Динаміка клініко-імунологічних показників у дітей та підлітків з вперше виявленим цукровим діабетом 1 типу в процесі лікування

Размещено на http://www.allbest.ru/

ІНСТИТУТ ЕНДОКРИНОЛОГІЇ ТА ОБМІНУ РЕЧОВИН

ім. В. П. КОМІСАРЕНКА АМН УКРАЇНИ

УДК 616.379-008.64-053.2-08: 612.017.1

Динаміка клініко-імунологічних показників у дітей та

підлітків з вперше виявленим цукровим діабетом 1 типу

в процесі лікування

14. 01. 14 - ендокринологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

МАЛИНОВСЬКА Тетяна Миколаївна

Київ -2003



Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті ендокринології та обміну речовин ім. В.П.Комісаренка АМН України

Наукові керівники: Кандидат медичних наук, старший науковий співробітник Большова-Зубковська Олена Василівна, Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П.Комісаренка АМН України, завідувач відділу дитячої ендокринної патології,

доктор медичних наук, професор Зак Костянтин Петрович, Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П.Комісаренка АМН України, завідувач лабораторії гормональної регуляції кровотворення

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, старший науковий співробітник Маньковський Борис Микитович, Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України, завідувач відділення профілактичної діабетології;

кандидат медичних наук, доцент Комісаренко Юлія Ігорівна, Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця, доцент кафедри ендокринології

Провідна установа: Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського АМН України, відділ клінічної ендокринології, м. Харьків

Захист відбудеться 11.03.2003 р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.558.01 з ендокринології в Інституті ендокринології та обміну речовин ім. В.П.Комісаренка АМН України (04114 м. Київ - 114, вул. Вишгородська 69)

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П.Комісаренка АМН України (04114 м. Київ - 114, вул. Вишгородська 69). Автореферат розісланий “10.02.2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук Калинська Л.М.



АНОТАЦІЯ

Малиновська Т.М. Динаміка клініко-імунологічних показників у дітей та підлітків з вперше виявленим цукровим діабетом 1 типу в процесі лікування. - Рукопис. інсулін імунітет діабет мікроскопія

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.14 - ендокринологія. - Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України, Київ, 2003.

Дисертацію присвячено вивченню стану клітинного та гуморального імунітету у дітей та підлітків з вперше виявленим ЦД-1 в динаміці лікування інсуліном. Обстежено 114 дітей у віці від 7 до 15 років; з них 61 хворий з вперше виявленим ЦД-1; 23 пацієнти з тривалістю захворювання 5-10 років та 30 практично здорових дітей того ж віку, що склали контрольну групу.

За допомогою імунологічних та цитологічних методів дослідження, включаючи FACS аналіз та електронну мікроскопію, вивчені показники Т- клітинного (CD3⁺-, CD4⁺-, CD8⁺-клітини) та ПК-клітинного (CD56⁺-клітини та ВГЛ), а також гуморального імунітету (CD20⁺-клітини та IgG, IgA і IgM) в динаміці тривалої інсулінотерапії (через 3, 6, 12, 18 і 24 міс) у 35 пацієнтів з вперше виявленим ЦД-1 та хворих на ЦД-1 з тривалістю захворювання від 5 до 10 років.

Проведеними дослідженнями встановлено, що для хворих дітей з вперше виявленим ЦД-1 до початку лікування характерно зниження вмісту в крові CD3⁺-клітин (загальної кількості Т-клітин), CD4⁺-клітин (Т-індукторів/хелперів). Традиційна інсулінотерапія на протязі двох років не призводить до нормалізації імунологічних показників крові, особливо кількості CD3⁺- , CD4⁺- та CD56⁺-клітин, виразність змін яких залежить від швидкості клінічної маніфестації. Однак у даних хворих вміст IgG, IgA і IgM у периферичній крові суттєво підвищений за нормальним рівнем CD20⁺-клітин.

Серед дітей та підлітків з вперше виявленим ЦД-1 відокремлена група дітей з низьким вмістом ПК-клітин та ВГЛ, які відносяться до особливого підвиду ЦД-1 зі спадковим дефектом ПК-клітин. Знайдено суттєве зниження кількості ВГЛ у крові хворих з вперше виявленим ЦД-1, що супроводжувалося порушеннями ультраструктури цих клітин.

Встановлено, що зміни показників Т- та ПК-клітинного імунітету у хворих на ЦД-1 з тривалістю захворювання 5-10 років стають ще виразнішими.

Ключові слова: цукровий діабет 1 типу, лейкоцити, імунологічний фенотип лімфоцитів, ультраструктура, імуноглобуліни, С-пептид, інсулінотерапія.



АННОТАЦИЯ

Малиновская Т.Н. Динамика клинико-иммунологических показателей у детей и подростков с впервые выявленным сахарным диабетом 1 типа в процессе лечения. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.14 - эндокринология. - Институт эндокринологии и обмена веществ им. В.П. Комиссаренко АМН Украины, Киев, 2003.

Диссертация посвящена изучению состояния клеточного и гуморального иммунитета у детей и подростков с впервые выявленным СД-1 в динамике инсулинотерапии. Обследовано 114 детей в возрасте от 7 до 15 лет; из них 61 больной с впервые выявленным СД-1; 23 больных СД-1 с длительностью заболевания 5-10 лет и 30 практически здоровых детей того же возраста, составлявших контрольную группу.

С помощью иммунологических и цитологических методов исследования, включавших FACS анализ и электронную микроскопию изучены показатели Т-клеточного (CD3⁺-, CD4⁺-, CD8⁺-клетки), ЕК-клеточного (CD56⁺-клетки и БГЛ), а также гуморального иммунитета (CD20⁺-клетки и IgG, IgA, IgM) в динамике длительной инсулинотерапии (через 3, 6, 12, 18 и 24 мес) у одних и тех же 35 пациентов с впервые выявленным СД-1.

В результате проведенных исследований установлено, что на фоне инсулинотерапии относительное и абсолютное содержание CD3⁺-клеток в крови у больных с впервые выявленным СД-1 остается в течение всего периода таким же низким, как и до лечения, особенно в конце 2 года наблюдения. Относительное и абсолютное содержание CD4⁺-клеток в крови у данных больных снижено по сравнению с группой здоровых детей на протяжении всего периода наблюдения. Анализ зависимости между степенью изменения содержания лимфоцитов различного иммунофенотипа в крови и временем, прошедшим от первых клинических проявлений СД-1 до окончательного установления диагноза показал, что выраженность этих изменений зависит от скорости клинической манифестации.

При исследовании показателей гуморального иммунитета установлено, что у детей и подростков с впервые выявленным СД-1 относительное и абсолютное содержание CD20⁺-клеток в динамике лечения инсулином не отличается от показателей у здоровых детей, а содержание различных классов иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM) в сыворотке крови статистически достоверно повышено по сравнению с нормальными показателями. При заместительной терапии инсулином у таких больных содержание IgG постепенно снижается, особенно к концу 2 года наблюдения, по отношению к норме. Содержание IgA на протяжении 18 мес наблюдения остается повышенным и только через 24 мес близко к норме; уровень IgM постепенно снижается и через 6 мес до завершения наблюдения данный показатель не отличается от показателей в контрольной группе.

При исследовании показателей ЕК-клеточного иммунитета у детей и подростков с впервые выявленным СД-1 обнаружено статистически достоверное снижение относительного и абсолютного количества CD56⁺-клеток и БГЛ в крови, которое на фоне инсулинотерапии на протяжении двух лет не нормализуется. Среди детей и подростков с впервые выявленным СД-1 выделена группа больных, у которых наблюдается стабильно низкое содержание CD56⁺-клеток и БГЛ на протяжении всего периода наблюдения. У таких детей один из родителей был болен СД-1 и у них также наблюдалось низкое содержание ЕК-клеток, что позволяет отнести данную группу детей к особому подтипу СД-1 с генетически обусловленным дефектом ЕК-клеток.

Выявлены изменения ультраструктуры БГЛ у детей и подростков с впервые выявленным СД-1, характерные для ослабленной цитолитической и секреторной функции естественных клеток-киллеров.

Изучены показатели клеточного и гуморального иммунитета у детей, болеющих СД-1 в течение 5-10 лет. Установлено, что у детей данной группы отмечаются еще более выраженные изменения содержания ЕК-клеток (CD56⁺-клеток) и С-пептида в крови, а также тенденция к снижению общего количества Т-лимфоцитов (CD3⁺-клеток) и Т-индукторов/хелперов, по сравнению с детьми, которые болеют СД-1 2 года.

Ключевые слова: сахарный диабет 1 типа, лейкоциты, иммунологический фенотип лимфоцитов, ультраструктура, иммуноглобулины, С-пептид, инсулинотерапия.



Annotation

Malinovska T.M. Dynamics of clinico-immunological indices in children and teen-agers with newly diagnosed type 1 diabetes mellitus in the process of treatment. - Manuscript.

Thesis for the degree of Candidate of Medical Sciences: speciality 14.01.14 endocrinology. - V.P. Komisarenko Institute of Endocrinology and Metabolism of AMS of Ukraine, Kyiv, 2003.

The dissertation is devoted to the study of the status of cellular and humoral immunity in children and teen-agers with newly diagnosed type 1 diabetes mellitus (DM-1) in the dynamics of insulin treatment. 114 children aged from 7 to 15 years (61 patient with newly diagnosed DM-1; 23 - with continuous diabetes more than 5 years and 30 patients who were as a control group among them) were examined. Using the immunological and cytological methods of the investigation including FACS analysis and electron microscopy the indices of T-cellular immunity (CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺-cells) and NK-cellular (CD56⁺-cell) and LGL, and also of humoral immunity (CD20⁺-cells and IgG, IgA and IgM) in the dynamics of long-term insulin therapy (in 3, 6, 12, 18 and 24 months) were studied in 35 patients with newly diagnosed type 1 diabetes mellitus. The 2 year adequate insulin therapy did not result in the normalization of blood immunological indices especially CD3⁺, CD4⁺ and CD56⁺-cells, which expression is dependent on the rate of the clinical manifestation. However after insulin treatment the significant increase was revealed in the content of IgG, IgA and IgM and in the peripheral blood under the normal level of CD20⁺-cells.

Among children and teen-agers with newly diagnosed DM-1 a group of children with decreased content of NK-cells and LGL that are the special subtype of DM-1 and inherited defect of NK-cells was shown. A significant decrease of LGL number in the blood of patient with newly diagnosed DM-1 that was accompanied by the disorders in the ultrastructure of these cells was discovered.

The changes in indices of T- and NK-cellular immunity in patient with DM-1 consisting of 5-10 years were more expressed.

Key words: diabetes mellitus, leucocytes, immunologic phenotype of lymphocytes, ultrastructure of lymphocytes, immunoglobulines, C-peptide, insulin treatment.



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Цукровий діабет 1 типу (ЦД-1) є одним з найбільш розповсюджених ендокринних захворювань у дитячому віці. Кожного року число хворих на ЦД-1 збільшується на 5-7%, а кожні 15 років подвоюється [Тронько М.Д. та ін., 1996; Єфімов А.С. та ін., 2000]. За даними багатоцентрової дослідницької групи “Eurodiab” у всіх регіонах Європи з 1989 по 1998 р. відзначається швидкий ріст кількості дітей, хворих на вперше виявлений ЦД-1. Передбачається, що до 2010 р. захворюваність на ЦД-1 у світі перевищить 30 чоловік на 100 000 населення [Onkamo et al., 1999; Patterson et al., 2001]. В останні роки захворюваність на ЦД-1 зросла й в Україні. Щорічно в нашій країні реєструється близько 800 хворих з вперше виявленим ЦД-1 у віці до 14 років. Захворюваність на ЦД-1 в Україні серед дітей складала у 2001 р. 9,3 на 100 000 дитячого населення.

Неухильне зростання числа хворих на ЦД-1, особливо дітей та підлітків, важкі судинні ускладнення, рання інвалідизація пацієнтів змушують розглядати цукровий діабет як одну з найбільш важливих медико-соціальних проблем.

Оскільки доведено, що ЦД-1 є хворобою аутоімунної природи, в патогенезі якої головну роль грає деструкція бета-клітин острівців Лангерганса (ОЛ) з наступним розвитком гіпоінсулінемії, розробка нових, науково-обґрунтованих шляхів його профілактики, діагностики і лікування неможлива без точних знань про імунні механізми, що беруть участь у етіопатогенезі цього захворювання.

За останні роки досягнуті великі успіхи в області фундаментальної діабетології, багато в чому вивчений механізм аутоімунної деструкції бета-клітин в ОЛ підшлункової залози при ЦД-1 в експерименті, запропоновані нові методи ранньої доклінічної діагностики ЦД-1 [Mandrup-Poulsen, 2001; Зак К.П. та ін., 2002]. Однак багато питань клінічної імунології ЦД-1 у дітей, що характеризується важким лабільним плином, частим виникненням гіпер- та гіпоглікемічних станів, розвитком ранніх важких судинних ускладнень, залишаються відкритими [Большова-Зубковська О.В. та ін., 2001].

Одним з найбільш точних методів оцінки стану імунітету у хворих на ЦД-1 є дослідження вмісту і функціональної активності різних субпопуляций лімфоцитів в периферичній крові (ПК). Однак наявна література, яка стосується визначення імунофенотипу лімфоцитів ПК у дітей, хворих на ЦД-1, нечисленна й неоднозначна. Це зумовлено насамперед тим, що різні автори обстежували неідентичні групи хворих, які мали різну тривалість плину захворювання і отримували неоднакові схеми лікування інсуліном. Майже зовсім відсутня інформація щодо імунофенотипу лімфоцитів у дітей з вперше виявленим ЦД-1 ще до початку інсулінотерапії. Неоднозначність отриманих даних пов'язана також з тим, що багато авторів використовували у своїх роботах нестандартизовані, вже застарілі методи визначення різних популяцій лімфоцитів, засновані на розеткоутворюванні.

У зв'язку з цим є актуальним вивчення стану імунітету з використанням сучасних методів дослідження кількості й функції лімфоцитів різного імунофенотипу, що включають проточну цитометрію й електронну мікроскопію клітин крові, проведених у одних і тих же дітей та підлітків з вперше виявленим ЦД-1, до початку лікування інсуліном, а потім у динаміці - через 3, 6, 12, 18 і 24 міс. Одночасно з цим з метою оцінки ступеня порушення інсулінпродукуючої функції підшлункової залози у хворих визначався вміст С-пептиду у сироватці крові.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація є фрагментом планових наукових досліджень Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України за темою №284 “Клініко-імунологічне та епідеміологічне дослідження цукрового діабету у дітей та підлітків, що страждають цукровим діабетом 1 типу”(номер державної реєстрації 0197U001109).

Мета роботи. Оцінити стан клітинного і гуморального імунітету у дітей і підлітків з вперше виявленим ЦД-1 до початку лікування інсуліном, а потім у тих же хворих в динаміці протягом двох років спостереження, при постійному контролі показників вуглеводного обміну, стану інсулінпродукуючої функції підшлункової залози, клінічного плину захворювання.

Задачі дослідження:

1. Вивчити лейкоцитарний склад крові у дітей та підлітків з вперше виявленим ЦД-1 та в динаміці лікування інсуліном.

2. Дослідити вміст у крові лімфоцитів різного імунологічного фенотипу (СD3⁺-, СD4⁺-, СD8⁺-, СD20⁺-, СD56⁺-клітин) за допомогою моноклональних антитіл і методу проточної цитометрії у дітей та підлітків з вперше виявленим ЦД-1 і в динаміці лікування інсуліном.

3. Вивчити вміст різних типів імуноглобулінів у дітей та підлітків з вперше виявленим ЦД-1 і в динаміці лікування інсуліном.

4. Дослідити ультраструктуру великих грануловмісних лімфоцитів (ВГЛ) у дітей та підлітків з вперше виявленим ЦД-1 і в динаміці лікування інсуліном.

5. Дослідити вміст ВГЛ крові у дітей і підлітків з вперше виявленим ЦД-1 та родичів першого ступеня споріднення, хворих на ЦД-1.

6. Вивчити лейкоцитарний склад крові, імунофенотип лімфоцитів крові, вміст імуноглобулінів у дітей та підлітків, хворих на ЦД-1 протягом 5-10 років.

Об'єкт дослідження - клітинний та гуморальний імунітет у дітей та підлітків, хворих на ЦД-1.

Предмет дослідження - показники клітинного та гуморального імунітету, ультраструктура ПК-клітин, показники інсулінпродукуючої функції підшлункової залози у дітей та підлітків з вперше виявленим та тривалим ЦД-1 в процесі лікування інсуліном.

Методи дослідження. Для оцінки стану хворих на ЦД-1 використані загальноклінічні методи обстеження, в тому числі дослідження рівня гліколізованого гемоглобіну та С-пептиду в крові; гематологічні - визначення лейкоцитарного складу та окремо кількості ВГЛ у крові; імунологічні - автоматизований підрахунок лімфоцитів різного імунологічного фенотипу (СD3⁺-, СD4⁺-, СD8⁺-, СD20⁺-, СD56⁺-клітин) за допомогою проточної цитометрії з використанням моноклональних антитіл (FACStar аналіз) і визначення рівня імуноглобулінів класів G, А, М, а також цитологічні - електронно-мікроскопічне дослідження ВГЛ.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше вивчені показники клітинного та гуморального імунітету у одних і тих же дітей та підлітків з вперше виявленим ЦД-1 до початку лікування й у динаміці протягом двох років інсулінотерапії.

Встановлено, що традиційна замісна інсулінотерапія не нормалізує показники імунного статусу у хворих на ЦД-1.

Вперше виявлено особливий підвид ЦД-1 у дітей та підлітків, що характеризується стабільно дуже низьким змістом природних клітин-кілерів (ПК-клітин) у крові, як у самих пацієнтів, так і їх родичів першої лінії споріднення.

Практичне значення одержаних результатів. На підставі проведених досліджень встановлено, що інсулінотерапія не приводить до нормалізації порушеного імунного статусу у хворих на ЦД-1. Рекомендується проводити в усіх хворих на ЦД-1 імунологічне обстеження 1 раз на рік.

Виявлено особливий підвид ЦД-1, що характеризується низьким вмістом CD56⁺-клітин і ВГЛ у крові. Родичів таких хворих на ЦД-1 варто виділити в групу ризику щодо ЦД-1 та проводити в них дослідження даних показників 1 раз на рік з метою ранньої доклінічної діагностики захворювання.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно здійснено підбір, обстеження, лікування хворих з вперше виявленим та тривалим ЦД-1, а також здорових дітей, що складали контрольну групу; підбиралися і призначалися відповідні схеми інсулінотерапії. Проводився регулярний систематичний клінічний огляд і спостереження за хворими в динаміці лікування (через 3, 6, 12, 18 і 24 міс). Разом зі співробітниками лабораторії гормональної регуляції кровотворення (п.н.с. Грузов М.А., ст.н.с. Афанасьєва В.В.) проводилося визначення вмісту різного виду лейкоцитів, імунофенотипу лімфоцитів у ПК методом проточної цитометрії, а також вивчення ультраструктури ПК-клітин за допомогою електронної мікроскопії.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідалися на III міжнародному симпозіумі ендокринологів (Крим, Ялта, 1998), на конференції “Актуальні питання ендокринології” (Мінськ, 1999), на IV імунологічному конгресі (Рим, Італія, листопад 1999), на V з'їзді ендокринологів України (Київ, травень 2001), I науково-практичній конференції молодих вчених, присвяченій 95-річчю з дня народження В.П. Комісаренка (Київ, січень 2002), на засіданні апробаційної комісії з клінічної ендокринології Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України (2002).

Публікація результатів дослідження. За матеріалами дисертації опубліковано 10 наукових праць, з яких 1 монографія, 5 статей у фахових наукових виданнях, рекомендованих ВАК України, та 4 - в збірниках тез доповідей конгресів, з'їздів та конференцій.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 127 сторінках машинопису. Складається зі вступу, огляду літератури, 5 розділів власних досліджень, обговорення результатів, висновків, практичних рекомендацій на 105 сторінках, списку використаної літератури на 22 сторінках, який містить 199 літературних джерел (38 - вітчизняних авторів та 161 - іноземних). Дисертація ілюстрована 9 таблицями та 25 рисунками на 30 сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Загальна характеристика хворих та методи дослідження. Обстежено 114 дітей та підлітків у віці від 7 до 15 років (середній вік складав 10,74±0,22 років); з них: 61 хворий з вперше виявленим ЦД-1; 23 хворих на ЦД-1 із тривалістю захворювання від 5 до 10 років і 30 практично здорових дітей того ж віку (середній вік - 11,2±0,27 років), що складали контрольну групу.

Діагноз ЦД-1 ставився відповідно до сучасних критеріїв ВООЗ (1999) на основі клінічних та лабораторних проявів (полідіпсія, поліурія, втрата ваги тіла, підвищення рівня цукру в крові натще і протягом дня, глюкозурія).

В динаміці лікування інсуліном на протязі двох років більшість дітей та підлітків з вперше виявленим ЦД-1 знаходились в стані субкомпенсації, що підтверджено даними лабораторного обстеження.

Усі хворі одержували загальноприйняту терапію, що складалася з дієти (стіл №9 по Певзнеру) й інсулінотерапії. Хворі на ЦД-1 одержували людський інсулін протофан, актрапид (“Novo-Nordisk”) чи хумулін Р и H (“Lilly”).

У комплекс обстеження хворих входили як традиційні клінічні тести, так і гематологічні й імунологічні методи дослідження. Ступінь компенсації вуглеводного обміну оцінювали по виразності клінічних ознак ЦД-1 і на підставі визначення рівня глюкози в крові та сечі (за глікемічними і глюкозурічними профілями), рівня гліколізованого гемоглобіну (HbА1c) у крові. Вміст глюкози крові визначали ортотолуїдиновим методом. Вміст гліколізованого гемоглобіну (у молярних %) визначався колориметричним методом по реакції з тіобарбітуровою кислотою за методом Standefer J.C., Eaton R.P., 1983 (у нормі - 4,5-6,1%).

Про рівень продукції інсуліну в підшлунковій залозі хворого судили на підставі дослідження вмісту С-пептиду у сироватці крові імунорадіометричним аналізом. Вміст С-пептиду, визначений цим методом, у нормі складав 0,21-0,93 нг/мол.

Для гематологічних та імунологічних досліджень використовували венозну гепаринізовану кров, взяту натще. Загальну кількість лейкоцитів і лейкоцитарну формулу визначали загальноприйнятими методами. Мазки крові фарбували по Папенгейму з використанням фосфатного буфера (рН 6,85). Диференційований підрахунок лейкоцитів різних типів проводився на 200 клітинах, окремо визначались ВГЛ, що є морфологічним гомологом ПК-клітин.

Визначення кількості й аналіз розподілу лімфоцитів різного імунологічного фенотипу проводили методом проточної цитометрії з використанням лазерного цитофлуориметра FACStar plus (“Becton Dіскеnsоn”, США). Мононуклеари з крові виділяли шляхом диференційованого центрифугування у градієнті щільності Фікол-Уротрасту. Для мічення лімфоцитів різного імунофенотипу використовували моноклональні антитіла, мічені FITC або FE (фірми “Becton Dіскіnsоn”, США) проти поверхневих антигенів: СD3 (усі Т-лімфоцити), СD4 (Т-індуктори/хелпери), СD8(Т-супресори/кілери), СD20 (В-лімфоцити), СD56 (ПК-клітини). На цитофлуориметрі аналізували по 25 000 клітин в кожній пробі.

Рівень імуноглобулінів (Ig) класів G, A, M у сироватці крові визначали методом радіальної імунодифузії за допомогою стандартних наборів. Метод заснований на здатності специфічних антитіл при зв'язуванні з антигеном утворювати видимі оком кільця преципітації в агарозному гелі (Manchini G. et al., 1970).

Для електронно-мікроскопічного дослідження ВГЛ з крові виділяли лейкоцитарну плівку, фіксували її 2,5% глутаральдегідом на 0,1 М какодилатному буфері з 2% сахарози, постфіксували 1% ОsО₄ на тому ж буфері й заключали в аралдит. Ультратонкі зрізи виготовлені на мікротомі LKB-8800 (Швеція), досліджували з використанням електронного мікроскопа JEM-100C (Японія).

Для вивчення зазначених гематологічних та імунологічних показників кров брали до початку інсулінотерапії і через 3, 6, 12, 18 і 24 міс після її початку. Статистичну обробку даних проводили на персональному комп'ютері з використанням критерію t Стьюдента. Різниці вважались достовірними за умови величини показника Р<0,05.

Результати досліджень та їх обговорення. Динаміка змін лейкоцитарного складу крові і Т-лімфоцитів різного імунофенотипу у дітей та підлітків, хворих на ЦД-1 у процесі лікування інсуліном. Дослідження лейкоцитарного складу крові були проведені у 61 дитини обох статей у віці 8-15 років (середній вік складав 11,58±0,21 років) з вперше виявленим ЦД-1. З усіх обстежених нами дітей з вперше виявленим ЦД-1 була ретельно відібрана група пацієнтів, що складалася з 35 дітей, які, відповідно до анамнезу, ще не приймали ніяких цукрознижующих засобів і у яких при ретельному інструментальному обстеженні не було виявлено ускладнень, особливо запальних. У хворих цієї групи паралельно з традиційними клініко-лабораторними дослідженнями було проведене вивчення гематологічних та імунологічних показників ПК у динаміці (до лікування і через 3, 6, 12, 18 і 24 міс після його початку). На протязі спостереження хворі одержували відповідні дози людського інсуліну: актрапід і протофан (фірми “Novo-Nordisk”) або хумулін P і H (фірми “Lilly”).

Протягом 6 міс після діагностування захворювання і початку інсулінотерапії загальна кількість лейкоцитів у ПК обстежуваних істотно не змінилася. Тільки через 12 міс й, особливо, через 24 міс після початку терапії відзначалося невелике, але статистично достовірне зниження загального числа лейкоцитів як відносно до вихідного стану, так і до норми (табл. 1). Відносна й абсолютна кількість палочкоядерних і сегментоядерних нейтрофілів протягом усього періоду спостереження практично були близькі до вихідних показників, за винятком зниження абсолютних середніх величин відносно до норми через 3 і 18 міс після початку інсулінотерапії.

В цій групі хворих не спостерігалося закономірних змін абсолютної кількості еозинофілів і базофілів у ПК. Однак відносний вміст еозинофілів у ПК хворих в усі строки дослідження був статистично вірогідно підвищеним у порівнянні з групою здорових дітей. Середні величини відносної й абсолютної кількості моноцитів у ПК хворих дітей протягом усього періоду спостереження істотно не відрізнялися від показників до початку лікування інсуліном. Характерною рисою дітей цієї групи з вперше виявленим ЦД-1 була абсолютна лімфоцитопенія, найбільш виразна через 12 і 24 міс після початку лікування. У ці терміни абсолютна кількість лімфоцитів у ПК хворих була статистично вірогідно знижена відносно до норми.

Відносна й абсолютна кількість палочкоядерних та сегментоядерних нейтрофілів протягом усього періоду спостереження практично були близькі до вихідних показників, за винятком зниження абсолютних середніх величин палочкоядерних нейтрофілів відносно до норми через 3 і 18 міс після початку інсулінотерапії, та сегментоядерних - через 3, 18 і 24 міс.

В обстежуваній групі хворих не спостерігалося закономірних змін абсолютної кількості еозинофілів і базофілів у ПК. Однак відносний вміст еозинофілів у ПК хворих в усі строки дослідження був статистично вірогідно підвищеним у порівнянні з групою здорових дітей. Середні величини відносної й абсолютної кількості моноцитів у ПК хворих дітей протягом усього дворічного періоду спостереження істотно не відрізнялися від показників до початку лікування інсуліном, зокрема відносної кількості, яка була вірогідно підвищена в усі строки дослідження. Характерною рисою дітей цієї групи з вперше виявленим ЦД-1 була абсолютна лімфоцитопенія, найбільш виразна через 12 і 24 міс після початку лікування. У ці терміни абсолютна кількість лімфоцитів у ПК хворих була статистично вірогідно знижена відносно до норми.

Імунофенотип Т-лімфоцитів (СD3⁺-, СD4⁺-, СD8⁺-клітин) у дітей та підлітків з вперше виявленим ЦД-1 у динаміці дворічного лікування. Проточно-цитометричне дослідження відносного й абсолютного вмісту лімфоцитів різного фенотипу з використанням FACS аналізу було проведено у хворих тієї ж групи, в яких визначали лейкоцитарний склад крові.

У результаті проведених досліджень було встановлено, що на фоні інсулінотерапії відносний і абсолютний вміст СD3⁺- і СD4⁺-клітин у ПК в більшості хворих протягом усього періоду спостереження залишається зниженим у порівнянні зі здоровими дітьми.

Особливо значне зниження кількості СD3⁺-клітин як стосовно вихідного стану, так і до групи здорових дітей того ж віку спостерігалось через 24 міс після початку інсулінотерапії. Відносний і абсолютний вміст СD4⁺-клітин у ПК на протязі двох років спостереження залишається зниженим у порівнянні зі здоровими дітьми.

За нашими даними відносний і абсолютний вміст CD8⁺-клітин в ПК більшості дітей та підлітків з вперше виявленим ЦД-1 був близький до норми. Однак, починаючи з 3 міс до кінця спостереження, тобто через 2 роки після початку інсулінотерапії, середній вміст цих клітин був достовірно нижчим у порівнянні зі здоровими дітьми.

Аналіз залежності між ступенем зміни вмісту різних популяцій Т-лімфоцитів в ПК та швидкістю маніфестації захворювання показав, що у дітей, у яких проміжок часу між першими клінічними проявами ЦД-1 та госпіталізацією був дуже коротким, відзначалося найбільше зниження відносної й абсолютної кількості CD3⁺- та CD4⁺-клітин у порівнянні з групою дітей з тривалим плином.

Таким чином, у більшості дітей та підлітків з вперше виявленим ЦД-1 до початку лікування інсуліном спостерігаються виразні зміни з боку Т-клітинної ланки імунітету: зниження загальної кількості Т-лімфоцитів (CD3⁺-клітин), Т-індукторів/хелперів (CD4⁺-клітин). У результаті лікування високоякісними препаратами людського інсуліну протягом 24 міс у більшості хворих не відзначалося нормалізації зазначених показників. Навпаки, через 24 міс після початку інсулінотерапії відносний і абсолютний вміст CD3⁺-клітин у середньому став ще нижчим у порівнянні з групою здорових дітей; відносний і абсолютний вміст CD4⁺-клітин залишається низьким на протязі всього періоду спостереження у порівнянні з групою здорових дітей. Проведені дослідження дозволяють припустити, що імунні порушення, виявлені у дітей та підлітків з вперше виявленим ЦД-1 не мають кореляції з показниками метаболізму [Al-Sakkaf L. et al., 1989; Buschard K. et al., 1989; Gale E. a. Clark A., 2000].

Динаміка змін кількості і функції В-лімфоцитів крові у дітей та підлітків, хворих на ЦД-1, у процесі лікування інсуліном. Дослідження вмісту CD20⁺-клітин було проведено в тій ж групі дітей і підлітків з вперше виявленим ЦД-1, у яких проводилося визначення й інших показників імунітету. При цьому була виявлена тенденція до деякого зниження відносної та абсолютної кількості CD20⁺-клітин у ПК дітей з вперше виявленим ЦД-1 до початку інсулінотерапії. У динаміці лікування інсуліном відносна й абсолютна кількість CD20⁺-клітин у ПК змінювалися незакономірно і лише через 2 роки після початку дослідження вміст В-лімфоцитів у ПК хворих знову став вірогідно нижчим стосовно до контролю та мав тенденцію до зниження стосовно вихідного стану.

При дослідженні вмісту імуноглобулінів різних класів у сироватці крові дітей та підлітків з вперше виявленим ЦД-1 відзначався статистично вірогідно підвищений рівень IgG, IgA і IgM у порівнянні з контрольною групою.

При замісній терапії інсуліном вміст IgG в ПК у таких хворих поступово достовірно знижується, особливо через 24 міс, коли він стає навіть нижчим ніж у контролі. Вміст IgА зостається підвищеним протягом 18 міс і тільки через 24 міс лікування стає нижче в порівнянні з групою до початку лікування, та близьким до показників у здорових дітей. Вміст IgМ поступово знижується і через 6 міс дані показники близькі до показників в контрольної групі і такий рівень зберігається до кінця спостереження.

Проведені дослідження показують, що у дітей з вперше виявленим ЦД-1 не відзначається статистично достовірних змін відносної й абсолютної кількості CD20⁺-клітин ПК у порівнянні з здоровими дітьми. Традиційна інсулінотерапія не приводить у більшості хворих до істотних змін вмісту В-лімфоцитів, але у дітей та підлітків з вперше виявленим ЦД-1 спостерігаються виразні порушення гуморального імунітету у вигляді змін продукції основних класів імуноглобулінів, які після початку інсулінотерапії частково нормалізуються.

Динаміка змін вмісту й ультраструктури ПК-клітин у крові у дітей та підлітків з вперше виявленим ЦД-1 у процесі лікування інсуліном. При дослідженні вмісту CD56⁺-клітин в ПК у дітей та підлітків з вперше виявленим ЦД-1 до початку інсулінотерапії було виявлено статистично достовірне зниження їхнього числа в порівнянні зі здоровими однолітками контрольної групи. В динаміці замісної терапії інсуліном відносний і, особливо, абсолютний вміст CD56⁺-клітин у ПК більшості хворих поступово, починаючи з 3 міс лікування, зростають, досягаючи максимуму через 12-18 міс від початку терапії. Наприкінці дворічного періоду у багатьох хворих знову відзначалася тенденція до зниження CD56⁺-клітин у порівнянні зі здоровими дітьми.

Динаміка змін абсолютної кількості ВГЛ у ПК хворих з вперше виявленим ЦД-1 на протязі 24 міс спостереження, як видно з рис. 1, майже цілком збігається з динамікою змін СD56⁺-клітин, що є підтвердженням вірогідності отриманих нами даних щодо змін вмісту ПК-клітин у крові дітей, хворих на ЦД-1.

Одночасно з цим при дослідженні вмісту ПК-клітин в крові дітей та підлітків з вперше виявленим ЦД-1 було встановлено, що у 40% хворих спостерігається низький рівень ПК-клітин. У таких хворих було проведено дослідження кількості ПК-клітин і ВГЛ через 24 год після в/в введення інсуліну. У 32,71% дітей вміст СD56⁺-клітин в ПК через 24 год підвисився, став близьким до норми, але у 64,29% таких хворих навпаки відмічалась тенденція до зниження цих показників. На протязі 24 міс у цих хворих спостерігався постійно низький рівень СD56⁺-клітин (чи ВГЛ) в ПК. У цих хворих було виявлено, що один з їх родичів першої лінії споріднення був також хворий на ЦД-1 та в нього також відзначався постійно низький рівень ПК-клітин в крові. Таким чином, хворі з постійно низьким рівнем ПК-клітин у крові належать до особливого підвиду ЦД-1, у етіопатогенезі якого є генетично детермінований дефект ПК-клітин.

Разом з визначенням кількості СD56⁺-клітин та ВГЛ в ПК нами було проведене дослідження їх ультраструктури за допомогою електронної мікроскопії, що дає можливість у певній мірі судити про функціональний стан цих клітин. Проведені дослідження показали, що у хворих з вперше виявленим ЦД-1 до початку інсулінотерапії спостерігались виражені зміни ультраструктури ВГЛ: більш хвилястий контур ядерної мембрани, виражені розширення канальців гранулярного ендоплазматичного ретикулума, структурних компонентів комплексу Гольджі, набрякання мітохондрій, зменшення розмірів, кількості і розпушення матриксу електронно-щільних гранул, зменшення кількості паралельно-трубчастих структур, що характерно для послабленої цитолітичної та секреторної функції ПК-клітин [Зак К.П. и соавт., 1988; Возианов А.Ф. и соавт., 1998]. Особливо значні порушення ультраструктури відзначалися у хворих на ЦД-1 з найбільш низьким вмістом CD56⁺-клітин або ВГЛ у ПК. У динаміці лікування інсуліном (протягом 24 міс) не відбувається повної нормалізації ультраструктури ПК-клітин крові у дітей з вперше виявленим ЦД-1.

Лейкоцитарний склад, імунофенотип лімфоцитів і вміст імуноглобулінів в ПК дітей та підлітків, що хворіють на ЦД-1 від 5 до 10 років. При дослідженні крові у 23 дітей та підлітків, що хворіють на ЦД-1 від 5 до 10 років не було виявлено статистично достовірних змін кількості лейкоцитів у крові у порівнянні зі здоровими дітьми того ж віку і статі, але у порівнянні з більш короткими термінами лікування (3 і 24 міс) спостерігалося підвищення їх числа. Суттєвих змін лейкоцитарного складу ПК у цій групі хворих не виявлено.

При дослідженні лімфоцитів різного імунофенотипу в ПК у дітей, що хворіють на ЦД-1 від 5 до 10 років, було виявлено найбільш низький вміст СD3⁺- і СD4⁺-клітин стосовно норми і тенденцію до зниження цих показників у порівнянні з хворими на ЦД-1 з коротким терміном лікування інсуліном.

За нашими даними відносний вміст СD8⁺-клітин у ПК хворих, що хворіють на ЦД-1 на протязі 5-10 років, був близьким до показників у здорових дітей і хворих на ЦД-1, що одержували інсулінотерапію коротший проміжок часу. Слід зазначити, що у дітей, що хворіють на ЦД-1 протягом 5-10 років, відзначається статистично достовірне зниження відносного й абсолютного вмісту ПК-клітин (СD56⁺-клітин) як у порівнянні з хворими з тривалістю захворювання 2 роки, так і з групою здорових дітей.

Проведене дослідження С-пептиду в ПК у цієї групи хворих виявило значне зменшення його вмісту в порівнянні зі здоровими дітьми та хворими з вперше виявленим ЦД-1 до початку лікування і через 3 та 24 міс інсулінотерапії.

У дітей та підлітків, що хворіють на ЦД-1 більш 5 років подібно до пацієнтів з меншою тривалістю захворювання, спостерігались значні порушення вмісту різних класів імуноглобулінів при нормальному рівні кількості CD20⁺-клітин в ПК. Рівень IgG залишається зниженим, вміст IgА та IgМ вірогідно підвищеним у порівнянні з групою хворих з тривалістю ЦД-1 два роки.

Таким чином, у дітей та підлітків, що хворіють на ЦД-1 протягом 5-10 років відзначаються ще більш виразні зміни вмісту ПК-клітин (CD56⁺-клітин) та С-пептиду у ПК, а також тенденція до зниження загальної кількості Т-лімфоцитів (CD3⁺-клітин) і основної їх субпопуляції (CD4⁺-клітин) в порівнянні з дітьми, що хворіють на ЦД-1 два роки. Це вказує на те, що у таких хворих, незважаючи на традиційну інсулінотерапію, не вдається нормалізувати функцію Т- і ПК-клітинної систем імунітету.



ВИСНОВКИ

При дослідженні імунологічного стану дітей та підлітків з вперше виявленим ЦД-1 встановлені виразні зміни показників клітинного і гуморального імунітету, що утримуються, незважаючи на традиційну інсулінотерапію. У дітей та підлітків, що хворіють тривалий час на ЦД-1, ці зміни стають ще виразнішими.

У дітей та підлітків з вперше виявленим ЦД-1 до початку лікування інсуліном виявлено: зниження вмісту в крові CD3⁺-клітин (загальної кількості Т-клітин), CD4⁺-клітин (Т-індукторів/хелперів) і CD56⁺-клітин (природних клітин-кілерів), виразність змін яких у значній мірі залежить від швидкості клінічної маніфестації.

Традиційна інсулінотерапія у дітей та підлітків з вперше виявленим ЦД-1 в динаміці спостереження протягом двох років не призводить до нормалізації показників Т- і ПК-клітинного імунітету крові.

Серед дітей та підлітків з вперше виявленим ЦД-1 виділена група (40%), де спостерігається стабільно низька кількість CD56⁺-клітин та ВГЛ. У таких дітей один з родичів першого ступеня споріднення був також хворий на ЦД-1, і в нього спостерігався низький вміст ПК-клітин. Це дозволяє припустити, що дана група дітей відноситься до особливого підвиду ЦД-1 з генетично зумовленим дефектом ПК-клітин.

У дітей та підлітків з вперше виявленим ЦД-1 виявлені зміни ультраструктури ВГЛ, характерні для ослабленої цитолітичної й секреторної функції ПК-клітин. Інсулінотерапія на протязі 24 міс не призводила до нормалізації ультраструктури ВГЛ.

У дітей та підлітків з вперше виявленим ЦД-1 відзначається підвищення вмісту IgG, IgA і IgM у сироватці крові при нормальному рівні CD20⁺-клітин. У динаміці лікування інсуліном відзначається тенденція до нормалізації IgA і Ig M. Рівень IgG наприкінці другого року спостереження знижений.

У дітей та підлітків, що хворіють на ЦД-1 на протязі 5-10 років поряд зі зниженням показників Т- і ПК-клітинного імунітету спостерігається паралельне зниження рівня С-пептиду.

Практичні рекомендації

На підставі проведених досліджень встановлено, що традиційна інсулінотерапія не призводить до нормалізації імунологічних показників у дітей та підлітків з вперше виявленим ЦД-1, а, навпаки, при тривалості захворювання 5-10 років виявлені зміни стають більш виразними. Рекомендується проводити в усіх хворих на ЦД-1 імунологічне обстеження 1 раз на рік.

Отримані дані дозволили нам виокремити й описати особливий підвид ЦД-1 у дітей, який характеризується стабільно низьким вмістом ПК-клітин та ВГЛ у крові. Родичів таких хворих у віці до 16 років рекомендовано виділити в групу ризику щодо ЦД-1 й проводити в них дослідження вмісту ПК-клітин та ВГЛ у крові 1 раз на рік.



СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Зак К.П., Малиновская Т.Н., Тронько Н.Д. Иммунитет у детей, больных сахарным диабетом. - К: Книга плюс, 2002. - 112 с. (Автором самостійно здійснювався пошук літератури за темою, проведено підбір, обстеження, лікування хворих, узагальнення отриманих результатів. Імунологічне обстеження проведено в лабораторії гормональної регуляції кровотворення під керівництвом проф. Зака К.П.)

Зак К.П., Малиновська Т.М. Динаміка показників гуморального імунітету у дітей з вперше виявленим цукровим діабетом 1 типу // ПАГ. - 2001. - №1. - С. 29-31. (Автором самостійно проведено підбір, обстеження, лікування хворих, аналіз та узагальнення змін в імунограмах пацієнтів, оцінку динаміки рівня імуноглобулінів в процесі лікування, написання статті).

Зак К.П., Малиновська Т.М., Грузов М.А. Імунофенотип лімфоцитів крові дітей з цукровим діабетом 1 типу в динаміці тривалої інсулінотерапії // Лік. справа. - 2001. - №3. - С. 44-47. (Автором самостійно проведено підбір, обстеження, лікування хворих, оцінку динаміки отриманих даних імунологічного дослідження, написання статті).

Зак К.П., Малиновская Т.Н., Большова-Зубковская Е.В. Состояние иммунной системы у детей, больных сахарным диабетом 1 типа // Ендокринологія. - 2001. - 6, №2. - С. 191-203. (Автором самостійно здійснювався пошук літератури за темою, проведено підбір, обстеження, лікування хворих, узагальнення отриманих результатів).

Малиновская Т.Н., Зак К.П. Особенности иммунофенотипа лимфоцитов крови у детей, больных сахарным диабетом 1 типа, в зависимости от длительности заболевания и уровня С-пептида // Доповіді НАН України. - 2002. - №2. - С. 192-195. (Автором самостійно проведено підбір, обстеження, лікування хворих, аналіз та узагальнення отриманих даних імунологічного та гормонального досліджень, написання статті).

Малиновська Т.М. Імунітет у дітей та підлітків з різною тривалістю цукрового діабету 1 типу // Ендокринологія. - 2002. - 7, №1. - С. 117-121. (Автором самостійно проведено підбір, обстеження, лікування хворих, аналіз та узагальнення отриманих даних, написання статті).

Афанасьева В.В., Грузов М.А., Малиновская Т.Н., Большова Е.В., Зак К.П. Гематологический и иммунологический мониторинг у детей, больных инсулинзависимым сахарным диабетом в течение инсулинотерапии // Тез. докл. ІІІ межд. симпозиума, Ново-Нордиск, 17-19.09.1998, Крым. - С. 3-4.

Грузов М.А., Малиновская Т.Н. Динамика гематологических и иммунологических показателей у детей с впервые выявленным инсулинзависимым сахарным диабетом (ИЗСД) // Акт. вопросы эндокринол. Тез. докл. Минск. - 1999. - С. 45-46.

Грузов М.А., Афанасьєва В.В., Малиновська Т.М., Зак К.П. Проточно-цитометричний аналіз лімфоцитів різного імунофенотипу та ультраструктури великих грануловмісних лімфоцитів крові у дітей з цукровим діабетом 1 типу // Тез. VІ з'їзду ендокринологів України, Київ, 23-25 травня, 2001. - С. 74.

Zak K.P., Gruzov M.A., Afanasyeva V.V., Malinоvskaya T.N. Subtype of IDDM in newly diagnosed type 1 diabetics, characterised by low number and activity of NK cells in the peripheral blood // The 4^th Immunology of Diabetes Society Congress. November. 10-15. 1999, Finggy (Rome), Italy. - P. 84.

Размещено на Allbest.ru

...