Система клонування генів у штамах актиноміцетів – продуцентах канаміцину streptomyces kanamyceticus та ландоміцину е streptomyces globisporus 1912

4. Лужецкий А.Н., Осташ Б.Е., Федоренко В.А. Межродовая конъюгация Еscherichia coli - Streptomyces globisporus 1912 с использованием интегративной плазмиды pSET152 и ее производных // Генетика. -2001.-Т.37, №10.-С.1340-1347.

5. Ostash B.O., Luzhetskiy A.M., Gromyko O.M., Fedorenko V.O. Transfer of plasmids from Escherichia coli to mutant strain Streptomyces globisporus LND900 with altered biosynthesis of antitumor antibiotic landomycin E // Науковий вісник Ужгородського національного університету, Серія Біологія. -2001.-Т.10.-С.147-149.

6. Luzhetskyy A., Fedoryshyn M., Fedorenko V. Obtaining and studying of Streptomyces galilaeus HKI 022 exconjugants, which carry conjugative plasmids pWA1, pSET152, and pWPK // Вісник Львівського університету. Сер.біол. 2001. №.27. С.89-96.

7. Федоренко В.О., Басілія Л.І., Заворотна С.А., Голець Л.М., Кириченко Н.В., Настасяк І.М., Демидчук Ю.О., Дубицька Л.П., Мазепа А.Й., Мар'їна О.В., Панькевич К.О., Осташ Б.О., Лужецький А.М., Громико О.М., Самбір М.В. Генетичний контроль біосинтезу антибіотиків та стійкості до антибіотиків у актиноміцетів. Глава з монографії „Генетика і селекція в Україні на межі тисячоліть”. K.: Логос.-2001.- Т.1. - С.469-476.

8. Luzhetskyy A., Fedoryshyn M., Hoffmeister D., Bechthold A., Fedorenko V. A gene cloning system for Streptomyces cyanogenus S136. Вісник Львівського унівеситету. Сер.біол. 2002. №.29. С.62-68.

9. Rebets Y., Ostash B., Luzhetskyy A., Hoffmeister D., Braтa A., Mendez C., Salas J.A., Bechthold A., Fedorenko V. Production of landomycins in strains Streptomyces globisporus 1912 and S. cyanogenus S136 is regulated by genes encoding putative transcriptional activators // FEMS Microbiol. Lett.-2003.-V.222(1).-P.149-153.

10. Pankevych K., Demydchuk J., Luzhetskiy A., Ostash B., Basiliya L., Weber K., Fedorenko V., Saluz H. and Krugel H. Pathway alignment and analysis of the landomycin E biosynthetic gene cluster from Streptomyces globisporus 1912. Dresden, VAAM-Workshop " Biologie der Actinomyceten" - Theses. - 1999.-26-28 September. -P. V18.

11. Luzhetskyy A. Introducing of plasmid DNA into Streptomyces kanamyceticus, the producer of medical important antibiotic kanamycin. 2^nd international medical conference for students and young doctors-April 28-30, 2000-Theses-P.:134-136. Lublin, Poland.

12. Luzhetskyy A. Conjugative transfer of plasmid pSET152 from E.coli to Streptomyces kanamyceticus and Streptomyces globisporus.// Conference on genetics and molecular biology for students and young scientists devoted to 100^th anniversary of genetics: Proc. (L'viv, Ukraine, 20 -22 April 2000). - L'viv, 2000. - P. 69.

13. Luzhetskyy A. M.. Development of gene cloning system in strains producers of antitumor antibiotics. // 8^th International scientific conference for student and young doctors; 4-6 May 2000, Gdansk, Poland (Theses).

14. Luzhetskyy A., Revonyuk N., Fedoryshyn M. Plasmid clining vectors which include genes for Landomycinb E biosinthesis. Conference on genetics and molecular biology for students and young scientifists devoted to 100 ^th anniversary of genetics: Proc.(L'viv, Ukraine, 20-22 April 2000). L'viv. -2000.- P. 76.

15. Ostash B.O., Pankevych K.O., Luzhetskiy A.M., Basiliya L.I., Gromyko O.M., Kruegel H., Fedorenko V.O. Studying of genes involved in landomycin E biosynthesis by Streptomyces globisporus 1912 // 12^th international symposium on the biology of actinomycetes; Vancouver, Canada, August 5-9, 2001. Theses.-P.133.

16. Fedorenko V.O., Ostash B.O., Luzhetskiy A. M., Basiliya L.I., Pankevych K.O., Gromyko O.M., Rebets Y., Kruegel H. Genetic control of antitumor antibiotic landomycin E biosynthesis in Streptomyces globisporus 1912 // Materialy ogolnopolskiego symposium mikrobiologicznego, Krakow, Poland, 6-8 Wrzesien 2001. Theses.-P.17-18.

17. Luzhetskyy A., Fedorenko О., Fedoryshyn M., Revonyuk N. Conjugation between Eshcherichia coli - Streptomyces as effective way of development gene cloning system in producers of antitumor antibiotics // Conference for students, PhD students and young scientists on molecular biology and genetics, September 20-22, 2001, Kyiv, Ukraine. Abstracts book. P.180.

18. Luzhetskiy A.M., Ostash B.O., Gromyko O.M., Fedorenko V.O. Conjugative transfer of plasmid DNA into Streptomyces - producers of antitumor antibiotics //12^th international symposium on the biology of actinomycetes; Vancouver, Canada, August 5-9, 2001. Theses.-P.80.

19. Fedoryshyn M.Y., Luzhetskyy A.M. Obtaining of recombinant strains of Streptomyces galilaeus - producer of aclacinomycins. // Conference for students, PhD students and young scientists on molecular biology and genetics, September 20-22, 2001, Kyiv, Ukraine. Abstracts book. P.90.

20. Rebets Y., Ostash B., Luzhetskyy A., Bechthold A., Fedorenko V. Pathway-specific regulatory genes for landomycins E and A biosynthesis of Streptomyces globisporus 1912 and Streptomyces cyanogenus S136, a new member of SARP family// VAAM - Workshop “Biologie bakterieller Naturstoffproduczenten” 29.Sept.-1 Okt.2002, Freiburg. - P.28.

21. Luzhetskyy A., Fedoryshyn M., Hoffmeister D., Bechthold A., Fedorenko V. Conjugal transfer of plasmid DNA from Escherichia coli to Streptomyces kanamyceticus: effects of chromosomal insertion on kanamycin production. Freiburg, VAAM-Workshop " Biologie der Actinomyceten" - 2002-29 September-1 October. V3.

22. Ребець Ю., Осташ Б., Лужецький А., Хофмейстер Д., Брана А., Мендез К., Салас Х.А., Бехтольд А., Федоренко В. Гени, що контролюють біосинтез ландоміцинів у Streptomyces globisporus 1912 та Streptomyces cyanogenus S136 // Тези доповідей учасників І-ої Всеукраїнської науково-практичної конференції студентів, аспірантів та молодих учених (10-11 лютого 2003р., м. Київ). С. 135-136.

23. Осташ Б., Лужецький А., Громико О., Ф Ломбо., Салас Х.А., Федоренко В. Генетичний контроль глікозилювання протипухлинного антибіотика ландоміцину Е: вивчення гену lndGT4 Streptomyces globisporus 1912 // Тези доповідей учасників І-ої Всеукраїнської науково-практичної конференції студентів, аспірантів та молодих учених (10-11 лютого 2003р., м. Київ). С. 130-131.

24. Лужецький А., Лябах Н., Федоришин М., Хофмейстер Д., Бехтольд А., Федоренко В. Гетеро логічна експресія генів біосинтезу ландоміцину Е в штамі Streptomyces fradiae Tu2717 продуценті урдаміцинів // Тези доповідей учасників І-ої Всеукраїнської науково-практичної конференції студентів, аспірантів та молодих учених (10-11 лютого 2003р., м. Київ). С. 128-129

25. Лужецький А., Грек М., Федоришин М., Осташ Б., Басілія Л., Бехтольд А., Федоренко В. Використання кон'югації для створення рекомбінантних штамів Streptomyces cyanogenus S136 // Тези доповідей учасників І-ої Всеукраїнської науково-практичної конференції студентів, аспірантів та молодих учених (10-11 лютого 2003р., м. Київ). С. 127-128.

АНОТАЦІЯ

Лужецький А.М. Система клонування генів у штамах актиноміцетів - продуцентах канаміцину Streptomyces kanamyceticus та ландоміцину Е Streptomyces globisporus 1912. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика.- Інститут фізіології рослин та генетики НАН України, Київ, 2003.

Розроблено ефективну методику перенесення рекомбінантних плазмід в штами - продуценти канаміцину S.kanamyceticus 1 та ландоміцину Е S.globisporus 1912 за допомогою кон'югації з E.coli. Показано, що інтегративні конюгативні плазміди pSET152 і pVWB успадковуються штамами S.globisporus 1912 і S.kanamyceticus 1 з частотою 100% під час вирощування в неселективних умовах. Реплікативні конюгативні плазміди pSOK101, pSOK201 та pCHZ101 підтримуються у 20 % клонів досліджуваних штамів після трьох пересівів у середовищі без антибіотика. Плазміда pSET152 інтегрується у два сайти (attB1 і attB2) хромосоми S.kanamyceticus 1 та S.globisporus 1912 і пригнічує біосинтез канаміцину та ландоміцину Е, досліджені реплікативні кон`югативні плазміди не впливають на рівень продукції антибіотиків. Клоновано і секвеновано чотири ORF, що оточують attB1- і attB2- сайти для інтеграції фага С31 в хромосомі S.kanamyceticus 1. Інтеграція pSET152 зумовлює руйнування ORF1, яка кодує білок, що, імовірно, бере участь у процесі конденсації хромосоми.

Розроблено векторну систему для спрямованого мутагенезу lnd-генів у штамі S.globisporus 1912. Проведено заміщення гена lndА, який кодує -кетоацилсинтазу на ген стійкості до канаміцину. Отриманий штам S.globisporus NKN не продукує ландоміцину Е. Експресія генів lndElndFlndAlndBlndClndD під контролем конститутивного промотора гену канаміцинстійкості aphII у продуценті спорідненого антибіотика урдаміцину А призводить до продукції нового ангуцикліна. Інтеграція плазміди pOJmellan2 в хромосому S.cyanogenus S136 призводить до полярного ефекту на гени lanGT4, lanZ3, lanZ4, lanZ5 та продукції цим штамом нових ландоміцинів F та Н, з різною кількістю цукрів у своїх молекулах і без гідроксильної групи у позиції С11 аглікону.

Ключові слова: Streptomyces, антибіотики, кон`югація, клонування генів, ландоміцин , канаміцин.

АННОТАЦИЯ

Лужецкий А.Н. Система клонирования генов в штаммах актиномицетов - продуцентах канамицина Streptomyces kanamyceticus и ландомицина Е Streptomyces globisporus 1912. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика. - Институт физиологии растений и генетики НАН Украины, Киев, 2003

Разработана еффективная методика переноса рекомбинантных плазмид в штаммы - продуценты канамицина S.kanamyceticus 1 и ландомицина Е S.globisporus 1912 при помощи конъюгации с E.coli. Установлено, что интегративные конъюгативные плазмиды pSET152 и pVWB наследуются штаммами S.globisporus 1912 и S.kanamyceticus 1 с частотой 100% при виращивании в неселективных условиях. Репликативные конъюгативные плазмиды pSOK101, pSOK201 и pCHZ101 поддерживаются в 20 % клонов исследуемых штаммов после трех пересевов на среде без антибиотика. Плазмида pSET152 интегрируется в два сайта (attB1 и attB2) хромосомы S.kanamyceticus 1 и S.globisporus 1912, угнетая биосинтез канамицина и ландомицина Е. Исследуемые репликативные конъюгативные плазмиды не влияют на уровень продукции антибиотиков. Клонированы и секвенированы четыре ORF, фланкирующие attB1- і attB2-сайты интеграции фага С31 в хромосоме S.kanamyceticus 1. Интеграция pSET152 приводит к разрушению ORF1, кодируюшую белок, участвующий в процессе конденсации хромосомы. Разработана векторная система для направленного мутагенеза lnd-генов в штамме S.globisporus 1912. Проведено замещение гена lndА, кодирующего -кетоацилсинтазу на ген канамицинустойчивости. Полученный штамм S.globisporus NKN не продуцирует ландомицин Е. Експрессия генов lndE lndF lndA lndB lndC lndD под контролем конститутивного промотора гена канамицинустойчивости aphII в продуценте родственного антибиотика урдамицина А приводит к продукции нового ангуциклина. Интеграция плазмиды pOJmellan2 в хромосому S.cyanogenus S136 оказывает полярный еффекту на гены lanGT4, lanZ3, lanZ4, lanZ5, в результате чего штамм продуцирует новые ландомицины F и Н, не содержащие гидроксильной группы в позиции С11 агликона с разным количеством гликозидных остатков.

Ключевые слова: Streptomyces, антибиотики, коньюгация, клонирование генов, ландомицин , канамицин.

ANNOTATION

Luzhetskyy A.M Gene cloning system for actynomycetes strains - producers of kanamycin Streptomyces kanamyceticus 1 and landomycin E Streptomyces globisporus 1912. - Manuscript.

Thesis for obtaining of Philosophy Doctor scientific degree by speciality - 03.00.15 - Genetics. - Institute of Plant Physiology and Genetics, NAS of Ukraine, Kiyv, 2003.

Gene cloning system in producers of kanamycin Streptomyces kanamyceticus and of landomycin E Streptomyces globisporus 1912 was developed using intergeneric conjugation from E.coli. The efficiency of the method was shown for 16 species of actynnomycetes, which are low frequency transformed with plasmid DNA. E.coli strains carrying plasmids of IncP incompatibility group are the most effective donors in mating with streptomycetes. Integrative conjugative plasmids pSET152 and pVWB are stably inherited in the chromosomes of S.kanamyceticus 1 and S.globisorus 1912 strains after several passages under non selective conditions. Exconjugants of these stains lost replicative conjugative plasmids pSOK101, pSOK201, and pCHZ101 with high frequency after several passages without selective antibiotics. Plasmid pSET152 integrates into two sites (attB1 and attB2) of S.kanamyceticus 1 and S.globisorus 1912 chromosomes. Surrounding regions of attB1 and attB2 sites of S.kanamyceticus 1 chromosome were cloned and sequenced. Four ORF were identified within cloned fragments. Integration of pSET152 caused disruption of ORF1 encoding protein condensation protein. Exconjugants of S.kanamyceticus 1 and S.globisorus 1912 containing pSET152 has antibiotics production inhibited. Replicative plasmids pSOK101, pSOK201, pCHZ101 and integrative pVWB do not influent on the level of kanamycin and landomycins production. Vector system for landomycin biosynthesis gene inactivation in S.globisporus 1912 and S.cyanogenus S136 was developed. The features of homologous recombinations S.globisporus 1912 and S.cyanogenus S136 between plasmid carrying cloned fragments and chromosome were studied. By means of directed mutagenesis lndA gene of -ketoacylsynthase controlling production of nascent polyketide chain was deleted. Resulted strain S.globisporus NKN does not produce any landomycin derivatives, thus proving that cloned lnd-cluster is involved in landomycin E biosynthesis. Integration of pOJmellan2 into S.cyanogenus S136 due to homologous recombination caused polar effect on lanGT4, lanZ3, lanZ4, lanZ5 genes resulted in production of new landomycin H and F. Landomycins F and H, possess mono- and disaccharide moieties, respectively, and unlike landomycin A lack C11-hydroxyl group. These results show that lanZ4 and lanZ5 genes are responsible for first ring hydroxylation of landomycin A precursor in position С11 and lanGT4 attaches third deoxysugar L-rhodinose during landomycin A biosynthesis. Heterologous expression of lndElndFlndAlndBlndClndD-genes under control of constitutive promoter derived from aminoglycoside-phosphotransferase gene aphII in urdamycin producer S.fradiae Tu2717 led to production of novel compound, similar in it's physico-chemical characteristics with urdamycins.

Key words: Streptomyces, antibiotics, conjugation, gene cloning, landomycin, kanamycin.

Размещено на Allbest.ru