Зміни окиснювального метаболізму та сперматогенної функції сім’яників щурів при хронічній інтоксикації нітратом натрію

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

УДК 616-008.9-092.9:615.916'175

Зміни окисНювального метаболізму ТА сперматогенної функції сім'яників ЩУРІВ ПРИ ХРОНІЧНІЙ ІНТОКСИКАЦІЇ НІТРАТОМ НАТРІЮ

14.03.04. - патологічна фізіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

ДЕНИСЕНКО СОФІЯ ВАЛЕРІЇВНА

Київ 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі патологічної фізіології Української медичної стоматологічної академії (м. Полтава). Міністерство охорони здоров'я України.

Науковий керівник: доктор медичних наук Костенко Віталій Олександрович, Українська медична стоматологічна академія, доцент кафедри патологічної фізіології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук Маньковська Ірина Микитівна, Інститут фізіології iм. О.О.Богомольця НАН України, провідний науковий співробітник відділу по вивченню гiпоксичних станів

доктор медичних наук, професор Попова Лариса Олександрівна, Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика, професор кафедри спортивної медицини та санології

Провідна установа: Інститут ендокринології та обміну речовин iм. В.П. Комісаренка АМН України

Захист відбудеться 6 травня 2003 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології iм. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології iм. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024 м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий “5” квітня 2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук Сорокiна - Марiна З.О.

Загальна характеристика роботи

Експерименти виконані на 210 білих щурах-самцях та 20 самках (останні для дослідження репродуктивної здатності тварин) лінії Вістар масою 180-250 г. Проведено п'ять серій дослідів: у першій серії необхідні показники вивчали в інтактних тварин (контрольна серія); у другій, третій, четвертій і п'ятій серіях - після введення нітрату натрію (у дозі 200 мг/кг маси тіла інтрагастрально за допомогою спеціального зонду) протягом відповідно 2-х тижнів, 1-го, 3-х і 6-ти місяців. Білих щурів декапітували під ефірним наркозом і вилучали потрібні органи і тканини.

Біохімічні та біофізичні методи дослідження. Вміст аденозинтрифосфату (АТФ) визначали за методом Beutler (1975), в основі якого знаходиться вимірювання оптичної густини реагуючих речовин, яка пропорційна вмісту АТФ у пробі. Вміст аденозинди- та монофосфату (АДФ і АМФ) визначали за методом Javoreck et al. (1974) в одній пробі за допомогою сполучених реакцій. Вміст неорганічного фосфату (Фн) визначали за методом Мєшкової та Северина (1950). Енергетичний потенціал розраховували за формулою Atkinson (1968).

Для одержання мітохондрій сім'яники після видалення вміщували на 3-5 хв в охолоджене середовище виділення (-2-0^оС) такого складу: 10 мМ трис HCl, 0,3 М сахарози, 0,5 мМ EДTА, pH = 7,4. Гомогенат сім'яників центріфугували в кутовому роторі рефрижераторної центрифуги ЦЛР-1 протягом 10 хв при 600 g для осадження незруйованих в процесі гомогенізації клітин і їх фрагментів. Супернатант центріфугували 20 хв при 8000 g. Всі операції, пов'язані з отриманням гомогенату та виділенням мітохондрій, проводили при температурі 0 - +2^оС. Дихальну та фосфорилюючу активність мітохондрій вимірювали за Chance та Williams (1955) за допомогою закритого платинового кисневого електроду Кларка на полярографі LP-7E.

За графіками споживання кисню обчислювали швидкість фосфорилюючого дихання (V₃, в метаболічному стані 3 за Чансом - в присутності субстрату, кисню і AДФ), контрольованого дихання (V₄, в метаболічному стані 4 за Чансом - після фосфорилювання всієї кількості внесеного AДФ) і розмежованого дихання (Vр, при додаванні до інкубаційного середовища роз'єднувача - 50 мкМ 2,4-динітрофенолу). Крім цього обчислювали показники, що характеризують ступінь спряження окиснення і фосфорилювання (дихальний контроль за Чансом, коефіцієнт ефективності фосфорилювання AДФ/O). В деяких серіях дослідів оцінювали вплив бичачого сироваткового альбуміну (БСА) (кінцева концентрація 0,2%) на функціональний стан мітохондрій, що давало орієнтовне уявлення про вміст в мітохондріальній зависі вільних жирних кислот (ВЖК) і ступеню їх розмежуючої дії на дихання та фосфорилювання (Чумаков В.Н., Крупеникова Л.И., 1986).

Утворення супероксидного аніон-радикалу оцінювали при проведенні тесту з нітросинім тетразолієм (НСТ) у модифікації Цебржинського (2002) з використанням мікроФЕК МКМФ-1 у гомогенаті тканини з індукторами у виді НАДН (для оцінки продукції супероксидного аніон-радикала мітохондріальним електронно-транспортним ланцюгом), НАДФН (мікросомальним електронно-транспортним ланцюгом) та пірогенала (фагоцитами).

Спектри ЕПР реєстрували за допомогою радіоспектрометру АЭ-4700 при значенні фактору g=2,007, що відповідає комплексам оксиду азоту з гемовим і негемовим залізом (Ажипа Я.И., 1983).

Рівень пероксидного окиснення ліпідів у тканинах оцінювали по утворенню в реакції тіобарбітурової кислоти (ТБК) з ТБК-активними продуктами забарвленого триметінового комплексу до і після 1,5-годинної інкубації (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972). Активність антиоксидантної системи оцінювали за приростом концентрації ТБК-активних продуктів за час півторагодинної інкубації у залізоаскорбатному буферному розчині, а також за активністю антиоксидантних ферментів - супероксиддисмутази (СОД) (Брусов О.С., Герасимов А.М., Панченко Л.Ф., 1976) та каталази (Архипова О.Г., 1988).

Морфологічні та функціональні методи дослідження. Визначали масу сім'яників і обчислювали ваговий коефіцієнт. Зрізи фарбували гематоксилін-еозином і вивчали за умов світлової мікроскопії. Окремі деталі тканинної організації досліджували в гістологічних препаратах, забарвлених за Ван-Гізоном або толуїдиновим синім.

Морфологічну оцінку стану сперматогенного епітелію проводили за кількісними показниками, одержаними при мікроскопії препаратів, пофарбованих гематоксилін-еозіном. Індекс сперматогенезу обчислювали, досліджуючи 100 канальців і визначаючи наявність у канальці певних стадій розвитку клітин (сперматогоній, сперматоцитів, сперматид і сперматозоїдів). Визначали сумарну кількість нормальних сперматогоній, кількість канальців зі злущеним сперматогенним епітелієм та із 12-ю стадією мейозу.

Кількість і функціональний стан сперматозоїдів визначали за Базарновою (1988). В нативних препаратах за умов світлової мікроскопії з віконцем Фоніо серед 100 сперматозоїдів підраховували відсоток клітин із швидким поступальним рухом (50 мкм/с) (нормокінезія), повільним поступальним рухом (гіпокінезія); нерухомих (акінезія) та коливальним невпорядкованим рухом (дискінезія). Життєздатність сперматозоїдів визначали в умовах еозинового тесту.

Вивчення репродуктивної здатності щурів проводили за методом Сєрової (2001). У відібраних інтактних самок з нормальним циклом визначали еструс та кожного самця парували з двома самками. Самцям попередньо вводили з водою нітрат натрію у дозі 200 мг/кг щодня протягом трьох місяців. Самок виводили з досліду на 20-й день вагітності. При дослідженні матки реєстрували кількість місць імплантації та резорбції, живих і дегенеруючих плодів.

Дані експериментів обробляли методами варіаційної статистики з використанням критерію Ст'юдента.

Результати досліджень та їх обговорення

1. Зміни окиснювального метаболізму в сім'яниках і крові білих щурів за умов хронічної інтоксикації нітратом натрію

Через 2 тижні від початку введення білим щурам нітрату натрію відзначається зміна співвідношення аденіннуклеотидів, що супроводжується збільшенням величини енергетичного потенціалу (ЕП) на 7,4% (р<0,05). Посилення ресинтезу макроергів також підтверджує зменшення концентрації АМФ (на 85,7%, р<0,001). Такі зміни, вочевидь, відображують активацію біоенергетичних процесів при адаптації організму до впливу токсичного агенту.

Через 1 міс від початку введення білим щурам нітрату натрію відмічається суттєве зниження концентрації АТФ на 27,9% (р<0,01) та ЕП на 6,2% (р<0,05). Вміст Фн зростає на 35,4% (р<0,02), що свідчить про обмеження активності ресинтезу АТФ у тканинах сім'яників. Дана спрямованість зрушень зберігається в динаміці розвитку хронічної нітратної інтоксикації. Найбільш тяжкі порушення біоенергетичних процесів відмічаються за умов 6-місячного введення нітрату натрію. В цей період інтоксикації спостерігається зменшення вмісту АТФ на 44,6% (р<0,01), суми аденіннуклеотидів - на 30,0% (р<0,01), ЕП - на 12,9% (р<0,001). Вміст АМФ та Фн зростає відповідно на 35,7% (р<0,01) та 49,2% (р<0,05).

Як бачимо, тривале введення надлишкової кількості нітратів справляє інгібуючу дію на енергетичний метаболізм у сім'яниках лабораторних тварин. У динаміці змін енергетичного обміну в сім'яниках при хронічній нітратній інтоксикації відмічається певна фазність: період активації біоенергетичних процесів, що виявляється зростанням енергетичного потенціалу, змінюється через 1 міс експерименту періодом їх прогресуючого пригнічення.

Після введення в організм білих щурів нітрату натрію протягом 2-х тижнів відмічається підвищення на 19,6% швидкості ендогенного дихання мітохондрій, які виділені з клітин сім'яників. Це, очевидно, пов'язано з компенсаторним зростанням надходження до мітохондрій субстратів окиснення. Суттєвих змін швидкостей дихання в метаболічних станах 3 і 4 за Чансом, дихального контролю та коефіцієнту АДФ/O в цей період не виявляється.

Через 1 міс від початку введення щурам нітрату натрію відмічається суттєве зниження швидкості фосфорилюючого та розмежованого дихання (відповідно на 19,0 та 25,2%), а також дихального контролю (на 12,5%). Одержані результати свідчать як про зниження функціонального стану АТФ-синтази, так й про інгібування активності ферментів дихального ланцюга. Це узгоджується з даними літератури стосовно ролі продукту метаболізму нітрит-іонів оксиду азоту (II) в порушенні процесів мітохондріального дихання та фосфорилювання в клітинах печінки, нирок і слинних залоз ссавців (Костенко В.О., 1995; Глєбова Л.Ю., 1997; Бондаренко В.В., 2001).

Водночас привертає увагу, що дихальний контроль при додатковому введенні до інкубаційного середовища БСА, що зв'язує ВЖК, суттєво не змінюється порівняно з даними контрольної серії. Таким чином, певну роль у порушенні спряження мітохондріального окиснення та фосфорилювання в сім'яниках через 1 міс хронічної інтоксикації нітратом натрію відіграє накопичення в тканинах ВЖК.

Тяжкі порушення процесів мітохондріального окиснення та фосфорилювання в сім'яниках білих щурів відмічаються за умов 3-місячного введення нітрату натрію. В цей період суттєво знижуються швидкості фосфорилюючого та розмежованого дихання (відповідно на 23,9 та 25,6%), дихального контролю та коефіцієнта ефективності фосфорилювання (відповідно на 19,7 та 25,6%). При внесенні до середовища інкубації БСА вірогідних змін досліджених полярографічних показників не виявлено. Це свідчить про відсутність суттєвої ролі накопичення ВЖК у роз'єднанні мітохондріального окиснення та фосфорилювання АДФ у цей період інтоксикації.

Таким чином, в динаміці змін мітохондріального окиснення та фосфорилювання в сім'яниках білих щурів при надлишковому введенні в організм нітрату натрію відмічається певна фазність: через 2 тижні інтоксикації - спостерігаються компенсаторні зміни (зростання швидкості ендогенного дихання, енергетичного потенціалу), через 1 і 3 місяці - прогресуюче зниження концентрації АТФ, енергетичного потенціалу, пригнічення функціональної активності ферментів дихального ланцюга, роз'єднання мітохондріального окиснення та фосфорилювання АДФ. Накопичення ВЖК справляє роз'єднуючу дію на мітохондріальне дихання та фосфорилювання при хронічній інтоксикації нітратом натрію тривалістю 1 місяць.

Через 2 тижні від початку введення щурам нітрату натрію відмічається вірогідне зростання загального фону продукції супероксидного аніон-радикалу на 36,1% (р<0,05) та його утворення мітохондріальним електронно-транспортним ланцюгом на 32,2% (р<0,02).

Зростання продукції супероксидного аніон-радикалу мітохондріальним електронно-транспортним ланцюгом на 23,2% (р<0,05) спостерігається й через 1 міс після початку введення в організм білих щурам нітрату натрію. В цей період спостерігається підвищення сигналу ЕПР (фактор g=2,007), що реєструється при взаємодії оксиду азоту з гемовим та негемовим залізом. При цьому число спінів змінюється з 69,786,1710¹³ (у контрольній серії) до 137,4024,8510¹³ (р<0,05), тобто, зростає на 96,9%. Водночас існує зворотна кореляційна залежність між рівнем залізо-нітрозильних комплексів та величинами швидкості фосфорилюючого дихання і дихального контролю (відповідно r = -0,84 і -0,68).

Після 3-місячного введення нітрату натрію відмічається суттєве підвищення як загального фону продукції супероксидного аніон-радикала на 58,3% (р<0,001) і його утворення мітохондріальним електронно-транспортним ланцюгом на 41,1%, (р<0,01), так і зростання продукції.О мікросомальним електронно-транспортним ланцюгом на 33,7%, (р<0,01). Утворення.О при використанні пірогеналу, що дозволяє оцінити внесок НАДФН-оксидазної системи лейкоцитів в процес продукції активних форм кисню (АФК), при дослідженні через 2 тижні, 1 і 3 місяці нітратної інтоксикації істотно не відрізняється від даних контрольної серії. У цей період рівень сигналу ЕПР при факторі g=2,007 не перевищує дані контрольної серії та на 42,2% поступається результату, що отриманий при дослідженні тканин щурів після місячної інтоксикації.

Виявлене зниження сигналу ЕПР, очевидно, пов'язане зі зменшенням “депонування” NO у вигляді залізо-нітрозильних комплексів внаслідок взаємодії з супероксидним аніон-радикалом, який накопичується в цей період, з утворенням реакційного пероксинітриту (Szabo C. et al., 1996).

Після 6-місячного введення нітрату натрію зростання загального фону продукції супероксидного аніон-радикалу, його продукції мітохондріальним та мікросомальним електронно-транспортними ланцюгами зростає та перевищує дані контрольної серії відповідно на 69,4% (р<0,01), 44,6% (р<0,01) та 47,6% (р<0,001). На відміну від попередніх термінів спостереження після 6-місячного введення нітрату натрію відмічається вірогідне зниження на 25,9% (р<0,05) утворення.О при використанні пірогеналу, що свідчить про обмеження функціональної активності НАДФН-оксидази лейкоцитів у цей період експерименту.

Таким чином, у динаміці хронічної інтоксикації нітратом натрію в сім'яниках білих щурів відзначається прогресуюче збільшення загального фону продукції АФК, зокрема, продукції супероксидного аніон-радикалу мітохондріальним та мікросомальним електронно-транспортним ланцюгами. В ранні терміни (2 тижні - 1 місяць від початку введення нітрату натрію) зростання продукції активних форм кисню та азоту пов'язане з посиленим утворенням супероксидного аніон-радикалу мітохондріальним електронно-транспортним ланцюгом та утворенням вільнорадикального продукту метаболізму нітратів - оксиду азоту (NO^.). Після 6-місячного введення нітрату натрію продукція АФК НАДФН-оксидазою лейкоцитів знижується.

Через 2 тижні та 1 місяць від початку введення в організм білих щурів нітрату натрію вірогідних змін утворення ТБК-реактантів не виявлено. Це, очевидно, пов'язано з компенсаторним підвищенням антиоксидантного потенціалу, зокрема, з вірогідним зростанням відповідно на 34,8 і 38,0% (р<0,05) активності СОД. Такий розвиток процесів пояснюється тим, що біосинтез СОД індукується субстратом (тобто супероксидним аніон-радикалом) (Feher J. et al., 1987; Поберезкина Н.Б., Осинская Л.Ф.,1989), а, як було відмічено раніше, в цьому терміні інтоксикації суттєво зростає його продукція.

Активність СОД знаходиться у взаємозв'язку з активністю іншого антиоксидантного ферменту - каталази, яка індукується на генному рівні пероксидом водню (Ponrdenz E., Kahl R., 1998). СОД забезпечує каталазу субстратом, а остання регенерує кисень для потреб клітини (Панченко Л.Ф., Герасимов А.М., Антоненко Г.Д., 1981). Проте замість очікуваного зростання активності каталази після 1-місячної інтоксикації нітратом натрію виявляється зниження каталазного показника на 36,0% (р<0,05). Одним із можливих механізмів зниження активності вказаного ферменту є блокування йону заліза його активного центра оксидом азоту (NO), що утворюється в процесі метаболізму нітрит-іонів. На це вказує, зокрема, підвищена в цей період величина рівня парамагнітних комплексів NO з гемовим та негемовим залізом. Справедливість такої думки підкреслює встановлена нами зворотна кореляційна залежність між рівнем цих комплексів та значенням каталазного показника (r=-0,74).

При відтворенні 3-місячної інтоксикації нітратом натрію відмічається зростання концентрації ТБК-реактантів до інкубації на 30,9% (р<0,05), а після 1,5-часовой інкубації в залізоаскорбатному буферному розчині - на 39,3% (р<0,01). Це свідчить про існування суттєвої активації процесів ПОЛ у тканинах сім'яників лабораторних тварин. У даний період вірогідно підвищується приріст концентрації ТБК-реактантів за час інкубації (на 61,8%, р<0,001), що вказує на зменшення антиоксидантного потенціалу в тканинах сім'яників. Зокрема, активність каталази прогресивно знижується та поступається контролю на 70,2% (р<0,001). Разом з тим, активність СОД на 44,7% (р<0,02) перевищує дані контрольної серії.

Зростання процесів пероксидації відмічається й після 6-місячної інтоксикації нітратом натрію. При цьому концентрація ТБК-реактантів зростає до інкубації на 47,3% (р<0,01), а після 1,5-годинної інкубації в залізоаскорбатному буферному розчині - на 59,6% (р<0,001). Приріст концентрації ТБК-реактантів за час інкубації вірогідно перевищує на 91,6% (р<0,001) значення контрольної серії. Це свідчить, що має місце посилення антиоксидантної недостатності. В даному терміні інтоксикації відсутнє зростання активності СОД, а активність каталази поступається величині контролю на 81,6% (р<0,001).

Таким чином, надлишкове введення нітратів у дозі 200 мг/кг призводить до суттєвої активації процесів ПОЛ та зменшення антиоксидантного потенціалу сім'яників через 3 місяці хронічної інтоксикації. В більш ранні терміни (після 1-місячного введення нітрату натрію) вірогідно знижується активність залізовмісних антиоксидантних ферментів (каталази). Активність СОД підвищується в динаміці хронічної інтоксикації нітратом натрію в період від 2-х тижнів до 3-х місяців.

Стадійні зміни процесів пероксидації при хронічній нітратній інтоксикації, очевидно, є неспецифічним компонентом її патогенезу і носять системний характер, оскільки нами виявлений певний паралелізм зрушень ПОЛ і антиоксидантного захисту в сім'яниках і крові тварин.

2. Порушення сперматогенної функції білих щурів-самців за умов хронічної інтоксикації нітратом натрію

Після 3-місячної інтоксикації нітратами виявлені морфологічні зміни сім'яників, які характеризуються потовщенням септ звивистих сім'яних канальців, які мають більш щільний волокнистий шар. Фолікулярні клітини Сертолі більш пухкіші, але в той же час більші за розмірами в порівнянні з аналогічними в контролі. Інтерстицій яєчка значно потовщений порівняно з таким у щурів контрольної групи. Поряд із існуванням полів клітинного спустошення спостерігаються окремі канальці, де виявлені ділянки розростання фіброзної тканини у вигляді полів з інтерстиціальними клітинами та великою кількістю фібробластів. В адлюмінальному шарі сім'яних канальців спостерігається інверсія форми клітин та вакуолізація цитоплазми. У каналі придатку на власній пластині виявлено двохрядний епітелій, плоскіший за норму. Сам канал розширений, стінки його розтягнуті й містять велику кількість фіброзної тканини.

На основі морфометричного аналізу виявлено, що 2-тижневе введення нітрату натрію не викликає вірогідних змін сперматогенного епітелію порівняно з контролем. Продовження токсичного впливу до 1 міс посилює деструктивні явища в канальцях. Це виявляється збільшенням кількості канальців зі злущеним епітелієм в 2,9 рази (р0,05) порівняно з контролем. Частка канальців з атрофічним чи пошкодженим епітелієм також зростає в 1,5 рази (р0,25). За цих умов кількість канальців у фазі росту перевищує контрольний рівень на 27% (р0,05), а кількість канальців у фазі дозрівання виявляється на 46% (р0,05) нижчою за контроль.

Введення щурам-самцям нітрату натрію протягом 3-х місяців поглиблює порушення сперматогенного епітелію. Це виявляється подальшим збільшенням кількості канальців зі злущеним або атрофічним епітелієм відповідно в 4,2 рази (р0,05) та в 2,1 рази (р0,05) порівняно з контролем. Спостерігається подальше зниження кількості канальців із 4-ма шарами епітелію (р0,01). Разом із цим, підвищується на 37% (р0,01) кількість канальців із 3-ма шарами епітелію. За цих умов індекс сперматогенезу знижується на 13% (р0,05).

Аналогічні зрушення мають місце й після 6-місячного введення щурам нітрату натрію. В даному випадку кількість канальців зі злущеним епітелієм в 4,5 рази (р0,05) більша за таку в контролі. Кількість канальців із пошкодженим або атрофічним епітелієм перевищує показники контрольної групи в 2,2 рази (р0,05). Частка канальців у фазі росту збільшується на 39% (р0,05), а частка канальців у фазі дозрівання - зменшується на 78% (р0,01). Одержані показники близькі до таких при 3-місячній інтоксикації. Це вказує, що комплекс морфофункціональних порушень сперматогенного епітелію, викликаних нітратом натрію, формується протягом 1-3-х місяців від початку введення токсиканту.

Таким чином, за умов надлишкового надходження нітрату натрію до організму щурів-самців, починаючи з 1-го місяця інтоксикації, формується комплекс морфологічних порушень у сім'яниках у вигляді дистрофічних змін з елементами компенсаторної гіперплазії. Відбувається спустошення сім'яних канальців, пошкодження сперматогенного епітелію, особливо на кінцевих етапах його розвитку, що характеризується зниженням індексу сперматогенезу. Дегенеративні зміни сперматогенного епітелію, очевидно, посилюються внаслідок дистрофічних змін у судинах мікроциркуляторного русла. Оскільки остаточне формування сперми відбувається в придатку, слід вважати, що дистрофічні процеси в стінці каналу придатку є ще одним виявом негативного впливу надлишку нітратів на репродуктивну сферу самців.

Дослідження сперматограм показує, що 2-тижневе введення нітрату натрію не викликає істотних змін загальної кількості сперматозоїдів, їх життєздатності і абсолютної кількості патологічних форм. Водночас серед патологічних форм сперматозоїдів зменшується в 1,6 рази (р0,05) частка клітин із патологією хвоста, що може бути наслідком зростання “питомої ваги” інших дегенеративних форм. Абсолютні значення кількості окремих видів патологічних форм сперматозоїдів у даному терміні інтоксикації лишаються на рівні контролю. Спостерігається поява сперміїв із дискінетичним характером руху.

Через 1 міс від початку введення тваринам нітрату натрію загальна кількість сперматозоїдів зменшується на 21% (р0,05) порівняно з контролем. Водночас на 37,5% зростає кількість патологічних форм сперматозоїдів. Серед дегенеративних форм сперміїв переважають клітини з патологією голівки і тіла. Ця патологія представлена мікро- і макроголівками, подвоєнням голівок, змінами розподілу в них хроматину. Зустрічаються клітини з перегином шийки, масивною шийкою і тілом, спостерігається пригнічення рухливості сперматозоїдів. Після 1-місячного введення щурам-самцям нітрату натрію частка нормокінетичних форм сперматозоїдів зменшується в 1,4 рази (р0,05) порівняно з контролем. Одночасно з цим представництво гіпокінетичних клітин збільшується в 2,1 рази (р0,001). Зростає частка сперматозоїдів з дискінетичним рухом, яких не відмічається в контрольних зразках сперми.

Продовження інтоксикації до 3-х міс викликає подальше зниження загальної кількості сперматозоїдів на 40% (р0,001) порівняно з контролем. Спостерігається збільшення кількості мертвих сперматозоїдів і патологічних форм відповідно на 27% (р0,05) та на 45% (р0,05) порівняно з показниками контрольних щурів. Як і в попередній групі, серед дегенеративних форм сперміїв переважають клітини із патологією голівки. Різко зменшується рухливість сперматозоїдів, при цьому частка нормокінетичних сперміїв зменшується в 2,6 рази (р0,01), а частки гіпо- та акінетичних клітин зростають відповідно в 3,6 рази та 2,3 рази (р0,001).

Після 6-місячного введення нітрату натрію щурам-самцям характер сперматограми близький до такого при 3-місячній інтоксикації. Загальна кількість сперматозоїдів у тварин цієї групи на 44% (р0,01) менша за контроль. Кількість нежиттєздатних клітин збільшується на 24% (р0,05), а кількість патологічних форм - на 32% (р0,05) порівняно з контролем. Серед патологічних форм переважають сперматозоїди з аномаліями голівки. Збільшується абсолютна кількість і частка змішаної патології. Водночас представництво дегенеративних форм із патологією тіла істотно не відрізняється від контролю. За цих умов представництво патологічних форм із аномаліями хвоста як за абсолютною величиною, так і за відсотковим вмістом виявляється нижчим за контроль відповідно в 2,5 рази та 3,25 рази (р0,05). Спостерігається подальше зниження рухливості сперматозоїдів. Серед них частка сперміїв із нормальною швидкістю руху зменшується в 3,2 рази (р0,001) порівняно з контролем. Водночас частка гіпокінетичних сперматозоїдів зростає в 3,2 рази (р0,001), а частка нерухомих клітин збільшується в 3,3 рази (р0,001). Сперматозоїди з дискінетичним рухом становлять 10% кінезисограми.

Таким чином, хронічна інтоксикація нітратом натрію справляє пошкоджуючий вплив на сперму лабораторних тварин. Він полягає в зниженні абсолютної кількості сперматозоїдів, їх життєздатності і рухливості. Перевага патологічних форм із аномаліями голівки вказує, що основною причиною порушень є зміни в сперматогенному епітелії сім'яників (Пастух М.Б., 1996). Динаміка показників сперми протягом 6-ти міс експерименту свідчить, що комплекс морфофункціональних порушень сперми формується протягом 1-3-х міс нітратної інтоксикації і зберігається таким при подальшому введенні нітрату натрію. Це свідчить про вичерпаність регенераторних можливостей і узгоджується з даними стосовно стану сперматогенного епітелію.

Введення нітрату натрію самцям щурів істотно впливає на перебіг ембріо- та фетогенезу у самок, які були паровані з самцями після 3-місячної нітратної інтоксикації. Зокрема, кількість місць імплантації зменшується на 41% (р0,01), кількість місць резорбції підвищується в 2,1 рази (р0,01) порівняно з контролем. Кількість живих плодів поступається контрольній серії на 41% (р0,01), а загальна ембріональна смертність істотно перевищує таку в контролі. Причиною виявлених порушень ембріо- та фетогенезу слід вважати зниження запліднюючої спроможності сперми самців із нітратною інтоксикацією, що може бути наслідком олігоспермії, зниження життєздатності та рухливості сперматозоїдів. Підвищення кількості місць резорбції і показників загибелі плодів може пояснюватися мутагенною дією нітратів на сперматогенний епітелій (Рубенчик Б.Л.,1990).

Таким чином, підвищене надходження нітратів до організму самців призводить до суттєвих розладів ембріо- та фетогенезу в парованих з ними самок, що виявляється в зменшенні місць імплантації та живих плодів, підвищенні кількості місць резорбції та загальної ембріональної смертності.

Висновки

У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що виявляється у визначенні сперматогенної функції сім'яників білих щурів та з'ясуванні ролі розладів енергетичного метаболізму та вільнорадикального окиснення біополімерів у порушенні сперматогенезу за умов хронічної інтоксикації нітратом натрію.

У динаміці змін мітохондріального окиснення та фосфорилювання в сім'яниках білих щурів при надлишковому введенні в організм нітрату натрію відмічається певна фазність: на 14-у добу інтоксикації відмічаються компенсаторні зміни - вірогідне зростання швидкості ендогенного дихання, енергетичного потенціалу, на 30-у та 90-у добу - прогресуюче зниження концентрації АТФ, енергетичного потенціалу, пригнічення активності ферментів дихального ланцюга, роз'єднання мітохондріального окиснення та фосфорилювання АДФ.

У патогенезі роз'єднання мітохондріального окиснення та фосфорилювання АДФ у сім'яниках білих щурів істотну роль відіграє утворення продукту метаболізму нітрат- і нітрит-іонів - оксиду азоту (II). Накопичення вільних жирних кислот у мітохондріях сім'яників білих щурів має роз'єднуючу дію на мітохондріальне дихання та фосфорилювання на 30-у добу хронічної інтоксикації нітратом натрію.

В динаміці хронічної інтоксикації нітратом натрію в сім'яниках білих щурів відзначається прогресуюче збільшення загального фона продукції супероксидного аніон-радикала за рахунок його вироблення мітохондріальним та мікросомальним електронно-транспортними ланцюгами.

В ранні терміни інтоксикації (на 14-30 добу після початку затруєння білих щурів нітратом натрію) зростання продукції активних форм кисню та азоту пов'язано з посиленням утворення мітохондріальним електронно-транспортним ланцюгом супероксидного аніон-радикала та утворенням продукту метаболізму нітрат- та нітрит-іонів - радикалу оксиду азоту (NO^.). Після 6-місячного введення нітрату натрію достовірно знижується продукція супероксидного аніон-радикала НАДФН-оксидазою лейкоцитів.

Надлишкове введення нітратів у дозі 200 мг/кг призводить до суттєвої активації процесів вільно-радикального пероксидного окиснення ліпідів та зниження антиоксидантного потенціалу в сім'яниках білих щурів через 3 місяці хронічної інтоксикації. В більш ранні терміни (після 1-місячного затруєння нітратом натрію) достовірно знижується активність залізовмісних антиоксидантних ферментів (каталази). Активність супероксиддисмутази підвищується в динаміці хронічної інтоксикації нітратом натрію в період від 2-х тижнів до 3-х місяців.

Хронічна інтоксикація нітратом натрію призводить до формування комплексу морфологічних порушень у сім'яниках у вигляді дистрофічних змін та аплазії сперматогенного епітелію, особливо на кінцевих етапах його розвитку, зниження індексу сперматогенезу, розладів у судинах мікроциркуляторного русла.

Хронічна інтоксикація нітратом натрію справляє пошкоджуючий вплив на сперму лабораторних тварин, що відбивається у зниженні абсолютної кількості сперматозоїдів, їх життєздатності та рухливості. Комплекс морфофункціональних порушень сперми формується протягом 1-3-х міс нітратної інтоксикації та зберігається таким при подальшому введенні токсиканту.

Підвищене надходження нітратів у організм самців призводить до суттєвих розладів ембріо- та фетогенезу у парованих з ними самок, що відбивається у зменшенні кількості місць імплантації та живих плодів, підвищенні кількості місць резорбції та загальної ембріональної смертності.

Список опублікованих праць за темою дисертації

Денисенко С.В. Кислородные соединения азота и их место среди негативных влияний на репродукцию // Актуальні проблеми сучасної медицини: Вісн. Укр. мед. стоматол. акад. 2001. Т.1, №1-2. С. 3-5.

Денисенко С.В. Изменения содержания и соотношения адениннуклеотидов в семенниках белых крыс в условиях избыточного поступления в организм нитрата натрия // Актуальні проблеми сучасної медицини: Вісн. Укр. мед. стоматол. акад. 2002. Т.2, №1. С. 16-17.

Денисенко С.В. Пошкодження сперматогенного епітелію сім'яників, зумовлені хронічною нітратною інтоксикацією // Вісн. пробл. біол. і мед. 2002. №6. С. 76-80.

Денисенко С.В. Динаміка змін перекисного окислення ліпідів і антиоксидантного захисту в сім'яниках при хронічній нітратній інтоксикації // Пробл. екол та мед. 2002. Т.6, №5. С. 8-10.

Денисенко С.В. Особливості сперматограми при хронічній інтоксикації нітратом натрію // Вісн. пробл. біол. і мед. 2002. №7-8. С. 38-41.

Денисенко С.В., Костенко В.А. Изменения продукции активных форм кислорода в семенниках белых крыс в условиях хронической интоксикации нитратом натрия // Совр. пробл. токсикологии. 2002. №4. С. 44-46. (Безпосередньо дисертанту належать дані про зміни показників вільнорадикального окиснення у сім'яниках білих шурів, проведений їх аналіз, сформульовано висновки, написаний текст статті).

Денисенко С.В., Костенко В.А. Изменения митохондриального окисления и фосфорилирования в семенниках белых крыс в условиях избыточного поступления в их организм нитрата натрия // Укр. биохим. журн. 2003. №1. С.95-97. (Безпосередньо дисертанту належать дані про зміни показників мітохондріального окиснення та фосфорилювання у сім'яниках білих шурів, рівень/ накопичення залізо-нітрозильних комплексів, проведений аналіз одержаних результатів, сформульовано висновки, написаний текст статті).

Костенко А.Г., Костенко В.О., Цебржинський О.І., Глєбова Л.Ю., Бондаренко В.В., Міщенко А.В., Денисенко С.В., Романцев О.Ю. Роль зміни прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу в розвитку різних патологічних процесів / Мат. III Національного Конгресу патофізіологів України з міжнародною участю // Фiзiол. журнал.2000. Т.46. 2, Додат. С. 82-83. (Безпосередньо дисертанту належать дані про зміни прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу в сім'яниках в умовах хронічної нітратної інтоксикації).

Денисенко С.В., Бондаренко В.В., Глєбова Л.Ю., Костенко В.О., Цебржинський О.І. Влияние токсических доз нитратов на окислительные и энергетические процессы // Тези доп. I з'їзду токсикологів України: 11-13 жовтня 2001 р. К., 2001. С. 94-95. (Безпосередньо дисертанту належать дані про зміни енергетичного обміну в сім'яниках в умовах хронічної нітратної інтоксикації).

Денисенко С.В., Костенко В.О., Міщенко А.В. Вплив надлишкового введення нітрату натрію на репродуктивну систему щурів-самців різного віку // Тези доп. ІІІ Української конф. молодих вчених, присв. пам'яті академіка В.В.Фролькіса: 28 січня 2002 р. К., 2002. С. 44. (Безпосередньо здобувачу належать дані про зміни сперматогенної функції у білих шурів, сформульовано висновки, написаний текст повідомлення).

Денисенко М.В., Денисенко С.В. Вплив нітратів на розлади репродуктивної функції тварин / Мат. межвузовской конф. “Биоэтика и экология” (Симферополь, 10-11 марта 2003 г.) // Вестн. биоэтики и экологии. 2003. Т.1, №1. С. 26-28. (Безпосередньо дисертанту належать дані про показники репродуктивної функції білих шурів в умовах хронічної нітратної інтоксикації, проведений аналіз одержаних результатів, сформульовано висновки).

Анотація

Денисенко С.В. Зміни окиснювального метаболізму та сперматогенної функції сім'яників щурів при хронічній інтоксикації нітратом натрію. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук зі спеціальності 14.03.04. - патологічна фізіологія. - Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, Київ, 2003.

Дисертацію присвячено визначенню сперматогенної функції сім'яників білих щурів та з'ясуванню ролі розладів енергетичного метаболізму та вільнорадикального окиснення у порушенні сперматогенезу за умов хронічної інтоксикації нітратом натрію. Установлено, що при хронічній нітратній інтоксикації в динаміці змін мітохондріального окиснення та фосфорилювання в сім'яниках має місце певна фазність: на 14-у добу інтоксикації - вірогідне зростання швидкості ендогенного дихання, енергетичного потенціалу, на 30-у та 90-у добу - прогресуюче зниження енергетичного потенціалу, пригнічення активності ферментів дихального ланцюга. Відзначено, що в патогенезі роз'єднання мітохондріального окиснення та фосфорилювання АДФ у сім'яниках щурів істотну роль відіграє утворення продукту метаболізму нітрат-іонів - оксиду азоту (NO^.). В динаміці хронічної інтоксикації нітратом натрію в сім'яниках білих щурів відзначається прогресуюче збільшення продукції супероксидного аніон-радикалу мітохондріальним та мікросомальним електронно-транспортними ланцюгами.

Морфологічними та морфометричними методами дослідження встановлено, що хронічна інтоксикація нітратом натрію призводить до розвитку дистрофічних змін сперматогенного епітелію та розладів мікроциркуляції. Підвищене надходження нітратів до організму самців призводить також до суттєвих розладів ембріо- та фетогенезу в парованих з ними самок.

Ключові слова: хронічна інтоксикація нітратом натрію, сперматогенез, сім'яники, окиснювальний метаболізм.

Аннотация

Денисенко С.В. Изменения окислительного метаболизма и сперматогенной функции семенников крыс при хронической интоксикации нитратом натрия. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.04. - патологическая физиология. - Институт физиологии им. А.А.Богомольца НАН Украины, Киев, 2003.

Диссертация посвящена выяснению сперматогенной функции семенников белых крыс и роли расстройств энергетического метаболизма и свободнорадикального окисления в нарушении сперматогенеза в условиях хронической интоксикации нитратом натрия.

Исследования были проведены на 210 белых крысах-самцах и 20 самках (последние для изучения репродуктивной способности животных) линии Вистар массой 180-250 г в пяти сериях опытов: у интактных крыс (контрольная серия), а также после введения нитрата натрию (в дозе 200 мг/кг массы тела интрагастрально) в течение соответственно 2-х недель, 1-го, 3-х и 6-ти мес.

Состояние окислительного метаболизма и функционального состояния семенников и спермы в тканях оценивали биохимическими, хемолюминесцентными, полярографическими и морфологическими методами исследования.

Установлено, что при хронической нитратной интоксикации в динамике изменений митохондриального окисления и фосфорилирования в семенниках отмечается определенная фазность: на 14-е сут интоксикации - возрастание скорости эндогенного дыхания, энергетического потенциала, на 30-е и 90-е сут - прогрессирующее снижение энергетического потенциала, угнетение активности ферментов дыхательной цепи. Отмечено, что в патогенезе разобщения митохондриального окисления и фосфорилирования АДФ в семенниках крыс важную роль играет образование продукта метаболизма нитрат-ионов - оксида азота (NO^.).

В динамике хронической интоксикации нитратом натрия в семенниках белых крыс отмечается прогрессирующее увеличение продукции супероксидного анион-радикала митохондриальной и микросомальной электронно-транспортными цепями. Избыточное введение нитратов приводит к существенной активации процессов свободно-радикального перекисного окисления липидов (ПОЛ) и снижению антиоксидантного потенциала в семенниках белых крыс через 3 мес хронической интоксикации. В более ранние сроки (после 1-месячной затравки нитратом натрия) достоверно снижается активность железосодержащих антиоксидантных ферментов (каталазы).

Стадийные изменения процессов пероксидации при хронической нитратной интоксикации, очевидно, являются неспецифичным компонентом ее патогенеза и носят системный характер, поскольку отмечается определенный параллелизм сдвигов ПОЛ и антиоксидантной защиты в семенниках и крови животных.

Морфологическими и морфометрическими методами исследования установлено, что хроническая интоксикация нитратом натрия приводит к развитию дистрофических изменений сперматогенного эпителия, снижению индекса сперматогенеза, нарушениям микроциркуляции. Отмечается снижение абсолютного количества сперматозоидов, их жизнеспособности и подвижности. Комплекс морфофункциональных нарушений спермы формируется в течение 1-3-х мес нитратной интоксикации и сохраняется в ходе дальнейшего введения нитрата натрия.

Повышенное поступление нитратов в организм самцов приводит к существенным расстройствам эмбрио- и фетогенеза у спариваемых с ними самок, что проявляется уменьшением количества мест имплантации и живых плодов, повышении числа мест резорбции и общей эмбриональной смертности.

Полученные результаты могут использоваться как экспериментальная база для разработки патогенетически обоснованных методов коррекции нарушений сперматогенеза в условиях избыточного поступления неорганических нитросоединений в организм человека и теплокровных животных.

Ключевые слова: хроническая интоксикация нитратом натрия, сперматогенез, семенники, окислительный метаболизм.

Summary

Denisenko S.V. Changes of oxidative metabolism and spermatogenic function of testicles under chronic intoxication with sodium nitrate. - Manuscript.

Thesis for a Candidate of Medical Sciences degree by Speciality 14.03.04. - Pathological Physiology. - O.O.Bogomolets Institute of Physiology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2003.

The dissertation is devoted to investigation of testicles spermatogenic function of white rats and a role of disorders of energy metabolism and free radical oxidation of biopolymers in the failure of spermatogenesis under the chronic intoxication with sodium nitrate.

It has been found that under the chronic nitrate intoxication certain phase character is marked in dynamics of changes of mitochondrial oxidation and phosphorylation in testicles: on 14 day of intoxication - ascending of rate of endogenic respiration energy potential, on 30 and 90 day - progressing decrease of energy potential, oppression of enzymes activity of respiratory chain. It was pointed out that in pathogenesis of uncoupling of mitochondrial oxidation and phosphorylation ADP in rats testicles the important role is played by formation of nitrates' product of metabolism - nitric oxide (NO^.). In dynamics of chronic intoxication with sodium nitrate in testicles of white rats we observed the progressing augmentation of production of superoxide anion-radical by mitochondrial and microsomal electron-transport chains.

Morphological and morphometric methods have proved that the chronic intoxication with sodium nitrate results in development of dystrophical changes of spermatogenic epithelium and disturbances of microcirculation.

The raised entering of sodium nitrate into organism of male rats results in essential disorders of embryo- and fetogenesis of female mated with them.

Key words: chronic intoxication with sodium nitrate, spermatogenesis, testicles, oxidative metabolism.

Размещено на Allbest.ru