоку при ДКМП. Методами іонообмінної та афінної хроматографії проводили виділення із сироватки крові хворих на ДКМП імуноглобулінів класу G (IgG), моноспецифічних до тропоніну. Морфологічне дослідження міокарда мишей, яких імунізували ТН, виділеним із міокарда хворого на ДКМП, проводили для встановлення можливих аутоімунних порушень в організмі піддослідних тварин.

Наукова новизна одержаних результатів.

1.Вперше продемонстровано зміни у функціональній активності регуляторних білків (ТМ іТН) скоротливого апарату кардіоміоцитів у хворих на ДКМП.

2.Встановлено, що для ДКМП характерним є підвищення імуногенності кардіального ТН.

3.Вперше показано, що при ДКМП в сироватці крові накопичуються антитропонінові антитіла, які мають біологічну активність на відміну від антитропонінових антитіл здорових осіб.

4.Виявлено різке зниження кількості шаперону Hsp70 у кардіоміоцитах на останніх етапах розвитку ДКМП.

5. Запропоновано оригінальну гіпотетичну молекулярну модель, в основі якої лежить уявлення про конформаційні зміни ТН при ДКМП.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані в дисертації дані розширюють і поглиблюють уявлення щодо молекулярних механізмів розвитку ДКМП. Зниження АТРазної активності актоміозину (АМ) міокарда при ДКМП з одночасними змінами функціональної активності регуляторних білків свідчать про те, що за умов такої патології мають місце порушення на рівні скоротливого апарату кардіоміоцитів. Припускається, що такі порушення певним чином пов'язані з підвищенням імуногенності ТН та різким зниженням кількості шаперону Hsp70 у хворих. Різке зменшення кількості Hsp70 при ДКМП може призводити до появи білків з неправильною конформацією, що призводить до запуску аутоімунних реакцій.

Підвищення імуногенності ТН міокарда, поява в сироватці хворих антитропонінових антитіл з біологічною активністю, яка відрізняється від такої антитропонінових антитіл із сироваток здорових донорів, свідчать про певні конформаційні зміни у структурі цих регуляторних білків при ДКМП. Реєстрація таких конформаційних змін ТН із дилатаційного міокарда може бути одним із діагностичних критеріїв розпізнавання цієї хвороби, а також основою для розробки хворобоспецифічних методів лікування та профілактики.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційну роботу було виконано під керівництвом д.б.н., професора, академіка НАН України Г.Х. Мацуки. Здобувачем особисто проаналізовано літературні дані за темою дисертаційної роботи, проведено виділення ТМ та АМ із різних видів патологоанатомічного матеріалу людини та АМ із міокарда бика. Проведено експерименти із перевірки імуногенності ТМ та ТН (імуноферментний аналіз та імуноблотинг). Виділено моноспецифічні антитропонінові антитіла із сироваток хворих на ДКМП людей та сироваток здорових донорів. Виконано роботу із визначення впливу моноспецифічних антитропонінових антитіл на АТРазну активність чутливого до кальцію міокардіального АМ. Автором здійснено імунізацію піддослідних мишей ТН та визначено кількісний вміст шаперону Hsp70 в цитоплазмі кардіоміоцитів людини.

Здобувач висловлює подяку за допомогу у виділенні ТН та проведенні дослідів із вивчення функціональної активності ТМ та ТН при розвитку ДКМП (реконструкція скоротливого апарату із його складових АМ та ТМ-ТН блоку і постановка АТРазної реакції) співробітникам відділу біофізики Науково-дослідного інституту фізіології імені Петра Богача Київського національного університету імені Тараса Шевченка к. б. н., с. н. с. Даниловій В.М. та к. б. н., с. н. с. Трегубову В.С.

Планування та проведення експериментів, обговорення, аналіз, інтерпретацію отриманих експериментальних даних, а також підготовку частини публікацій до друку проводили разом із к. б. н., с. н. с. Сидорик Л.Л., д.мед.н. Рябенком Д.В., к.б.н., с.н.с. Даниловою В.М., к.б.н., с.н.с. Трегубовим В.С. та м.н.с. Бобиком В.І. Усім цим фахівцям автор висливлює щиру вдячність.

Клінічне обстеження хворих, сироватки яких досліджувалися в роботі, проводилось у відділенні серцевої недостатності Інституту кардіології ім. М.Д.Стражеска АМН України д.мед.н., с.н.с. Рябенком Д.В.

Морфологічні дослідження міокарда піддослідних мишей проводили у відділенні патоморфології Інституту кардіології ім. М.Д.Стражеска АМН України к. мед. н., пров. н. с. Сергієнко О.В. та ст. лаборантом з вищою освітою Труніною І.В.

Апробація результатів дисертації. За результатами роботи зроблено доповіді на Ювілейній науковій конференції, присвяченій 165-річчю Київського національного університету імені Тараса Шевченка (16, 17 вересня 1999 року), на Конференції молодих вчених в ІМБіГ НАН України (20-22 вересня 2001 року), 31-й щорічній конференції Європейської спілки м'язових досліджень (Люнтерен, Нідерланди, 2002 рік). Отримані наукові дані доповідалися та обговорювалися на наукових семінарах відділу структури і функцій нуклеїнових кислот ІМБіГ НАН України.

Публікації. За результатами дисертаційної роботи опубліковано 5 статей та тези 2 доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, 4 розділів основної частини, висновків та списку використаних літературних джерел. Роботу викладено на 123 сторінках. Вона містить 26 рисунків, 8 таблиць. Список літератури охоплює 164 бібліографічних посилання.

Основний зміст

Матеріали та методи дослідження. ТМ із міокарда людини, яка загинула від ДКМП, та із міокарда практично здорової людини, яка загинула внаслідок нещасного випадку, виділяли за методом Міше (Mische, 1987) з модифікаціями. В результаті наших модифікацій, по-перше, було зменшено кількість промивок м'язового фаршу, по-друге, у кожний розчин було додано інгібітор протеаз фенілметилсульфонілфторид у концентрації 0,2 мМ, що значно підвищило вихід, чистоту та активність одержаних препаратів. ТН із міокарда людини, яка загинула внаслідок ДКМП, із міокарда особи, яка померла внаслідок ішемічної кардіоміопатії (ІКМП), та із міокарда практично здорової людини, яка загинула в результаті нещасного випадку, виділяли за методом Барської та Гусєва (Барская, Гусев, 1981) із модифікаціями. Модифікації були такі ж, як і при виділенні ТМ. Препарати АМ виділяли з міокарда бика та людини за методом Маргосин (Margossian, 1985).

Чистоту білкових препаратів перевіряли методом електрофорезу в поліакріламідному гелі (ПААГ). Електрофорез отриманих білкових препаратів проводили у 12% та 14,5% ПААГ за методом Собешек (Sobieszek, 1994), а також у грaдієнті концентрації (7-22%) ПААГ за Леммлі (Laemmli, 1970). Концентрацію білків визначали за методом Бредфорд (Bradford, 1976) та спектрофотометрично. Твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA) було застосовано для порівняльного дослідження імуногенності регуляторних білків із дилатаційного та здорового міокардів. Методом імуноблотингу визначали кількісний вміст шаперону Hsp70 у цитоплазмі кардіоміоцитів людини на останній стадії розвитку ДКМП. Метод реконструкції скоротливого апарату із його складових структурних (АМ) та регуляторних компонентів розроблено і використовано для дослідження функціональної активності цієї системи. АТРазну активність АМ визначали за кількістю відщепленого ферментом неорганічного фосфату (Р_i ) у перерахунку на міліграм білка за хвилину (нмоль Р_i x мг білка^-1 х xв^-1). Кількість відщепленого Р_i визначали за методом Кодами (Kodama, 1986) та Фіске і Суббароу (Fiske, Subbarow, 1925). Методами іонообмінної та афінної хроматографії проводили виділення із сироватки крові хворих на ДКМП IgG моноспецифічних до ТН. Перевіряли можливу біологічну активність моноспецифічних до ТН IgG шляхом визначення їхнього впливу на АТРазну активність чутливого до кальцію кардіального АМ. Морфологічне дослідження міокарда мишей, яких імунізували ТН, виділеним із міокарда хворого на ДКМП, проводили для встановлення можливих аутоімунних порушень в організмі піддослідних тварин. При статистичній обробці результатів дослідження використовували пакет статистичних програм “STATISTICA for Windows 5.1”. Для оцінки достовірності різниці показників використовували t-критерій Ст'юдента. Значення р<0,05 розглядали як критерій достовірності різниці.

Результати досліджень та їх обговорення. Виділення міокардіального ТМ та визначення імуногенності ТМ кардіоміоцитів людини при розвитку ДКМП. Застосований і модифікований нами метод виділення препаратів ТМ із міокарда людини дозволив отримати достатню для виконання подальших досліджень кількість очищеного препарату білка (рис.1).

Ступінь імуногенності досліджуваних ТМ визначали методом твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA). Всього було тестовано сироватки 62 хворих на ДКМП. Як контроль брали сироватки 21 практично здорового донора. Результати дослідження імунореактивності сироваток хворих проти ТМ із здорового та ураженого ДКМП міокардів наведено на рис.2. Функціонально ТМ відіграє важливу роль у регуляції взаємодії головок міозину з глобулами актину залежно від концентрації кальцію у цитозолі. Як видно з рис.2, імуногенність ТМ не змінюється при ДКМП`, принаймі рівень імунної відповіді за даними імуноферментного аналізу проти ТМ із різних міокардів (ушкодженого ДКМП та нормального) у сироватках крові хворих на ДКМП та у практично здорових людей достовірно не відрізняється.

Як відоио із літературних даних, в гені серцевого ТМ не виявлено мутацій при ДКМП. Ці дані, а також отримані нами результати щодо низької імуногенності цього білка можуть свідчити про відсутність структурних змін в ТМ при цій серцевій патології.

Виділення ТН з міокарда людини і визначеня його імуногенності. ТН виділяли із міокарда людини з різним функціональним станом: практично здорової людини, людини хворої на ДКМП та хворої на ІКМП. Останню, як більш розповсюджену і краще досліджену, використовували для порівняння. Для очищення та ідентифікації ТН використовували методи іонообмінної хроматографії та гель-електрофорезу. Типовий профіль елюції ТН при хроматографічній очистці на DEAE-сефарозі і результати електрофорезу наведено відповідно на рис. 3 та рис. 4. Як видно з даних електрофоретичного розділення субодиниць ТН, отриманого із різного патологоанатомічного матеріалу, вони практично не відрізняються за молекулярною масою. Відносна молекулярна маса окремих субодиниць тропоніну, за даними електрофорезу, становить для ТН Т - 38 кДа, ТН І - 22 кДа, ТН С - 18 кДа, що збігається з літературними даними.

Результати дослідження методом ELISA рівня аутоантитіл проти ТН в сироватках крові обстежених людей наведено в табл.1 та на рис.5. Було проскриновано сироватки 62 хворих на ДКМП, сироватки 34 хворих на ІКМП та сироватки 21 практично здорового донора. Групи хворих на ДКМП та на ІКМП практично не відрізнялися за такими вихідними показниками як кінцевий систолічний і кінцевий діастолічний об'єми міокарда та фракція викиду крові.

Із наведених результатів видно, що титри аутоантитіл проти всіх трьох антигенів були достовірно вищі (р<0,05) у сироватках крові хворих на ДКМП та ІКМП при порівнянні з аналогічними показниками у групі здорових донорів. Найвищий рівень аутоантитіл виявлено у хворих на ДКМП. У цих пацієнтів відсоток перевищення рівня АТ (Д %) над аналогічними показниками здорових донорів складав: 75,9 - для ТН з міокарда хворого на ДКМП; 57,9 - для ТН з міокарда хворого на ІКМП та 48,3 - для ТН зі здорового міокарда, та був достовірно вище (р<0,05), ніж аналогічні показники в групі ІКМП.

Таблиця 1

Рівень циркулюючих антитіл до ТН з міокарда хворого на ДКМП, ТН з міокарда хворого на ІКМП і ТН з міокарда практично здорової людини у сироватках хворих на ДКМП (62 особи), ІКМП (34 особи) та здорових донорів (21 особа)

Тропонін	Рівень циркулюючих антитіл, одиниці оптичної густини
	Хворі на ДКМП	Хворі на ІКМП	Здорові донори
З міокарда ДКМП	0,172+0,016*#	0,144+0,007*	0,104+0,007
З міокарда ІКМП	0,126+0,009*#	0,105+0,004*	0,086+0,005
Із здорового міокарда	0,086+0,005*#	0,075+0,003*	0,060+0,004

Примітка. Різниця показників достовірна (p<0,05) при порівнянні з такими ж значеннями: *- у здорових донорів, # - у хворих на ІКМП.

Порівняльний аналіз показав, що найбільш імуногенним є ТН, який виділено з міокарда хворого на ДКМП. Рівні циркулюючих аутоантитіл у всіх трьох групах були достовірно вище (р<0,05) до ТН з міокарда хворого на ДКМП.

Отримані дані свідчать про те, що найбільш висока імунна відповідь була характерна для хворих на ДКМП при порівнянні з хворими на ІКМП. За даними ELISA ТН із міокарда хворого на ДКМП був найбільш імуногенним.

Дослідження функціональної активності ТН міокарда людини в нормі та при захворюванні на ДКМП. Для дослідження можливих змін функціональної активності ТН при ДКМП ми застосували оригінальний метод реконструкції скоротливого апарату кардіоміоциту із структурних (АМ) і регуляторних (ТМ-ТН) білків. У цих дослідах ми використовували десенситизований АМ, тобто такий АМ, який не був чутливим до кальцію. Проводили порівняльні дослідження змін чутливості до кальцію АМ при додаванні комплексу регуляторних білків із нормального та патологічного міокарда.

Перш за все варто підкреслити, що при додаванні ТМ-ТН комплексу до десенситизованого АМ його чутливість до кальцію відновлювалася (рис. 6), але вона залежала від того, який регуляторний комплекс використовували для реконструкції скоротливого апарату. Нами показано, що регуляторний комплекс із міокарда хворого на ДКМП у безкальцієвому середовищі достовірно пригнічував АТРазну активність АМ порівняно з регуляторним комплексом нормального міокарда (рис. 6). Саме такий "патологічний" регуляторний комплекс надавав реконструйованій скоротливій системі більшої чутливості до кальцію (рис. 7). У кальцієвому середовищі АТРазна активність практично не залежала від походження регуляторного комплексу (рис. 6).

З наведених даних також видно, що при ДКМП відбувається значне зниження питомої АТРазної активності серцевого АМ порівняно з таким же показником для АМ нормального міокарда.

Таким чином, нами встановлено, що підвищена імуногенність ТН кардіоміоцитів за умов патології супроводжується змінами його функціональної активності, зокрема здатності підвищувати чутливість до кальцію реконструйованого скоротливого апарату, що може свідчити про зміни в структурній організації ТН, але не ТМ, оскільки останній має низьку імуногенність.

Дослідження впливу моноспецифічних антитропонінових аутоантитіл на АТРазну активність серцевого АМ. Для вивчення можливого впливу антитропонінових аутоантитіл на АТРазну активність кардіального АМ (біологічна активність антитіл) аутоантитіла були очищені з найбільш імунореактивних (за результатами ELISA) сироваток методами колонкової хроматографії на DEAE-Tyopearl, Protein-G-сефарозі та афінній колонці з пришитим дилатаційним ТН. Як контроль брали декілька сироваток практично здорових донорів. З кожним етапом очистки підвищувалась як чистота препаратів імуноглобулінів, так і їхня афінність (тестована за методом ELISA).

Визначали вплив антитропонінових аутоантитіл хворих на ДКМП на АТРазну активність АМ з міокарда бика. Останній є зручною моделлю для подібних досліджень. ТМ і ТН у процесі виділення не видалялися з цих препаратів АМ, тобто АМ не втрачав чутливості до кальцію. АМ та антитропонінові IgG людини (10, 15 або 25 мкг, відповідно) змішували у 20 мМ імідазольному буфері (рН-7,5) і витримували протягом 30 хвилин при кімнатній температурі (+20⁰С), після чого вимірювали АТРазну активність АМ. Результати визначення АТРазної активності АМ подано в табл.2.

Таблиця 2

Вплив моноспецифічних антитропонінових аутоантитіл на АТРазну активність чутливого до кальцію кардіального АМ

Препарат	АТРазна активність АМ у нмоль Рі х мг білка -1 х хв-1.	Чутливість до Са 2+ (%)
	Кальцієве середовище (10 -4 М CaCl2)	Безкальцієве середовище (10 -3 M ЕГТА)
АМ	94,4+5,05	25,8+1,25	72,6+4,450
АМ+ 10 мкг IgG зд	97,8+2,27	27,8+0,99	71,6+6,01
АМ+ 15 мкг IgG зд	96,2+3,34	27,8+3,56	71,1+6,78
АМ+ 25 мкг IgG зд	101,7+5,0	31,1+1,57	69,4+4,45
АМ+ 10 мкг IgG д	117,2+6,67*	52,6+7,12*	55,1+4,01*
АМ+ 15 мкг IgG д	123,6+1,8*	60,3+4,09*	51,2+3,33*
АМ+ 25 мкг IgG д	161,4+6,8*	99,6+2,25*	38,3+0,55*

*- достовірна різниця з аналогічним показником для АМ (р<0,01)

IgG д - аутоантитіла, які очищені з найбільш імунореактивних сироваток хворих на ДКМП;

IgG зд - аутоантитіла, які очищені з пулу сироваток здорових донорів;

АМ - чутливий до кальцію актоміозин міокарда бика;

ЕГТА - етиленгліколь-біс (2-аміноетиловий ефір)- N,N,N',N'- тетраоцтової кислоти.

Активуючий вплив антитропонінових аутоантитіл, виділених саме з сироваток хворих на ДКМП, є досить цікавим результатом. Він може свідчити про те, що антитропонінові антитіла при зв'язуванні зі своїми епітопами на чутливому до кальцію АМ здатні так модифікувати його структуру, що фермент набуває здатності ефективніше розщеплювати АТР in vitro.

Звичайно, не можна прямо екстраполювати ці результати на процеси, що відбуваються in vivo в серцевому м'язі. Донедавна вважалося, що антитіла не здатні проникати в клітини і взаємодіють з ними тільки на рівні поверхневих рецепторів. Але в останні роки опубліковано ряд праць, в яких продемонстровано здатність імуноглобулінів проникати через цитоплазматичну мембрану та впливати на процеси, що відбуваються в цитоплазмі та ядрі. Тому однозначно не можна нехтувати здатністю аутоантитіл проникати в кардіоміоцити при ДКМП та впливати на їхнє функціонування.

Морфологічні особливості міокарда мишей, що зумовлені імунізацією ТН. Для встановлення участі дилатаційного ТН у розвитку аутоімунної патології, проводили експериментальну імунізацію мишей лінії Balb/c цим білком. Раніше в нашій лабораторії було продемонстровано, що імунізація мишей цієї лінії викликала розвиток у них гістологічних порушень міокарда, подібних до ДКМП у людини. В нашому випадку, морфологічне дослідження міокарда тварин не виявило ДКМП-подібних гістологічних порушень (табл.3).

Між міокардом мишей, що їх імунізували дилатаційним ТН з повним ад'ювантом Фрейнда (АФ) та контрольною групою тварин, яку імунізували тільки АФ, достовірну різницю (р<0,001) зафіксовано тільки при підрахунку відносного об'єму міоцитарних змін кардіоміоцитів. Такий результат свідчить про те, що при імунізації мишей дилатаційним не розвиваються гістологічні зміни, які характерні для ДКМП. Специфічних незворотних змін кардіоміоцитів, які характерні для ДКМП, при імунізації дилатаційним ТН не виявлено.

Таблиця 3

Відносний об'єм (%), який займають кардіоміоцити з різними типами ушкодження у міокарді мишей на 21-й день після їхньої імунізації дилатаційним ТН людини (ТН д) та АФ

Групи тварин	Типи ушкоджень кардіоміоцитів (% площі препаратів)
	Контрактурні ушкодження	Резорбції контрактур	Локальний кардіосклероз	Міоцитарні зміни
АФ	1,32 + 0,39	--	--	0,12 + 0,09
ТН д	1,32 + 0,31	--	--	1,00 + 0,27*

* - достовірність різниці з аналогічними показниками в групі АФ (p<0,001).

Визначення кількісного вмісту шаперону Hsp70 у кардіоміоцитах людини при розвитку ДКМП. Порушення згортання білків може призводити до розвитку багатьох хвороб людини. Враховуючи отримані нами дані щодо зміни імуногенності та функціональної активності ТН при ДКМП, ми висунули припущення про можливі зміни в кількісному рівні та/або функціональній активності одного з основних кардіопротекторних шаперонів - Нsp70.

Для перевірки цього припущення ми визначали вміст шаперону Нsp70 в цитоплазматичних фракціях кардіоміоцитів шлуночків нормального та ураженого ДКМП міокардів людини методом імуноблотингу. В експерименті використовували антитіла проти рекомбінантного білка, отриманого за допомогою експресії гена DnaK (бактеріального гомолога еукаріотичного Hsp70). Хоча й відомо, що усі представники сімейств шаперонів від бактерій до ссавців мають високу гомологію, необхідно було показати імунохімічний перехрест Hsp70 у різних організмів. На рис.9 наведено дані щодо імунореактивності антитіл проти Hsp70 в лізатах міокардів (цитоплазматичні фракції) представників різних сімейств ссавців (від миші до людини). Ці антитіла розпізнавали поліпептид з молекулярною масою біля 70 кДа в міокардіальних лізатах миші, кроля, бика та людини. Ці дані, а також дані літератури про високу гомологію Hsp70 у різних організмів (від бактерій до ссавців) дозволяють використовувати антитіла проти рекомбінантного DnaK при дослідженні експресії Hsp70 при ДКМП у людини.

У роботі досліджували вміст шаперону в цитоплазмі кардіоміоцитів. Встановлено, що кількість Hsp70 різко падає на останніх етапах прогресії ДКМП в цитоплазматичній фракції кардіоміоцитів (рис.10, доріжки 4-6) при порівнянні з таким у здорових донорів (рис.10, доріжки 1-3).

Відомо, що кардіоміоцит - це клітина, яка знаходиться на кінцевій стадії диферинціації і не може ділитися. Кардіоміоцит росте протягом всього життя людини, що супроводжується постійним рівнем біосинтезу білка. Одним із важливих компонентів білкового пулу в кардіоміоциті є Hsp70. Падіння рівня експресії Hsp70 може призвести до апоптотичної загибелі кардіоміоцитів, що характерна для ДКМП, із загальним падінням рівня біосинтезу білка в кардіоміоцитах при цій патології.

Внаслідок зниження кількості Hsp70 в кардіоміоциті при ДКМП можуть з'являтися неправильно укладені білки. Зміна конформації власних білків є сигналом для імунної системи і вона починає розпізнавати неправильно укладені власні білки як чужі. Можливо, при ДКМП відбувається презентація неправильно укладеного ТН антигенопрезентуючими клітинами і, як наслідок, підвищується рівень антитропонінових антитіл. Відомо, що при індукції міокардиту в піддослідних мишей підвищується рівень молекул основного комплексу гістосумісництва II в комплексі з міозином в міокарді, а міокардит часто передує розвитку ДКМП у людини.

Таким чином, з одного боку, нами показано підвищення імуногенності ТН при ДКМП, виявлено зміни у його функціональній активності і продемонстровано, що моноспецифічні до дилатаційного ТН аутоантитіла здатні підсилювати АТРазну активність АМ. З іншого боку - виявлено різке зниження рівня експресії Hsp70 в цитоплазмі кардіоміоцитів. На основі одержаних даних та аналізу даних літератури ми пропонуємо гіпотетичну молекулярну модель конформаційних змін ТН кардіоміоциту при розвитку ДКМП у людини. Згідно з цією моделлю, зафіксоване нами зниження вмісту Hsp70 при ДКМП може бути причиною конформаційних змін кардіальних білків, зокрема ТН.

Але залишається незрозумілим, які саме конформаційні зміни відбуваються в ТН при ДКМП. Не викликає сумнівів те, що значну частину хворих з набутою формою ДКМП можна розглядати як осіб з аутоімунною органоспецифічною патологією. Тому пошук хворобоспецифічних аутоантигенів є надзвичайно важливим не тільки для встановлення етіології ДКМП, але й для розробки діагностикумів виявлення хвороби на ранніх стадіях її розвитку та терапевтичних засобів її запобігання. Вперше виявлене нами підвищення імуногенності ТН із дилатаційного міокарда може бути основою для діагностичних критеріїв розпізнавання цієї хвороби, отримання хворобоспецифічних методів лікування та профілактики.

Подальший прогрес у розв'язанні питання, що ж все-таки є пусковим механізмом у виникненні аутоімунної ДКМП, буде пов'язаний із розкриттям точної фізіологічної ролі молекулярних перебудов скоротливого апарату кардіоміоциту. Можливо, що зусилля потрібно зосередити на поглибленому вивченні конформаційних змін кардіоспецифічного ТН та його окремих субодиниць.

Висновки

У дисертаційній роботі досліджено молекулярні механізми, що задіяні у розвитку такої аутоімунної органоспецифічної патології людини як дилатаційна кардіоміопатія (ДКМП), і встановлено, що певну роль у цьому відіграють структурно-функціональні зміни регуляторних білків скоротливого апарату міокарда, зокрема тропонінового комплексу.

1. Розроблено метод реконструкції скоротливого апарату кардіоміоцитів із окремих структурних та регуляторних білків, для чого адаптовано і модифіковано стосовно міокарда людини існуючі методи виділення препаратів тропоміозину і тропонінового комплексу.

2. Досліджено імуногенність регуляторних білків міокарда в нормі і при дилатаційній кардіоміопатії і встановлено, що при патології імуногенність тропоміозину не змінюється, а імуногенність тропонінового комплексу підвищується порівняно з нормою.

3. Підвищена імуногенність тропонінового комплексу кардіоміоцитів при патології супроводжується змінами його функціональної активності, зокрема здатності підвищувати чутливість до кальцію реконструйованого скоротливого апарату, що може свідчити про конформаційні зміни в структурі окремих тропонінових субодиниць.

4. Показано, що тропоніновий комплекс із дилатаційного міокарда достовірно інгібує АТРазну активність актоміозину в безкальцієвому середовищі.

5. Виявлено, що моноспецифічні до дилатаційного тропоніну антитіла з сироваток крові хворих на ДКМП мають активуючий вплив на АТРазну активність кардіального актоміозину і, можливо, можуть відігравати певну роль у патогенезі дилатаційної кардіоміопатії.

6. Морфологічні зміни, які спостерігаються у міокарді піддослідних тварин після імунізації дилатаційним тропоніном, не є характерними для дилатаційної кардіоміопатії.

7. Встановлено, що однією з можливих причин конформаційних змін тропонінового комплексу при дилатаційній кардіоміопатії може бути порушення роботи шаперону Hsp70.

8. Запропоновано гіпотетичну модель розвитку ДКМП, в основі якої лежить уявлення про конформаційні зміни тропонінового комплексу за рахунок зниження кількості шаперонів.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Сидорик Л.Л., Федоркова О.М., Ковеня Т.В., Бобык В.И., Роднин Н.В., Мацука Г.Х. Структурно-функциональное изучение тропомиозина миокарда как аутоантигена при дилатационной кардиомиопатии // Биополимеры и клетка.-1998.- Т.14, №3.-С.203-209.

Особистий внесок дисертанта - виділення препаратів тропоміозину з міокарда, проведення твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA) та імуноблотингу. Аналіз, інтерпретація отриманих результатів та підготовка статті до друку здійснені разом зі співавторами.

2. Сидорик Л.Л., Федоркова О.М., Рябенко Д.В., Бобык В.И., Данилова В.М., Трегубов В.С., Мацука Г.Х. Сравнительное исследование иммунореактивности тропонинового комплекса при дилатационной и ишемической кардиомиопатиях // Биополимеры и клетка.-2000.- Т.16, №1.-С.40-45.

Особистий внесок дисертанта - виділення препаратів тропонінового комплексу із міокардів, проведення твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA) та підготовка статті до друку.

3. Федоркова О.М., Ковеня Т.В., Бобык В.И., Рябенко Д.В., Данилова В.М., Трегубов В.С., Сидорик Л.Л., Мацука Г.Х. Изучение молекулярних механизмов функционирования кардиомиоцитов при дилатационной кардиомиопатии на модели реконструированной миофибриллы миокарда млекопитающих// Биополимеры и клетка.-2000.- Т.16, №5.-С.425-429.

Особистий внесок дисертанта - виділення препаратів актоміозину, тропоміозину та тропонінового комплексу із міокардів людини, розробка методики реконструкції скоротливого апарату кардіоміоцитів та проведення реконструкції, визначення АТРазної активності реконструйованих комплексів. Аналіз, інтерпретація отриманих результатів та підготовка статті до друку здійснені разом зі співавторами.

4. Федоркова О.М., Бобык В.И., Рябенко Д.В., Данилова В.М., Мацука Г.Х., Сидорик Л.Л. Изучение биологической активности антитропониновых антител при дилатационной кардиомиопатии // Біополімери і клітина.-2003.- Т.19, №3. - С.295-297.

Особистий внесок дисертанта - виділення препаратів тропонінового комплексу та антитропонінових антитіл із сироваток крові хворих на ДКМП та здорових людей. Отримання чутливого до кальцію актоміозину з міокарда бика та перевірка біологічної активності антитропонінових антитіл. Підготовка статті до друку. Аналіз та інтерпретація отриманих результатів здійснені разом зі співавторами.

5. Сидорик Л.Л., Рябенко Д.В., Федоркова О.М., Вигонтина О.Г., Бобык В.И., Рибкинска Т.А., Коваленко В.Н., Мацука Г.Х. Изменение уровня экспрессии шаперона Hsp70 при дилатационной кардиомиопатии // Український кардіологічний журнал.-2002.-№5.- С.59-62.

Особистий внесок дисертанта - виділення мітохондрій та цитоплазматичної фракції кардіоміоцитів, визначення вмісту шаперону Hsp70 в цитоплазматичній фракції методом імуноблотингу та підготовка статті до друку.

6. Fedorkova O., Bobyk V., Ryabenko D., Danilova V., Tregubov V., Sidorik L., Matsuka G. Immunoreactivity and functional activity of cardiomyocite tropomyosin-troponin complex at human dilated cardiomyopathy // Conference for students, PhD students and young scientists "Molecular biology and genetics". - Kyiv (Ukraine).-2001.-P.140.

Особистий внесок дисертанта - виділення тропоміозину та тропонінового комплексу, проведення експериментів із реконструкції скоротливого апарату та визначення АТРазної активності. Написання та підготовка тез до друку.

7. Narolska N., Fedorkova O., Tregubov V., Omelianyuk V., Danilova V. Functional activity of troponin complex in normal muscle and at dilated cardiomyopathy // J Muscle Res Cell Motil., abstracts: 31^st Annual Meeting of the European Society for Muscle Research.- Lutheren (Nitherlands).-2002.-Vol.23, №1.-P.35-36.

Особистий внесок дисертанта - виділення тропонінового комплексу із нормального і дилатаційного міокардів, виділення нечутливого до кальцію актоміозину, проведення експериментів із реконструкції скоротливого апарату кардіоміоциту та визначення АТРазної активності. Написання та підготовку тез до друку проведено зі співавторами.

Анотація

Федоркова О.М. Функціональна активність та імуногенність тропоміозин-тропоніового комплексу кардіоміоцитів при дилатаційній кардіоміопатії. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 - молекулярна біологія.- Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2003.

Дисертацію присвячено дослідженням функціональної активності та імуногенності регуляторного комплексу скоротливого апарату кардіоміоцитів - тропоміозину та тропоніну при дилатаційній кардіоміопатії у людини.

Адаптовано щодо міокарда людини методики виділення тропоміозину та тропонінового комплексу. Методом твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA) показано, що імуногенність кардіального тропоміозину не підвищується, а тропонінового комплексу зростає при цій патології. Розроблено методику реконструкції скоротливого апарату кардіоміоцитів із структурних (актоміозин) та регуляторних (тропоміозин та тропонін) білків. Цю методику застосовано для вивчення функціональної активності тропоміозин-тропонінового комплексу при дилатаційній кардіоміопатії. Виявлено зміни у функціонуванні регуляторного комплексу, а саме здатність дилатаційного тропонінового комплексу достовірно інгібувати АТРазну активність актоміозину в безкальцієвому середовищі. Зафіксовано появу біологічно активних антитропонінових антитіл та зниження вмісту шаперону Hsp70 в цитоплазмі кардіоміоцитів при цій патології. Запропоновано гіпотетичну модель конформаційного переходу тропонінового комплексу, в основі якої лежить уявлення про конформаційні зміни тропонінового комплексу за рахунок зниження кількості шаперонів.

Ключові слова: тропоміозин, тропонін, міокард, дилатаційна кардіоміопатія, імуногенність, конформація, шаперон Hsp70, АТРазна активність.

Федоркова О.М. Функциональная активность и иммуногенность тропомиозин-тропонинового комплекса кардиомиоцитов при дилатационной кардиомиопатии. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2003.

Дисcертация посвящена изучению молекулярных механизмов, вовлеченных в развитие органоспецифической аутоиммунной патологии человека - дилатационной кардиомиопатии. При этой патологии наблюдается снижение сократительной способности миокарда. Поэтому предметом исследования были кардиальные белки человека - тропомиозин и тропониновый комплекс - как главное звено в регуляции сократительной активности миофиламентов кардиомиоцитов.

Были адаптированы к миокарду человека и модифицированы существующие методики выделения препаратов тропомиозина и тропонинового комплекса. В результате наших модификаций удалось повысить выход, чистоту и активность белковых препаратов. Чистоту полученных белков определяли методом электрофореза в денатурирующих условиях в полиакриламидном геле.

Иммуногенность полученных препаратов тропомиозина и тропонина изучали методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Показано, что иммуногенность кардиального тропомиозина не повышается при этой патологии, что может свидетельствовать об отсутствии структурных изменений в этом белке при дилатации. Иммуногенность тропонинового комплекса при этой патологии возрастает.

Для изучения возможных изменений функционирования регуляторного звена при дилатационной кардиомиопатии нами разработан оригинальный метод реконструкции сократительного аппарата из структурных (актомиозин) и регуляторных (тропомиозин и тропонин) белков. Выявлены изменения в функциональной активности регуляторного звена, а именно способность дилатационного тропонинового комплекса ингибировать Mg²⁺-АТРазную активность актомиозина в бескальциевой среде достоверно сильнее, нежели нормального тропонинового комплекса. Дилатационный тропониновый комплекс придавал реконструированному сократительному аппарату большей чуствительности к кальцию, чем нормальный тропониновый комплекс.

Зафиксировано наличие в сыворотках больных дилатационной кардиомиопатией антитропониновых аутоантител, способных активировать Mg²⁺-АТРазную активность чувствительного к кальцию кардиального бычьего актомиозина in vitro в кальциевой среде. На сегодня установлена способность антител проникать в клетки, поэтому не исключено, что антитропониновые антитела способны изменять функционирование кардиомиоцитов при дилатационной кардиомиопатии.

Проведена экспериментальная иммунизация лабораторных животных - мышей линии Balb/c - дилатационным тропониновым комплексом с целью установления его причастности к индукции дилатационной кардиомиопатии. При морфологическом исследовании миокардов иммунизированных животных не выявлено изменений, характерных для дилатационной кардиомиопатии у человека.

Учитывая полученные данные относительно повышения иммуногенности и нарушения функциональной активности тропонина при дилатационной кардиомиопатии, було выдвинуто предположение о возможных изменениях количества и/или функциональной активности шаперонов. Изучалось содержание шаперона Hsp70 - одного из важнейших факторов укладки белков - в цитоплазматической фракции кардиомиоцитов при дилатационной кардиомиопатии. Методом иммуноблотинга продемонстрировано снижение количества этого шаперона на последних этапах болезни. На основании полученных результатов и анализа литературных данных сформулирована гипотетическая модель конформационного перехода тропонинового комплекса при этой сердечной патологии. Согласно этой модели снижение количества шаперона Hsp70 может приводить к появлению тропонина с измененной конформацией, что в свою очередь ведет к нарушению функциональной активности и повышению иммуногенности.

Повышение иммуногенности тропонинового комплекса, появление в сыворотке крови больных антитропониновых антител с биологической активностью, отличной от такой антитропониновых антител из сывороток здоровых доноров, свидетельствует об определенных конформационных изменениях в структуре этих регуляторных белков при дилатационной кардиомиопатии. Регистрация таких конформационных изменений тропонина из дилатационного миокарда может быть одним из диагностических критериев определения этой болезни, а также основой для разработки болезнеспецифических методов лечения и профилактики.

Дальнейший прогресс в разрешении вопроса, что же запускает развитие дилатационной кардиомиопатии будет связан с раскрытием точной физиологической роли молекулярных перестроек сократительного аппарата кардиомиоцитов. Возможно, усилия необходимо сконцентрировать на углубленном изучении конформационных изменений кардиоспецифического тропонина и его отдельных субъединиц.

Ключевые слова: тропомиозин, тропонин, миокард, дилатационная кардиомиопатия, иммуногенность, конформация, шаперон Hsp70, АТРазная активность.

Fedorkova O.M. Functional activity and immunogenecity of tropomyosin-troponin complex of cardiomyocytes at dilated cardiomyopathy.- Manuscript.

Thesis for a Philosophy Doctor (PhD) degree in Biology by speciality 03.00.03 - molecular biology.- Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv, 2003.

Thesis is devoted to the investigation of functional activity and immunogenecity of cardiomyocytes' contractile apparatus regulated complex - tropomyosin and troponin at dilated cardiomyopathy in human.

The methods of tropomyosin and troponin purification were developed and adapted for the human myocardium. The increasing of the immunogenecity of tropomyosin was not observed at this cardiac pathology by ELISA method. The most pronounced immunogenecity of troponin complex has been shown for the isolated from dilated cardiomyopathy patient myocardium. The method of reconstruction of cardiomyocites' contractile apparatus from structural (actomyosin) and regulatory (tropomyosin and troponin complex) proteins was elaborated. This method was employed for investigation of functional activity of tropomyosin-troponin complex at dilated cardiomyopathy. The changes in functional activity of troponin complex were revealed. The inhibition of ATPase activity of actomyosin by dilated troponin was more pronounced at free-calcium milieu. The activated influence of antitroponin autoantibodies from dilated cardiomyopathy pathients' sera on bovine actomyosin ATPase activity in vitro was shown. The decrease in the Hsp70 level in the cytoplasm of dilated cardiomyocites was revealed by immynoblotting The hypothetical molecular model of conformational changes in troponin complex was proposed. According to this model, decreasing of chaperon Hsp70 level in the cytoplasm of cardiomyocytes may lead to the alteration of cardiac troponin complex conformation at dilated cardiomyopathy.

Key words: tropomyosin, troponin, myocardium, dilated cardiomyopathy, immynogenesity, conformation, chaperon Hsp70, ATPase activity.

Размещено на Allbest.ru

...