Активація В-лімфоцитів, що визначається за числом Leu 23-клітин, у хворих з ХНН була підвищеною. Якщо в нормі цей показник звичайно не повинен перевищувати 5%, то у потенційних реципієнтів він становив 8,59+4,2%, а у здорових донорів 2,29+0,83% (p<0,05). Відзначено коливання цього показника від 1,96 до 21,80%.

Отже, дослідження з допомогою моноклональних антитіл продемонстрували, що рівень експресії антигенів гістосумісності ІІ класу й активації Т-лімфоцитів у потенційних реципієнтів, що чекали на пересадку нирки, не відрізняється від норми, тоді як має місце підвищення ступеня ранньої активації В-лімфоцитів, що несуть Leu 23-антигени.

Нами вивчався вплив циклоспорину А на проліферативну активність клітин і ступінь експресії DR-антигенів. Дослідження з вивчення реакції бластної трансформації (РБТ) у відповідь на мітогени показали, що середній рівень індексу стимуляції на ФГА у хворих з ХНН становив 1,9+0,6, на МЛ - 2,6+0,7, що значно нижче, ніж рівень у здорових осіб (3,8+0,3). Індивідуальний аналіз даних виявив значну варіабельність показників від 0,87 (А-ко) до 3,2 (К-ка, П-на, Ш-ук) на ФГА й від 1,0 (Б-с) до 5,0 (Р-ко) на МЛ. Відзначено, що у 50% обстежених ІС у відповідь на мітогени був нижчим за 1,5, що свідчить про зниження проліферативної активності лімфоцитів у хворих. Під час аналізу даних з використанням моделей in vitro з ЦсА (1у та 5у) показано, що у 88% випадків відзначався інгібуючий ефект на проліферацію клітин. Як слід було чекати, субоптимальна доза ЦсА викликала менш виражену супресію лімфоцитів з використанням обох мітогенів. Рівень супресії від вихідного становив у середньому 20-30%. Використання оптимальної концентрації препарату дало ефект більш вираженого характеру, досягаючи 70-80% інгібіції. Порівняльний аналіз даних показав, що виражене пригнічення РБТ було відзначено у хворих з вихідним високим показником ІС і спостерігалося у 51% обстежених. Екзогенний ЦсА пригнічує ДНК-РНК транскрипційний процес і у такий спосіб впливає на проліферативний механізм Т-клітин. Вважаємо, що названих вище хворих можна віднести до групи низького ризику розвитку відторгнення після трансплантації, оскільки у цих потенційних реципієнтів спостерігається висока чутливість Т-клітин до імуносупресії препаратом. Можливо, хворим з високими фоновими рівнями необхідно призначати ЦсА за кілька днів до пересадки нирки і, таким чином, запобігати розвиткові реакції відторгнення. Важливо відзначити, що 37% хворих з ХНН мали низький відсоток супресії на ЦсА (близько 30%), і фонові показники ІС були дуже низькими (нижчими за 1,2). Мабуть, у цьому випадку має місце виснаження резервних можливостей Т-клітин, оскільки на фоні слабкої відповіді Т-клітин на мітогени, зумовленої імуносупресією, викликаною уремією й лікувальними заходами (гемодіаліз, гемотрансфузії, гемосорбція тощо), ефект інгібіції ЦсА не виражений.

Одержані дані продемонстрували різну чутливість хворих з ХНН до алотрансплантації до циклоспорину А. Виявлено ЦсА-чутливих (88%) і ЦсА-резистентних (12%) потенційних реципієнтів на підставі проліферативної активності Т-лімфоцитів на мітогени, що становить важливий момент при індивідуальному тестуванні хворих щодо чутливості до препарату перед пересадкою і при подальшій імуносупресивній терапії у постранплантаційному періоді.

? Для оптимізації протоколів імуносупресивної терапії, які включають комбінацію кількох препаратів, ми досліджували спрямування імунофармакологічної взаємодії препаратів.

Відмітною особливістю пропонованого підходу є спроба створення індивідуального протоколу імуносупресивної терапії для кожного реципієнта з урахуванням оптимальних комбінацій препаратів та їх доз. Це досягається внаслідок експериментальних досліджень проліферативної активності і цитокінової продукції лімфоцитів реципієнтів під впливом in vitro імуносупресивних препаратів. У перших експериментах ми зупинили свій вибір на сандимуні-неоралі і дексаметазоні. Сандимун є базовим препаратом у сучасних протоколах імуносупресії клінічної трансплантології, а дексаметазон - препарат кортикостероїдного ряду, який використовується для посилення дії першого. Комбіноване використання цих двох препаратів дозволило призначити їх у меншому дозуванні з одержанням того ж імуносупресивного ефекту. Цей емпіричний факт підтверджено тривалим клінічним досвідом. Ми ж використали цю комбінацію препаратів для підтвердження слушності підходів у визначенні спрямованості взаємодії імуносупресивних препаратів. Сандимун (циклоспорин А) є циклічним поліпептидом і має здатність специфічно пригнічувати початкові етапи активації Т-клітин, що призводить до зниження продукції цитокінів, а саме інтерлейкіну-2 (ІЛ-2), і у такий спосіб перешкоджає визріванню специфічних Т-кілерів (СD8+-клітин). Сандимун-неорал відрізняється від сандимуну більш вираженою прямо пропорційною залежністю ефекту циклоспорину від його дози і більш постійним профілем абсорбції. У зв`язку з цим сандимун-неорал знайшов широке застосування у клінічній трансплантології.

Дексаметазон є синтетичним глюкокортикостероїдом. Відзначається високою активністю, більш тривалою дією. Препарат характеризується вираженим імуносупресивним ефектом, що досягається гальмуванням продукції ІЛ-1 та ІЛ-2, а також зниженням експресії продуктів головного комплексу гістосумісності на мембрані лімфоцитів.

Концентрації дексаметазону: 4 мг/мл, 2 мг/мл, 1 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,25 мг/мл, 0,125 мг/мл - одержували також шляхом розведення живильним середовищем RPMI-1640 одного мл ампульного розчину, який містить 4 мг дексаметазону фосфату у вигляді натрієвої солі.

Здатність дексаметазону й сандимуну-неоралу інгібувати проліферацію трансформованих лімфоцитів, стимульованих ФГА, широко варіювала серед волонтерів та реципієнтів. З 15 лише у 3 волонтерів мали місце єдині корелятивні зв`язки. У решти відзначалася виражена індивідуальна відповідь на дози препаратів окремо і в суміші. Це, на наш погляд, пов`язано з використанням волонтерами та реципієнтами різних фармакологічних препаратів, які могли вплинути на індивідуальну чутливість лімфоцитів.

Використання синергічного ефекту між імуносупресивними препаратами дозволяє зменшити дозу, тим самим зменшуючи токсичність, але зберігаючи одночасно біологічний ефект - ефект імуносупресії.

Математичний розрахунок коефіцієнта сполучення можна застосувати до імуносупресивних препаратів, і при його розрахунку ми дійшли важливого висновку, що взаємодія сандимуну-неоралу з дексаметазоном може мати синергічний ефект.

Цікаво, що ці висновки співвідносяться з існуючим клінічним досвідом: кортикостероїди посилюють ефект сандимуну. Дані, одержані in vitro і статистично оброблені, можуть мати клінічні екстраполяції і служити для оптимізації імуносупресивної стратегії. Вважаємо за можливе робити якісь висновки лише за умови індивідуального дослідження проліферативної відповіді лімфоцитів кожного індивідуума при дії імуносупресивних препаратів окремо та в їх комбінації.

? Хоча користь від циклоспорину була незаперечною, невдовзі клініцисти визнали, що йому властива здатність викликати як гостру, так і хронічну нефротоксичність. Остання обставина примусила дослідників ввести додатково до протоколів імуносупресивної терапії мікофенолат мофетил. У клінічних випробуваннях він давав однакове виживання пацієнта і трансплантата і був ефективнішим додатковим препаратом, ніж азатіоприн, завдяки своїй здатності скорочувати частоту епізодів кризу відторгнення, якщо його використовувати з циклоспорином.

Новий препарат селсепт (Cell-Cept), який є морфоліно-етиловим ефіром мікофенолової кислоти і пригнічує утворення пуринів за рахунок інгібіції іонозин-монофосфат-дегідрогенази, а також експресію адгезивних молекул, що призводить до блокування проліферації Т і В-лімфоцитів, продукції антитіл і генерації цитотоксичних Т-лімфоцитів. Азатіоприн і селсепт є антиметаболітами й інгібують метаболізм пурину, але селсепт робить це більш вибірково шляхом інгібування ензиму іонозину-монофосфатдегідрогенази. Селсепт показаний для профілактики і лікування гострої реакції відторгнення трансплантата.

З серпня 1998 року у відділенні трансплантації нирки Інституту урології і нефрології АМН України розпочато застосування селсепту в групі хворих після трансплантації нирки. Препарат було призначено 18 хворим з первинним нирковим трансплантатом у дозі 2 г/доба. Всі хворі поряд з селсептом одержували імуносупресивну терапію сандимуном у дозі 6 мг/кг маси тіла на добу з наступною корекцією оптимальної дози препарату в крові (200-300 нг/мл), а також преднізолон з початковою дозою 1,5-2 мг/кг з постійним зниженням її у кінці 2-го тижня до 20 мг на добу. При розвиткові гострої реакції відторгнення призначалася пульс-терапія метилпреднізолоном по 250-500 мг/доба протягом 3-7 днів. Результати проведеного дослідження показали, що включення селсепту до схеми трикомпонентної імуносупресивної терапії замість азатіоприну дозволило зменшити частоту кризів відторгнення трансплантованої нирки з 63,6% до 36,4%. Заміна азатіоприну селсептом стала ефективним засобом лікування ранніх кризів, які були рефрактерними до болюсних введень глюкокортикоїдів.

Для більш обгрунтованих висновків знадобилися подальші дослідження цієї проблеми. Нас цікавила ситуація, що мала місце у реципієнтів, в яких не вдалося купірувати криз відторгнення. На нашу думку, одним із головних напрямків для вирішення цього питання було вивчення спрямованості взаємодії сандимуну з селсептом на проліферативну відповідь лімфоцитів конкретного реципієнта. Метою дослідження було вивчення in vitro спрямованості взаємодії сандимуну-неоралу з селсептом на проліферативну реакцію, стимульовану ФГА, лімфоцитів волонтерів та реципієнтів.

Капсулу селсепту 250 мг розчиняли в суміші 0,1 мл диметилсульфоксиду і 0,9 мл середовища RPMI-1640, одержували концентрацію препарату 250 мг/мл. Концентрації 125 мг/мл, 62,5 мг/мл, 31,25 мг/мл, 15,63 мг/мл, 7,8 мг/мл, 3,9 мг/мл, 1,95 мг/мл - одержували шляхом розведення стандартного розчину препарату живильним середовищем RPMI-1640. Аналізувався ступінь імуносупресивної дії препаратів та їх комбінації на лімфоцити з допомогою реакції бласттрансформації лімфоцитів периферичної крові на ФГА. Концентрації препаратів, що призводили до 50% інгібування проліферативної відповіді лімфоцитів на ФГА, варіювали у діапазоні: для сандимуну-неоралу - 25-100 мг/мл; для селсепту - 31,25-250 мг/мл. При індивідуальному аналізі волонтерів та реципієнтів ми розподілили їх на три групи за ступенем вираженості інгібіції проліферації лімфоцитів. Коли досліджували дію двох препаратів у сполученні, то до аналізу були включені препарати у рівноцінних і різних пропорціях по всьому діапазонові доз. Ми детально аналізували ті результати взаємодії in vitro сандимуну-неоралу і селсепту, які свідчили про рівень інгібіції проліферації лімфоцитів, стимульованих ФГА, в діапазоні 50-100%. У десяти випадках комбінації доз препаратів рівень інгібіції проліферативної відповіді становив від 62% до 90%. При розрахунку коефіцієнта сполучення (КСх) у трьох випадках він становив 1, що відбивало адитивність взаємодії сандимуну-неоралу і селсепту.

Всі інші шість випадків комбінації досліджуваних препаратів призводили до ефекту антагонізму, що підтверджував коефіцієнт сполучення - понад 1.

Сандимун-неорал демонстрував з селсептом ефект взаємодії: cинергічний - 10%, антагоністичний - 30%, адитивний - 60%. Проте виявлення певних доз препаратів, які давали б синергічний або адитивний ефекти у комбінації, вимагає індивідуального аналізу дії на лімфоцити кожного волонтера або реципієнта.

Результати вивчення спрямованості взаємодії сандимуну-неоралу і селсепту in vitro дають підстави для розуміння можливого індивідуального клінічного ефекту селсепту як “додаткового” препарату з метою профілактики гострого кризу відторгнення ниркового трансплантата.

? У трансплантаційних центрах 70% імуносупресивних протоколів засновані на циклоспоринові, а решта - на такролімусі (прографі). Однак програф може бути використаний у випадках трансплантації нирки як додаток до препаратів для купірування відторгнення у пацієнтів з двома та більше епізодами, незважаючи на терапію циклоспорином. У деяких реципієнтів виникає мутація циклофіліну, який або не може зв`язати циклоспорин А, або після зв`язування його не може деактивувати кальцинейрин. Диференційна експресія й активність циклофіліну і зв`язуючого FK506 протеїну - імунофіліну - є підставою для застосування FK506 у пацієнтів, які не реагують на циклоспорин-А-терапію. Використання препаратів з токсичним ефектом у протоколах імуносупресивної терапії може бути оптимізоване сполученням ліків, що діють синергічно при низьких дозах. Потенційною перевагою цих протоколів є те, що вони могли б зберігати імуносупресивну ефективність, зводячи, водночас, до мінімуму коротко- і довготривалу нефротоксичність. Для застосування конкретних сполучень препаратів обов`язковим є дослідження фармакологічної взаємодії імуносупресивних препаратів in vitro. Ці завдання ми реалізували у відношенні сандимуну-неоралу та прографу. Ми вивчили ступінь інгібіції проліферативної відповіді лімфоцитів на мітогени - ФГА й анти-СD3-моноклональні антитіла і продукції інтерлейкіну-2 при взаємодії сандимуну-неоралу і прографу in vitro.

Капсулу прографу - 1 мг розчиняли в метанолі і потім концентрацію препарату 1 мг/мл розводили комплексним живильним середовищем, одержуючи концентрації препарату: 0,5 мг/мл, 0,25 мг/мл, 0,125 мг/мл, 0,063 мг/мл. Сандимун-неорал і програф продемонстрували різні криві, що відбивають рівень інгібіції проліферації лімфоцитів при дії різних доз вказаних препаратів. Стимуляцію проліферативної відповіді здійснювали з використанням двох мітогенів: фітогемаглютиніну й анти-СD3-моноклональних антитіл. При цьому характер кривих “доза-ефект” прографу мав більш пласку криву при стимуляції проліферації як ФГА, так і анти-СD3. За таких же умов крива “доза-ефект” сандимуну-неоралу була більш гіперболічно вираженою.

Інгібіція проліферативної відповіді на ФГА у діапазоні 50-85% досягалася кількома дозами прографу: 1 мг/мл та 0,5 мг/мл. Сандимун-неорал у дозах 100 мг/мл робив пригнічення проліферативної відповіді на ФГА у діапазоні 80-99%, а решта доз препарату призводили до ефекту інгібіції у межах 32-45%.

Ці дані також підтверджено після логарифмічного перетворення рівняння середнього ефекту.

Сандимун-неорал і програф продемонстрували помітно відмінні коефіцієнти зниження лінії (m) після стимулювання ФГА та анти-СD3.

Прографові властива набагато більша ефективність, ніж сандимуну-неоралу для досягнення 50% інгібування: дози прографу були втричі меншими, ніж сандимуну-неоралу при стимулюванні проліферативної відповіді ФГА і в 300 разів меншими при стимулюванні анти-СD3-моноклональними антитілами.

Експерименти з двома препаратами виконувалися з метою вивчення здатності сполучень сандимун-неорал/програф інгібувати проліферацію лімфоцитів.

Якщо ефекти інгібування нижчі за 40%, спостерігався синергізм, а у клінічно значущому діапазоні інгібування - 55-95% - між прографом і сандимуном-неоралом існував стійкий антагонізм. Необхідно відзначити, що під час численних досліджень проліферативної відповіді лімфоцитів під впливом різних імуносупресивних препаратів дослідники встановили оптимальний діапазон інгібіції 55-95%, при якому чітко виражений клінічний ефект будь-яких імуносупресивних препаратів. А рівень інгібіції менший за 50% викликає, як правило, сумнівний клінічний ефект. Отже, більшу увагу ми приділили тим дозам препаратів, які у сполученні давали клінічно значущий діапазон інгібування: 55-95%. Так само, в умовах активації анти-СD3, різні пропорції сполучення сандимуну-неоралу і прографу продемонстрували менше інгібування, ніж передбачалось ефектом змішування (додатковим) кожного препарату окремо. Аналіз середнього ефекту показав антагонізм по всьому діапазону інгібування.

Окремо програф і сандимун-неорал інгібували продукцію ІЛ-2 дозозалежним способом у межах вузького діапазону доз.

Програф давав 50% інгібування інтерлейкіну при дозах у 12,5 разів менших, ніж сандимун-неорал. Ступінь інгібіції, що досягався при застосуванні препаратів у сполученні, був постійно меншим, ніж той, на який очікували від результатів застосування окремо кожних ліків.

При використанні аналізу середнього ефекту було підтверджено антагоністичну взаємодію прографу і сандимуну-неоралу in vitro у низьких дозах: всі значення КСх, одержані в експериментах, перевищували 1,0.

У цих дослідженнях інгібуючу взаємодію імуносупресивних препаратів ми розраховували кількісно шляхом порівняння дії ліків окремо і в комбінації (сполученні) після лінійного перетворення їх відношень “доза-ефект”. У проведених дослідженнях виявлений фармакологічний антагонізм сандимуну-неоралу по відношенню до прографу. Цей ефект підтверджений у всіх моделях: інгібування проліферативної відповіді лімфоцитів in vitro, інгібіція продукції ІЛ-2 in vitro. Було встановлено, що додавання до культури одного й того ж окремого препарату забезпечувало потужніший інгібуючий ефект, порівняно з додаванням рівної кількості іншого препарату. In vitro такий антагонізм був особливо відчутним у межах клінічно важливого діапазону інгібування - 55-95%. Синергізм натомість виявлявся у клінічно незначних ситуаціях, а саме при рівнях інгібування нижчих за 40% і обмежених пропорціях “препарат-комбінація”.

У проведеній роботі було використано модель для вивчення взаємодії ліків, яка надає найбільш достовірну інформацію для клініцистів, тобто досліджувався ефект на повний діапазон доз і ретельно аналізувалися дані із застосуванням рівняння середнього ефекту. Кількісні параметри взаємодії препаратів можуть служити підставою для підбору оптимальної комбінації агентів у протоколах імуносупресивної терапії. У цих дослідженнях сандимун-неорал продемонстрував фармакологічний антагонізм по відношенню до прографу в інгібуванні проліферації лімфоцитів in vitro та інгібіції продукції ІЛ-2 in vitro.

Таким чином, виявлений антагонізм між препаратами не дозволяє використовувати сполучення прографу і сандимуну-неоралу для зниження їх доз і, разом з тим, зменшення їх токсичних ефектів.

? Ми вивчали вплив пептидного комплексу нирок на продукцію ІНФ-? лімфоцитами Тх1 типу здорових осіб, хворих з термінальною стадією ХНН до і після алотрансплантації донорської нирки. Встановлено, що у здорових осіб пептидний комплекс нирок у концентрації 0,05 мкг/мл здійснював імуносупресивний вплив на функціональну активність Тх1-клітин, що призводило до достовірного зниження секреції ІНФ-?. У пацієнтів з ХНН до трансплантації не виявлено впливу субоптимальної дози ПК (0,05 мкг/мл) на секрецію ІНФ-? Тх1-лімфоцитами, а при використанні ПК - 0,5 мкг/мл відзначено супресорний вплив порівняно з контрольною групою. Найбільш виражена інгібіція відзначалась у пацієнтів з підвищеними показниками продукції ІНФ-?. У реципієнтів алогенної нирки у ранньому посттрансплантаційному періоді (1-2 місяці після операції) зі стабільно функціонуючим органом і на фоні трьохкомпонентної імуносупресивної терапії рівень ІНФ-? був значно нижчим від доопераційного. Під впливом ПК нирок у дозі 0,5 мкг/мл вироблення цитокіну не змінювалось. Блокада рецепторного апарату мембрани лімфоцитів, можливо, здійснюється через вплив імуносупресивних препаратів на механізми, шляхом яких реалізуються ефекти пептидів.

У наших дослідженнях взаємодії імуносупресивних препаратів ми розраховували оптимальні дози математично, порівнюючи дію ліків окремо і в комбінації після лінійного перетворення їх відношень “доза-ефект”. Враховуючи все викладене вище, ми вважаємо, що результати нашої роботи зможуть бути певним внеском у розуміння механізмів патогенезу реакції відторгнення ниркового алотрансплантату і шляху її імунокорекції.

ВИСНОВКИ

Поліпшено результати пересадки алогенної нирки в клініці шляхом оптимізації діагностики реакції відторгнення трансплантата на підставі вивчення особливостей функціонування субпопуляцій Т-хелперів периферичної крові реципієнтів, а також розробки нового підходу до комбінованої імуносупресивної терапії.

1. Встановлено, що стан імунітету хворих на термінальну стадію ХНН до трансплантації алогенної нирки характеризується підвищенням функціональної активності Т-лімфоцитів-хелперів ІІ типу та зниженням активності Т-лімфоцитів-хелперів І типу.

2. Виявлені особливості інтерлейкін-продукуючої функції
Т-лімфоцитів-хелперів І типу у реципієнтів алогенної нирки:

- у період розвитку реакції відторгнення трансплантата на фоні ударних доз ІСТ зростає спонтанна продукція ІНФ-? у 2-3 рази порівняно з доопераційним рівнем;

- у реципієнтів з необоротними реакціями відторгнення рівень спонтанної продукції ІНФ-??досягав 100 пг/мл і більше, а рівень продукції ІЛ-2 відповідав доопераційному рівневі або підвищувався на 10-20%;

- у реципієнтів з оборотними реакціями відторгнення й наступною стабільною функцією трансплантата рівень спонтанної продукції ІНФ-? становив не вище, ніж 35,0 пг/мл та індукованої - не вище, ніж 60 пг/мл, а також відбувалося зниження продукції ІЛ-2 на 35-50% порівняно з доопераційним рівнем;

- у ранньому післяопераційному періоді (1,5-2 місяці) у реципієнтів із задовільною функцією трансплантата рівень продукції ІЛ-2 знижувався на 65% порівняно з доопераційним рівнем; також знижувався показник індукованої продукції ІНФ-? і становив 32,6+1,9 пг/мл за незмінної динаміки спонтанної продукції ІНФ-?.

3. Виявлені особливості інтерлейкін-продукуючої активності
Т-лімфоцитів-хелперів ІІ типу у реципієнтів алогенної нирки:

- у реципієнтів з необоротними реакціями відторгнення, незважаючи на здійснювану антикризову ІСТ, зберігався високий порівняно з вихідним рівень продукції ІЛ-4 Тх2-клітинами і низький рівень продукції ІЛ-10 - менший від 15 пг/мл;

- у реципієнтів з оборотними реакціями відторгнення знижувалась продукція ІЛ-4, і показники продукції ІЛ-10 становили: спонтанної - не нижчі від 20 пг/мл, індукованої - не нижчі від 62 пг/мл;

- у реципієнтів із задовільною функцією трансплантата у ранньому післяопераційному періоді (1,5-2 місяці) відзначався низький рівень продукції ІЛ-4 Тх2-клітинами - 60+25 пг/мл, тоді як на фоні підтримуючих доз ІСТ виявлялися високі показники спонтанної й індукованої продукцій ІЛ-10: 127+10,6 пг/мл та 173,7+12,4 пг/мл відповідно, що забезпечувало толерантний стан до трансплантата.

4. Виявлені особливості функціональної активності Т-лімфоцитів-хелперів І та ІІ типів дозволяють своєчасно діагностувати розвиток гострої реакції відторгнення й прогнозувати її оборотність, що сприяє виконанню адекватної тактики ведення реципієнтів у посттрансплантаційному періоді.

5. При схожості первісної клінічної симптоматики достовірно вищий рівень продукції ІЛ-10 (46,8+2,1 пг/мл - спонтанної та 84,8+4,2 пг/мл - індукованої) відзначався при інфекційних ускладненнях порівняно з періодами розвитку гострої реакції відторгнення трансплантата (25,6+3,2 пг/мл - спонтанна продукція та 44,6+5,3 пг/мл - індукована), що дозволяє вважати цей показник додатковим критерієм у диференційній діагностиці цих ускладнень.

6. У 80% потенційних реципієнтів з підвищеною експресією рецепторів до ІЛ-2 у поєднанні з високою продукцією ІЛ-2 виявлено в HLA-фенотипі DR2-антиген, що свідчить про зв`язок високої активності ІЛ-2-ланки імунітету з системою гістосумісності і дозволяє віднести таких пацієнтів до групи ризику гострої реакції відторгнення.

7. У потенційних реципієнтів встановлена індивідуальна чутливість до циклоспорину А на підставі змін проліферативної активності
Т-лімфоцитів на мітоген під впливом препарату, що дозволило циклоспорин-А-резистентних реципієнтів віднести до групи ризику розвитку реакції відторгнення трансплантата.

8. При дослідженні in vitro напрямку взаємодії імуносупресивних препаратів з використанням рівняння середньої дії виявлено:

- синергічну взаємодію між сандимуном-неоралом і дексаметазоном, що співвідноситься з існуючим клінічним досвідом;

- виявлені ефекти від синергізму до антагонізму при взаємодії сандимуну-неоралу і селсепту, що дає підставу для розуміння клінічного ефекту селсепту як “додаткового” імуносупресивного препарату;

- виявлено “фармакологічний” антагонізм сандимуну-неоралу до про-графу, що не дозволяє рекомендувати поєднання цих препаратів у низьких дозах з метою зменшення їх токсичних ефектів при проведенні ІСТ.

9. При вивченні впливу пептидного комплексу нирок у дозі 0,5 мкг/мл на продукцію ІНФ-g Тх1-клітинами реципієнтів in vitro визначено супресорний вплив препарату у реципієнтів до операції, а після неї за стабільної функції трансплантата відсутність впливу пептидного комплексу на продукцію ІНФ-g.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. З метою своєчасної діагностики реакції відторгнення трансплантата та прогнозування її оборотності доцільно включати в комплекс імуномоніторингу реципієнтів дослідження інтерлейкін-продукуючої функції Т-лімфоцитів-хелперів І та ІІ типів.

2. Визначення у реципієнтів рівня продукції інтерлейкіну-10 в післяопераційному періоді може бути диференційно-діагностичним критерієм реакції відторгнення трансплантата та інфекційних ускладнень.

3. Групу ризику розвитку реакції відторгнення трансплантата складають реципієнти з підвищеною експресією рецепторів до інтерлейкіну-2 у поєднанні з високою продукцією інтерлейкіну-2 і наявністю DR2 антигену у фенотипі.

Для призначення оптимальних комбінацій імуносупресивних препаратів та їх доз проводити дослідження спрямування взаємодії препаратів in vitro на підставі проліферативної активності лімфоцитів і продукції ними інтерлейкіну-2 з використанням рівняння середньої дії.

Перелік основних наукових статей, опублікованих з теми дисертації

1. Дранник Г.Н., Лунева А.Г., Калинина Н.А., Баран Е.Я. Влияние циклоспорина А на рецепторы и пролиферативную активность иммунокомпетентных клеток реципиентов аллогенной почки // Лабораторная диагностика. - 1998. - №2. - С. 24-28.

2. Дранник Г.Н., Лунева А.Г., Баран Е.Я., Лиховид Н.П., Калинина Н.А. Интерлейкин-2 (ИЛ-2) продуцирующая функция лимфоцитов и экспрессия рецепторов к ИЛ-2 у больных с хронической почечной недостаточностью перед аллотрансплантацией почки // Лабораторная диагностика. - 1998. - №3. - С.18-21.

3. Дранник Г.Н., Лунева А.Г., Баран Е.Я., Калинина Н.А., Дриянская В.Е. Взаимосвязь HLA-фенотипа с продукцией ИЛ-2 и экспрессией рецептора к ИЛ-2 у потенциальных реципиентов аллогенной почки // Імунологія та алергологія. - 1999, №1-2. - С.77-81.

4. Лунева А.Г., Дранник Г.Н., Баран Е.Я., Порошина Т.В., Калинина Н.А. Интерлейкин-4 продуцирующая функция лимфоцитов у больных с аллотрансплантированной почкой // Лабораторная диагностика. - 1999, №3. - С.78-82.

5. Порошина Т.В., Лунева А.Г., Дранник Г.Н., Калинина Н.А., Дриянс- кая В.Е., Баран Е.Я. In vitro продукция интерлейкина-2 (ИЛ-2) лимфоцитами периферической крови больных до и после аллотрансплантации почки // Імунологія та алергологія. - 2000, №1. - С.73-76.

6. Дранник Г.Н., Лунева А.Г., Баран Е.Я., Калинина Н.А., Порошина Т.В., Родионов Н.Л. Интерлейкин-10 продуцирующая функция лимфоцитов у пациентов с аллотрансплантированной почкой // Архив клинической и экспериментальной медицины. - 2000. - Том 9, №2. - С.270-274.

7. Драннік Г.М., Луньова Г.Г., Баран Є.Я., Калініна Н.А., Порошина Т.В., Родіонов М.Л. Функціональна активність лімфоцитів Т-хелперів ІІ типу (ТХ2) у реципієнтів з алотрансплантованою ниркою // Трансплантологія. - 2000. - Том 1, №1. - С.105-107.

8. Баран Є.Я., Руденко А.В., Драннік Г.М., Родіонов М.Л., Луньова Г.Г., Зограб'ян Р.О., Кругликов В.Т., Калініна Н.А. Перебіг післятрансплантаційного періоду при повторних алотрансплантаціях нирки (АТН) // Трансплантологія. - 2000. - Том 1, №1. - С.111-115.

9. Дранник Г.Н., Лунева А.Г., Баран Е.Я., Калинина Н.А., Порошина Т.В., Фесенкова В.И. Интерлейкин-10 (ИЛ-10) продуцирующая функция лимфоцитов - критерий диагностики посттрансплантационных осложнений у реципиентов с аллогенной почкой // Лабораторная диагностика. - 2000, №4. - С. 14-18.

10. Дранник Г.Н., Лунева А.Г., Калинина Н.А., Баран Е.Я., Порошина Т.В., Фесенкова В.И. Продукция ?-интерферона (?-ИНФ) Т-хелперами I типа у реципиентов до и после трансплантации почки // Архив клинической и экспериментальной медицины. - 2001. - Том. 10, №3. - С. 305-308.

11. Драннік Г.М., Кайдашев І.П., Луньова Г.Г., Калініна Н.А., Порошина Т.В., Фесенкова В.І. Особливості продукції ?-інтерферону (?-ІНФ) мононуклеарами периферичної крові під впливом пептидного комплексу нирок // Проблеми екології та медицини. - 2001. - Том 5, №3-4. - С. 55-57.

12. Лунева А.Г., Дранник Г.Н., Калинина Н.А., Порошина Т.В., Папаки-на В.С. Метод определения направленности взаимодействия иммуносупрессивных препаратов // Лабораторная диагностика. - 2001. - №4. - С. 47-51.

13. Drannik G.N., Lunova A.G., Baran Ye.Ya., Poroshina T.V., Kalinina N.A. Cytokine producing function of type II T-helpers in transplanted kidney patients // Transplantation Proceedings. - 2001. - V.33. - P. 2352-2354.

14. Луньова Г.Г. Вивчення взаємодії низьких доз прографу і сандимуну-неоралу на продукцію ІЛ-2 лімфоцитами волонтерів in vitro // Трансплантологія. - 2002. - Том 3, №1. - С. 86-88.

15. Лунева А.Г., Дранник Г.Н., Калинина Н.А., Дриянская В.Е., Порошина Т.В., Фесенкова В.И. Особенности интерлейкин-2 (ИЛ-2) и интерлейкин-4 (ИЛ-4) продуцирующей активности лимфоцитов периферической крови реципиентов в иммуноадаптации почечного аллотрансплантата // Проблеми екології та медицини. - 2002. - Том 6, №1-2. - С.20-23.

16. Лунева А.Г., Дранник Г.Н., Калинина Н.А., Порошина Т.В., Зограбьян Р.А., Папакина В.С., Баран Е.Я. Исследование характера взаимодействия сандиммуна неорала с селлсептом in vitro // Імунологія та алергологія. - 2002. - №1. - С. 12-16.

17. Лунева А.Г. Антагонистическое взаимодействие низких доз прографа и сандиммуна-неорала in vitro // Імунологія та алергологія. - 2002. - №2. - С. 25-29.

18. Луньова Г.Г. Показники продукції інтерлейкіну-2 і проліферативної відповіді лімфоцитів в оцінці взаємодії імуносупресивних препаратів // Лабораторна діагностика. - 2002. - №3. - С. 14-20.

19. Драннік Г.М., Луньова Г.Г., Баран Є.Я., Калініна Н.А., Порошина Т.В., Фесенкова В.І, Зограб`ян Р.А. Функція Т-лімфоцитів-хелперів І та ІІ типів (Тх1 та Тх2) у механізмі імуноадаптації реципієнтів до ниркового трансплантата // Трансплантологія. - 2002. - Том 3, №2. - С. 85-91.

20. Патент України №43664А від 17.12.2001 року за заявою “Спосіб діагностики гострої реакції відторгнення ниркового трансплантата” (співавт. Драннік Г.М., Луньова Г.Г., Баран Є.Я., Калініна Н.А., Порошина Т.В., Фесенкова В.І.).

21. Патент України №51133А від 15.11.2002 року за заявою “Спосіб імуносупресивної терапії у посттрансплантаційному періоді” (співавт. Драннік Г.М., Луньова Г.Г., Калініна Н.А., Порошина Т.В., Папакіна В.С.).

Анотація

Луньова Г.Г. Роль Т-хелперної ланки імунітету в реакції відторгнення алогенного трансплантата нирки людини. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук за спеціальністю 14.03.08 - імунологія та алергологія. - Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця, Київ, 2003.

У дисертації представлені шляхи оптимізації діагностики реакції відторгнення ниркового алотрансплантату, засновані на вивченні у реципієнтів особливостей функціональної активності Т-лімфоцитів-хелперів І та ІІ типів за продукцією ними ряду основних медіаторів-інтерлейкінів (ІЛ-2, ІЛ-10, ІЛ-4), інтерферону-?? (ІНФ-?). Обстежено й проаналізовано стан 149 реципієнтів, з яких 54 виконано первісну трансплантацію, а 12 - вторинну трансплантацію алогенної нирки. Проведено 2804 імунологічних дослідження реципієнтів, виконано 2390 експериментів in vitro. Визначено закономірність продукції медіаторів у реципієнтів до і після пересадки нирки з урахуванням особливостей посттрансплантаційного періоду, на підставі чого розроблено алгоритм моніторингу. Показано, що однією з головних умов спрямованої імуномодуляції Т-хелперів периферичної крові реципієнтів є індивідуалізація протоколів імуносупресивної терапії. Проведено аналіз експериментальних даних з вивчення взаємовпливу імуносупресивних препаратів (сандимуну-неоралу, селсепту, дексаметазону, прографу) на функціональну активність імунокомпетентних клітин. Аналіз експериментів здійснювався за рівнянням середньої дії, внаслідок чого встановлені коефіцієнти сполучення, що характеризують синергічну, адитивну та антагоністичну взаємодію імуносупресивних препаратів. Результатом досліджень став новий підхід у підборі імуносупресивних препаратів та їх доз.

Лунева А.Г. Роль Т-хелперного звена иммунитета в реакции отторжения аллогенного трансплантата почки человека. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности 14.03.08 - иммунология и аллергология. -

Национальный медицинский университет им. А.А. Богомольца, Киев, 2003.

В диссертации представлены пути оптимизации диагностики реакции отторжения почечного аллотрансплантата, основанные на изучении у реципиентов особенностей функциональной активности Т-лимфоцитов-хелперов I и II типов по продукции ими ряда основных медиаторов-интерлейкинов (ИЛ-2, ИЛ-10, ИЛ-4), интерферона-g (ИНФ-g). Обследовано и проанализировано состояние 149 реципиентов, из которых 54 выполнена первичная трансплантация, а 12 - вторичная трансплантация аллогенной почки. Проведено 2804 иммунологических исследования реципиентов, выполнено 2390 экспериментов in vitro. Определена закономерность продукции медиаторов у реципиентов до и после пересадки почки с учетом особенностей посттрансплантационного периода. В период развития реакции отторжения трансплантата на фоне антикризовой ИСТ возростала спонтанная продукция ИНФ-? в 2-3 раза по сравнению с дооперационным уровнем. У реципиентов с необратимыми реакциями отторжения уровень спонтанной продукции ИНФ-? достигал 100 пг/мл и более, сохранялся по сравнению с исходным высокий уровень продукции ИЛ-4 Тх2-клетками и низкий уровень продукции ИЛ-10 - меньше 15 пг/мл, а уровень продукции ИЛ-2 соответствовал дооперационному уровню или повышался на 10-20%. У реципиентов с обратимыми реакциями отторжения уровень спонтанной продукции ИНФ-? составлял не выше 35 пг/мл, а индуцированной - не выше 60 пг/мл, а также происходило снижение продукции ИЛ-2 на 35-50% по сравнению с дооперационным уровнем и снижалась продукция ИЛ-4, и показатели продукции ИЛ-10 составляли: спонтанной - не ниже 20 пг/мл, индуцированной - не ниже 62 пг/мл. У реципиентов с удовлетворительной функцией трансплантата через 1,5-2 месяца после трансплантации почки уровень продукции ИЛ-2 снижался на 65% по сравнению с дооперационным уровнем, также снижался показатель индуцированной продукции ИНФ-?? и составлял 32,6+1,9 пг/мл при неизменной динамики спонтанной продукции, и отмечался низкий уровень продукции ИЛ-4 Тх2-клетками - 60+25 пг/мл, тогда как определялись высокие показатели спонтанной и индуцированной продукций ИЛ-10: 127+10,6 пг/мл и 173,7+12,4 пг/мл соответственно. На основании выявленных закономерностей разработан алгоритм мониторинга. Показано, что одним из основных условий целенаправленной иммуномодуляции Т-хелперов периферической крови реципиентов является индивидуализация протоколов иммуносупрессивной терапии. Проведен анализ экспериментальных данных по изучению взаимовлияния иммуносупрессивных препаратов (сандиммуна-неорала, селлсепта, дексаметазона, прографа) на функциональную активность иммунокомпетентных клеток. Анализ экспериментов проводился по уравнению среднего воздействия. Было установлено: синергическое взаимодействие сандиммуна-неорала и дексаметазона, что соотносится с существующим клиническим опытом; выявлены эффекты от синергизма до антагонизма при взаимодействии сандиммуна-неорала и селлсепта, что дает основание для понимания клинического эффекта селлсепта как “дополнительного” иммуносупрессивного препарата; выявлен “фармакологический” антагонизм сандиммуна-неорала к прографу, что не позволяет рекомендовать одновременное использование этих препаратов в низких дозах с целью уменьшения их токсических эффектов при проведении ИСТ. Результатом исследований явился новый подход в подборе комбинаций иммуносупрессивных препаратов и их доз.

Ключевые слова: почечный аллотрансплантат, Т-хелперы I типа,
Т-хелперы II типа, итерлейкины-2, 4, 10; интерферон-?, коэффициенты сочетания взаимодействия иммуносупрессивных препаратов.

Summary

Lunova A.G. T-helper immunity link role in kidney allotransplant rejection of man - Manuscript.

Dissertation for the Doctor's Degree in Medical Sciences specializing in 14.03.08 - immunology and allergology. - National Medical University named after A.A.Bogomolets, Kyiv, 2003.

The dissertation presents the optimization ways of kidney allograft rejection diagnostics based on studying recipients“ peculiarities of T-lymphocyte-helpers type I and II functional activity in accordance with their producing a number of mediator-interleukines (IL-2, IL-10, IL-4, g-interferon (g-INF). 149 recipients have been examined and analysed, 54 of which have primarily undergone transplantation, 12 - have undergone secondary allograft transplantation. 2804 immunological examinations of recipients have been performed, 2390 experiments have been carried out in vitro. The order of mediator production in recipients prior and after kidney transplantation taking into account the peculiarities of posttransplantation period, basing on which the algorithm of immune monitoring was developed. It has been shown that one of the main conditions of direct recipients peripheral blood T-helper immunomodulation is the individualization of immune-suppressive therapy protocols. Experimental data on examining interaction between immunosuppressive drugs (sundimmun-neoral, сell-cept, dexamethazone, prograf) have been analysed for the functional activity of immunecompetent cells. The experiments have been analysed in accordance with median effect equation, due to, which interaction factors have been determined, which characterize synergistic, additive and antagonistic interaction of immunesuppressive drugs. As a result of the research a new approach to immune-suppressive combinations and their dozes has been forend.

Key words: kidney allograft, type I T-helpers, type II T-helpers, interleukines-2, 4, 10, g-interferon, combination factors of immunesuppressive drugs interaction.

Размещено на Allbest.ru