24

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

Кріоконсервування сироватки кордової крові, визначення її біологічної активності та клінічної ефективності в терапії хронічних сальпінгоофоритів

14.01.35 - кріомедицина

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Мошко Юліана Олександрівна

Харків - 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті проблем крiобiологiї i кріомедицини НАН України.

Захист відбудеться "21” жовтня 2003 року о 13³⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 при Інституті проблем крiобiологiї i кріомедицини НАН України за адресою 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці IПКiК НАН України за адресою: 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23.

Автореферат розісланий "20" вересня 2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор мед. наук, професор Гольцев А.М.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Розвиток кріобіології в Україні протягом останніх десятиліть, спрямований на проведення фундаментальних досліджень впливу низьких температур на різноманітні біооб'єкти, дозволив розробити надійні науково обґрунтовані методи їх кріоконсервації. Кріобіологічні технології, надаючи можливість максимально зберігати нативність тканин і органів протягом тривалого часу, дозволили одержати принципово нові біогенні стимулятори, значно більш ефективні за "переживаючi" тканини, запропоновані до застосування В.П. Філатовим. При цьому ембріофетальна клітинна та тканинна трансплантація виявилася набагато ефективнішою, ніж трансплантація клітин і тканин організму дорослих (В.І. Грищенко та співавт., 1996-2003; В.І. Говалло, 1996; В.І. Кулаков, Г.Т. Сухих, Є.М. Молнар, 1996). Крім того, кріобіологічні технології дозволяють легко маніпулювати інтервалом часу між етапом заготівлі матеріалу і його клінічним застосуванням, що надає можливість провести необхідні дослідження для виключення інфікування донорських клітин і тканин. Такий препарат доступний у клінічно потрібній ситуації, його можна легко транспортувати на будь-яку відстань, і, нарешті, з'являються можливості створення його стратегічних запасів у кріобанках. Одержання нових ефективних біологічних препаратів - один із пріоритетних напрямків сучасної кріобіології і кріомедицини (В.І. Грищенко та співавт., 1999-2003).

Здатність кордової (плацентарної) крові (КК) чинити загальностимулюючий вплив давно привернула увагу клініцистів. Використовувати плацентарну кров для переливання вперше було запропоновано М.С. Маліновським у 1933 р. У останні роки знову зростає інтерес до використання її компонентів (зокрема, гемопоетичних клітин і фетальних еритроцитів) у клінічній практиці. У вирішенні проблеми досягнення максимальної схоронності складу і властивостей клітинних компонентів КК провідне значення мало використання досягнень кріобіології (В.І. Грищенко, О.С. Прокопюк, 1997; А.М. Гольцев, Т.О. Калиниченко, 1998; П.М. Перехрестенко та співавт., 2000; А.О. Цуцаєва та співавт., 2001). Сироватка кордової крові (СКК) містить понад 60 специфічних плацентарних білків, що відіграють роль ферментів, адаптогенів, рецепторів, факторів росту, імунорегуляторних агентів; цілий ряд пептидів - структурних аналогів нейропептидів головного мозку; гормонів; вітамінів; мікроелементів (Й. Тодоров, 1968; В.Я. Гаврилов, Є.К. Неміров, 1991; В.В. Митькін, Г.Т. Сухих, 1993; С.В. Ширшев, 1993; А.П. Мілованов, Є.С. Ляшко, 1999). Отже, СКК є унікальною біологічно активною субстанцією. Розробка оптимальних технологій низькотемпературного консервування СКК, що дадуть можливість максимально зберегти її біоактивні сполучення у нативному стані без порушення їх вихідного фізіологічного співвідношення, дозволить одержати новий ефективний біопрепарат. Різні біологічні об'єкти вимагають індивідуальної технології кріоконсервування, а розробка її є однією зі складових багатопрофільних задач кріобіології. Індивідуальність підходу до розробки технологій низькотемпературного консервування СКК обумовлена особливостями біології даного матеріалу, пов'язаними насамперед з його специфічною фето-неонатальною природою. У зв'язку з тим, що немає досвіду кріоконсервування СКК, особливої актуальності набуває пошук оптимальних умов і швидкостей заморожування, умов збереження даного біологічного матеріалу, а також вивчення його біологічної активності.

Відповідно сучасним уявленням, найважливішою ланкою патогенезу хронічних запальних захворювань різної локалізації є зниження імунологічної реактивності організму. Отже, провідного значення в їх лікуванні набуває використання засобів, що активують функції найважливіших систем організму, засобів, що володіють імуностимулюючою дією, у тому числі й біологічних препаратів (К.А. Лебедєв, І.Д. Понякіна, 1990; Є.І. Соколов та співавт., 1998). До такого роду захворювань належить, зокрема, хронічний сальпінгоофорит (ХСО), проблема лікування якого продовжує залишатися актуальною і недостатньо розробленою у зв'язку з недостатньою ефективністю традиційних методів лікування (В.І. Бодяжина, 1978; С.Н. Занько, 1998; З.М. Дубоссарська та співавт., 1999; В.А. Пітько, 2000). Отже, з метою визначення біологічної активності нового біологічного препарату - кріоконсервованої СКК - його доцільно використовувати, зокрема, у терапії ХСО.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є складовою частиною наукових досліджень Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України і виконана відповідно напрямку роботи відділу кріобіології системи репродукції (шифр теми 2.2.6.66, № державної реєстрації 0100U000408), де автор виконувала самостійні розділи.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи - визначення впливу кріоконсервування на білковий та гормональний склад СКК, структурно-функціональні властивості її білкових макромолекул, а також вивчення її біологічної активності та клінічної ефективності в терапії ХСО.

Для досягнення поставленої мети необхідно вирішити наступні задачі:

вивчити закономірності змін структурно-функціональних властивостей білків СКК під впливом низьких температур за допомогою надвисокочастотної (НВЧ) діелектрометрії, флуоресцентної спектроскопії;

розробити методи одержання повноцінної стерильної СКК;

дослідити вплив заморожування і низькотемпературного зберігання на білковий і гормональний склад СКК, визначити припустимі терміни її збереження в умовах низьких температур;

визначити оптимальні технології низькотемпературного консервування СКК;

вивчити біологічну активність кріоконсервованої СКК на підставі клініко - імунологічних досліджень при використанні її у лікуванні ХСО (у порівнянні з біостимулятором полібіоліном);

розробити схеми лікування ХСО, що включають кріоконсервовану СКК.

Об'єкт дослідження - сироватка кордової крові.

Предмет дослідження - визначення змін білкових компонентів сироватки кордової крові під впливом низьких температур, вивчення біологічної активності СКК (в терапії ХСО).

Методи дослідження. Для досягнення поставленої мети використані біохімічні, радіоімунні, реологічні, спектрофотометричні, діелектрометричні, імуноферментні, клініко-лабораторні, клініко-інструментальні, імунологічні (у т. ч. імунофлуоресцентні) і статистичні методи дослідження.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше у порівняльному аспекті досліджений білковий і гормональний склад СКК до і після кріоконсервування та в процесі збереження в умовах низьких температур; вивчений вплив різних режимів заморожування на склад СКК та структуру і міжмолекулярні взаємодії її білків. Вперше досліджені діелектричні і спектральні параметри СКК, які характеризують стан білків в біосистемі, та їх зміни під впливом низьких температур. Визначені оптимальні методи заготівлі, умови та режими кріоконсервування СКК, що забезпечують її стерильність і повноцінність, а також припустимі терміни її збереження в умовах низьких температур. Вперше вивчена біологічна активність кріоконсервованої СКК на підставі клініко-імунологічних досліджень в терапії ХСО (у порівнянні з полібіоліном).

Практичне значення одержаних результатів. Проведене у процесі дисертаційного дослідження комплексне вивчення СКК як об'єкта кріоконсервування має науково-практичне значення в аспекті створення запасів для її тривалого зберігання з метою подальшого клінічного застосування. Створено банк кріоконсервованої СКК, доведена її висока біологічна активність і клінічна ефективність. Одержані результати дозволяють оптимізувати етіопатогенетичне лікування великої кількості захворювань, що супроводжуються зниженням неспецифічної реактивності організму, зокрема, ХСО, гнійно-деструктивних уражень підшлункової залози, післяопераційних гнійно-септичних ускладнень. Розроблені методичні рекомендації з заготівлі, кріоконсервування сироватки і плазми КК та їх клінічного застосування, отриманий патент України на винахід №42454А від 15.10.01. Запропонований спосіб лікування ХСО із застосуванням кріоконсервованої СКК використовується у спеціалізованому клінічному пологовому будинку №5 м. Харкова, Харківському міжрегіональному центрі планування сім`ї і репродукції людини, Інституті оптимальної медицини (м. Харків), ТОВ "Сана-мед" (м. Харків).

Особистий внесок здобувача. Дисертант самостійно склав програму досліджень, проаналізував і узагальнив дані літератури, визначив оптимальні умови заготівлі та режими кріоконсервування СКК. Клінічне застосування кріоконсервованої СКК, загальноклінічне та ультразвукове обстеження хворих на ХСО, статистична обробка отриманих цифрових даних, інтерпретація отриманих результатів і формулювання висновків проведені особисто автором дисертації. У виконанні ряду фрагментів роботи, пов'язаних з використанням лабораторних методів дослідження (біохімічних, імунологічних, вивчення гормонального статусу), автору надавали допомогу співробітники Інституту медичної радіології АМН України (м. Харків); вивчення температурної залежності динамічної в'язкості СКК проводилося разом з к. б. н., ст. наук. співр. ІПКіК НАН України О.В. Ліпіною; у проведенні експериментів з флуоресцентної спектрофотометрії автору надавала допомогу к. б. н., ст. наук. співр. ІПКіК НАН України Т.С. Дюбко; НВЧ-діелектрометрія здійснювалася спільно зі ст. наук. співр. кафедри біологічної і медичної фізики Харківського національного університету, к. фіз. - мат. наук О.Т. Ніколовим, за що автор висловлює їм щиру подяку.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації докладені та обговорені на Республіканському семінарі "Актуальні питання клінічної трансплантології" (Полтава, 2000), на Науково-практичній конференції "Клітинна і тканинна трансплантація" (Житомир, 2000), представлені на II-му конгресі Української асоціації спеціалістів УЗД в перинатології, генетиці та гінекології (Харків, 2000), Симпозіумі з проблеми тканинних банків з міжнародною участю "Биоимплантология на пороге ХХI века" (Самара, 2001), Міжнародній науково-практичній конференції "Нові технології одержання і застосування біологічно активних речовин" (Алушта, 2002), конференції молодих вчених Харківського державного медичного університету "Медицина третього тисячоліття" (Харків, 2002), конференції "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" (Пущино, 2002).

Публікації. За темою дисертаційного дослідження опубліковано 10 наукових праць, з них 3 статті у центральних профільних журналах, видані методичні рекомендації, зареєстровано патент України на винахід.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, розділу, присвяченого матеріалам та методам дослідження, двох розділів власних досліджень, заключної частини та висновків. Робота викладена на 161 сторінці, містить 16 таблиць, 16 ілюстрацій (графіків, діаграм), які разом займають 12 окремих сторінок. Список використаних літературних джерел складається з 232 найменувань (у тому числі 88 закордонних), викладених на 24 сторінках.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Матеріалом дослідження була сироватка кордової крові. З метою її одержання заготівлю КК під час пологів здійснювали за допомогою "закритої" методики у завальковані сухі (що не вміщували консерванту) скляні флакони. Заморожування СКК здійснювали у поліетиленових контейнерах місткістю 1 мл у таких режимах:

1 програма - швидке заморожування до - 196°С шляхом занурення проб у рідкий азот (швидкість охолодження - близько 300-400°С/хв), наступне збереження - у бункерах з рідким азотом;

хронічний сальпінгоофорит сироватка кров

2 програма - повільне заморожування до - 20°С шляхом розташування проб у морозильній камері (швидкість охолодження складала 1-2°С/хв), наступне збереження - в умовах морозильної камери при температурі - 20°С.

Розморожування СКК здійснювали на водяній лазні при температурі +40°С. +42°С протягом 40-60 секунд.

Таким чином, ми використовували класичні програми заморожування, що найчастіше застосовуються в кріобіології (Н.С. Пушкар, А.М. Білоус, 1975; А.М. Білоус, В.І. Грищенко, 1994).

З метою вивчення білкового складу СКК досліджували вміст загального білка уніфікованим методом по біуретовій реакції, визначали фракції сироваткового білка за допомогою методу електрофоретичного розподілу на папері у модифікації А. Є. Гурвича (1953). Визначення рівня гормонів (ФСГ, ЛГ, естрадіолу, прогестерону) в СКК здійснювали радіоімунним методом з використанням тест-систем "БіоРад" (США), "Лабсистемс" (Фінляндія). З метою визначення схоронності білкового та гормонального складу СКК при низькотемпературному консервуванні вищевказані показники досліджували до і після швидкого та повільного заморожування (через 1 добу, 1 місяць і 6 місяців). Одержані результати порівнювали з аналогічними показниками, отриманими при дослідженні сироватки крові здорових жінок.

З метою вивчення впливу кріоконсервування на структуру та міжмолекулярні взаємодії білків СКК досліджували її динамічну в'язкість при зниженні температури від +40°С до 0°С, тобто на початковому етапі кріоконсервування, на капілярно-рамковому віскозиметрі типу Коплі (Copley, 1976), у модифікації (Н.С. Пушкар, П.О. Пустовойт, 1983), досліджували діелектричні параметри СКК методом діелектричної спектроскопії в області дисперсії молекул води за допомогою НВЧ-діелектрометра резонаторного типу до і після швидкого та повільного заморожування, а також здійснювали вимір спектрів власної флуоресценції білків СКК та спектрів флуоресценції в СКК флуоресцентного зонда-катіона ДСМ (4- (n-діметіл-аміностирил) - 1-метілпіридинія, "Zonde", Латвія) у кінцевій концентрації 3,63^.10^-6М, використовуючи спеціально розроблену в ІПКіК НАН України програму "Спектр" (автор - Б.Н. Леонов), на спектрофлуориметрі "Hitachi F 4010" (Японія).

Клінічні спостереження проведені на базі кафедри акушерства і гінекології №1 Харківського державного медичного університету, спеціалізованого міського клінічного пологового будинку №5 м. Харкова. З метою вивчення біологічної активності СКК (у порівнянні з полібіоліном) було проведено комплексне клініко-імунологічне обстеження 74 хворих на ХСО, що склали 2 клінічні групи. Розподіл хворих за віком, тривалістю захворювання, клінічним даним та результатам додаткових досліджень було аналогічним в обох групах (p>0,05). Одержані результати обстеження хворих на ХСО порівнювали з аналогічними показниками, отриманими при обстеженні 30 здорових невагітних жінок репродуктивного віку зі збереженою генеративною та менструальною функціями.

У першу групу (контрольну) увійшли 36 пацієнток, які на другому етапі лікування одержували традиційну консервативну комплексну терапію, що включала полібіолін (0,5 г сухої речовини розчиняли у 5 мл 0,5% розчину новокаїну і вводили внутрішньом'язово щодня протягом 10 днів (М.В. Міндюк, 1988)). Другу групу (основну) склали 38 хворих, традиційне комплексне лікування яких на другому етапі включало кріоконсервовану СКК. Її вводили по 1 мл з 2 мл 2% -го розчину новокаїну в одному шприці внутрішньом'язово через день, на курс - 5 ін'єкцій.

Застосування кріоконсервованої СКК в клініці базується на “Сертифікаті про державну реєстрацію медичного імунобіологічного препарату" №371/03-300200000 (Державний департамент з контролю за якістю, безпекою та виробництвом лікарських засобів і виробів медичного призначення МОЗ України).

Обстеження хворих включало вивчення скарг, анамнезу, об'єктивне загальносоматичне і спеціальне гінекологічне дослідження, загальноклінічне лабораторне обстеження (клінічний аналіз крові, сечі, біохімічне дослідження крові, коагулограму).

Вплив кріоконсервованої СКК (у порівнянні з полібіоліном) на імунний статус пацієнток оцінювали, визначаючи (до і після лікування, через 10 днів, 3 і 6 місяців) популяційний та субпопуляційний склад імунокомпетентних клітин крові хворих (методом непрямої iмунофлуоресценції з використанням моноклональних антитіл), концентрацію імуноглобулінів у сироватці крові (методом одномірної радіальної імунодифузії в агаровому гелі "Діфко" по G. Manchіnі et al., 1965), фагоцитарну активність нейтрофилів крові хворих за допомогою тесту відновлення нитросинього тетразолію (НСТ-тесту) спонтанного та індукованого (цитохімічний варіант НСТ-тесту, М. Є. Вiксман, А.Н. Маянський, 1979), а також шляхом визначення параметрів фагоцитарної реакції стосовно мікробної тест-культури (Н.В. Васильєв, Ю.Н. Одинцов, Ю.В. Федотов, 1972).

За допомогою трансабдомінальної і трансвагінальної ехографії, використовуючи апарати "Aloka SSD-256" (лінійний датчик) та "1100-FLEXUS" (секторальний датчик), оцінювали вплив кріоконсервованої СКК та полібіоліну на стан внутрішніх статевих органів, формування і зростання фолікулу, визначали наявність і час настання овуляції.

З метою вивчення впливу досліджуваного біопрепарату на ендокринну систему хворих визначали вміст гормонів (ФСГ, ЛГ, естрадіолу, прогестерону) у сироватці крові пацієнток радіоімунним методом з використанням тест-систем "БіоРад" (США), "Лабсистемс" (Фінляндія). Функцію гіпоталамо-гіпофізарно-яєчникової системи оцінювали також за результатами тестів функціональної діагностики (виміру базальної температури тіла).

Статистичну обробку цифрових даних, одержаних у ході досліджень, проводили за методом Стьюдента-Фішера на IBM PC Pentium-II з використанням електронних таблиць Microsoft Excel.

Результати власних досліджень. У результаті проведених нами досліджень виявлено, що відносний вміст a₁-глобулінів в СКК (3,2±0,3%) відповідає фізіологічній нормі дорослих (3,4±0,3%), у той час як абсолютний і відносний рівень a₂ - (6,2±0,6%) і b-глобулінів (6,9±0,6%) знижений, а рівень g-глобулінів - підвищений (18,2±0,9%) стосовно цих же показників у здорових жінок (9,9±0,9%, 12,7±0,9% і 15,9±0,4% відповідно, p<0,05). Внаслідок зниження процентного рівня a₂ - і b-глобулінів ми спостерігали відносне підвищення рівня альбуміну в СКК (65,6±1,5%) у порівнянні з даними, отриманими у дорослих (57,6±1,1%), p<0,05. Відповідно співвідношення альбумін: глобуліни в СКК (2,12±0,08) було вище (p<0,05), ніж у дорослих (1,36±0,06). Абсолютні рівні альбуміну в СКК (42,6±1,4 г/л) та у здорових жінок (43,0±2,9 г/л) не відрізнялися (p>0,05), тому що вміст загального білка в СКК нижче, ніж у дорослих (61,1±2,2 г/л і 74,7±4,7 г/л відповідно, p<0,05).

Вміст ФСГ (46,43±2,27 мМО/мл) і ЛГ (52,76±4,31мМО/мл) в крові немовлят майже вдвічі, а естрадіолу (984,87±12,16 пг/мл) - у 6 разів вище, ніж в крові здорових жінок у періовуляторний період, коли концентрації цих гормонів досягають максимальних значень (22,86±1,63 мМО/мл; 28,14±1,82 мМО/мл та 154,6±7,65 пг/мл відповідно, p<0,05). Рівень прогестерону в крові здорових жінок при дослідженні на 21-24 день менструального циклу (у стадії розквіту жовтого тіла, коли вміст цього гормону досягає свого максимуму), складає 18,6±1,61 нг/мл. Це майже у 12 разів нижче, ніж в СКК (219,34±15,32 нг/мл, p<0,05).

Через 1 добу після заморожування, а також при короткочасному (протягом 4 тижнів) збереженні СКК при низьких (-20°С) температурах (після повільного заморожування) і при тривалому (протягом 6 місяців) збереженні при ультранизьких (-196°С) температурах (після швидкого заморожування) статистично достовірних змін протеїнограми та вмісту гормонів ми не спостерігали, у той час як при тривалому збереженні СКК при - 20°С нами виявлено зниження (p<0,05) рівнів гормонів білкової природи: ФСГ - до 40,48±1,87 мМО/мл, ЛГ - до 43,56±1,46 мМО/мл у порівнянні з вихідними - 46,43±2,27 мМО/мл і 52,76±4,31 мМО/мл відповідно (для порівняння, у стандартному розчині полібіоліну (0,5 г сухої речовини на 5 мл розчинника) вміст ФСГ і ЛГ у десятки, а естрадіолу і прогестерону - у сотні разів нижче, ніж у кріоконсервованій СКК), а також зниження (p<0,05) відносного вмісту a₂-глобулінів до 4,2±0,4% та b-глобулінів - до 5,0±0,2% у порівнянні з нативною СКК (6,2±0,6% та 6,9±0,6% відповідно). За даними С.В. Ширшева (1993), А.П. Мілованова, Є.С. Ляшко, (1999), специфічні фетоплацентарні білки переважно знаходяться у фракції a₂ - глобулінів, а також - b_?-глобулінів. Зниження їх процентного вмісту в СКК у результаті тривалого збереження при - 20°С (після повільного заморожування), на наш погляд, може побічно свідчити про те, що ці групи білків найбільш чутливі до дії низьких температур і в більшому ступені піддаються кріоденатурації, а також про те, що процеси заморожування-відігрівання впливають на стан білків СКК на молекулярному рівні.

Тому, з метою виявлення змін структури та міжмолекулярних взаємодій білків СКК під впливом низьких температур, нами було здійснено дослідження реологічних властивостей СКК при зниженні температури від +40°С до 0°С (тобто на початковому етапі кріоконсервування), вивчення її діелектричних та спектральних характеристик та їх змін в результаті низькотемпературного консервування.

Дослідження температурної залежності динамічної в'язкості СКК показало, що зниження температури від +40°С до +2°С приводить до підвищення в'язкості майже втричі. Температурна залежність динамічної в'язкості СКК має нелінійний характер, її криву умовно можна розділити на дві ділянки: перша - зі слабко вираженим підйомом (при зниженні температури від +37°С до +20°С), де приріст в'язкості складає 20% від її загального збільшення у температурному інтервалі +38°С. +4°С, і друга ділянка (від +18°С до +4°С) - з основним підйомом в'язкості. Отримані дані вказують на важливість внеску міжмолекулярних взаємодій білків СКК у термотропні аномалії в'язкості, тому що для розчинів неорганічних компонентів сироватки подібних аномалій виявлено не було.

В результаті проведених досліджень діелектричних параметрів СКК встановлено, що значення дійсної частини (?') комплексної діелектричної проникності СКК після повільного заморожування для всіх зразків нижче (р<0,05), ніж ?' нативної СКК, що свідчить про зменшення кількості вільної води у системі в результаті підвищення ступеня гідратації компонент СКК. Це може відбуватися внаслідок звільнення додаткових ділянок зв'язування для молекул води у результаті структурних змін білків СКК, викликаних дією низьких температур. e' СКК після швидкого заморожування також знижується (р<0,05), але на величину, приблизно вдвічі меншу (р<0,05), ніж у випадку повільного заморожування. Імовірно, порушення структури компонент СКК при швидкому заморожуванні менш значні і приводять до звільнення меншої кількості додаткових ділянок зв'язування для молекул води. Це дозволяє припустити, що під час процесів швидкого заморожування компоненти СКК перетерплюють мінімальні зміни.

Дослідження спектральних характеристик СКК та їх змін під впливом низьких температур здійснювали в 36 зразках СКК, що підлягали швидкому заморожуванню, тому що цей режим, за нашими даними, найбільш сприятливий. За даними флуоресцентної спектроскопії, пік сумарної флуоресценції білків СКК має максимум при 334?3 нм, що свідчить про досить суттєвий внесок триптофанових залишків у загальні спектри флуоресценції білків СКК. Заморожування-відігрівання приводять до зменшення білкової флуоресценції на 15??% (p<0,05) без істотної зміни положення її максимуму. При збудженні спектрів флуоресценції СКК після заморожування світлом з довжиною хвилі 296 нм істотних змін ні у положенні смуг, ні в їх інтенсивності відзначено не було, тобто, були відсутні помітні зміни в оточенні триптофанових залишків. Отже, зменшення інтенсивності флуоресценції спектрів СКК після заморожування може бути віднесене на рахунок гасіння флуоресценції тирозинових залишків, що, мабуть, стають більш доступними молекулам води. Це дозволяє припустити, що у даному випадку відбуваються зміни структури білкових розчинів, які є наслідком змін четвертинної структури білків.

Спектри флуоресценції зонда-катіона ДСМ у фізіологічному розчині мали максимум при 603?2 нм і інтенсивність порядку 4,82 ум. од. В СКК вони зрушувалися у короткохвильовий бік (до 575?? нм), що супроводжувалося майже 10-кратним зростанням інтенсивності флуоресценції відносно фізіологічного розчину. Подібне поводження зонда відбиває його зв'язування з білками СКК і, у першу чергу, із сироватковим альбуміном (Т.С. Дюбко і співавт., 1999). Заморожування-відігрівання приводили до збільшення інтенсивності флуоресценції зонда і незначного короткохвильового зрушення максимуму його спектра флуоресценції. Це може бути інтерпретоване як збільшення зв'язування ДСМ із білками СКК після заморожування-відігрівання, яке є результатом їх конформаційних змін у результаті дії низької температури. При зв'язуванні з білками СКК форма спектра флуоресценції ДСМ змінюється: крім компоненти, яка співпадає за параметрами спектра із параметрами зонда, що знаходиться у водному оточенні, у спектрі виявляються ще дві складові, розташування яких дозволяє віднести їх до зонда, який зв`язується на поверхні білків, і зонда, зв'язаного у неполярних зонах білка. При цьому основний внесок у загальний спектр флуоресценції зонда вносять молекули ДСМ, зв`язані на поверхні білків. У результаті заморожування-відігрівання збільшується загальна кількість зонда, зв'язаного з білками СКК, а також спостерігається його частковий перерозподіл з полярних ділянок зв'язування у більш гідрофобні Це свідчить про підвищення доступності розчинникові поверхневого шару білків СКК внаслідок кріовпливу. Зміни, які спостерігаються, носять адитивний характер і підсилюються після повторних циклів заморожування-відігрівання.

Таким чином, результати проведених нами досліджень дозволили зробити висновок про те, що кращим є швидке заморожування СКК (зі швидкістю 300 - 400°С/хв до - 196°С з подальшим зберіганням в рідкому азоті), оскільки воно дозволяє максимально зберегти її білковий і гормональний склад та істотно не впливає на структуру її білкових макромолекул; СКК, кріоконсервована у такий спосіб, може бути використана у клінічних цілях.

Середній вік обстежених 74 хворих із ХСО склав 27,1±2,7 років (у контрольній групі (n=36) - 28,2±2,96 років і в основній (n=38) - 26,3±2,9 років, p>0,05). Більшість із них (93,2%) були молодше 30 років, тобто знаходилися у найбільш сприятливому репродуктивному віці.

Тривалість захворювання склала від 3 до 14 років (у середньому в контрольній групі - 6,6±2,04 років і в основній - 6,7±2,3 років, p>0,05). Рецидивуючий характер запалення, із середньою частотою рецидивів 1-2 рази на рік, відзначали 28 (77,8%) жінок контрольної і 29 (76,3%) - основної групи (p>0,05). Усі хворі у минулому неодноразово одержували курси антибактеріальної і протизапальної терапії.

На порушення менструального циклу скаржилися 33 (91,7%) пацієнтки контрольної і 36 (94,7%) - основної групи (p>0,05), з них 31 (86,1%) і 33 (86,8%) відповідно (p>0,05) зв'язували ці зміни з початком захворювання. Переважали альгодисменорея (у контрольній групі - 22 (61,1%) і в основній - 26 (68,4%), p>0,05), гіпоменструальний синдром (14 (38,9%) і 14 (36,8%) відповідно, p>0,05), гіперполіменорея (10 (27,8%) і 11 (28,9%) відповідно, p>0,05).

24 (66,7%) жінки контрольної і 29 (76,3%) - основної групи не мали у минулому пологів (p>0,05). У 10 (27,8%) хворих контрольної та у 12 (31,6%) - основної групи (p>0,05) була первинна, у 19 (52,8%) та у 20 (52,6%) відповідно (p>0,05) - вторинна безплідність.

Усі жінки в стадії загострення захворювання одержали традиційну консервативну поетапну комплексну терапію (К.І. Малевич, П.С. Русакевич, 1994). Перший етап лікування проводився в умовах гінекологічного стаціонару і включав антибактеріальне лікування з урахуванням результатів бактеріологічного дослідження, інфузійну і десенсибілізуючу терапію, спазмолітики, ненаркотичні аналгетики та інгібітори простагландинів, вітамінотерапію. Через 4-8 тижнів було проведено комплексне обстеження хворих і курс реабілітаційної терапії (другий етап лікування) в амбулаторних умовах.

Хворі скаржилися на загальну слабкість, стомлюваність, зниження працездатності. Ниючі болі внизу живота турбували 80,6% пацієнток контрольної і 84,2% - основної клінічної групи (p>0,05).6 (16,7%) хворих контрольної і 7 (18,4%) - основної групи (p>0,05) відчували дискомфорт внизу живота. Підвищення температури тіла до 37,0-37,2°С у вечірній час продовжували відзначати 7 (19,4%) пацієнток контрольної і 9 (23,7%) - основної клінічної групи, p>0,05.

При проведенні дворучного гінекологічного дослідження були виявлені збільшення (що підтверджено даними УЗД, p<0,05) і помірна болісність придатків матки при пальпації по обидва боки у 28 (77,8%) хворих контрольної та у 28 (73,7%) - основної групи; з одного боку - у 6 (16,7%) і у 7 (18,4%) відповідно (p>0,05). У 20 (55,6%) пацієнток контрольної і 22 (57,9%) - основної групи (p>0,05) матка була обмежена у рухливості, у 13 (36,1%) та у 14 (36,8%) відповідно - відхилена від середньої лінії; у 4 (11,1%) і 4 (10,5%) хворих відповідно (p>0,05) була виявлена ретродевіація матки, обумовлена спайковим процесом, що підтверджувалося даними УЗД. УЗД дозволило також виявити непрямі ознаки спайкового процесу у малому тазу: наявність гіперехогенних лінійних структур в області придатків, "підтягнутість" і незміщуваність придатків стосовно матки.

Результати імунологічного обстеження хворих свідчили про дисфункціональний імунодефіцитний стан. Відзначалося пригнічення клітинної ланки імунітету: зменшення загальної кількості Т-лімфоцитів і Т-хелперів, а також підвищення Т-супресорів, що привело до зниження співвідношення хелперів і супресорів (у порівнянні зі здоровими жінками, p<0,05). Ми спостерігали зниження показників фагоцитарної активності нейтрофилів крові: фагоцитарного індексу (ФІ), фагоцитарного числа (ФЧ), показника завершеності фагоцитозу (ПЗФ), а також зниження показників НСТ-тесту спонтанного та індукованого (p<0,05). Збільшення вмісту Іg A, IgM та IgG поряд з підвищеним рівнем В-клітин (p<0,05) свідчило про дисфункцію гуморальної ланки імунної системи.

При дослідженні гормонального статусу у 33 (91,7%) пацієнток контрольної та у 36 (94,7%) - основної групи (p>0,05) були виявлені порушення функції гіпофіза і гормональної функції яєчників.

На підставі даних УЗД і тестів функціональної діагностики зроблений висновок про наявність ановуляторних менструальних циклів у 16 (44,4%) хворих контрольної і у 18 (47,4%) - основної групи (p>0,05), що клінічно виявлялося порушеннями менструальної функції та у частини хворих приводило до безплідності. У 17 (47,2%) хворих контрольної та у 18 (47,4%) - основної групи (p>0,05) при наявності овуляції швидкість росту і максимальний діаметр домінантного фолікула були значно нижчі (p<0,05), ніж у здорових жінок.

З огляду на вищевикладене, був проведений другий етап лікування (із застосуванням кріоконсервованої СКК або полібіоліну), метою якого було досягнення стійкого протизапального і фібринолітичного ефектів, корекція порушених функцій імунної та ендокринної систем, відновлення овуляції та фертильності.

Оцінюючи найближчі результати лікування хворих з використанням кріоконсервованої СКК, ми відзначили у всіх жінок поліпшення загального самопочуття, зникнення болей внизу живота, гіпертермії. У контрольній групі (із застосуванням полібіоліну) у 14 (48,3%) з 29 хворих зберігся хронічний больовий тазовий синдром, у 3 (42,9%) із 7 - субфебрилітет (p<0,05).

При бімануальному дослідженні через 1-3 місяці після лікування встановлено, що анатомічні зміни у придатках матки збереглися у 2 (5,7%) із 35 хворих основної і у 22 (64,7%) із 34 - контрольної групи (p<0,05); у 20 (90,9%) з 22 пацієнток основної і у 3 (15,0%) із 20 - контрольної групи (p<0,05) була відновлена рухливість матки.

Вищесказане свідчить про більш виражений протизапальний та фібринолітичний ефекти кріоконсервованої СКК (у порівнянні з полібіоліном).

У 26 (72,2%) з 36 жінок основної та у 6 (18,2%) з 33 - контрольної групи (p<0,05) ми спостерігали нормалізацію порушених функцій ендокринної системи. У 23 (88,5%) із 26 хворих основної та у 11 (50,0%) з 22 - контрольної групи з альгодисменореєю зменшився болючий синдром (p<0,05); у 8 (40,0%) з 20 пацієнток основної групи відновився нормальний ритм менструацій.

При УЗД виявлено (рис.1), що у 5 (13,9%) пацієнток контрольної та у 6 (15,8%) - основної групи розміри яєчників у результаті лікування значно зменшилися (p<0,05), однак залишалися більше норми. У 7 (19,4%) хворих контрольної та у 30 (78,9%) - основної групи ми спостерігали нормалізацію розмірів яєчників (p<0,05), зникнення ехографічних ознак хронічного запального процесу у придатках матки. На підставі даних УЗД (рис.2) і виміру базальної температури тіла протягом 3-6 місяців ми зробили висновок про відновлення овуляції у 16 (88,9%) з18 хворих основної та у 4 (25,0%) із 16 - контрольної групи, у яких раніше спостерігалася стійка ановуляція (p<0,05).

Вищесказане свідчить про більш виражену протизапальну дію і вплив кріоконсервованої СКК на ендокринну і менструальну функції хворих на ХСО, а також на процеси овуляції (у порівнянні з полібіоліном).

У хворих контрольної групи (табл.1) відразу після закінчення курсу лікування підвищилася (p<0,05) відносна кількість Т-лімфоцитів загальних та Т-хелперів, унаслідок чого збільшився імунорегуляторний індекс (p<0,05), однак повної їх нормалізації не відбулося.

Таблиця 1

Динаміка показників імунограми у хворих на ХСО при різних варіантах лікування

Примітка.1 - вірогідність розходжень стосовно норми; p<0,05; ² - вірогідність розходжень показників у групах до і після лікування; p<0,05; ³ - вірогідність розходжень між контрольною й основною групою після лікування.

У пацієнток основної групи через 10 днів (див. табл.1) після лікування вищевказані показники клітинної ланки імунітету не відрізнялися від норми. У хворих обох груп через 10 днів після лікування підвищилися (p<0,05) показники НСТ-тесту спонтанного та індукованого, ФІ, ФЧ, однак у пацієнток контрольної групи вони продовжували відрізнятися від норми (p<0,05). ПЗФ нормалізувався у всіх хворих.

Дані дослідження імунологічного статусу хворих контрольної групи через 3 і 6 місяців після лікування продовжували свідчити про недостатню функціональну активність клітинних факторів неспецифічного захисту організму (вірогідність розходжень у порівнянні зі здоровими жінками, p<0,05).

Вміст В-лімфоцитів, Іg A, Іg M і ІgG залишався підвищеним (p<0,05) у хворих обох клінічних груп і знизився до нормальних значень у пацієнток основної групи через 3 місяці після лікування, що вказувало на повне закінчення запального процесу (К.А. Лебедєв, І.Д. Понякіна, 1990). У хворих контрольної групи через 3 місяці після лікування ми спостерігали достовірне (p<0,05) зниження рівня ІgG, однак його нормалізації не відбулося.

Через 6 місяців після лікування ми не виявили істотних змін в імунограмах хворих обох клінічних груп.

Таким чином, результати імунологічного дослідження свідчили про більш виражену імуномоделюючу дію кріоконсервованої СКК (у порівнянні з полібіоліном).

Катамнестичне спостереження за хворими основної групи протягом 3 років після проведеного курсу лікування виявило, що ні в однієї з них не спостерігалося повторних загострень захворювання; у контрольній групі випадки одноразового загострення були у 8 (22,2%) пацієнток, дворазового - у 4 (11,1%), p<0,05.

У контрольній групі вагітність наступила у 1 (10,0%) з 10 жінок, що страждали первинною безплідністю, та у 2 (10,5%) із 19, що страждали вторинною безплідністю (2 народили у термін здорових дітей, у 1 вагітність прогресує); в основній групі вагітність наступила у 5 (41,7%) з 12 жінок, що страждали первинною безплідністю, та у 8 (40,0%) з 20, що страждали вторинною безплідністю (p<0,05). У 6 вагітність закінчилася нормальними пологами, 1 пацієнтці у терміні пологів було зроблено кесарів розтин у зв'язку зі змішаним сідничним передлежанням плоду, у 6 вагітність прогресує.

Отже, кріоконсервована СКК володіє вираженою загальностимулюючою, протизапальною, імуномоделюючою і фібринолітичною активністю завдяки наявності біологічно активних речовин і гормонів, схоронність яких у високих концентраціях і фізіологічних співвідношеннях дозволяють забезпечити кріобіологічні технології.

Висновки

1. У дисертаційній роботі наведене рішення наукової проблеми з розробкою оптимального методу низькотемпературного консервування СКК, що дозволяє максимально зберегти її білковий і гормональний склад та біологічну активність, на підставі біохімічних, радіоімунних, діелектрометричних та спектрофотометричних досліджень, запропонований новий метод лікування хворих на ХСО з використанням кріоконсервованої СКК, ефективність якого підтверджують дані клініко-імунологічних досліджень.

2. Зміни діелектричних параметрів і спектральних характеристик СКК, які спостерігаються при швидкому, та особливо повільному заморожуванні, свідчать про зміни в результаті кріоконсервування структури і міжмолекулярних взаємодій білків СКК, що згодом, при тривалому (більш 6 місяців) збереженні при - 20С (після повільного заморожування), приводить до невеликого, але статистично достовірного зниження рівнів білків a₂ - и b-глобулінових фракцій, фолікулостимулюючого і лютеінізуючого гормонів.

3. Більш повноцінним є швидке заморожування СКК (зі швидкістю 300-400°С/хв до - 196°С) з наступним збереженням у рідкому азоті, оскільки воно дозволяє максимально зберегти її білковий і гормональний склад та істотно не впливає на структуру її білкових макромолекул; отже, СКК, кріоконсервована у такий спосіб, може бути використана у клінічних цілях.

4. ХСО у стадії клінічної ремісії у обстежених нами хворих супроводжувалися порушенням клітинного і гуморального імунітету: зниженням числа Т-лімфоцитів, дисбалансом імунорегуляторних субпопуляцій (хелпери, супресори), підвищенням рівнів В-лімфоцитів, імуноглобулінів A, M і G, зниженням функціональної активності клітинних факторів неспецифічного захисту організму; у 93,2% хворих на ХСО відзначені порушення гормональної функції гіпофіза і яєчників і менструальної функції, у 82,4% - репродуктивної функції. Це визначає доцільність застосування у терапії даної патології біологічних препаратів, що стимулюють функціонування різних систем організму, зокрема, імунної системи.

5. Застосування кріоконсервованої сироватки кордової крові на другому етапі лікування хворих на ХСО сприяло поліпшенню найближчих результатів лікування, відновленню порушених функцій ендокринної системи (у 72,2% хворих), менструальної (у 66,7%) і репродуктивної (у 40,6%) функцій, підвищенню імунологічної реактивності: нормалізації показників клітинної ланки імунітету, активації поглинальної і перетравлювальної здатності мононуклеарних фагоцитів. Через 3 місяці після лікування відбулася нормалізація показників гуморальної ланки імунітету. Застосування полібіоліну також призвело до деякого поліпшення показників імунограми, однак їх повної нормалізації не відбулося; відновлення порушених функцій ендокринної системи спостерігалося у 18,2% хворих, менструальної - у 33,3% і репродуктивної - у 10,3%.

6. Результати, отримані при вивченні складу і властивостей СКК в умовах впливу низьких температур, дозволяють рекомендувати у практику запропонований метод кріоконсервування цього біологічного об'єкта через практично повну схоронність його складу і біологічних функцій.

7. Висока ефективність застосування кріоконсервованої СКК у терапії ХСО, її висока імуномоделююча і загальностимулююча активність дозволяють рекомендувати препарат для впровадження у практику охорони здоров'я, що буде сприяти зниженню частоти рецидивів захворювання і більш повному відновленню специфічних функцій жіночого організму.

Список опублікованих праць здобувача за темою дисертації

1. К вопросу о криоконсервировании плазмы кордовой крови (соавТ.о.В. Липина, О.С. Прокопюк) // Проблемы криобиологии. - 2000. - №4. - С.83-84. (Дисертант готував зразки плазми та сироватки кордової крові до експериментів; приймав участь у постановці експериментів з вивчення динамічної в'язкості та в узагальненні одержаних результатів).

2. Некоторые аспекты ультразвуковой диагностики и терапии хронических сальпингоофоритов (соавт.В.И. Грищенко, В.С. Лупояд, О.С. Прокопюк, О.В. Липина) // Експериментальна i клінічна медицина. - 2000. - №4. - С.107-108. (Дисертантом самостійно проведене загальноклінічне та ультразвукове обстеження хворих).

3. Применение криоконсервированной сыворотки кордовой крови в лечении женщин с хроническими сальпингоофоритами // Проблемы криобиологии. - 2001. - №1. - С.70-75.

4. Патент 2001031493 UA, 42454А, 7 А 61 К 35/16. Біостимулюючий препарат "Кріокорд-С" та спосіб лікування хронічних сальпінгоофоритів з використанням цього препарату/В.І. Грищенко, О.В. Ліпіна, О.С. Прокопюк, Ю.О. Мошко. - Опубл.15.10.2001. - Бюл. №9. - 2 с.

5. Заготівля, кріоконсервування сироватки і плазми кордової крові та їх клінічне застосування (співавт.В.І. Грищенко, О.С. Прокопюк, О.В. Ліпіна). Методичні рекомендації. - Харків, 2000. - 11 с.

6. До питання диференційної діагностики захворювань придатків матки запального генезу за допомогою УЗ-обстеження (співавт.В.І. Грищенко, В.С. Лупояд, В.А. Пітько, К.В. Лупояд, В.С. Страховецький) // Плід як частина родини: Збірник тез ІI-го Конгресу Української асоціації спеціалістів УЗД в перинатології, генетиці та гінекології - Харків: Константа. - 2000. - С.307-308.

7. Низкотемпературное консервирование плазмы кордовой крови (соавт. О.В. Липина, И.Б. Мусатова) // Биоимплантология на пороге ХХI века: Сб. тезисов Симпозиума по проблеме тканевых банков с международным участием. - Самара. - 2001. - С.22-23.

8. Опыт применения криоконсервированной сыворотки кордовой крови при лечении женщин с хроническими сальпингоофоритами // Збірник тез конференції молодих вчених Харківського державного медичного університету "Медицина третього тисячоліття". - Харків, 2002. - С.119.

9. "Криокорд-С" - биологически активная сыворотка кордовой крови человека (соавт. В.И. Грищенко, О.В. Липина, О.С. Прокопюк, И.Б. Мусатова) // Новые технологии получения и применения биологически активных веществ. Тезисы докладов Международной научно-практической конференции. - Алушта, Крым, Украина, 20-25 мая 2002 г. - Симферополь: Издат-во КНЦ. - 2002. - С.72.

10. Низкотемпературное консервирование сыворотки кордовой крови (соавТ.о.В. Липина, О.С. Прокопюк, И.Б. Мусатова) // Труды конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям". - Пущино, Россия, 11-14 ноября 2002 г. - Пущино, 2002. - С.92.

Анотації

Мошко Ю.О. Кріоконсервування сироватки кордової крові, визначення її біологічної активності та клінічної ефективності в терапії хронічних сальпінгоофоритів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.35 - кріомедицина. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2003.

Було досліджено вплив різних методів кріоконсервування на білковий та гормональний склад сироватки кордової крові і структурно-функціональні властивості її білків.

Визначені оптимальні методи заготівлі, умови та режими кріоконсервування сироватки кордової крові, а також допустимі терміни її зберігання в умовах низьких температур.

Доведена висока біологічна активність і клінічна ефективність кріоконсервованої сироватки кордової крові (у порівнянні з полібіоліном) на підставі клініко-імунологічних досліджень у моделі терапії хронічних сальпінгоофоритів. Цей біологічний препарат виявляє значну загальностимулюючу, протизапальну, імуномоделюючу, фібринолітичну активність.

Ключові слова: сироватка кордової крові, кріоконсервування, флуоресценція, діелектрична проникність, хронічний сальпінгоофорит.

Мошко Ю.А. Криоконсервирование сыворотки кордовой крови, определение ее биологической активности и клинической эффективности в терапии хронических сальпингоофоритов. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.35 - криомедицина. - Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2003.

Диссертация посвящена определению влияния криоконсервирования на белковый и гормональный состав сыворотки кордовой крови, структурно-функциональные свойства ее белковых макромолекул, разработке оптимальных технологий ее низкотемпературного консервирования и определению допустимых сроков хранения в условиях низких температур, а также изучению ее биологической активности и клинической эффективности в терапии хронических сальпингоофоритов.

Быстрое замораживание сыворотки кордовой крови до - 196°С осуществляли путем погружения проб в жидкий азот (скорость охлаждения - около 300-400°С/мин) последующее хранение - в бункерах с жидким азотом; при медленном замораживании до - 20°С пробы охлаждались путем помещения в морозильную камеру (скорость охлаждения - 1-2°С/мин), последующее хранение - в условиях морозильной камеры при температуре - 20°С.

Исследованы реологические, диэлектрические и спектральные характеристики сыворотки кордовой крови и их изменения при криоконсервировании. Выявленные изменения диэлектрических параметров и спектральных характеристик сыворотки кордовой крови, которые наблюдались при быстром, и особенно медленном замораживании, свидетельствовали об изменениях в результате криоконсервирования структуры и межмолекулярных взаимодействий ее белков, что впоследствии, при длительном (более 6 месяцев) хранении при - 20С, приводило к небольшому, но статистически достоверному снижению уровней белков a₂ - и b-глобулиновых фракций, фолликулостимулирующего и лютеинизирующего гормонов в сыворотке кордовой крови.