Розробка специфічних компонентів імуноферментної тест-системи для визначення антитіл до вірусу Епштейна-Барр

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ

ІМ. Д.К.ЗАБОЛОТНОГО

УДК 578.825.13:616.98

РОЗРОБКА СПЕЦИФІЧНИХ КОМПОНЕНТІВ ІМУНОФЕРМЕНТНОЇ ТЕСТ-СИСТЕМИ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ АНТИТІЛ ДО ВІРУСУ ЕПШТЕЙНА-БАРР ТА ХАРАКТЕРИСТИКА ЇЇ ПАРАМЕТРІВ

03.00.06 - вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ЗАГОРОДНЯ Світлана Дмитрівна

Київ - 2003



Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі молекулярної біології вірусів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор, член-кор. НАНУ, Дяченко Наталя Сергіївна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України, завідувач відділу молекулярної біології вірусів

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Руденко Адель Вікторівна, Інститут урології АМН України, завідувач лабораторії мікробіології і вірусології

доктор медичних наук, професор Дзюблик Ірина Володимирівна, Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України, завідувач кафедри вірусології

Провідна установа: Київський національний університет ім. Тараса Шевченка, кафедра вірусології, Міністерство освіти і науки України, м. Київ

Захист відбудеться 22 січня 2003 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України (03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154 )

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154 .

Автореферат дисертації розіслано 20 грудня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої Вченої ради,

кандидат біологічних наук Пуріш Л.М.



АНОТАЦІЯ

Загородня С.Д. Розробка специфічних компонентів імуноферментної тест-системи для визначення антитіл до вірусу Епштейна-Барр. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06. - вірусологія. - Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України, Київ, 2003.

Дисертація присвячена розробці імуноферментної тест-системи для виявлення антитіл до вірусу Епштейна-Барр. Одержаний антиген для сенсибілізації планшет, який містить кілька білків (EBNA, EA, VCA) вірусу Епштейна-Барр та підтверджена його специфічність. Оптимізовані умови проведення всіх етапів імуноферментного аналізу, склад детектуючих компонентів та буферних розчинів. До специфічного антигену та очищеного вірусу одержані гіперімунні поліклональні сироватки кроля та охарактеризована їх активність. Створені панелі позитивних та негативних сироваток, що гарантовано містять або не містять антитіла до ВЕБ відповідно, які надалі використовувались як стандарти при конструюванні тест-системи та визначенні критеріїв оцінки результатів.

Показано, що специфічність тест-системи “ІФА-АтВЕБ-стрип” становить 100%, а чутливість - 96%.

З використанням тест-системи та конкурентного ІФА досліджений рівень антигенної спорідненості ВЕБ з деякими представниками родини герпесвірусів як один з критеріїв її специфічності. Цей показник досить низький і становить 2,4%, 4,1% та 2,2% відповідно для ВЕБ та вірусу герпесу звичайного 1-го типу, ВЕБ та цитомегаловірусу, ВЕБ та вірусу оперізуючого лишаю. імуноферментний антиген вірус епштейн

Були досліджені понад 2000 сироваток різних груп населення м. Києва, (донорів, здорових вагітних жінок, хворих на інфекційний мононуклеоз, лімфоми, туберкульоз) та 45 виробничих серій “Імуноглобуліну людини нормального”. В них визначені високі рівні антитіл до ВЕБ, що свідчить про значну напруженість специфічного імунітету та широку циркуляцію цього вірусу

В результаті проведених досліджень вперше в Україні розроблена твердофазна імуноферментна тест-систему, яка дозволяє виявляти антитіла (IgG та IgM) проти вірусу Епштейна-Барр в сироватках крові людини та проводити диференційну діагностику захворювань, спричинених ВЕБ.

Ключові слова: вірус Епштейна-Барр, антитіла, імуноферментний аналіз, тест-система і її специфічність, чутливість.



АННОТАЦИЯ

Загородняя С.Д. Разработка специфических компонентов иммуноферментной тест-системы для определения антител к вирусу Эпштейна-Барр. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06. - вирусология. - Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного НАН Украины, Киев, 2003.

Диссертация посвящена разработке иммуноферментной тест-системы для выявления антител (IgG и IgM) к вирусу Эпштейна-Барр. В качестве специфического антигена при конструировании тест-системы, лабораторный образец которой получил название „ИФА-АтВЭБ-стрип”, использовали экстракт лимфобластоидных клеток В95-8, которые трансформированы этим вирусом и хронически продуцируют его антигены, а также целые вирусные частицы. Специфичность полученного антигена для сенсибилизации подтверждена методами иммуоблотинга, иммуноферментного анализа со специфическими сыворотками из известных коммерческих тест-систем и путём сравнения разработанного антигена с отрицательным антигеном из моноцитарной массы пуповинной крови. Показано наличие в нём, в частности, раннего (ЕА), нуклеарного (EBNA) и капсидного (VCA) антигенов ВЭБ.

Оптимизированы условия проведения всех ключевых моментов реакции, состав буферных и детектирующих компонентов тест-системы. Схема проведения ИФА включала сенсибилизацию плашек антигеном, инкубацию с исследуемыми сыворотками больных, контакт с мечеными пероксидазой антивидовыми коньюгатами против IgG или IgM человека, финальное количественное определение интенсивности ферментативной реакции общепринятыми приёмами. Разработаны критерии оценки результатов анализа исследуемых сывороток.

Созданы панели положительных (50 образцов) и отрицательных (50 образцов) сывороток, которые гарантировано содержали или не содержали антитела к вирусу Эпштейна-Барр.

Сравнительно исследован ряд сывороток, которые содержали антитела к ВЭБ (20 образцов) и не содержали антител к ВЭБ (15 образцов) в двух коммерческих тест-системах “Epstein-Barr EBNA IgG” (Sanofi diagnostics Pasteur, Франція), “SIATM Epstein-Barr EBNA IgG” (Sigma diagnostics, США) и “ИФА-АтВЭБ-стрип”, что позволило определить специфичность (100%) и чувствительность (96%) разработанной тест-системы.

Изучен уровень антигенного родства вируса Эпштейна-Барр и некоторых представителей семейства герпесвирусов. Для этого использован ряд модификаций ИФА, в частности, непрямой, последовательный и одномоментный конкурентный ИФА. Этот показатель имеет низкие значения и равен 2,4 % для ВЭБ и вируса герпеса простого 1-го типа, 2,2 % - ВЭБ и вируса опоясывающего лишая и 4,1 % для ВЭБ и цитомегаловируса.

Используя разработанную тест-систему “ИФА-АтВЭБ-стрип”, исследована напряжённость иммунитета к ВЭБ среди разных групп населения г. Киева, в частности, высокий уровень антител содержит 4% сывороток здорового населения, 71% сывороток больных инфекционным мононуклеозом и 35% - больных туберкулёзом. Эти материалы свидетельствуют о широкой циркуляции вируса среди населения.

Тест-система прошла независимые лабораторно-клинические испытания на базе вирусологической лаборатории Киевского городского териториального медицинского объединения “Санэпидстанция” г. Киева и получила положительный отзыв.

Апробация разработанной тест-системы “ИФА-АтВЭБ-стрип” проведена на более чем 2 000 сывороток здоровых людей и людей с заболеваниями, которые могут быть этиологически связаны с ВЭБ. Показано, что тест-система “ИФА-АтВЭБ-стрип” позволяет выявлять антитела (IgG и IgM) к вирусу Эпштейна-Барр в сыворотках крови, а также проводить дифференциальную диагностику заболевания и может быть использована в диагностических целях.

Ключевые слова: вирус Эпштейна-Барр, антитела, иммуноферментный анализ, тест-система, её специфичность и чувствительность.



ABSTRACT

Zagorodnya S.D. Design of specific components of immunosorbent test system for detection of antibodies to Epstein-Barr virus. - Manuscript.

The thesis for a candidates degree by speciality 03.00.06. - Virology. - D.K.Zabolotny Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2003.

The thesis is focused on development of immunosorbent test system for detection of antibodies to Epstein-Barr virus. Au antigen containing some EBV proteins (EBNA, EA, VCA) for plates' sensibilization has been obtained, and its specificity confirmed. All stages of ELISA, composition of detecting components and buffer solutions were optimized. Hyperimmune polyclonal rabbit antiserums to purified virus and specific antigen have been obtained and characterized. Panels of positive and negative serum that guaranteed did or did not contain antibodies to EBV have been developed and used further as standards during design of the test system and determining the criterions for results evaluation.

There was shown that specificity of “ELISA-AtEBV-strip” test system was 100%, and sensitivity - 96%.

Using the test system and competitive ELISA, level of antigenic relationships of EBV and some representatives of Herpesviridae family was revealed as one of the criteriums of system's specificity. This index was rather low - 2,4%, 4,1% and 2,2% for herpes simplex virus1 types, cytomegalovirus and varicela zoster virus, correspondingly.

Over 2 000 serums of different groups of Kyev' population (donors; healthy pregnant women; people diseased with infectious mononucleosis, lymphomas, tuberculosis) and 45 industrial series of “Normal human immunoglobulin” have been tested. There were detected high levels of antibodies to EBV suggesting serious intensity of specific immunity and widespread circulation of this virus.

As a result of researches conducted, enzyme-linked immunosorbent test system has been developed in Ukraine for the first time that allows to human blood and to conduct differential diagnostics of EBV-induced diseased.

Key words: Epstein-Barr virus, antibodies, enzyme-linked assay, test system and its specificity, sensitivity.



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вірус Епштейна-Барр (ВЕБ) є представником розповсюдженої родини герпесвірусів. Його роль у патології людини пов'язують із деякими формами лімфопроліферативних захворювань - лімфомою Беркітта, лімфомою Ходчинга назофаренгіальною карциномою. Клінічною формою первинного інфікування людини вірусом Епштейна-Барр (ВЕБ) вважається інфекційний мононуклеоз - досить поширене, переважно серед дітей, тяжке захворювання з ураженням лімфатичної системи, крові, а також гепатоспленомегалією та ангіною. З активацією ВЕБ-інфекції пов'язують розвиток синдрому хронічної стомлюваності, посттрансплантантний лімфопроліферативний синдром та деякі інші процеси. Особливістю ВЕБ є його здатність до латентного (безсимптомного) збереження в організмі після первинного інфікування з наступною активацією і розвитком клінічно вираженого захворювання. Активуючі фактори різні, зокрема це погіршення імунологічного статусу людини під дією несприятливих чинників навколишнього середовища, а також стрес, гормональні зміни організму. Ця обставина важлива для стану здоров'я населення сучасної України і м. Києва як мегаполіса з додатковим набором несприятливих антропогенних факторів.

В зв'язку з вищевказаним, велике значення має практичне використання високо специфічних методів лабораторної діагностики ВЕБ-інфекції, що дозволить диференціювати етіологічний чинник інфекційного захворювання. На сьогодні для діагностики ВЕБ-інфекції використовується ряд методів, спрямованих на виявлення геному чи антигенів вірусу або специфічних до них антитіл в сироватках крові хворих. В випадку виявлення вірусного антигену чи антитіл використовуються методи імунофлуоресценції, радіоімунологічний аналіз, імуноблотинг. При виявленні геному вірусу чи його фрагментів використовується полімеразна ланцюгова реакція. Але найбільш розповсюдженим та інформативним для лабораторної діагностики ВЕБ-інфекції є метод імуноферментного аналізу (ІФА) - високочутливий, специфічний та найбільш прийнятний для масштабних досліджень, який може бути спрямований на виявлення антигенів вірусу, чи, частіше, специфічних антитіл.

Існують закордонні тест-системи на виявлення антитіл проти вірусу Епштейна-Барр з використанням різних рекомбінантних антигенів вірусу, що дають змогу провести етіологічну діагностику захворювання, а також диференціювати стадії хвороби. Серед них “Platelia EBV EBNA IgG” (Sanofi diagnostics Pasteur, France) i “SIATM Epstein-Barr EBNA IgG ” (Sigma diagnostics, USA) та ін. Виробництво подібних тест-систем в Україні відсутнє, як і їх розробка. На жаль в зв'язку з рядом економічних чинників наша країна не в змозі забезпечити медичні заклади закордонними тест-системами. Тому питання про розробку та виробництво власних вітчизняних тест-систем беззаперечно стоїть на порядку денному і має бути вирішене системою охорони здоров'я населення України. Саме тому створення оригінальної імуноферментної тест-системи, спрямованої на виявлення антитіл проти вірусу Епшгтейна-Барр, на сьогодні важливе, що дозволить здійснювати диференційну діагностику захворювань, спричинених даним вірусом, та більш раціонально підходити до вирішення проблеми їх направленої терапії та профілактики.

За допомогою створеної тест-системи проведені дослідження рівня імунітету до вірусу Епштейна-Барр серед різних груп населення міста Києва. Одержані результати є важливими, оскільки відсутня будь-яка епідеміологічна оцінка циркуляції ВЕБ серед населення, як м. Києва, так і в Україні в цілому.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу молекулярної біології вірусів Інституту мікробіології і вірусології НАН України. Виконана в рамках гранту Міністерства освіти і науки України “Розробити імуноферментну тест-систему для етіологічної діагностики віpусу Епштейна-Баpp і підготувати необхідну НТД” за договором 2/964-97 в 1997-2000 роках (шифр: 02.07/04228, N державної Реєстрації 01.97.U 019180) та в рамках гранту Київської міської держадміністрації "Розробка імуноферментної тест-системи для етіологічної діагностики віpусу Епштейна-Баpp і підготовка необхідної науково-технічної документації" №26-98 за 1998-2001 роки.

Мета і завдання дослідження. Метою дослідження була розробка специфічних компонентів для конструювання на їх основі високочутливої вітчизняної імуноферментної тест-системи для виявлення антитіл (IgG та IgM) проти вірусу Епштейна-Барр, її всебічна характеристика, дослідження рівня антигенної спорідненості ВЕБ з деякими представниками родини герпесвірусів, вивчення поширеності ВЕБ серед різних груп населення, апробація одержаних зразків тест-системи. Реалізацію поставленої мети проводили шляхом послідовного вирішення таких завдань:

Розробити специфічний антиген, який містить білки вірусу Епштейна-Барр, дослідити його специфічність, оптимізувати методи його одержання та накопичення.

Одержати специфічну сироватку до розробленого антигену, визначити показники її активності та специфічності.

Сконструювати тест-систему на виявлення антитіл до вірусу Епштейна-Барр на основі розробленого специфічного антигену.

Створити панелі позитивних та негативних сироваток до ВЕБ як контрольних компонентів тест-системи.

Охарактеризувати інформативність створеної тест-системи (специфічність, чутливість).

З використанням розробленої тест-системи вивчити рівень антигенної спорідненості вірусу Епштейна-Барр з деякими представниками родини герпесвірусів.

Вивчити стан колективного імунітету до ВЕБ та його поширеність серед різних груп населення м. Києва.

Об'єкт дослідження - імуноферментна тест-система для виявлення антитіл проти вірусу Епштейна-Барр “ІФА-АтВЕБ-стрип”.

Предмет дослідження - якість компонентів тест-системи, визначення її параметрів, а саме специфічності та чутливості, накопичення досвіду застосування.

Матеріали та методи дослідження - для виконання поставлених завдань використовувалися вірусологічні, молекулярно-біологічні та імунологічні методи, а також методи біометричної обробки результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Одержаний оригінальний препарат специфічного антигену ВЕБ, на основі якого створена перша вітчизняна високочутлива та специфічна імуноферментна тест-система для виявлення антитіл (IgG та IgM) до вірусу Епштейна-Барр, проведена її всебічна характеристика, створені панелі позитивних та негативних сироваток, які гарантовано містять або не містять антитіла до даного вірусу. Встановлений низький рівень антигенної спорідненості ВЕБ з цитомегаловірусом, вірусом герпесу звичайного 1-го типу, вірусом оперізуючого лишаю. Створена тест-система дозволила певною мірою охарактеризувати стан колективного імунітету до ВЕБ серед різних груп населення м. Києва, зокрема, хворих на інфекційний мононуклеоз, туберкульоз, гематологічні захворювання, групи здорового населення (великий процент його складали здорові вагітні жінки, донори) та вперше одержати дані, що свідчать про досить широку циркуляцію цього вірусу.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблений метод одержання антигену ВЕБ із лімфобластоїдної культури клітин, який запатентовано. Визначена схема проведення імуноферментного аналізу на основі одержаного антигену та підібраний склад компонентів, які входять до даної тест-системи, оптимізований режим проведення послідовних етапів реакції. Наявність у складі розробленого антигену білків ВЕБ, що виявляються на ранніх стадіях гострого захворювання, персистенції вірусу або реконвалесценції та одночасне застосування антивидових кон'югатів проти імуноглобулінів G та М людини дає змогу одномоментно за допомогою розробленої тест-системи визначити стадію захворювання людини при ВЕБ-інфекції. Проведена апробація тест-системи на понад 2 000 сироватках крові різних груп населення. Крім того, проведені незалежні лабораторно-клінічні випробування зразків сконструйованої імуноферментної тест-системи на базі вірусологічної лабораторії Київського міського територіального медичного об'єднання “Санепідстанція” м. Києва, які підтвердили її високу ефективність. Розроблені проекти науково-технічної документації, а саме: проект “Інструкція по виготовленню і контролю імуноферментної тест-системи “ІФА-АтВЕБ-стрип”, проект “Інструкція по використанню імуноферментної тест-системи “ІФА-АтВЕБ-стрип”, проект Фармакопейної статті на панелі позитивних та негативних сироваток, які містять або ні антитіла до вірусу Епштейна-Барр.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проаналізована наукова літературу по темі дисертації. Основний об'єм експериментальної роботи, обробка та аналіз отриманих результатів, формулювання висновків дисертаційної роботи виконані пошукачем особисто. Здобувачем самостійно проаналізований одержаний експериментальній матеріал, який нею викладений у ряді статей в фахових виданнях та тезах доповідей на вітчизняних і міжнародних конференціях. Планування основних напрямків досліджень дисертаційної роботи, обговорення отриманих результатів та їх узагальнення здійснені під керівництвом д.б.н., професора, члена-кореспондента НАН України, зав. відділом молекулярної біології вірусів ІМВ НАНУ Дяченко Наталії Сергіївни.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації представлені на І та ІІІ Міжнародних конференціях “Біоресурси та віруси” (Київ, 1998, 2001), ІІ з'їзді онкологів країн СНД “Онкологія 2000” (Київ, 2000), конференції молодих вчених ІМВ НАНУ (Київ, 2000), ІІ (ІХ) з'їзді Мікробіологічного товариства (Чернігів, 2000), ХІІ Європейському конгресі з клінічної мікробіології і інфекційних захворювань (Туреччина, Стамбул, 2001), Міжнародній науково-практичній конференції “Нові технології одержання та використання біологічно активних речовин” (Алушта, Крим, 2002)

Апробація дисертації відбулась на засіданні відділу молекулярної біології вірусів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті у наукових фахових виданнях та тези 6 доповідей, одержано патент на науково-практичну розробку UA № 40966А “Тест-система на виявлення антитіл проти вірусу Епштейна-Барр “ІФА-АтВЕБ-стрип””.

Структура та обсяг роботи. Загальний обсяг роботи складає 151 сторінку машинописного тексту, вона складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, експериментальної частини, яка включає в себе виклад результатів з використанням 11 ілюстрацій та 16 таблиць, висновків, списку літератури, який включає в себе 149 публікацій, а також Додатків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Огляд літератури складається із двох розділів, в яких охарактеризована структурна організація вірусу Епштейна-Барр, його роль в патології людини та методи діагностики спричинених ним захворювань. В другому розділі детально висвітлені методи імуноферментного аналізу як найбільш широко застосовуваний для етіологічної діагностики захворювань спричинених ВЕБ.

Матеріали та методи досліджень. Антигени вірусу Епштейна-Барр та його віріони одержували з перещеплюваної культури клітин В95-8, яка є В-лімфоцитами периферичної крові мавп-мармазеток, що трансформовані ВЕБ, і хронічно продукують його. Очищення вірусу проводили шляхом центрифугування в перформованому градієнті щільності декстрану (5-30%). Чистоту препарату визначали спектрофотометрично та за допомогою електронної мікроскопії. Методика одержання комплексного антигену з лізату клітин включає в себе осадження клітин В95-8 низькошвидкісним центрифугуванням з наступним руйнуванням клітин гомогенізацією та ультразвуком. Вказана методика є предметом патентування. Саме цей антиген надалі використовувався для конструювання тест-системи. Специфічність одержаних препараті комплексного антигену вірусу Епштейна-Барр з лізату лімфобластоїдних клітин контролювали методами електрофорезу в поліакриламідному гелі (ПААГ) та імуноблотингу, а також та методом ІФА з позитивними та негативними сироватками із комерційних тест-систем, які містять або не містять відповідно антитіла до ВЕБ. Також використовували контрольний антиген, одержаний з моноцитів пуповиної крові, які, як відомо, не містять ВЕБ. Цей антиген досліджували з вказаними вище позитивними та негативними сироватками до ВЕБ. Концентрацію білків визначали біуретовим методам за стандартною методикою.

При проведенні досліджень використовували комерційні тест-системи “Platelia EBV EBNA IgG” (Sanofi diagnostics Pasteur, France), “Platelia EBV EA IgG” (Sanofi diagnostics Pasteur, France) i “SIATM Epstein-Barr EBNA IgG” (Sigma diagnostics, USA) для визначення антитіл до ВЕБ в сироватках крові та такі тест-системи фірми “Novum diagnostica” (Німеччина): “Herpes simplex virus type 1 (HSV1) IgG ELISA”, “Varicella zoster virus (VZV) IgG ELISA” та “Cytomegalovirus (CMV) IgG ELISA”, “Epstein-Barr virus (VCA EBV) IgG ELISA”, призначені для виявлення в сироватках крові людей антитіл до вірусу герпесу звичайного 1-го типу, вірусу оперізуючого лишаю, цитомегаловірусу, вірусу Епштейна-Барр відповідно. Імуноферментний аналіз в цих випадках та облік результатів проводили згідно інструкції виробника.

При конструюванні та апробації тест-системи використовували сироватки крові як здорових людей, так і осіб з різними захворюваннями, етіологічним агентом яких є ВЕБ, а саме:

- сироватки донорів, які не містили HBs-антигену та антитіл до ВІЛ, одержані зі Станції переливання крові м. Києва ( 372 зразка);

- сироватки крові здорового населення, одержані з вірусологічної лабораторії КМТМО “Санепідемслужба” м. Києва (540 зразків);

- сироватки крові хворих на інфекційний мононуклеоз з відділення ускладнених форм грипу, ГРВІ і нейроінфекцій Інституту епідеміології і інфекційних хвороб АМНУ, Сімферопольської дитячої інфекційної лікарні, Київська міська дитяча лікарня інфекційних захворювань (всього 928 зразків);

- сироватки хворих на лімфому Беркітта тестовані в референс-лабораторії СНІД Інституту епідеміології і інфекційних хвороб АМНУ (20 зразків), вони були попередньо тестовані в тест-системі “Platelia EBV EBNA IgG” і входили до складу панелі сироваток ВІЛ-інфікованих з лімфомою Беркітта;

- сироватки хворих на туберкульоз (176 зразків);

- 45 серій “Імуноглобуліну людини нормального”, одержані з ДКПВБП “Біофарма”.

Всього досліджено 1 542 сироваток дорослих та 474 сироватки дітей.

При підборі твердрофазних носіїв нами досліджені планшети кількох фірм-виробників: “Медбіополімер” (Росія), “Labsystems” (Фінляндія), “Sarstedt” (США), “Labstar” (Швеція), “Dynatech” (Німеччина), “Nunc poly sorp” (Данія).

При підборі розчинників для іммобілізації антигену на планшетах були досліджені такі буферні розчини: 0,05 М карбонатний буфер, рН 9,6; 0,01 М натрій-фосфатний буфер, рН 7,4; який містить 0,1 М NaCl; 0,05 М трис-НСl, рН 7,2, який містить 0,1 М NaCl; 0,15 М NaCl, pH 6,8.

Під час конструювання тест-системи використовували такі антивидові кон'югати, мічені пероксидазою хрону:

антитіла кози проти імуноглобулінів людини класу М фірми "Sigma" (США) в робочому розведенні 1:18.000;

антитіла кози проти імуноглобулінів людини класу G фірми "Sigma" (США) в робочому розведенні 1:15.000;

антитіла кози проти імуноглобулінів кроля класу G фірми "Sigma" (США), в робочому розведенні 1:1.000.

Як проявник використовували ортофенілендіамін (ОФД) “Serva” (Німеччина) в концентрації 4 мкг ОФД в 10 мл 50 мМ цитратного буферу, рН 5,0, з додаванням 6 мкл 30 % перекису водню (Н2О2) (розрахунок на один планшет).

В роботі використано ряд модифікацій твердофазного імуноферментного (ТІФА) аналізу. В непрямому варіанті проведення ТІФА послідовність проведення аналізу така: в лунки полістиролових вносили по 100 мкл антигенвмісного матеріалу і інкубували для його, потім промивали планшети і використовували для дослідження сироваток. Після внесення сироваток планшет інкубували певний час, промивали, а потім в кожну лунку вносили по 100 мкл відповідного для умов досліду антивидового кон'югату, міченого пероксидазою хрону, інкубували, промивали і проявляли за допомогою ОФД. Після зупинки реакції 4N H2SO4, виявляли ферментативну активність утвореного комплексу проводили на рідері “MR 700” фірми “Dynatech” (Швейцарія) за величиною оптичної густини при двох довжинах хвиль 492/620 нм.

При визначенні рівня антигенної спорідненості ВЕБ з іншими герпесвірусами застосовували одномоментний та послідовний конкурентний імуноферментний аналіз. При проведенні конкурентного ІФА в лунки 96-луночних планшетів, що сенсибілізовані антигенами ВЕБ, вносили одночасно по 50 мкл гіперімунної кролячої сироватки до ВЕБ та по 50 мкл конкурентної сироватки (позитивна або негативна сироватка людини із комерційних тест-систем, яка містила або не містила антитіла до вірусу герпесу звичайного 1-го типу, вірусу оперізуючого лишаю та цитомегаловірусу відповідно до умов досліду). Інкубували 1 год. при 370С, після чого промивали ФСБТ (тричі), вносили по 100 мкл мічених антивидових антитіл проти імуноглобулінів кроля, а в іншому випадку антивидові антитіла проти імуноглобулінів людини класу G. Інкубували 40 хвилин при 37 0С, промивали 5 раз ФСБТ, вносили по 100 мкл розчину субстрату з барвником (6 мкл 30% перекису водню, 4 мкг ОФД в 10 мл 50 мМ цитратного буферу, рН 5,0), інкубували 15-30 хв при кімнатні температурі (20-25 0С). Після зупинки реакції (4 Н H2SO4) вимірювали величину оптичного поглинання як описано вище.

Для підрахунку граничного значення (ГЗ) оптичного поглинання сироваток визначали середньоквадратичне відхилення.

При визначенны специфічності тест-системи “ІФА-АтВЕБ-стрип” досліджу-вали 20 сироваток, що не містили IgG антитіл до ВЕБ, в ній та двох тест-системах порівняння “Epstein-Barr EBNA IgG” (Sanofi diagnostics Pasteur, Франція) i “SIATM Epstein-Barr EBNA IgG” (Sigma diagnostics, США). Кожна сироватка досліджувала-ся в 4 повторах. Одержані результати піддавали статистичній обробці з визначен-ням середньоквадратичної похибки. Специфічність імунофермент-ної тест-системи визначали за формулою С= Nн/(Nн+Nхп)100%, де С - специфіч-ність системи, Nн - кількість негативних результатів в даній системі, Nхп - кількість хибно позитивних результатів. Чутливість тест-системи “ІФА-АтВЕБ-стрип” визначали шляхом порів-няння результатів дослідження 15 сироваток, що містять IgG до ВЕБ, в ній та двох тест-системах порівняння, зазначених вище. Кожна сироватка досліджувалась в 4 повторах. Чутливість імуноферментної тест-системи визначали за формулою Ч=Nп/(Nп+Nхн)х100%, де Ч - чутливість системи, Nп - кількість позитивних результатів в даній системі, Nхн - кількість хибно позитивних результатів.

Результати аналізу деяких сироваток в розробленій тест-системі порівнювали з результатами їх дослідження в неспецифічній реакції гетерогемаглютинації Пауля-Буннеля.

Одержання специфічних компонентів для конструювання тест-системи та оптимізація умов проведення ІФА. На першому етапі досліджень нами розро-блена технологія одержання комплексного антигену, що містить білки ВЕБ, а також препарату очищеного вірусу із продукуючої його лімфобластоїдної культури клітин. Ці препарати надалі використовували для створення імуноферментної тест-системи на виявлення антитіл проти вірусу Епштейна-Барр, а також для одержання гіпер-імунних сироваток кроля, які містили антитіла до окремих білків та віріонів. Одер-жаний препарат очищеного вірусу досліджували методом електронної мікроскопії та спектрофотометрично. В ньому виявлені віріони, які за структурою відповідають представникам родини Herpesviridae, результати спектрофотометричного аналізу також характерні для представників цієї родини.

З метою визначення специфічності антигену проводили його електрофоре-тичне розділення в ПААГ з наступною ідентифікацією специфічними сироватками за допомогою методу імуноблотингу.. Утворення комплексу антиген-антитіло спостерігається при взаємодії одного з поліпептидів, одержаного після електрофоретичного розділення препарату антигену, з позитив-ною сироваткою з тест-системи “Platelia EBV EBNA IgG”, що містить антитіла до EBNA-антигену ВЕБ (трек 2). Цей же поліпептид взаємодіє з сироватками хворих на клінічно виражений інфекційний мононуклеоз, які були позитивними у вказаній комерційній тест-системі.

1.негативна сироватка із комерційної тест - системи “Platelia EBV EBNA IgG”

2.позитивна сироватка із комерційної тест - системи “Platelia EBV EBNA IgG”

3, 5, 6 сироватки хворих на інфекційний мононуклеоз, позитивні у вказаній тест-системи.

4. сироватка здорової людини.

Проведене імуноферментне дослідження розроблюваного антигену з негативними та позитивними сироватками із комерційних тест-системи, що наведені вище. Результати представлені в таблиці 1. Крім позитивної сироватки до EBNA-антигену ВЕБ з тест-системи “Platelia EBV EBNA IgG” в цьому досліді використані сироватки до ЕА та VCA антигенів вірусу з тест-системи “Platelia EBV EA IgG” та “Epstein-Barr virus (VCA) IgG” відповідно, а також гіперімунна сироватка. Всі ці сироватки взаємодіють з отриманим антигеном на відміну від негативних сироваток. Порівнювали результати дослідження позитивного антигену, одержаного з лімфобластоїдних клітин та негативного контрольного антигену, що був отриманий з моноцитарної маси пуповинної крові людини. Негативний антиген не утворював комплексу антиген-антитіло з позитивною сироваткою до очищеного ВЕБ , а також з позитивними та негативними сироватками з тест-систем “Platelia EBV EBNA IgG” та “SIATM Epstein-Barr EBNA IgG.

Таким чином, доведена специфічність одержаного нами антигену і підтверджена наявність у ньому, зокрема, нуклеарного (EBNA), раннього (ЕА) та капсидного (VCA) антигенів ВЕБ.

Під час розробки тест-системи для визначення антитіл до ВЕБ нами оптимізовані режими проведення основних етапів імуноферментного аналізу, і встановлено, що оптимальними умовами є: сорбція антигену в 0,05 М карбонатному буфері (рН 9,6) на планшетах “Nunc poly sorb” (Данія) протягом 16-18 год при 4 ОС; взаємодія антигену з досліджуваними сироватками в розведенні 1:5 протягом 1 год при 37 ОС; використання для виявлення утвореного комплексу антивидових антитіл до IgG чи IgM людини, мічених пероксидазою хрону, для диференційного визначення фази інфекційного процесу.

При конструюванні тест-системи обов'язковим показником її інформативності є визначення граничного значення або порогового значення (ГЗ або cut off), згідно з якими одержаний результат дослідження сироватки слід вважати позитивним або ж негативним. В нашому випадку ГЗ розраховували як суму середнього значення ОГ негативних сироваток та трьох середньоквадратичних відхилень. При проведенні аналізу значення сироватки вважається позитивним, якщо її ОГ перевищує ГЗ на 10 %, якщо ОГ нижче за 10 %, то сироватка є негативною. Якщо значення ОГ досліджуваної сироватки потрапляє до сірої зони від ГЗ +10 %, то сироватка вважається сумнівною і необхідно провести її повторне тестування. У разі розрахунку ГЗ використовували створені нами панелі позитивних та негативних сироваток. Панелі представляють собою набір сироваток, одержаних від хворих на інфекційний мононуклеоз, в яких визначені антитіла до ВЕБ в обумовлених титрах (позитивні сироватки), а також сироватки крові донорів, які не містять таких антитіл (негативні сироватки). Сироватки були попередньо тестовані з використанням комерційних імуноферментних тест-систем порівняння “Platelia EBV EBNA IgG” (Sanofi diagnostics Pasteur, Франція), “SIATM Epstein-Barr EBNA IgG” (Sigma diagnostics, США) та розроблюваної тест-системи. Критерієм включення позитивної сироватки до стандартної панелі було співвідношення ОГ зразка до ГЗ (ОГ/ГЗ) > 1,1, а при включенні сироватки до негативної панелі ОГ/ГЗ < 1. Створені панелі сироваток містять 50 позитивних зразків та 50 негативних зразків.

Для підсумкової оцінки інформативності розроблюваної тест-системи визначали її специфічність та чутливість. Специфічність визначається стабільною відтворюваністю негативних результатів порівняльного дослідження негативних сироваток, що не містять антитіл до ВЕБ, в розроблюваній та стандартних тест-системах. Для визначення специфічності тест-системи “ІФА-АтВЕБ-стрип” ми чотириразово досліджували 20 сироваток, що не містили IgG антитіл до ВЕБ, в ній та двох тест-системах порівняння “Platelia EBV EBNA IgG”, “SIATM Epstein-Barr EBNA IgG”. Одержані результати подані в таблиці 3. Як свідчать наведені матеріали, в жодному випадку дослідження негативних сироваток в тест-системі “ІФА-АтВЕБ-стрип” та тест-системах порівняння не зареєстровано значень ОГ, які свідчили б про сумнівний чи позитивний результат (ОГ/ГЗ<1). Отже, показано повний збіг результатів в трьох тест-системах, тобто специфічність розроблюваної тест-системи становить 100 % і при її використанні не було визначено хибно-позитивних результатів.

Чутливість тест-системи - це стабільність відтворення позитивних результатів при дослідженні позитивних сироваток. Чутливість тест-системи “ІФА-АтВЕБ-стрип” визначали шляхом порівняння результатів чотириразового дослідження 15 сироваток, що містять IgG до ВЕБ, в ній та двох тест-системах порівняння, зазначених вище. Відмічена розбіжність у випадку сироватки № 8, тобто чутливість тест-системи “ІФА-АтВЕБ-стрип” становить 96 %.

Таким чином, створений лабораторний зразок першої вітчизняної імуноферментної тест-системи для виявлення антитіл (IgG або IgM) проти вірусу Епштейна-Барр, який дістав назву “ІФА-АтВЕБ-стрип” та оптимізовані умови проведення всіх етапів аналізу. Вона має високі показники специфічності та чутливості, за якими не відрізняється від зарубіжних тест-систем.

Було проведене порівняння результативності ТІФА з використанням розроблюваної тест-системи і реакції Пауля-Бунеля, як методів визначення антитіл до ВЕБ. Неспецифічна реакція Пауля-Бунеля, яка на сьогодні ще застосовується для діагностики інфекційного мононуклеозу в клініках України, заснована на реакції аглютинації баранячих еритроцитів, вона не може виявити збудник або антитіла до нього, а визначає лише реакцію організму на зміни в структурі моноцитів під впливом ВЕБ, які з'являються в організмі при хворобі. Тобто, відсутнє диференційне визначення того, чим викликане захворювання на інфекційний мононуклеоз (ВЕБ, цитомегаловірусом чи іншими чинниками), а отже і направленої терапії в даному випадку не може бути. Сконструйована нами імуноферментна тест-система “ІФА-АтВЕБ-стрип” дозволяє виявляти в сироватках крові саме антитіла до ВЕБ, тобто дозволяє виявляти ВЕБ як етіологічного чинника захворювання. В пропонованій тест-системі “ІФА-АтВЕБ-стрип” та неспецифічній реакції Пауля-Бунеля порівняно досліджена серія сироваток хворих, які мали клінічні ознаки інфекційного мононуклеозу.

Імуноферментна тест-система в порівнянні з реакцією Пауля-Бунеля дозволила визначити вищу кількість позитивних сироваток серед хворих, яким за клінічним показниками був поставлений діагноз інфекційного мононуклеозу або була підозра на наявність цього захворювання і необхідність у підтвердженні діагнозу серологічними методами. Це свідчить про більшу результативність пропонованого методу у порівнянні з реакцією Пауля-Бунеля. Окрім більшого числа виявлення позитивних сироваток, перевагою ТІФА є можливість диференційного визначення специфічних до ВЕБ імуноглобулінів класу IgM та IgG як показників стадії розвитку хвороби, що є зокрема недоступним для реакції Пауля-Бунеля

Визначення рівня антигенної спорідненості ВЕБ з іншими герпетичними вірусами. Метою наступного етапу дослідження було визначення рівня антигенної спорідненості вірусу Епштейна-Барр з іншими представниками цієї родини, а саме вірусом герпесу звичайного 1-го типу (ВГЗ-1), цитомегаловірусом (ЦМВ), вірусом оперізуючого лишаю (ВОЛ) в сконструйованій нами твердофазній імуноферментній тест-системі “ІФА-АтВЕБ-стрип”. Визначення рівня перехресних реакцій - важливий елемент при створенні тест-системи для підтвердження специфічності тест-системи та одержання вірогідних результатів. Для цього застосовували кілька варіантів ІФА: конкурентний (одномоментний та послідовний) та непрямий ІФА з використанням зазначених вище тест-систем до ВГЗ-1, ЦМВ, ВОЛ. На рис.2 представлені результати одномоментного конкурентного ІФА. Показано, що антитіла до ВГЗ-1, ЦМВ, ВОЛ незначно інгібують взаємодію антигенів ВЕБ, сорбованих на планшеті, з антитілами до ВЕБ, бо майже не знижується показник оптичної густини в гомологічній системі (антитіла до ВГЗ-1 на 2,4%, антитіла до ЦМВ на 4,1%, антитіла до ВОЛ на 2,2%). Подібні результати одержані в дослідах за іншими схемами ІФА.

Отже, встановлений незначний рівень антигенної спорідненості ВЕБ з ВГЗ-1, ЦМВ та ВОЛ у разі використання розробленої нами ІФА тест-системи.

Вивчення рівня імунітету до вірусу Епштейн-Барр серед різних груп населення м. Києва. На основі розробленої тест-системи “ІФА-АтВЕБ-стрип” досліджений рівень імунітету до ВЕБ серед різних груп населення м, Києва, зокрема: здорового населення (донори, вагітні жінки), хворих на інфекційний мононуклеоз (дорослі та діти), ВІЛ-інфікованих з лімфомою Беркітта та хворих на туберкульоз. Всього проведено скринінг близько двох тисяч сироваток та 45 серій “Імуноглобуліну людини нормального” виробництва ДКПВБП “Біофарма”, кожна з яких готується з близько 1000 індивідуальних сироваток чи плазми крові людини. Одержані дані свідчать про досить високий рівень імунітету до ВЕБ мешканців м. Києва.

Представлені вище результати дослідження сироваток хворих на лімфому Беркітта, що являли собою панель сироваток від хворих на СНІД з даним захворюванням. Данні сироватки були раніше опротестовані в комерційних тест-ситемах на наявність антитіл до ВЕБ. Зокрема дані сироватки містили антитіла до нуклеарного та капсидного антигенів ВЕБ. Одержані позитивні результати в тест-системі “ІФА-АтВЕБ-стрип” свідчать про можливість застосування розробленої тест-системи при діагностиці лімфопроліферативних захворювань спричинених вірусом Епштейна-Барр.

Таким чином, з використанням розробленої тест-системи “ІФА-АтВЕБ-стрип” отримані дані про досить широку циркуляцію вірусу Епштейна-Барр в досліджуваному регіоні.

Проведені незалежні лабораторно-клінічні випробування створеної тест-системи “ІФА-АтВЕБ-стрип” в вірусологічній лабораторії КМТМО “Санепідслужба” м. Києва, досліджені сироватки крові різних груп населення (97 сироваток хворих на інфекційний мононуклеоз, 90 сироваток хворих на гематологічні захворювання, 540 сироваток крові здорових мешканців м. Києва) на наявність антитіл до вірусу Епштейна-Барр. Крім того, 19 сироваток крові різних груп були додатково протестовані у використаній імуноферментній тест-системі та в референс-тест-системі “Platelia EBV EBNA IgG” (Sanofi diagnostics Pasteur, France). Імуноглобуліни класів G та M до ВЕБ виявлені в 120 сироватках крові з різних груп, тобто незалежно підтверджена ефективність імуноферментної тест-системи “ІФА-АтВЕБ-стрип”.



ВИСНОВКИ

1. Створена перша вітчизняна тест-система “ІФА-АтВЕБ-стрип” для виявлення антитіл (IgG та IgM) до ВЕБ, в якій використаний отриманий за авторською методикою антиген з лізату лімфобластоїдних клітин В95-8 і показана наявність в ньому кількох вірусних білків.

2. Розроблені оптимальні умови проведення всіх етапів імуноферментної реакції з використанням цього антигену.

3. Створені панелі позитивних та негативних сироваток, які гарантовано містять або не містять антитіла до вірусу Епштейна-Барр.

4. Визначені основні параметри створеної тест-системи: специфічність складає 100 %, чутливість - 96 % та розроблені критерії оцінки одержаних результатів.

5. Вивчені рівні антигенної спорідненості вірусу Епштейна-Барр з вірусом герпесу звичайного 1-го типу, цитомегаловірусом, вірусом оперізуючого лишаю, які становили відповідно 2,4 %, 4,1 % та 2,2 %.

6. З використанням розробленої тест-системи “ІФА-АтВЕБ-стрип” було досліджено понад 2 000 сироваток, з них: хворих на інфекційний мононуклеоз 928; хворих на туберкульоз 176; хворих на лімфопроліферативні захворювання 20; здорового населення (донори, здорові вагітні жінки) 912, також досліджені 45 серій “Імуноглобуліну людини нормального” виробництва ДКПВБП “Біофарма”.

7. Визначені високі рівні антитіл до ВЕБ в сироватках обстежених груп населення, що свідчить про досить значну циркуляцію цього вірусу. Показана можливість використання тест-системи “ІФА-АтВЕБ-стрип” для діагностики захворювань, спричинених вірусом Епштейна-Барр.

8. Розроблена аналітично-нормативна документація на тест-систему “ІФА-АтВЕБ-стрип”, а саме проекти “Інструкції по виготовленню та контролю імуноферментної тест-системи ”ІФА-АтВЕБ-стрип””, проект “Інструкції по використанню іммуноферментної тест-системи “ІФА-АтВЕБ-стрип””, проект Тимчасомвої Фармакопейної статті на панелі позитивних та негативних сироваток до вірусу Епштейна-Барр.



ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ ВИКЛАДЕНО У ПУБЛІКАЦІЯХ

1. Загородня С.Д., Нестерова Н.В., Дяченко Н.С., Баранова Г.В., Рибалко С.Л., Іванська Н.В., Василенко Л.Г. Конструювання імуноферментної тест-системи для виявлення антитіл проти вірусу Епштейна- Барр // Мікробіол. Журн. - 2001. - N6. - C.61-70.

2. Загородня С.Д., Нестерова Н.В., Баранова Г.В., Рыбалко С.Л., Василенко Л.Г., Руденко А.А. Обнаружение антител к вирусу Эпштейна-Барр в сыворотках крови доноров и больных инфекционным мононуклеозом // Бюлетень Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН. - Чернігів, 2000. - N7.- C.53.

3. Н.С. Дяченко, К.В.Курищук, Л.С.Рядская, Н.И.Нетреба, С.П.Писарева, Э.Г.Михайлова, Н.В.Нестерова, С.Д. Загородняя, Н.Я.Спивак, В.П.Лозицкий, В.В.Смирнов. Специфические иммуноглобулины как эффективные препараты для лечения вирусных инфекций: современное состояние и насущные задачи. // Мікробіол. Журн. - 2002. - 63,N1. - с.3-10.

4. Загородня С.Д., Нестерова Н.В., Баранова Г.В. Дослідження антигенної спорідненості вірусу Епштейна-Барр з іншими герпес вірусами. // Вісник Біологія. Вип. 35, Київський Національний Університет ім. Тараса Шевченка.-2001.- С.40-43.

5. Загородня С.Д., Дяченко Н.С., Рыбалко С.Л., Повница О.Ю., Руденко А.А., Василенко Л.Г. Некоторые подходы к созданию иммуноферментной тест-системы для обнаружения антител против вируса Эпштейна-Барр // ІІ Науково- практична конференція „Бiоресурси та віруси”. - К., 1998. - С.60.

6. S. Zagorodnya, N. Nesterova, N. Dyachenko, S. Rybalko Revealing of Epstein-Barr virus (EBV) antibodies in sera of healthy population // “Матеріали II з'їзду онкологів країн СНД”. - К., 2000. - c.195.

7. S. Zagorodnya N. Nesterova, N. Dyachenko, A. Kollos Revealing of antibodies to Epstein-Barr virus (EBV) in sera of patients with infectious mononucleosis, tuberculosis and HIV infection. // 11th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Istanbul (Turkey), 1-5 маy, 2001. - Istanbul, 2001. - P.764.

8. Загородня С.Д., Нестерова Н.В., Баранова Г.В. Исследование антигенного родства вируса Эпштейна-Барр с другими герпесвирусами // ІІІ Науково- практична конференцiя „Бiоресурси та віруси” - К., 2001. - С.50.

9. Загородня С.Д., Дяченко Н.С., Нестерова Н.В., Баранова Г.В., Рибалко С.Л., Василенко Л.Г. С.Д. Загородняя, Н.С Технология получения специфического антигена для иммуноферментной тест-системы на антитела к вирусу Эпштейна-Барр и критерии её качества. // Международная научно-практическая конференция “Новые технологии получения и применения биологически активных веществ” (Алушта, 20-25 мая 2002.). - Алушта. - 2002- с.118.

10. Пат. UA№40966А. Тест-система на виявлення антитіл проти вірусу Епштейна-Барр “ІФА-АтВЕБ-стрип”. // Загородня С.Д., Дяченко Н.С., Нестерова Н.В., Баранова Г.В., Рибалко С.Л., Василенко Л.Г., Іванська Н.В. Бюлет. №7. - 15.08.2001.

Размещено на Allbest.ru

...