Фактори противірусного імунітету під впливом різних доз антиретикулярної цитотоксичної сироватки

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

УДК 578.23+615.373

ФАКТОРИ ПРОТИВІРУСНОГО ІМУНІТЕТУ ПІД ВПЛИВОМ РІЗНИХ ДОЗ АНТИРЕТИКУЛЯРНОЇ ЦИТОТОКСИЧНОЇ СИРОВАТКИ

03.00.06 - вірусологія

Автореферат

на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КВЕЛЕНКОВА КСЕНІЯ ІГОРІВНА

Київ-2003



Дисертацією є рукопис

Роботу виконано на кафедрі загальної та молекулярної генетики Київського національного університету імені Тараса Шевченка, м. Київ

Науковий керівник доктор біологічних наук, професор, Демидов Сергій Вікторович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач кафедрою загальної та молекулярної генетики

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Воронцова Ада Леонідівна, Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України провідний науковий співробітник відділу експериментальних клітинних систем.

доктор біологічних наук, професор Бучацький Леонід Петрович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет провідний науковий співробітник лабораторії фізико-хімічної біології

Провідна установа: Київський науково-дослідний інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського, м. Київ

Захист дисертації відбудеться “8” квітня 2003 р. о 16 годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 Київського Національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, Київ, проспект Глушкова, 2, корпус 12, ауд. 215 Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 62

Автореферат розісланий “7” березня 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Молчанець О.В.



АНОТАЦІЇ

Квеленкова К.І. Фактори противірусного імунітету під впливом різних доз антиретикулярної цитотоксичної сироватки. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 - вірусологія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2003.

Дисертація присвячена вивченню впливу антиретикулярної цитоксичної сироватки на розвиток вірусної інфекції in vivo та in vitro, та зміни клітинних факторів імунітету під дією різних доз препарату.

Показано виражену дозозалежну активність препарату антиретикулярної цитотоксичної сироватки по відношенню до впливу на розвиток вірусної інфекції як in vitro, так і in vivo, викликаної вірусами везикулярного стоматиту, імунодефіциту людини типу 1 та герпесу.

Показано стимулюючу дію препарату на клітинні фактори, які мають значення для створення захисту проти вірусної інфекції.

Показано, що вплив АЦС на розвиток вірусної інфекції відбувається за рахунок безпосереднього впливу на клітини, шляхом активації синтезу інтерферону, інтерлейкінів 1 та 2, а також нормалізації співвідношення рівня цитокінів у організмі, порушеного під впливом інфекції.

Встановлено, що низькі розведення препарату мають яскраво виражену цитотоксичну дію. герпес цитотоксичний імунодефіцит стоматит

Ключові слова: вірусна інфекція, антиретикулярна цитотоксична сироватка, вірус імунодефіциту людини, вірус везикулярного стоматиту, вірус герпесу простого ІІ типу, інтерлейкін-1, інтерлейкін-2, фактор некрозу пухлин, функціональний стан лімфоцитів.



Квеленкова К.И. Факторы противовирусного иммунитета под влиянием разных доз антиретикулярной цитотоксической сыворотки. - Рукопись.

Диссертация на получение научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06 - вирусология. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2003.

Диссертация посвящена изучению влияния антиретикулярной цитотоксической сыворотки на развитие вирусной инфекции in vivo и in vitro, а также изменения клеточных факторов иммунитета под действием разных доз препарата.

Противовирусную активность исследуемого препарата изучали на модели вируса везикулярного стоматита в культуре клеток лейкоцитов периферической крови человека путем оценки степени защиты от цитопатического действия вируса, на модели вируса иммунодефицита человека первого типа (штамм BRU) в культуре лимфобластоидных клеток МТ-4, по угнетению цитопатического действия вируса, а также по уровню содержания антигена р24 в культуральной среде. Влияние на вирусную инфекцию в неспецифическом организме исследовали путем введения антиретикулярной цитотоксической сыворотки до и после интрацеребрального заражения мышей вирусом герпеса простого II типа, вызывающего 100% гибели животных в эксперименте.

Влияние антиретикулярной цитотоксической сыворотки на клеточные факторы противовирусного иммунитета изучали путем исследования способности лимфоцитов человека к спонтанному розеткообразованию, восстановлению рецепторов после обработки трипсином, а также трансформации в бласт в результате действия митогенов, путем оценки уровня включения радиоактивной метки. Определение активности клеток перитонеального экссудата на основе способности клеток мононуклеарного ряда к фагоцитарной активности.

С целью оценки влияния на систему цитокинов определяли продукцию интерферона, интерлейкинов 1 и 2 в культуре клеток, а также фактора некроза опухолей в организме мышей, под действием сыворотки.

Показана выраженная способность низких доз препарата антиретикулярной цитотоксической сыворотки к угнетению репродукции вирусов везикулярного стоматита и иммунодефицита человека в исследуемых культурах клеток, однако выявлено, что сыворотка в определенных разведениях способствует размножению вируса и проявлению его цитотоксического действия. На основе проведенных исследований сделан вывод о перспективности использования препарата в комплексной терапии СПИДа.

Установлено, что антиретикулярная цитотоксическая сыворотка оказывает профилактическое и защитное действие в неспецифическом организме при инфекции, вызванной вирусом герпеса простого ІІ типа in vivo.

Показано дозозависимое действие препарата на клеточные факторы, которые имеют значение для защиты против вирусной инфекции, а именно: способность стимулировать в низких дозах и угнетать в высоких дозах функциональную активность лимфоцитов человека при создании условий, отвечающих состоянию иммуносупрессии, in vitro; способствовать восстановлению рецепторов лимфоцитов при разрушении их протеолитическим ферментом, не влияя на рецепторный аппарат клеток нормальных доноров, а также активировать фагоцитарную активность клеток перитонеального экссудата, угнетенную вследствие развития хронической инфекции in vivo.

Установлено, что влияние АЦС на развитие вирусной инфекции происходит обусловлено, в частности, путем непосредственного влияния на клетки, путем активации синтеза интерферона, интерлейкинов 1 и 2, а также нормализации соотношения уровня цитокинов в организме, затронутого под влиянием инфекции. Показано, что ингибирование репродукции вируса в культуре не имеет непосредственной зависимости от продукции интерферона в культуре клеток лейкоцитов периферической крови человека.

В результате проведенных исследований установлено, что противовирусное действие антиретикулярной цитотоксической сыворотки обусловлено стимуляцией защитных факторов и продукции биологически активных веществ в организме, а также непосредственным влиянием на репродукцию вируса в культуре клеток.

Ключевые слова: вирусная инфекция, антиретикулярная цитотоксическая сыворотка, вирус иммунодефицита человека, вирус везикулярного стоматита, вирус герпеса простого ІІ типа, интерлейкин-1, интерлейкин-2, фактор некроза опухолей, функциональное состояние лимфоцитов.



Kvelenkova K.I. Factors of antiviral immunity under the action of different doses of antireticular cytotoxic serum - Manuscript.

The thesis for obtaining PhD degree by speciality 03.00.06 - virology. - Taras Shevchenko' Kyiv national university, Kyiv, 2003.

The thesis is dedicated to studing of influencing of antireticular cytotoxic serum on viral infection development in vivo and in vitro, and of changing of cellular factors of antiviral immunity under different doses of investigated preparation.

The obvious ability of immune serum to inhibit the development of viral infection, caused by vesicular stomamtitis virus, human immunodeficiency virus and herpes virus II, as in vitro, so in vivo, was shown.

Was revealed that action of ACS in viral infection connected with direct influencing on cells, with inducing of interferon, interleukins 1 and 2 synthesis, and also normalising of ration of cytokines in organism, damaged by infection.

Dose-depending action of antireticular cytotoxic serum on cellular immunity factors responsible for defencing from viral infection was shown.

Key words: viral infection, antireticular cytotoxic serum, human immunodeficiency virus, vesicular stomatitis virus, herpes simplex virus II, interleukin-1, interleukin-2, tumor necrosis factor, lymphocytes functional status.



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На сьогодні, агенти вірусної природи є причиною значного відсотку від загальної кількості інфекційних хвороб. В процесі коеволюції системи вірус-хазяїн спостерігається тенденція до поширення латентних та персистуючих інфекцій, які є найбільш вигідними для вірусів з точки зору збереження виду. При цьому несприятливі фактори навколишнього середовища діють не на користь організму-хазяїна у функціонуванні захисних механізмів, що забезпечуються імунною системою. В результаті здатності вірусів до швидкого пристосування та уникнення імунного нагляду організму спостерігається значне підвищення розладів імунної системи у людей, що стикаються із вірусними інфекціями, у вигляді різних порушень імунних реакцій, розвитку вторинної імунної недостатності у різних проявах, в залежності від агенту або агентів, якими викликаний даний вид інфекції. Оскільки віруси використовують різні стратегії уникнення впливу імунної системи організму хазяїна, для них характерні різні шляхи реалізації інфекційності, а тому більшість із противірусних засобів є вузькоспецифічними і можуть застосовуватись лише по відношенню до обмеженої групи патогенів. Тому пошук противірусних засобів не обмежується колом препаратів із ефективною безпосередньою противірусною дією. Важливе значення має пошук терапевтичних агентів, які мають здатність неспецифічно регулювати діяльність імунної системи, з метою виправлення розладів, викликаних різними інфекційними агентами, стимулювати необхідні реакції, що перешкоджають розвитку невигідних для організму-хазяїна наслідків інфекції.

Антиретикулярна цитотоксична сироватка (АЦС) - імунна сироватка коней до тканин кісткового мозку та селезінки людини, розроблена на початку сторіччя академіком О.О. Богомольцем, є неспецифічним імуномодулюючим засобом і має здатність впливати на загальну реактивність організму. Препарат виключно позитивно зарекомендував себе при лікуванні багатьох захворювань, пов'язаних із порушеннями імунної системи, включаючи інфекційні хвороби. Дані про вплив антиретикулярної цитотоксичної сироватки на вірусні інфекції, а також на фактори противірусного імунітету, в літературі практично не зустрічаються. Для обґрунтованого використання даної імунної сировватки, а також для максимальної реалізації її можливостей, необхідне ретельне вивчення дії препарату при захворюваннях вірусної етіології, з метою накопичення об'єктивних даних, що забезпечують можливість безпосереднього лікування захворювань або точного керування тими чи іншими імунологічними реакціями організму, ефективно і цілеспрямованого виправлення порушень, на фоні яких вірусні інфекції можуть зумовлювати небажані наслідки. Дослідження, що пояснювали б дію АЦС при вірусних захворюваннях, тим більше обґрунтовані, що препарат є доступним для отримання за відпрацьованою методикою і виробляється в Україні.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в рамках наукових тем кафедри генетики біологічного факультету Київського Національного університету імені Тараса Шевченка “Особливості структурної організації хроматину еукаріот, яка визначає ефективність дії на ДНК фізичних та хімічних факторів” (реєстраційний номер 97086) та “Вплив біологічно активних речовин та еластичних напружень ДНК на будову хроматину в ядрах клітин” (реєстраційний номер 01. БФ036.06).

Мета і завдання досліджень. Антиретикулярна цитотоксична сироватка дозволяє керувати функціями організму, включаючи імунні реакції, шляхом підбору доз, що мають пригнічуючий або стимулюючий вплив. Обмежена кількість даних щодо впливу препарату на фактори противірусного імунітету в літературі обмежує можливість її використання при надзвичайно актуальних захворюваннях вірусної етіології, особливо таких, що мають хронічний характер та вимагають корекції імунного статусу організму. Для ефективного застосування антиретикулярної цитотоксичної сироватки, в першу чергу, необхідно було показати специфічний та неспецифічний вплив різних доз антиретикулярної цитотоксичної сироватки на фактори противірусного імунітету in vivo та in vitro.

Досягнення поставленої мети передбачалось через вирішення наступних завдань:

1). Дослідження неспецифічної противірусної дії різних доз АЦС на розвиток герпетичної інфекції, викликаної вірусом герпесу ІІ типу, у мишей.

2). Вивчення специфічної дії антиретикулярної цитотоксичної сироватки на розвиток цитопатичного ефекту вірусу везикулярного стоматиту у культурі клітин лейкоцитів периферичної крові людини та на репродукцію ВІЛ-1/BRU у культурі лімфобластоїдних клітин людини МТ-4.

3). Дослідження впливу різних доз АЦС на фактори противірусного імунітету шляхом оцінки:

продукції інтерферону в культурі клітин лімфоцитів периферичної крові людини;

впливу високих та низьких доз антиретикулярної цитотоксичної сироватки на функціональний стан лімфоцитів периферичної крові людини за наступними показниками: розвиток відповіді на мітоген в умовах експериментального пригнічення преднізолоном in vitro, здатність до спонтанного розеткоутворення та відновлення рецепторів Т-лімфоцитами;

активації синтезу ІЛ-1 та ІЛ-2 моноцитами периферічної крові людини;

корегуючого впливу антиретикулярної цитотоксичної сироватки на продукцію фактору некрозу пухлин та активність макрофагів перитонеального ексудату.

Об'єкт дослідження - антиретикулярна цитотоксична сироватка.

Предмет дослідження - розвиток вірусної інфекції та зміна різних факторів імунітету під дією різних доз антиретикулярної цитотоксичної сироватки.

Методи дослідження включали вірусологічні методи визначення вірусної цитопатичної дії, моделювання гострої та хронічної інфекції у тваринах, титрування інтерферону в культурі клітин, метод імуноферментного аналізу, методи визначення функціональної активності лімфоцитів та активності синтезу цитокінів шляхом включення радіоактивної мітки, метод спонтанних розеток, метод відновлення рецепторів Т-лімфоцитів, метод визначення активності макрофагів перитонеального ексудату шляхом оцінки фагоцитозу, методи статистичної обробки даних.

Наукова новизна отриманих результатів. В даній роботі вперше було виявлено можливість неспецифічного впливу антиретикулярної цитотоксичної сироватки на інфекцію вірусу герпесу простого ІІ типу та встановлено здатність антиретикулярної цитотоксичної сироватки Богомольця до пригнічення репродукції вірусу імунодефіциту людини.

Виявлено, що продукція інтерферону під дією АЦС в культурі клітин периферичної крові людини не має прямої кореляції з пригніченням репродуції вірусу у цій культурі.

На моделі стану імуносупресії, створеного за допомогою преднізолону in vitro, показано, що високі дози АЦС мають здатність пригнічувати функціональну активність лімфоцитів, в той час як низькі дози мають протилежну активуючу властивість і усувають стан пригнічення функціональної активності клітин у культурі, що відповідає моделі імуносупресії.

Встановлено вплив АЦС на продукцію фактору некрозу пухлин та здатність до нормалізації співвідношення цитокінів при хронічній інфекції.

Практичне значення роботи. На підставі проведених досліджень низькі дози антиретикулярної цитотоксичної сироватки можуть бути рекомендовані для проведення клінічних випробувань з метою можливості застосування для терапії вірусних інфекцій, зокрема, для комбінованої терапії при СНІДі, корекції імунодефіцитних станів, викликаних вірусними інфекціями. За результатами вивчення проти-ВІЛ активності отримано спільний патент “Спосіб пригнічення репродукції вірусу імунодефіциту людини за допомогою антиретикулярної цитотоксичної сироватки Богомольця” (Пат. 29 770А (Україна), МПК А61К 31/70, А61К 31/66 заявка № 97062685; заявлений 6.06.97; опубл. 15.11.2000, Бюл. “Промислова власність” №6, ч.II).

В роботі показано, що відносно високі дози дослідженого препарату можуть сприяти активізації репродукції вірусу при відсутності видимих ознак цитопатичної дії, що є важливим при підборі індивідуальних лікувальних доз в кожному конкретному випадку.

Отримані результати щодо вивчення стимулюючого впливу сироватки на лімфоцити у стані пригнічення функціональної активності дозволяють рекомендувати її до використання при вірусних захворюваннях, які супроводжуються або викликають імуносупресію.

Показано можливість пригнічення та стимулювання за допомогою різних доз сироватки синтезу інтерлейкінів, який, згідно літературних даних, звичайно тим чи іншим чином порушується при вірусних інфекціях.

Особистий внесок здобувача. Інформаційний пошук, опрацювання літературних даних, розробку схем експериментів, планування та розробку методичних підходів виконання комплексу лабораторних досліджень, отримання експериментальних даних, їх узагальнення та інтерпретацію автором дисертації виконано особисто. Визначення проти-ВІЛ активності досліджуваного препарату проведено спільно із лабораторією загальної вірусології Київського інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського під керівництвом к.б.н. Антоненко С.В. Вивчення впливу препарату на синтез цитокінів при хронічній інфекції здійснювалось під керівництвом Співака М.Я. спільно із відділом проблем інтерферону та імуномодуляторів Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного. Вплив антиретикулярної цитотоксичної сироватки на герпетичну інфекцію у мишей досліджували спільно із лабораторією контролю за якістю імунобіологічних препаратів під керівництвом Рибалко С.Л.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи були представлені на: Міжнародному регіональному семінарі: “Enviroment protection: modern studies in ecology and microbiology”, Uzhgorod, May 13-16, 1997; конференції “Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов”, посвященной 95-летию Уфимского научно-исследовательского института вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, 6-7 июля 2000 года, Республика Башкорстан, Уфа; конференції з генетики та молекулярної біології для студентів та молодих науковців, присвяченій 100-річчю генетики, 20-22 квітня 2000 року, Україна, Львів.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 наукових праць, з яких 3 - статті в наукових журналах, 3 - матеріали конференцій та отримано один спільний патент.

Структура та обсяг дисертації. Обсяг дисертаційної роботи складає 128 сторінок комп'ютерного тексту. Робота включає 12 рисунків та 7 таблиць, складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, результатів та їх обговорення, підсумків, висновків та переліку використаних джерел, який містить 190 літературних джерел (із них 128 - іноземних).

Розділ дисертації, в якому наведено огляд літератури, складається із 4 основних підрозділів, у яких на підставі перегляду робіт вітчизняних та зарубіжних авторів висвітлені сучасні відомості про вплив вірусних інфекцій на фактори противірусного імунітету, зокрема на функціонування імунокомпетентних клітин, систему цитокінів. Оглянуто застосування препаратів цитотоксичних сироваток у сучасній лікарській практиці і, зокрема, у терапії вірусних інфекцій. Показано значення досліджуваного препарату як активного імуномодулятора.

Препарати антиретикулярної цитотоксичної сироватки, які використовувались у дослідженнях. В роботі використовували готовий комерційний препарат АЦС людини з титром не нижче 1:160, виготовлений підприємством по виробництву бактерійних препаратів “Біофарма” та імунну антиретикулярну цитотоксичну сироватку до селезінки та кісткового мозку мишей, отриману на кролях породи Шиншила в ході експерименту. Для приготування антигену селезінку та кістковий мозок розтирали, приливали фізіологічний розчин та центрифугували при низькій швидкості. Надосадову рідину фільтрували через 4 шари марлі та вводили кролям триразово у вушну вену із інтервалом 7 днів по 1.0, 1.5, 2.0 мл (Барштейн Ю.А., Кузьменко В.П., 1972). Через тиждень після останньої імунізації кров відбирали для перевірки титру цитотоксинів. Титр цитотоксичних антитіл у сироватці кролів визначали за допомогою реакції зв'язування комплементу за наявністю гемолізу у системі. Для титрування використовували гемолітичну сироватку (гемолізин), отриману шляхом імунізації кроликів еритроцитами барана.

Вивчення противірусної дії антиретикулярної цитотоксичної сироватки in vitro. З метою визначення здатності препарату антиретикулярної цитотоксичної сироватки безпосередньо впливати на розмноження вірусів, були проведені дослідження на моделі вірусів везикулярного стоматиту (ВВС) та вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ-1) у культурі клітин. Для диференціації цитотоксичного ефекту, викликаного дією вірусу та препарату в культурі клітин, а також з метою підбору оптимального діапазону розведень АЦС, оцінювали її вплив на дослідну культуру за показниками щільності клітинної суспензії та життєздатності клітин у культурі.

Визначення впливу препарату на репродукцію вірусу везикулярного стоматиту за проявом цитопатичної дії в культурі клітин. Дослідження проводили на культурі клітин лейкоцитів периферичної крові нормальних донорів, які виділяли загальноприйнятим методом із крові нормальних донорів, негативної на наявність антигенів ВІЛ та вірусу гепатиту В та С, отриманої із станції переливання крові. Готували десятикратні розведення досліджуваного препарату і вносили у культуру. Між першим та другим розведенням вводили додаткові двократні розведення препарату. Вірус вносили у дозі, що становила 100 ТЦПД₅₀/лейкоцит, інкубували протягом двох годин для адсорбції вірусу, відмивали та вносили свіже підтримуюче середовище. Як контроль, використовували культуру, куди не вносили препарат, але вносили вірус, інтактну культуру клітин, та культуру, куди вносили нормальну сироватку коней. Клітини інкубували до появи ознак цитопатичної дії вірусу у контролі, куди не вносили препарат, після чого культуральну рідину титрували на культурі клітин L-41. Титр вірусу обраховували за методом Reed and Muench.

Визначення впливу АЦС на репродукцію ВІЛ-1. Дослідження проводили на моделі ВІЛ-1, штам BRU (люб'язно наданий проф. K.J. Krohn, Університет м. Тампере, Фінляндія) на культурі лімфобластоїдних клітин МТ-4. Рівень репродукції вірусу враховували за показником життєздатності клітин та шляхом визначення рівня білку р24 у культуральній рідині за допомогою імуноферментного аналізу. Для вивчення впливу АЦС безпосередньо на репродукцію вірусу, препарат у лунки з культурою МТ-4 вносили за сім діб, 3 доби та за добу до зараження, одночасно із зараженням та через дві доби після зараження. Готували вихідне розведення 1:100, а далі - двократні розведення препарату від 1:20 до 1:1280. В якості контролів використовували інтактну культуру, інфіковану культуру без препарату, а також культуру, куди вносили вірус та нормальну сироватку коней. В якості контрольного препарату використовували азидотимідин (АЗТ, “Wellcome”, США) у концентрації 5 мкг/мл, який має підтверджену хіміотерапевтичну дію. Ступінь захисту клітин від цитопатичної дії обраховували за формулою (Н.Н. Носик, Д.Н. Носик, Н.В. Кузнецова, 1992.):

А

A - B% захисту = ^_________ х 100 ,

К - В

де A - кiлькiсть життєздатних клiтин у дослiджуванiй культурi

В - те ж - у контрольнiй культурi при дiї вiрусу

К - у неiнфiкованiй контрольнiй культурi.

Рівень антигену р24 визначали методом ІФА на тест-системах фірми “Abbott” (США) згідно з рекомендаціями фірми-виробника.

Вивчення противірусної дії антиретикулярної цитотоксичної сироватки in vivo. Вплив АЦС, як неспецифічної імунної сироватки, на розвиток вірусної інфекції in vivo, вивчали на моделі інфекції, викликаної вірусом простого герпесу ІІ типу у білих безпородних мишей. Вірусовмісну рідину отримували від пацієнта з герпетичними везикулами і вводили мишам у кількості 0,2 мл/мишу інтрацеребрально. Введення АЦС проводили за два дні до зараження у дозі 0,01 мл/мишу та через добу після зараження у такій же дозі. За тваринами спостерігали до повного вимирання групи заражених контрольних тварин, яким не вводили препарат. Фіксували будь-які аномальні ознаки у зовнішньому вигляді або поведінці тварин.

Визначення функціональної активності лімфоцитів. Вплив препарату на функціональну активність лімфоцитів вивчали in vitro за здатністю до розеткоутворення, відновлення рецепторів після обробки трипсином, у реакції бласттрансформації після пригнічення преднізолоном,

Метод спонтанних розеток. Дослідження проводили на мононуклеарах нормальної донорської крові загальноприйнятим методом (Лебедев К.И., Понякина И.Д., 1990). Клітину вважали розеткоутворюючою, якщо на її поверхні фіксувалось не менше трьох ксеногенних еритроцитів.

Метод відновлення рецепторів Т-лімфоцитів. Для вивчення біологічної активності АЦС по відношенню до клітинних факторів противірусного імунітету вивчали її вплив на відновлення лімфоцитами рецепторів після оброблення їх трипсином. Лімфоцити у суспензії обробляли свіжим 0,5% розчином трипсину. Згусток, що утворився після внесення трипсину, відсмоктували піпеткою, після чого суспензію центрифугували, надосадову рідину зливали, клітини відмивали, ретельно ресуспендували у 1 мл середовища 199, і доводили до концентрації 2х10⁶ кл/мл. У пробірки додавали по 0,1 мл 1% свіжих відмитих розчином Хенкса еритроцитів барана і десятикратні розведення препарату АЦС від першого до шостого, а також нерозведений препарат. Культуру інкубували, центрифугували і підраховували кількість розеток у камері Горяєва.

Визначення функціональної активності лімфоцитів, пригніченої за допомогою преднізолону, в реакції бласттрансформації. Дослідження проводили на клітинах лімфоцитів периферичної крові людини за допомогою обрахунку індексу стимуляції по включенню радіоактивної мітки ³Н-тимідину. Пригнічення функціонального стану лімфоцитів викликали за допомогою внесення преднізолону в концентрації 20 мкг/мл. У дослідні пробірки вносили фітогемаглютинін та преднізолон, АЦС у десятикратних розведеннях до 1х10^-6 та не розведений препарат. Як контроль, залишали пробірки з інтактною культурою. Пробірки з культурою інкубували при 37 ⁰С 48 годин, після чого вимірювали радіоактивність в імпульсах за хвилину на лічильнику “Бета-1” і вираховували рівень стимуляції по відношенню до контролю клітин.

Дослідження впливу антиретикулярної цитотоксичної сироватки на систему цитокінів. Для вивчення здатності АЦС впливати на систему цитокінів, досліджували продукцію інтерферону, інтерлейкінів 1 та 2 у культурі клітин та фактору некрозу пухлин в організмі мишей під впливом препарату.

Вивчення впливу АЦС на продукцію інтерферону. Визначення синтезу інтерферону клітинами під впливом антиретикулярної цитотоксичної сироватки проводили на культурі клітин лейкоцитів периферичної крові людини, з наступним титруванням на культурі L-41. Культуру лейкоцитів готували загальноприйнятим методом, АЦС вносили у пробірки з культурою у десятикратних розведеннях від 10^-1 до 10^-8. Рівень екзогенного інтерферону визначали у культуральному середовищі через 6, 8 та 24 години. Титрування інтерферону проводили згiдно стандартної методики (Ершов Ф.И., Сайтикулов А.М., 1984). Як тест-вірус використовували вірус везикулярного стоматиту (ВВС), штам Індіана, оскільки він не здатний самостійно індукувати інтерферон у даній культурі. Результати враховували за розвитком цитопатичної дії вірусу. Для підтвердження типової приналежності інтерферону частину зразків культуральної рідини підігрівали до 60 ⁰С, частину - підкислювали до рН 2.0, оскільки інтерферони, що відносяться до І-го типу, є кислото- та температуростійкими. Для остаточного підтвердження використовували зразок проти--інтерферонового імуноглобуліну, який використовували за інструкцією по застосуванню.

Визначення активності синтезу ІЛ-1 та ІЛ-2. Інтенсивність синтезу інтерлейкінів вивчали за методом, викладеним у (Лимфоциты. Методы. П/ред. Дж.Клауса, 1990). Дослідження проводили на моноцитах, отриманих із нормальної донорської крові. Стимуляцію синтезу інтерлейкінів здійснювали за допомогою субоптимальних концентрацій мітогенів ліпополісахариду (LPS) E. Coli (B6:026, “Sigma”, Німеччина) у кінцевій концентрації 10 мкг/мл для отримання контролів ІЛ-1 та конканаваліну-А (Кон-А) в концентрації 20 мкг/мл для визначення ІЛ-2. Із зразків, які перевіряли на наявність ІЛ-2 готували серії двократних розведень. У дослідні пробірки вносили також АЦС у десятикратних розведеннях від першого до шостого. Як контролі використовували інтактну культуру. Клітини інкубували, центрифугували, а до супернатанту вносили мітогени для визначення комітогенного ефекту. У лунки із культурою вносили ³Н-тимідин і визначали радіоактивність на сцинтиляційному лічильнику “Бета-1”. Результати виражали у вигляді індексу стимуляції:

кількість імп/хв. дослідних зразках

ІС=

кількість імп/хв. у контрольних зразках

Рівень синтезу інтерлейкінів вважали достовірним, якщо індекс стимуляції перевищував 3.0.

Вивчення продукції фактору некрозу пухлин під впливом АЦС in vivo. Вплив АЦС на продукцію фактору некрозу пухлин (ФНП) вивчали на основі властивості останнього до цитотоксичного впливу на культуру клітин L929. Препарат АЦС вводили самцям мишей лінії СВА підшкірно у дозі 0.001/0.1 мл через 24 години після внутрішньочеревинного зараження Staphylococcus aureus (штам 209) в дозі LD₅₀/0,1 мл. Контрольній групі тварин замість препарату вводили фізіологічний розчин. На 1-й, 2-й, 4-й, 6-й та 8-й день після зараження у мишей відбирали селезінки, виділяли спленоцити, відмивали та інкубували протягом 24 годин, після чого супернатанти відбирали та досліджували на наявність ФНП. Індекс цитотоксичності в культурі L929 визначали після забарвлення кристалічним фіолетовим та вимірювання оптичної густини барвника на мультискані (Titertek, “Flow”) при довжині хвилі 540 нм за формулою:

ІЦ=((а-b)/а)х100%,

де а- оптична густина барвника у контрольних лунках із інтактною культурою

b- оптична густина барвника у лунках із досліджуваними зразками.

Визначення активності клітин перитонеального ексудату. Дослідження проводили на основі здатності клітин мононуклеарного ряду до фагоцитарної активності. Клітини перитонеального ексудату виділяли без фенолового червоного, в якості мішеней використовували клітини еритромієлоїдної лінії К-562. Клітини-мішені інкубували у поживному середовищі в присутності ³Н-тимідину, відмивали з метою видалення незв'язаної мітки. Клітини-ефектори та мішені змішували у співвідношенні 1:50. В якості контрольної використовували інтактну культуру, для контролю спонтанного виходу мітки - культуру клітин-мішеней, куди вносили лише поживне середовище, для контролю максимального виходу мітки тритон - Х-100 (“Serva”, США). Радіоактивність вимірювали на сцинтиляційному лічильнику “Бета-1” за кількістю імпульсів на хвилину. Підрахунок проводили за формулою:

% лізису= {1- [(A-B) / (C-B)]}х100

де А-радіоактивність в присутності ефекторів

В-радіоактивність після обробки клітин-мішеней тритоном Х-100

С-радіоактивність при спонтанному виході мітки.

Цитотоксичність вважали відсутньою при проценті лізису, нижчому за 10, слабкою - в межах 10-25, вираженою - при проценті лізису, вищому за 25.

Статистична обробка даних. Статистичну обробку даних здійснювали за допомогою ПК (програма Microsoft Excel) з урахуванням t-критерія Стьюдента.

Перегляд доступних експериментальних робіт дозволяє зробити припущення щодо здатності АЦС впливати на розвиток вірусних інфекцій в організмі та культурі клітин, хоча літературні дані щодо результатів досліджень є суперечливими. Згідно деяких джерел АЦС сприяє розмноженню вірусу, згідно інших - пригнічує цей процес. Тому науковий та практичний інтерес пов'язаний із більш широким вивченням можливих механізмів, з якими може бути пов'язана противірусна дія АЦС.

Вплив АЦС на репродукцію вірусу везикулярного стоматиту в культурі клітин лейкоцитів периферичної крові людини. Вибір даного вірусу зумовлений його низькою інтерфероногенною активністю. Клітини периферичної крові людини здатні до активного синтезу даного цитокіну, а тому вірус із низькою індуктивною здатністю, в даному випадку, є найбільш адекватною частиною модельної системи.

При визначенні цитотоксичності препарату АЦС на дослідній культурі клітин за показником життєздатності клітин, виявилось, що нерозведений препарат та розведення 10^-1 і 10^-2 мають значний токсичний ефект. У вищих розведеннях видимих порушень не спостерігалось. З причин токсичності перші два розведення не використовувались при вивченні впливу препарату на репродукцію ВВС. У розведенні 1х10^-3 ознаки ЦПД, що розвивалась внаслідок дії ВВС, були найбільш яскраво виражені, титр вірусу в пробірках цієї паралелі практично дорівнював і навіть перевищував контрольний, що може свідчити про порушення метаболізму у клітині, які сприяють підвищенню чутливості клітин до дії інфекційного агенту.

Дане спостереження потребує додаткового дослідження in vivo, оскільки механізми реалізації противірусної дії на рівні клітин і на рівні організму можуть дещо відрізнятись. При внесенні АЦС у культуру клітин за 3 доби захисний ефект був низьким. При внесенні препарату за 1 добу, спостерігався значний ефект захисту клітин, максимальний у розведенні 1х10^-4, із зниженням до нуля у 1х10^-8 .

Зниження титру вірусу може відбуватись за рахунок блокування антитілами рецепторів на мембранах і перешкоджання, таким чином, інфікування певного проценту популяції клітин. а також виділення певних активних речовин, що підвищують резистентність клітин, дія яких досягає піку протягом 24-48 годин.

В умовах внесення сироватки одночасно із вірусом позитивний ефект дії сироватки практично не спостерігається у порівняні з контролем. При введенні АЦС після зараження спостерігається, як і у випадку преінкубації клітин з препаратом протягом доби, високий рівень захисту клітин від дії вірусу. Результати вивчення дії сироватки на розмноження ВВС у культурі клітин лейкоцитів периферійної крові людини показують, що різні дози сироватки можуть мати прямо протилежну дію у одних і тих же умовах. Деякі дози АЦС, здійснюючи пошкоджуючий вплив на клітини, не викликають порушень, що можуть бути помічені візуально, але підвищують їх чутливість до дії вірусу, і здатність підтримувати його розмноження на вищому рівні, ніж контрольна культура, а тому, використання сироватки при вірусних захворюваннях вимагає врахування даної особливості, оскільки неправильно підібрана доза може призвести до ускладнень при протіканні інфекційного процесу.

Вплив різних доз АЦС на репродукцію ВІЛ. Умови досліду на інфікованій на культурі лімфобластоїдних клітин МТ-4 відповідали моделі гострої ВІЛ-інфекції (Барбашева О.В., Антоненко С.В., Гринь О.В., 1995). При попередньому визначенні токсичності препарату на культурі МТ-4 виявилось, що розведення сироватки від 1:100 до 1:2000 викликають значне зниження густини клітинної суспензії. Починаючи від розведення 1:4000 видимих порушень моношару або зниження густини клітинної суспензії не спостерігалось. Розведення, під дією яких знижувалась густина клітинної суспензії в культурі, в основному досліді не використовувались. Як і у випадку із ВВС, найвищий захисний ефект у системі клітина - препарат-вірус спостерігався при внесенні АЦС за одну добу до зараження. Максимальний захист спостерігався у розведеннях а:160 - а:640 (а=1:100). Ефект захисту, що спостерігався, цілком співставимий із ефектом АЗТ.

Щодо синтезу антигену р24, який є важливим показником при вивченні ВІЛ-інгібуючої дії препаратів, під впливом розведення а:160 (а=1:100) він значно знижується.

Спираючись на отримані дані, можна зробити висновок про наявність вираженого анти-ВІЛ ефекту препарату АЦС. Загальне підвищення кількості життєздатних клітин у інфікованій культурі під дією АЦС може бути пов'язане як з раннім пригніченням реплікації вірусу (і, як наслідок, з проліферацією неінфікованої популяції клітин), так і з тим, що АЦС, перешкоджає зв'язуванню та проникненню ВІЛ у незаражені клітини.

Розвиток герпетичної інфекції під дією АЦС. В результаті інтрацеребрального зараження мишей даним вірусом, у інфікованих тварин розвивається герпетичний енцефаліт, який супроводжується паралічем задніх кінцівок, судомами, після чого наступає трупна закляклість та смерть. Загибель тварин у контрольній групі, яка не отримувала препарат, наступала протягом 3-5 діб. Тварин, що загинули протягом першої доби після зараження, не враховували, оскільки в даному випадку смерть наступала від травми головного мозку, а не в результаті розвитку інфекції.

В ході досліду виявилось, що неспецифічна АЦС має і профілактичний, і терапевтичний ефект і не викликає розвитку ознак токсичності. Кількість тварин, що вижили, в групі, яка отримувала препарат до зараження, і в тій, якій вводили сироватку після зараження, була практично однаковою.

При дослідженні терапевтичної дії АЦС протягом часу спостереження після введення препарату в дослідній групі загинула третя частина тварин. В групі, якій вводили сироватку профілактично, загинуло 50% мишей. В обох дослідних групах жодна з тих тварин, що вижили, не мала симптомів інфекції. Смертність тварин у контрольній групі становила 100%.

Дані, отримані в результати досліду свідчать, що цитотоксичні антитіла здатні до прояву неспецифічного захисного ефекту при вірусній інфекції і дозволяють зробити висновок про здатність АЦС ефективно регулювати імунні реакції, які забезпечують елімінацію ВПГ із організму, оскільки внутрішньомозкове зараження призводить до 100% загибелі тварин, як це видно на прикладі контрольної групи.

Клітинні фактори противірусного імунітету під впливом АЦС. Внаслідок вірусної інфекції значною функціональна активність клітин системи імунітету значно знижується. При вивченні впливу АЦС на функціональний стан Т-лімфоцитів було встановлено, що препарат не впливає на процес утворення розеток лімфоцитами нормальної донорської крові. Показник розеткоутворення під дією всіх досліджуваних розведень препарату залишався практично рівним показнику в інтактній культурі. При обробці лімфоцитів трипсином, утворення розеток під впливом АЦС відбувалось набагато інтенсивніше, ніж у контролі. Після протеолізу рецепторів на поверхні клітин за допомогою трипсину (про що свідчить достовірне, р0,05, зниження кількості розеток на сто клітин з 21,2+0,4 у контролі до 3,5+0,5 після обробки ферментом), препарат активізував відновлення поверхневих мембранних структур залежно від дози, при цьому найвищий ефект спостерігався у розведенні АЦС 10^-5 .

За припущенням, відсутність дії АЦС на активність розеткоутворення у нормальних донорів, зумовлена, в основному, нормальним співвідношенням зрілих імунокомпететних клітин та їх попередників (Чередеев А.Н., Зимин Ю.И., 1977). У випадку протеолітичного руйнування рецепторів Т-лімфоцитів біологічна дія препарату виявляється у активізації процесу відновлення рецепторного апарату, характерного для зрілої форми клітини.

Визначення відновлення функціональної активності лімфоцитів, пригніченої преднізолоном. Однією з найбільш загальних реакцій імунної системи є реакція бласттрансформації лімфоцитів. Результати проведеного досліду показали, що під дією розведень АЦС від 10^-3 до 10^-5 спостерігається активна стимуляція лімфоцитів .

Значення індексу стимуляції при розведеннях 10^-4 та 10^-5 наближаються до відповідних показників, отриманий при дії ФГА. У пробірках з розведенням 10^-6 індекс стимуляції знижувався, хоча і був вищий за контрольний. При внесенні преднізолону спостерігалось пригнічення клітинних функцій, яке в даному досліді виявлялось у падінні індексу стимуляції значно нижче контрольного значення.

У розведеннях, вищих за 10^-2, АЦС усувала стан пригнічення проліферативної активності клітин, викликаний преднізолоном, про що свідчить активне включення радіоактивної мітки в ДНК клітин. Значення індексу стимуляції в даному випадку були дещо нижчими, ніж у пробах без додавання преднізолону, але значно вищими за контрольні. Максимальне значення індексу спостерігалось у розведенні 10^-5 .

Синтез цитокінів під дією АЦС. Оскільки АЦС виявляє неспецифічну дію і впливає на широкий спектр вірусів, можна припустити, що одним з агентів, які виділяються клітинами під дією препарату, є інтерферон. При вивченні інтерфероногенної активності АЦС були отримані наступні результати.

В культуральному середовищі клітин лейкоцитів периферійної крові людини було виявлено агент з противірусною активністю, температуро- та кислотостійкий, противірусна активність якого усувалась при застосуванні проти-б інтерферонового імуноглобуліну. Це дозволило віднести його до інтерферонів І типу. Противірусна активність препарату АЦС та його інтерфероногенна активність корелювали за часом, але дещо відрізнялись в залежності від дози. Найвищий титр інтерферону спостерігався у розведенні 10^-3, яке сприяло підвищенню рівня репродукції ВВС у попередньому експерименті. Пік продукції інтерферону припадав на 24-ту годину, що не заперечує його ролі як певного чинника у знижені титру вірусу, однак його кількість у культуральному середовищі клітин, оброблених АЦС, була досить низька для того, щоб безпосередньо викликати пригнічення цитопатичної дії вірусу в культурі клітин. Отже, хоча отримані дані співпадають з літературними, які свідчать про здатність цитотоксичних сироваток стимулювати виділення клітинами інтерфероноподібного агента (Edelman R., Wheelock E.F., 1968), противірусна дія АЦС має бути пов'язана, в основному, із іншими факторами.

При вивченні впливу АЦС на продукцію інтерлейкінів in vitro було встановлено, що розведення від 10^-3 до 10^-6 значно підвищують індекс стимуляції синтезу інтерлейкіну-1.

Сироватка у більшій концентрації, навпаки, викликала пригнічення функціональної активності клітин, їх здатність до продукції цитокінів.

При вивченні продукції інтерлейкіну 1 та фактору некрозу пухлин (ФНП) при хронічній стафілококовій інфекції, яка є одним із важливих ускладнень вірусних захворювань внаслідок пригнічення імунних реакцій, та супроводжується значними порушеннями у функціонуванні системи цитокінів, було встановлено, що введення АЦС нормалізує їх співвідношення, сприяючи переходу хронічної інфекції у гостру форму та одужанню інфікованих тварин. При розвитку інфекційного процесу підвищення рівня ІЛ-1 до максимального супроводжується мінімальними значеннями рівня ФНП. Після введення тваринам АЦС спостерігалось підвищення продукції ІЛ-1 та ФНП у першу добу після інфікування, причому їх співвідношення зміщувалось у бік ІЛ-1, прозапального цитокіна.

Активність клітин перитонеального ексудату. Загострення інфекційного процесу, викликаного введенням АЦС, супроводжувалось підвищенням активності клітин перитонеального ексудату.

Активність макрофагів є важливим показником при вірусних та бактеріальних інфекціях, оскільки даний фактор сприяє елімінації збудника із інфікованого організму. Оскільки ІЛ-1 служить для макрофага праймуючим сигналом, що підсилює процес представлення антигену лімфоцитам, а ФНП виконує роль тригерного сигналу, що опосередковує підсилення бактерицидної та цитотоксичної активності фагоцитуючих клітин, було зроблено припущення, що під впливом АЦС відбувається активізація фагоцитуючої активності даних клітин, яке підтвердилось в результаті проведеного експерименту.



ВИСНОВКИ

Дослідження показали, що антиретикулярна цитотоксична сироватка у низьких (розведення 10^-4 - 10^-6) пригнічує репродукцію вірусу везикулярного стоматиту в культурі лейкоцитів периферичної крові людини in vitro. Однак розведення сироватки 10^-3, що не виявляло явного прояву цитотоксичності в даній культурі, стимулює підвищення рівня реплікації вірусу.

Антиретикулярна цитотоксична сироватка дозозалежно впливає на репродукцію вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ-1/BRU) в культурі клітин МТ-4, сприяючи у високих розведеннях зниженню інфекційного титру вірусу та рівня синтезу вірусного білку р24.

При застосуванні антиретикулярної цитотоксичної сироватки коней проти тканин людини при герпетичному енцефаліті, викликаному інтрацеребральним введенням вірусу герпесу простого ІІ типу у мишей, спостерігається видонеспецифічна захисна дія препарату, що виявляється у 50% виживанні інфікованих тварин порівняно з контролем як при профілактичному, так і при терапевтичному застосуванні.

Досліджуваний препарат виявляє дозозалежний вплив на функціональний стан лімфоцитів людини при моделюванні стану імуносупресії in vitro.

АЦС не впливає на експресію поверхневих рецепторів лімфоцитів нормальних донорів у реакції розеткоутворення, однак сприяє їх відновленню до нормального рівня після оброблення протеолітичним ферментом.

Антиретикулярна цитотоксична сироватка дозозалежно стимулює in vitro продукцію клітинами цитокінів, зокрема інтерферону, інтерлейкінів типу 1 та 2.

Досліджена імунна сироватка у вигляді видоспецифічного препарату стимулює продукцію ФНП та ІЛ-1, нормалізуючи їх рівень, а також підвищує цитотоксичну активність макрофагів при стафілококовій інфекції, яка характеризується зниженням активності всіх досліджених в роботі факторів і має значення як супутня інфекція при багатьох вірусних захворюваннях, що підтверджує перспективність використання АЦС при вірусних захворюваннях, які характеризуються частими ускладненнями.

Таким чином, противірусна дія антиретикулярної цитотоксичної сироватки дозозалежно виявляється як на рівні організму через стимуляцію захисних механізмів, так і на клітинно-молекулярному рівні через зміни у метаболізмі клітин та активацію їх функціональної активності, а також за рахунок продукції біологічно активних речовин.



Перелік наукових праць, опублікованих за темою ДИСЕРТАЦІЇ

1. Співак М.Я., Карпов О.В., Антоненко С.В., Барбашева О.В, Квеленкова К.І. Пригнічення репродукції вірусу імунодефіциту людини за допомогою антиретикулярної цитотоксичної сироватки Богомольця//Мікроб. Журнал. - 1997. - Т.59, №5. - С.57-61.

2. Ganova L., Kvelenkova K., Spivak N. Production of cytokines at staphylococcus infection, interferon and Bogomolets's cytotoxic serum in corrective effect// Proc. Іnternational regional semin. “Enviroment protection:modern studies in ecology and microbiology”. - Uzhgorod, May 13-16. - 1997. - P.343-345.

3. Демидов С.В., Квеленкова К.І. Діденко Н.Ю. Дозозалежний вплив антиретикулярної цитотоксичної сироватки (сироватки Богомольця) на репродукцію вірусу везикулярного стоматиту in vitro//Актуальні проблеми клінічної імунології та алергології. - Щорічник. -1998. - №3. - С.72-78.

4. И.В. Черная, К.И. Квеленкова, С.В. Демидов, К.В. Курищук. Влияние антиретикулярной цитотоксичной сыворотки на функциональное состояние лимфоцитов периферической крови человека в условиях экспериментального угнетения in vitro//Материалы конф. “Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов”, посвященной 95-летию Уфимского научно-исследовательского института вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова. - Часть 1. - Уфа (Республика Башкорстан), 5-7 июня. - 2000. - С. 166-170.

5. Demidov S., Chornaya I., Kvelenkova K. Reaction of peripheral lymphocytes, inhibited by prednisolon in vitro, on various dozes of antireticular cytotoxic serum//Abstr. Conf. Gen. Mol. Biol. for students and young scientists devoted to 100^th anniversary of genetics. L'viv, April 20-22. - 2000. - С. 130.

6. Рибалко С.Л, Квеленкова К.І., Демидов С.В. Вивчення неспецифічної противірусної дії антиретикулярної цитотоксичної сироватки in vivo//Вісник КНУ імені Тараса Шевченка. - 2002. - Вип.38. - С.75-76.

7. Спосіб пригнічення репродукції вірусу імунодефіциту людини за допомогою антиретикулярної цитотоксичної сироватки Богомольця. Пат. 29 770А (Україна), МПК А61К 31/70, А61К 31/66 Співак М.Я., Карпов О.В., Антоненко С.В., Барбашева О.В., Квеленкова К.І., Волощенко Ю.В. -№ 97062685; заявлений 6.06.97; опубл. 15.11.2000, Бюл. “Промислова власність” №6, ч.II.

Размещено на Allbest.ru

...