Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМ. В.Н. КАРАЗІНА

ВПЛИВ БОКОВИХ ЛАНЦЮГІВ АРОМАТИЧНИХ ЛІГАНДІВ НА ПРОЦЕСИ АСОЦІАЦІЇ І КОНКУРЕНТНОГО ЗВ'ЯЗУВАННЯ З ДНК

03.00.02 - біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико-математичних наук

ЛАНТУШЕНКО Анастасія Олегівна

Харків - 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Севастопольському національному технічному університеті Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівникдоктор фізико-математичних наук, професор Веселков Олексій Никонович, Севастопольський національний технічний університет, завідувач кафедри фізики.

Офіційні опоненти:

доктор фізико-математичних наук, професор Благой Юрій Павлович, Фізико-технічний інститут низьких температур ім. Б.І. Вєркіна НАН України, головний науковий співробітник (м. Харків);

кандидат фізико-математичних наук, старший науковий співробітник Шестопалова Ганна Вікторівна, Інститут радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усікова НАН України, старший науковий співробітник (м. Харків).

Провідна установа Інститут фізики НАН України, відділ фізики біологічних систем, м. Київ.

Захист відбудеться “ 13 ” червня 2003 р. о 15⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному університеті ім. В.Н.Каразіна, за адресою: 61077, м.Харків, пл.Свободи, 4. ауд.7-4. ароматичний ліганда гидротропний нікотинамід

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна за адресою: 61077, м.Харків, пл.Свободи, 4.

Автореферат розісланий “ 10 ” травня 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої радиГаташ С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Установлення зв'язку між структурою й активністю біологічно активних сполук (БАС) є однією з найважливіших задач молекулярної біофізики. Ароматичні БАС (протипухлинні антибіотики, мутагенні і канцерогенні речовини, барвники) являють собою великий клас речовин, що знайшли широке застосування в клінічній практиці й експериментальних дослідженнях. У багатьох випадках молекулярна основа біологічної активності таких препаратів полягає в їх взаємодії з ДНК, причому інтеркаляційний тип зв'язування, при якому плоский поліциклічний хромофор ароматичної молекули вбудовується між сусідніми парами основ подвійної спіралі ДНК, є домінуючим. Незважаючи на те, що до теперішнього часу опубліковано досить багато робіт, присвячених дослідженню впливу структури ароматичних хромофорів на їх спорідненість до зв'язування з ДНК, питання про роль бокових ланцюгів хромофорів у комплексоутворенні лігандів із ДНК вивчено недостатньо. Можна сказати, що в літературі відсутні систематичні послідовні дослідження впливу структурних особливостей бокових ланцюгів ароматичних БАС на закономірності їх біологічної активності і ступінь зв'язування з ДНК.

Підвищення біологічної активності (зв'язане, зокрема, із збільшенням розчинності) ароматичних БАС може бути досягнуте при їх спільному використанні з гідротропними агентами (такими як нікотинамід, кофеїн і тощо), що має важливе значення при клінічному використанні малорозчинних БАС, зокрема, вітамінів і антибіотиків. Однак молекулярний механізм дії подібних гідротропних речовин у цей час не встановлений. Слід зазначити, що спільне використання ароматичних БАС (наприклад, при комбінаційній хіміотерапії) також може впливати на їх медико-біологічну активність.

Таким чином, для цілеспрямованого синтезу БАС із заданими властивостями, для прогнозування ефективності спільної дії БАС у біофізичних і біохімічних процесах важливим є знання молекулярного механізму асоціації різних біологічно активних речовин і їх комплексоутворення з біополімерами, зокрема, з ДНК. У дисертаційній роботі досліджено вплив бокових ланцюгів ароматичних БАС (фенантридінових барвників і феноксазонових речовин) на утворення асоціатів і комплексів з фрагментами ДНК у водному розчині методами одномірної і двомірної ЯМР-спектроскопії, які дозволяють одержати найбільш повну інформацію про структурні і термодинамічні параметри молекулярних комплексів у розчині.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в рамках держбюджетної наукової теми “Ліганд-2” Міністерства освіти і науки України (№ держ.реєстр. 0101U001816): “Молекулярний механізм регуляції медико-біологічної активності при комбінаційному використанні ароматичних сполук і роль гетероасоціації і конкурентного зв'язування ароматичних лігандів з нуклеіновими кислотами”, 2001-2003; за Міжнародним Грантом INTAS-97 31753: “Design, synthesis and testing of novel biologically-active molecules as potential drugs with sequence-specific binding to nucleic acids”, 1999-2002; за Договором про науково-технічне співробітництво СевНТУ з департаментом хімії Беркбек коледжу Лондонського університету (Великобританія), 1998-2003рр., за Договором про науково-технічне співробітництво СевНТУ з Гумбольдським університетом (Німеччина), 1999-2004 рр.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність теми, сформульовано мету і задачі дослідження, показано новизну отриманих результатів, їх наукове і практичне значення.

У першому розділі, що містить огляд літератури за темою дисертації, проаналізовано вплив структури хромофорів ароматичних біологічно активних сполук і їх бокових ланцюгів на фізико-хімічні властивості лігандів і їх медико-біологічну активність при взаємодії з ДНК. Розглянуто основні параметри вторинної структури ДНК із використанням прийнятої в даний час номенклатури. Обговорено літературні дані про самоасоціацію ароматичних лігандів і олігонуклеотидів, гетероасоціації БАС і їх комплексоутворення з ДНК, отримані за допомогою різних експериментальних методів. Проаналізовано загальні закономірності асоціації ароматичних лігандів з різною структурною організацією хромофорів і бокових ланцюгів.

Розглянуто вплив структурних особливостей бокових ланцюгів ароматичних БАС на їх медико-біологічну активність при комплексоутворенні з ДНК на прикладі двох груп ароматичних речовин, що мають різні біологічні властивості: фенантридінових барвників бромистого етидію (EB) і його азидо-аналогів моно-(EMB) і діазиду (EDC) етидію, що відрізняються будовою бокових ланцюгів, і феноксазонових сполук - протипухлинного антибіотика актиноміцину D і його синтетичних похідних. Показано, що незначні модифікації структури бокових ланцюгів хромофорів БАС приводять до суттєвих змін їх біологічної активності. Зроблено висновок про необхідність проведення систематичних послідовних досліджень фізичних механізмів асоціації БАС зі структурно різними боковими ланцюгами з метою з'ясування молекулярних основ специфіки взаємодії біологічно активних речовин з молекулою ДНК. Проаналізовано зміну біологічної активності (зв'язану, зокрема, зі збільшенням розчинності) ароматичних БАС при їх спільному використанні з гідротропними агентами, що має важливе значення при клінічному використанні малорозчинних БАС (зокрема, вітамінів і антибіотиків.) Як приклад, розглянуто солюбілізуючу дію гідротропного агента нікотинаміду на малорозчинний вітамін В₂ (рібофлавін).

В розділі 2 розглянуто основи спектроскопії ядерного магнітного резонансу. Коротко описано експериментальні параметри ЯМР- спектроскопії і їх застосування для дослідження молекулярних комплексів у розчині. Розглянуто методики двомірної гомоядерної спектроскопії, які виявляють кореляцію хімічних зсувів через хімічні зв'язки (2D-COSY і 2D-TOCSY) і через простір (2D-NOESY і 2D-ROESY). Особливу увагу приділено методиці 2D-ROESY, яка дозволяє проводити аналіз просторових структур для молекул щодо невеликих молекулярних мас, досліджених у дисертаційній роботі. Описано засіб готування експериментальних зразків та умови проведення експериментів, а також методика обробки експериментальних даних. Зразки фенантридінових барвників EMB, EDC, вітамінів нікотинаміду і рібофлавін-5'-монофосфату натрію, кофеїну, антибіотика дауноміцину і синтетичних феноксазонових сполук (ActII-ActV) розчиняли в D₂O з ізотопною чистотою 99.95% D, ліофілізували і потім розчиняли в дейтерированому 0.1М а-фосфатному буфері (pD=7.1). Концентрацію ароматичних сполук визначали спектрофотометрично, використовуючи наступні коефіціенти екстинкції: =5860 М^-1см^-1 (=480 нм) для EB; = 5220 М^-1см^-1 ( = 458 нм) для EMB, = 5850 М^-1см^-1 ( = 432 нм) для EDC; = 36700 М^-1см^-1 ( = 450 нм) для ActII-ActIV; =9740 М^-1 см^-1 (=273 нм) для кофеїну і =11500 М^-1см^-1 (=477 нм) для DAU. 1D- і 2D-¹Н-ЯМР-спектри одержані на спектрометрі “Bruker DRX” з резонансною частотою 500 Мгц. Концентраційні виміри протонних хімічних зсувів проводили при двох температурах, при дослідженні гетероасоціації молекул концентрація одного з ароматичних речовин підтримувалася постійною.

Температурні залежності хімічних зсувів ароматичних протонів вимірювали при постійному складі розчину. Стабілізацію температури в процесі вимірів здійснювали BVT-терморегулятором. Хімічні зсуви визначали відносно ДСС, як внутрішній стандарт використовували бромід тетраметиламонію (ТМА).

У розділі 3 досліджено вплив бокових груп фенантридінових барвників на їх самоасоціацію, гетероасоціацію з антибіотиком дауноміцином і конкурентне зв'язування лігандів з олігомером ДНК.

Представлено загальну схему ЯМР - дослідження процесів молекулярного комплексоутворення в розчині, що включає в себе аналіз процесів самоасоціації, гетероасоціації і комплексоутворення ДНК із лігандом, при цьому аналіз кожного процесу може бути метою як окремого дослідження, так і бути одним з етапів при дослідженні конкурентного зв'язування ароматичних БАС із ДНК.

Структурні і термодинамічні параметри асоціації ароматичних молекул барвників, антибіотиків і вітамінів, досліджених у дисертаційній роботі, були отримані на основі аналізу експериментальних концентраційних і температурних залежностей протонних хімічних зсувів молекул.

Для інтерпретації експериментальних даних були використані моделі нескінченномірної некооперативної і кооперативної самоасоціації. У некооперативній моделі передбачається рівність констант рівноваги Kj для реакцій:

(1)

так, що K1=...Kj=K.

У нескінченномірній кооперативній моделі самоасоціації молекул прийнято, що рівноважні константи реакцій (1) однакові при всіх j 2 (K2=K3=...Kj=K) і К1=К, де - параметр кооперативности.

Результати розрахунків для всіх досліджених ароматичних молекул представлені в табл.1.

Порівняльний аналіз параметрів реакцій самоасоціації фенантридінових барвників - бромистого етидію і його азидо-аналогів, що відрізняються будівлею бокових ланцюгів, показав, що:

Величина параметра 1 для азидо-аналогів етидію свідчить про відсутність кооперативности при самоасоціації молекул EMB і EDC.

Спостерігаєме послідовне зменшення рівноважних констант та ентальпій реакцій самоасоціації фенантридінових барвників при збільшенні кількості азидо-груп обумовлено послабленням дисперсійних взаємодій при утворенні стопочних асоціатів азидо-похідних етидію за рахунок взаємодії електричного диполя азидо-групи () з спряженими електронами ароматичних кілець хромофора.

Аналіз значень індукованих хімічних зсувів протонів, що необмінюються, для EMB і EDC дозволяє зробити висновок про антипаралельну орієнтацію хромофорів барвників в агрегованому комплексі.

9. Структурний і термодинамічний аналіз гетероасоціації фенантридінових барвників з антибіотиком дауноміцином у водному розчині виконано на підставі експериментальних концентраційних і температурних залежностей

Таблиця 1 Розрахункові значення параметрів самоасоціації ароматичних молекул у водному розчині (0,1 М фосфатний буфер, pD = 7.1, T=298K)

(2)

де KА, KP і Kh - рівноважні константи самоасоціації антибіотика і барвника і їх гетероасоціації, відповідно.

Використовуючи адитивну модель для протонного хімічного зсуву і ефект ближнього порядку на екранування ядер (тільки найближчі сусідні молекули дають внесок в екранування ядер в асоціаті), залежність спостерігаємих протонних хімічних зсувів для протонів дауноміцина може бути записана у вигляді:

(3)

Вираз для хімічного зсуву протонів барвника _P може бути отримано з (3) шляхом заміни символів a на p і p на a. Тут величини _mA, _dA, _сA і _mP, _dP, _сP - протонні хімічні зсуви DAU і барвника в мономерній, димерній формах і в гетероасоціатах відповідно. Розрахункові значення параметрів реакцій гетероасоціації ароматичних молекул наведено в табл.2. З таблиць 1 і 2 видно, що константи гетероасоціації EMB-DAU і EDC-DAU займають проміжне положення між константами самоасоціації молекул, що беруть участь у реакції.

Результати, отримані в цій роботі, а саме, закономірне зменшення імовірності утворення гетерокомплексів у розчині при заміні однієї (EMB) чи обох (EDC) аміногруп фенантридінового хромофора на азидогрупи, що не можуть утворювати H-зв'язку з молекулою DAU, однозначно свідчать про додаткову стабілізацію гетерокомплекса бромистого етидія і дауноміцина за рахунок утворення міжмолекулярного H-зв'язку, донором якого є аміногрупи фенантридінового барвника. Закономірне зменшення абсолютних значень ентальпії й ентропії гетероасоціації EMB-DAU і EDC- DAU (див. табл.2) також корелюють зі спостерігаємим зменшенням константи K у ряді EB-DAU, EMB-DAU, EDC-DAU (див. табл.2) і припущенням про зниження імовірності утворення водневого зв'язку при заміні аміно- на азидогрупи у фенантридіновому хромофорі.

Отримані значення хімічних зсувів _C для протонів барвників і DAU були використані для розрахунку найбільш імовірних структур 1:1 комплексів моноазиду і діазиду етидію з антибіотиком у водному розчині. Як приклад на рис.1 представлена просторова структура комплексу EMB-DAU. Порівняльний аналіз індукованих хімічних зсувів протонів антибіотика і барвників =_m-_C дозволяє зробити певні висновки про структуру утворених гетерокомплексів. Для всіх протонів DAU і барвників EB/EMB/EDC має місце наближено пропорційна зміна величини при переході від системи EB-DAU до EMB-DAU і EDC-DAU. Останнє свідчить про подібність найбільш імовірних структур гетерокомплексів у зазначених системах. З іншого боку, підвищене екранування протонів барвників в комплексах EMB-DAU і EDC-DAU пов'язано зі зменшенням відстані між хромофорами в таких дімерах з 0.34 нм до 0.31 нм у порівнянні з комплексом EB-

Таблиця 2 Параметри гетероасоціації ароматичних молекул у 0.1 моль/л фосфатному буфері, pD 7.1, Т=298К

1. Проведено аналіз впливу бокових ланцюгів БАС - фенантридінових барвників, - азидо-аналогів бромистого етидію (модельна система) на процеси само-, гетероасоціації з антибіотиком дауноміцином і конкурентного зв'язування ароматичних лігандів з олігомером ДНК. Показано, що послідовна заміна бокових аміно - груп фенантридінового хромофора на азидо-групи виражається в істотній зміні параметрів асоціації ароматичних молекул і їх конкурентного зв'язування з олігомером ДНК.

2. Вперше досліджено самоасоціацію ароматичних молекул фенантридінових барвників моноазида (ЕМВ) і діазида (EDC) етидію та їх гетероасоціацію з антибіотиком дауноміцином методом одномірної та двомірної гомоядерної ЯМР - спектроскопії. Визначено структурні та термодинамічні параметри реакцій само- і гетероасоціації і розраховано найбільш імовірні просторові структури 1:1 димерів EMB і EDC і 1:1 EMB - DAU і EDC - DAU гетерокомплексів в водному розчині. Виявлено послідовне зменшення констант самоасоціації фенантридінових барвників при заміні аміно- груп на азидо-групи, що обумовлено послабленням дисперсійних взаємодій при утворенні стопочних асоціатів азидо-похідних етидію. Встановлено додаткову стабілізацію гетерокомплекса бромистого етидія і дауноміцина міжмолекулярним водневим зв'язком.

3. Проведено аналіз впливу структури бокових ланцюгів фенантридінових барвників на процеси конкурентного зв'язування азидо-аналогів і антибіотика дауноміцина з олігомером ДНК. Показано, що структура бокових ланцюгів фенантридінів впливає на рівноважний розподіл різних типів молекулярних комплексів у змішаному розчині.

4. Вперше методом одномірної та двомірної гомоядерної ЯМР - спектроскопії проведено віднесення сигналів протонів і досліджено самоасоціацію серії синтетичних феноксазонових речовин ActII-ActV з аміноалкильними боковими ланцюгами різної довжини. Визначено структурні і термодинамічні параметри реакцій самоасоціації досліджених ароматичних молекул. Показано, що значення рівноважних констант, параметрів кооперативності та ентальпій реакцій самоасоціації ActII, ActIII, ActIV і ActV збігаються в межах похибки їх визначення. Зміна ентропії при самоасоціації ActII, що має максимальну біологічну активність серед серії феноксазонових речовин, трохи менша, ніж для інших досліджених БАС

5. Визначено найбільш імовірні просторові структури дімерів синтетичних феноксазонових речовин на підставі аналізу міжмолекулярних крос-піків у 2D-ROESY спектрах розчинів ActII - ActV, а також експериментальних концентраційних залежностей протонних хімічних зсувів 1D ЯМР - спектрів. Установлено, що в самоасоціатах феноксазонових похідних має місце антипаралельна орієнтація хромофорів молекул, при цьому визначальну роль при утворенні молекулярних асоціатів грають стекінг-взаємодії ароматичних хромофорів молекул.

6. Досліджено комплексоутворення ароматичних гідротропних агентів нікотинаміду і кофеїну з рібофлавин-мононуклеотидом і феноксазоновим антибіотиком ActIII. Отримано числові значення структурних і термодинамічних параметрів реакцій само- і гетероасоціації ароматичних молекул. Установлено, що молекулярний механізм гідротропної дії нікотинаміду і кофеїну на ароматичні біологічно активні речовини обумовлений гетероасоціацією гідротропних агентів і ароматичних молекул БАС.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Веселков А.Н., Лантушенко А.О., Евстигнеев М.П., Веселков Д.А., Дэвис Д.Б. Особенности процесса гетероассоциации моноазида этидия с антибиотиком дауномицином в водном растворе: анализ по данным ¹H ЯМР спектроскопии // Доповiдi НАН Украiни. - 2001. - Т.8. - С.173-178.

2. Veselkov A.N., Lantushenko A.O., Hernandez Santiago A., Davies D.B. Effect of side groups of phenanthridines on their hetero-association with antibiotic daunomycin and the competitive binding with a DNA oligomer // Вісн. Харк. ун-ту. - 2002. - № 568. Біофізичний вісн. Вип.2(11). - С.6-14.

3. Veselkov A.N., Lantushenko A.O. NMR investigation of phenanthridine dyes self-association in aqueous solution: structural and thermodynamical analysis // SPIE Proceeding. - 2002. - V.4938. - Р.113 - 119.

4. Веселков А.Н., Лантушенко А.О., Веселков Д.А., Дэвис Д.Б. Анализ самоассоциации никотинамида в водном растворе по данным ¹H-ЯМР спектроскопии // Ж. физич. химии - 2001. - Т.75, №12. - С.2184-2188.

5. Веселков А.Н., Лантушенко А.О., Веселков Д.А., Дэвис Д.Б. // Структурный и термодинамический анализ самоассоциации фенантридиновых красителей в водном растворе по данным ¹H ЯМР спектроскопии // Журн. структур. химии. - 2002.- Т.43, №2. - С.253-260.

6. Веселков А.Н., Лантушенко А.О., Чубаров А.С., Веселков Д.А., Дэвис Д.Б. ¹Н ЯМР анализ самоассоциации рибофлавин-мононуклеотида и его комплексообразования с никотинамидом в водном растворе. // Ж. физич. химии. - 2002. - Т.76, №7. - С.1313-1320.

7. Веселков Д.А., Лантушенко А.О., Дэвис Д.Б., Веселков А.Н. ¹H ЯМР анализ самоассоциации антибиотика актиноцил-бис-(3-диметиламинопропил) амина в водном растворе // Биоорганическая химия. - 2002. - Т.28, №4. - C.379-384.

8. Веселков А.Н., Лантушенко А.О., Веселков Д.А., Дэвис Д.Б. ¹H ЯМР анализ гетероассоциации кофеина с антибиотиком актиноцил-бис-(3-диметиламинопропил) амином в водном растворе // Биоорганическая химия. - 2002. - Т.28, №5. - C.474-480.

9. Лантушенко А.О., Дэвис Д.Б., Веселков А.Н. Анализ самоассоциации синтетических феноксазоновых антибиотиков в водном растворе методом ¹H ЯМР спектроскопии // Вестник СевНТУ (серия “Физика и математика”). - 2003. - №43. - С.39-46.

10. Veselkov A.N., Lantushenko A.O., Evstigneev M.P.¹H NMR investigation of effect of side groups on the self-association of phenanthridines and their hetero-association with daunomycin // Вестник СевНТУ (серия “Физика и математи ка”). - 2003. - №43. - С.5-16.

11. Veselkov D.A., Lantushenko A.O., Davies D.B., Veselkov A.N. NMR investigation of phenanthridine dyes self-association in aqueous solution. Structural and thermodynamical analysis // Proc. 15-th International School-seminar “Spectroscopy of molecules and crystals”. - Chernihiv (Ukraine). - 2001. - P.72.

12. Lantushenko A.O., Veselkov A.N. ¹H NMR analysis of the self-association of synthetic antibiotic actinocyl-bis-(3-dimethylaminopropyl) amine and its complexation with caffeine in aqueous solution // Proc. Second International Young Scientist Conference “Scientific Problems of Optics and High Technology Material Science”. Kyiv (Ukraine). - 2001. - P.48.

13. Veselkov A.N., Lantushenko A.O., Evstigneev M.P., Davies D.B. ¹H NMR analysis of the effect of side groups on the association of phenanthridines and daunomycin // Book of abstracts. 16th European experimental NMR conference (EENC 2002). - Prague (Czech Republic). - 2002. - Р.56.

14. Lantushenko A.O., Veselkov K.A., Chubarov A.S., Davies D.B., Veselkov A.N. ¹H NMR analysis of aggregation behaviour of hydrotropic agent nicotinamide and its complexation with riboflavine-mononucleotide in aqueous solution // Proc. 6-th International Conference on applications of magnetic resonance in food science. - Paris (France). - 2002. - Р.227.

15. Лантушенко А.О., Веселков А.Н. Влияние боковых групп фенантридиновых красителей на их гетероассоциацию с антибиотиком дауномицином и конкурентное связывание лигандов с олигомером ДНК // Конференция “Молодые ученые Крыма в решении актуальных вопросов современности”.- Севастополь (Україна). - 2002. - C.6.

16. Lantushenko A.O., Rogova O.V., Davies D.B., Veselkov A.N. ¹H NMR analysis of self-association of synthetic phenoxazone antibiotics in aqueous solution // Тези доповідей III з'їзду Українського біофізичного товариства. - Львів (Україна). - 2002. - С. 42.

17. Vysotsky S.A., Veselkov K.A., Lantushenko A.O., Veselkov A.N. ¹H NMR analysis of the hetero-association of caffeine with phenoxazone antibiotics in aqueous solution // Тези доповідей III з'їзду Українського біофізичного товариства. - Львів (Україна). - 2002. - С. 43.

АНОТАЦІЯ

Лантушенко А.О. Вплив бокових ланцюгів ароматичних лігандів на процеси асоціації і конкурентного зв'язування з ДНК. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Харківський національний університет ім. В.Н.Каразіна, м.Харків, 2003.

Досліджено вплив структурних особливостей бокових ланцюгів ароматичних молекул на параметри їх асоціації і конкурентного зв'язування з олігомером ДНК. Розглянуто дві групи ароматичних сполук, які мають різні біологічні властивості: фенантридінові барвники бромистий етидій (EB) і його азидо-аналоги моно-(EMB) і діазид (EDC) етидію, що відрізняються будовою бокових ланцюгів, і серія феноксазонових сполук ActII-ActV - аналогів протипухлинного антибіотика актиноміцину D з аміноалкильними боковими ланцюгами різної довжини. Досліджено самоасоціацію феноксазонових сполук ActII-ActV і барвників EMB і EDC, гетероасоціацію барвників з антибіотиком дауноміцином і конкурентне зв'язування лігандів з олігомером ДНК методом одно- і двомірної гомоядерної ¹H ЯМР - спектроскопії (500 МГц). З метою встановлення молекулярного механізму дії гідротропних агентів нікотинаміду і кофеїну досліджено їх комплексоутворення з біологічно активними сполуками, які мають різні медико-біологічні властивості. Зроблено висновки про специфіку фізичних механізмів асоціації БАС зі структурно різними боковими ланцюгами і їх взаємодію з молекулою ДНК.

Ключові слова: фенантридінові барвники, феноксазонові антибіотики, нікотинамід, само- і гетероасоціація, кофеїн, 1D и 2D ¹Н-ЯМР- спектроскопія, ДНК, конкурентне зв'язування.

АННОТАЦИЯ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. - Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина, г.Харьков, 2003.

Исследовано влияние структурных особенностей боковых цепей ароматических молекул на параметры их ассоциации и конкурентного связывания с олигомером ДНК. Рассмотрены две группы ароматических соединений, обладающих различными биологическими свойствами: фенантридиновые красители бромистый этидий (EB) и его азидо-аналоги моно-(EMB) и диазид (EDC) этидия, отличающиеся строением боковых цепей, и серия феноксазоновых соединений ActII-ActV - аналогов антиопухолевого антибиотика актиномицина D с аминоалкильными боковыми цепями различной длины. Исследована самоассоциация феноксазоновых соединений ActII-ActV и красителей EMB и EDC, гетероассоциация красителей с антибиотиком дауномицином и конкурентное связывание лигандов с олигомером ДНК методом одно- и двумерной гомоядерной ¹H-ЯМР спектроскопии (500 МГц). С целью установления молекулярного механизма действия гидротропных агентов никотинамида и кофеина исследовано их комплексообразование с биологически активными соединениями, обладающими различными медико-биологическими свойствами.

Сделаны выводы о специфике физических механизмов ассоциации БАС со структурно различными боковыми цепями и их взаимодействия с молекулой ДНК.

Ключевые слова: фенантридиновые красители, феноксазоновые антибиотики, никотинамид, само- и гетероассоциация, кофеин, 1D и 2D ¹Н-ЯМР- спектроскопия, ДНК, конкурентное связывание.

SUMMARY

Lantushenko A.O. Effect of side chains of aromatic ligands on their association and competitive binding with a DNA oligomer. - Manuscript.

Thesis for a Candidate's degree of Physical and Mathematical Sciences in Biophysics - Speciality 03.00.02, V.N. Karazin Kharkov National University, Kharkov, 2003.

Effect of side chains of aromatic molecules on their association and competitive binding with a DNA oligomer in aqueous solution has been investigated. Two groups of aromatic compounds with different biological properties have been studied: synthetic phenoxazone drugs ActII-ActV - analogues of antibiotic actinomycin D with aminoalkyl side chains of variable length and phenanthridine dyes - ethidium bromide (EB) and its azido-derivatives, 8-azido-ethidium bromide (EMB) and 3,8-diazido-ethidium chloride (EDC) with different structures of side chains. 1D and 2D 500 MHz ¹H NMR spectroscopy has been used to determine structural and thermodynamical parameters of the self-association of phenoxazone drugs ActII-ActV and phenanthridine dyes, hetero-association of the aromatic dyes with anthracycline antibiotic daunomycin (DAU) and competitive binding of ligands with a DNA oligomer. Equilibrium constants and thermodynamical parameters (enthalpy and entropy) of the association reactions have been determined and the most favourable structures of 1:1 self- and hetero-complexes have been calculated for all the systems studied. It has been found that:

Substitution of amino- with azido groups leads to a decrease in the effective magnetic anisotropy of the aromatic phenanthridine chromophore; in addition, interactions of electric dipoles of the azido group with electrons of aromatic rings leads to a weakening of dispersive interactions and, consequently, affects the stacking interactions in the association of aromatic molecules. The structural and thermodynamical parameters of hetero-association of the phenanthridines with DAU are consistent with an intermolecular hydrogen bond between the 3,8-amino groups of

to the stability of the hetero-complexes in aqueous solution. Knowledge of the equilibrium constants for self- and hetero-association of the phenanthridines and DAU and their complexation with a DNA fragment, the deoxytetranucleotide 5`-d(TpGpCpA), enabled the relative content of each of the EB-DAU, EMB-DAU, EDC-DAU, EB-DAU-d(TGCA), EMB-DAU-d(TGCA) and EDC-DAU-d(TGCA) complexes to be calculated as a function of drug concentration in mixed solutions. It is found that when intercalating drugs are used in combination, the decrease in binding of drug or mutagen with DNA is due both to formation of drug-mutagen hetero-association complexes in the mixed solution and to competition for the binding sites by the aromatic molecules; the relative importance of each process depends on the molecular properties of the drug or mutagen molecules being considered.