Використання пластівцевоутворюючого фактора для діагностики інфекцій стафілококової етіології

Размещено на http://www.allbest.ru/

Київський національний університет імені Тараса Шевченка

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

03.00.09 - імунологія

Використання пластівцевоутворюючого фактора для діагностики інфекцій стафілококової етіології

Іванова Вікторія Джанівна

Київ - 2003

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано на кафедрі мікробіології та загальної імунології Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Позур Володимир Костянтинович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач кафедри мікробіології та загальної імунології

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Гавриленко Тетяна Іллівна, Інститут кардіології імені М.Д. Стражеска АМН України, керівник відділу імунології

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Скок Марина Володимирівна, Інститут біохімії імені О.В. Палладіна НАН України, старший науковий співробітник відділу молекулярної імунології

Провідна установа: Національний медичний університет імені О.О. Богомольця МОЗ України, м. Київ

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради О.В. Молчанець

Анотація

Іванова В.Д. Використання пластівцевоутворюючого фактора для діагностики інфекцій стафілококової етіології. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.09 - імунологія. Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2003.

Дисертацію присвячено дослідженню гуморальної імунної відповіді на пластівцевоутворюючий фактор (ПлФ) у хворих на стафілококову інфекцію та визначенню цінності цього антигену для діагностики інфекцій стафілококової етіології. Проведено експерименти з оптимізації експресії гена clfA S. aureus, що кодує ПлФ, у клітинах E. coli XLI-Blue. На основі штаму E. coli BL21(DE3)Gold сконструйовано систему для конститутивної експресії рекомбінантного ПлФ, перевагами якої є простота ферментації та низька собівартість процесу культивування штаму-продуцента.

За допомогою твердофазного імуноферментного аналізу (ТІФА) проаналізовано сироватки хворих на кістково-гнійну інфекцію, інфекцію верхніх дихальних шляхів та здорових донорів різних вікових категорій щодо рівня та афінності антитіл до ПлФ. Встановлено, що при стафілококовій інфекції відбувається підвищення титру та афінності анти-ПлФ-антитіл, а виявлення їх у сироватці крові має діагностичне та прогностичне значення, що зумовлює використання ПлФ в ТІФА для діагностики інфекцій стафілококової етіології. На основі рекомбінантного ПлФ розроблено експериментальну модель системи ТІФА для виявлення антитіл до ПлФ, що впроваджена в роботу лабораторії мікробіології та хіміотерапії інституту травматології та ортопедії АМН України і використовується в межах комплексного дослідження для встановлення стафілококової етіології захворювань.

Ключові слова: пластівцевоутворюючий фактор, стафілокок, стафілококова інфекція, діагностика, твердофазний імуноферментний аналіз, антитіло, афінність.

Аннотация

Иванова В.Д. Использование хлопьеобразующего фактора для диагностики инфекций стафилококковой этиологии. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.09 - иммунология. Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2003.

В диссертационной работе исследован гуморальный иммунный ответ на хлопьеобразующий фактор (ХОФ) у больных стафилококковой инфекцией и показано значение антигена для диагностики инфекций данной этиологии.

В качестве антигена в исследованиях использован рекомбинантный ХОФ, синтезированный в клетках E. coli XLI-Blue (pCF41). Показано, что для генно-инженерной конструкции, обеспечивающей экспрессию ХОФ, характерна нестабильность, обусловленная быстрой элиминацией рекомбинантной плазмиды из клеток в ходе культивирования. С целью повышения стабильности плазмиды pCF41 и усиления биосинтеза рекомбинантного белка осуществляли подбор условий культивирования штамма E. coli XLI-Blue. Предварительный скрининг высокопродуктивных клонов (синтезирующих не менее 18-20% белка) и культивирование клеток в присутствии ампициллина в концентрации 200 мкг/мл, добавляемого каждые 2 часа (а после индукции изопропилтио--D-галактопиранозидом - через 1 час) в ходе культивирования позволяют сохранить значительную часть плазмидсодержащих клеток в популяции. Выращивание продуцента на солевой среде М9 с добавлением глюкозы (до 1 %), гидролизата казеина (до 1 %) и дрожжевого экстракта (до 0,5 %) позволяет увеличить выход рекомбинантного белка до 30 % относительно других клеточных белков (содержание белка определяли сканированием дорожек электрофоретического геля с последующим их анализом с помощью разработанной нами программы “Densitometer”). На основе штама E. coli BL21(DE3)Gold сконструирована система для конститутивной экспрессии рекомбинантного ХОФ, преимуществом которой является простота ферментации и низкая себестоимость процесса культивирования штамма-продуцента. Показано, что очищенный рекомбинантный белок взаимодействует с фибриногеном, связывается с антителами к ХОФ.

На основе рекомбинантного ХОФ разработан метод твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА) для определения анти-ХОФ-антител в сыворотке крови людей. В ходе разработке ТИФА исследовали сорбционные свойства полистироловых планшетов, определяли сорбционную концентрацию рекомбинантного белка, состав растворов для разведения сывороток и конъюгата, оптимальный для уменьшения неспецифического связывания - наличие в них детергента, белков лизата клеток E. coli, содержание бычьего сывороточного альбумина.

Исследован гуморальный иммунный ответ на ХОФ у больных гнойной инфекцией кости, верхних дыхательных путей и здоровых людей разных возрастных категорий (взрослых - 20_50 лет, детей - 8_16 лет). Установлено, что анти-ХОФ-антитела обнаруживаются в сыворотках здоровых и больных людей в 100 % случаев, при этом титры антител к ХОФ в сыворотках крови больных независимо от нозологической формы заболевания достоверно выше, чем у здоровых доноров. При гнойной стафилококковой инфекции происходит значительное увеличение уровня антител к ХОФ, при этом показано, что титр антител у больных гнойной инфекцией кости достоверно выше, чем у больных гайморитом, что указывает на возможное существование зависимости между уровнем гуморального иммунного ответа на ХОФ и локализацией инфекции. Различия уровня и частоты обнаружения анти-ХОФ-антител у здоровых доноров не выявлены.

Показано, что обнаружение антител к ХОФ S. aureus в сыворотке крови имеет диагностическое и прогностическое значение, что определяет использование ХОФ в ТИФА для диагностики инфекций стафилококковой этиологии. Диагноз, поставленный на основе определения антител к ХОФ, совпадает с клиническим, микробиологическим и серологическим диагнозами. Минимальным диагностическим титром анти-ХОФ-антител, указывающим на стафилококковую этиологию при костной локализации, является титр 1 : 800, при гайморитах - 1 : 400. Титры антител, превышающие 1 : 800, характерны только для больных стафилококковой инфекцией и могут служить надежным диагностическим критерием при подтверждении данной этиологии заболевания.

Исследование аффинности антител к ХОФ золотистого стафилококка у больных костно-гнойной инфекцией показало, что для здоровых доноров характерно присутствие в сыворотке высоко- и низкоаффинных антител к ХОФ с широким диапазоном значений константы связывания (от 10^-7 до 10^-10 М). У больных стафилококковой инфекцией сывороточные антитела высокоаффинные с достоверно высшими по сравнению со здоровыми людьми значениями константы диссоциации. Зависимости между титрами анти-ПлФ-антител и их аффинностью не обнаружено.

Использование ХОФ S. aureus в ИФА дает возможность осуществлять диагностику гнойной стафилококковой инфекции путем определения титров анти-ХОФ-антител в сыворотке крови. Разработанная на основе рекомбинантного ХОФ экспериментальная модель системы ТИФА внедрена в работу лаборатории микробиологии и химиотерапии института травматологии и ортопедии АМН Украины и используется в рамках комплексного клинико-лабораторного исследования для повышения точности этиологической диагностики стафилококковых инфекций.

Ключевые слова: хлопьеобразующий фактор, стафилококк, стафилококковая инфекция, диагностика, твердофазный иммуноферментный анализ, антитело, аффинность.

Annotation

Ivanova V.D. The utilization of the clumping factor of Staphylococcus aureus for diagnostics of the staphylococcal etiology of infections.

Thesis for a scientific degree of candidate of biological sciences by speciality 03.00.09 - immunology. - Kyiv National Taras Shevchenko University, Kyiv, 2003.

The thesis deals with antibody immune response against the clumping factor (Clf) in patients with different staphylococcal infections and its diagnostic value. Experiments for optimization of the clfA gene expression in E. coli XLI-Blue cells were carried out. The bacterial strain constitutively producing recombinant Clf has been constructed on the basis of E. coli BL21(DE3)Gold recipient strain. The advantage of this expression system is its fermentation simplicity and cost-effectiveness.

The serum anti-Clf-antibody levels, their specificity and affinity to Clf in patients with staphylococcal antritis, osteopurulent infection and in healthy individuals, adults (20 to 50 years old) and children (8 to 16 years old), were studied by immunoensyme assay (ELISA). Antibody levels against Clf and antibody affinity were shown to be increased during the disease; they were considerably higher in patients with staphylococcal infection comparing to healthy persons. Diagnostic and prognostic values of serum anti-Clf-antibodies detection and possibility of the given antigen use for the diagnostics of the staphylococcal infections were demonstrated. The ELISA test-system aimed for the detection of Clf-specific antibodies was designed using recombinant Clf. The system was applied at Laboratory of Microbiology and Chemotherapy of Institute of Traumatology and Orthopedics (Academy of Medicine Sciences of Ukraine, Kyiv, Ukraine).

Key words: clumping factor, Staphylococcus aureus, staphylococcal infection, diagnostics, immunoensyme assay (ELISA), antibody, affinity.

1. Загальна характеристика роботи

стафілококовий інфекція рекомбінантний антитіло імунний

Актуальність теми. Протягом останніх десятиріч проблема захворювань, викликаних золотистим стафілококом, залишається однією з найбільш актуальних у зв'язку з їх широким розповсюдженням, можливістю розвитку важких ускладнень, відсутністю надійних засобів діагностики та профілактики.

На сьогодні лабораторна діагностика стафілококової інфекції передбачає комплексне дослідження з використанням мікробіологічних та серологічних методів (Бидненко и др., 1993), проте встановлення з його допомогою етіологічного діагнозу в багатьох випадках є доволі складним та мало ефективним. Серед лабораторних методів серодіагностики основними залишаються ті, що спрямовані на визначення антитіл до соматичного видоспецифічного антигену стафілокока, -токсину, ліпази, пептидоглікану, тейхоєвих кислот (Дерябин и др., 1988, Christensson et al., 1985, Nagel et al., 1975), але здебільшого вони є або низькочутливими, або низькоспецифічними (Дерябин и др., 1988) і, головне, недоступними для широкого використання з причини відсутності комерційних тест-наборів. Пошук діагностичних засобів спрямований на виявлення поверхневих видоспецифічних антигенів цих бактерій, одним з яких є пластівцевоутворюючий фактор.

Пластівцевоутворюючий фактор (ПлФ) - компонент клітинної стінки Staphylococcus aureus і один з факторів їх потенційної патогенності (McDevitt et al., 1994), що забезпечує адгезію бактерій до вкритих фібриногеном поверхонь (Vaudaux et al., 1989, 1995), згустків крові та пошкоджених клітин ендотелію (Moreillon et al., 1995), обумовлюючи розвиток інфекції. При зв`язуванні ПлФ з розчинним фібриногеном відбувається агрегація клітин стафілококів, що забезпечує маскування їх поверхневих антигенів і перешкоджає опсонізації та ефективному фагоцитозу клітин (Hasche et al., 1975).

Видоспецифічність, поверхневе розташування та виражені антигенні властивості дозволяють розглядати ПлФ як можливий діагностичний маркер стафілококової інфекції. З іншого боку, участь зв`язаного з клітинною стінкою ПлФ в ініціюванні інфекції та здатність очищеного білка блокувати адгезію стафілококів до поверхонь, вкритих фібриногеном (наприклад, медичних імплантатів), зумовлюють можливість його використання у складі протистафілококових вакцин.

ПлФ виділено та очищено, визначено його структуру та фізико-хімічні властивості, клоновано гени, які його кодують. Білок детально охарактеризовано на молекулярному рівні, його можлива роль у патогенезі стафілококової інфекції вивчається за допомогою сайт-специфічних мутацій в умовах in vivo та in vitro на моделях інфекції та адгезії. У цей же час значення ПлФ для індукції імунних реакцій (особливо гуморальної ланки) практично не досліджувалось, одержані дані виявились достатньо суперечливими й не дозволяють скласти чіткого уявлення про роль даного антигену в патогенезі стафілококової інфекції та в антистафілококовому імунітеті.

Вивчення закономірностей імунної відповіді на ПлФ, зокрема, динаміки і рівня гуморальної її ланки, дозволить, з одного боку, оцінити дану субстанцію як можливий компонент вакцинних препаратів, а з іншого - з'ясувати можливість використання білка з діагностичною метою, що у подальшому сприятиме створенню нових високоспецифічних систем для діагностики стафілококової інфекції. Вирішенню останнього питання присвячено дану роботу.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано в межах планової науково-дослідної розробки кафедри мікробіології та загальної імунології Київського національного університету імені Тараса Шевченка “Закономірності формування імунної відповіді на біополімери бактеріального походження” (№ держреєстрації 0101u001570).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було дослідження гуморальної імунної відповіді на пластівцевоутворюючий фактор у хворих на стафілококову інфекцію та визначення цінності цього антигену для діагностики інфекцій даної етіології.

Для реалізації вказаної мети вирішували такі завдання:

Експресувати, виділити та очистити рекомбінантний ПлФ, дослідити його імунобіологічні властивості.

Дослідити вплив умов культивування на вихід рекомбінантного білка та визначити заходи для підвищення рівня його експресії у клітинах Escherichia coli.

Розробити на основі твердофазного імуноферментного аналізу (ТІФА) метод виявлення антитіл до ПлФ у сироватці крові людини.

Вивчити гуморальну імунну відповідь на ПлФ S. aureus, зокрема рівень, частоту виявлення та афінність антитіл, специфічних до ПлФ, у хворих на стафілококову інфекцію різної локалізації, провести порівняльний аналіз вказаних показників хворих та здорових людей.

З`ясувати можливість застосування ПлФ у комплексній діагностиці стафілококових захворювань.

Об`єкт дослідження: рекомбінантний ПлФ, експресійна система клітин E. coli, специфічні до ПлФ антитіла, сироватка хворих на стафілококову інфекцію та здорових людей.

Предмет дослідження: ефективність експресії ПлФ у клітинах E. coli різних штамів, рівень гуморальної імунної відповіді на ПлФ, діагностичне значення рівнів анти-ПлФ-антитіл за стафілококової інфекції.

Методи дослідження: імунохімічні, імунологічні, мікробіологічні, біохімічні, молекулярно-генетичні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано діагностичне значення виявлення сироваткових анти-ПлФ-антитіл у хворих на стафілококову інфекцію та розроблено ТІФА на основі рекомбінантного ПлФ для підвищення точності діагностики захворювань, викликаних S. aureus.

Оптимізовано експресію гена clfA S. aureus, що кодує ПлФ, у клітинах E. coli XLI-Blue, запропоновано засоби, що дозволяють істотно збільшити вихід рекомбінантного білка. На основі штамів-реципієнтів E. coli M15 та BL21(DE3)Gold сконструйовано системи для індуцибельної та конститутивної експресії рекомбінантного ПлФ. Перевагою останньої є простота ферментації та низька собівартість процесу культивування штаму-продуцента.

Вперше досліджено рівень гуморальної імунної вiдповiдi на ПлФ під час гнійної стафілококової інфекції та зв`язок між титром анти-ПлФ-антитіл та їх афінністю. Встановлено, що антитіла до ПлФ виявляються в сироватках здорових та хворих людей, при цьому їх титри у хворих вірогідно вищі.

Вперше визначено значення константи дисоціації сироваткових анти-ПлФ-антитіл хворих і здорових людей, доведено, що при стафілококовій інфекції відбувається утворення високоафінних антитіл, спорідненість яких до ПлФ вірогідно вища за таку більшості здорових донорів.

Результати проведених досліджень значно розширюють i доповнюють сучасні уявлення про iмунобiологiчну активність пластівцевоутворюючого фактора S. aureus.

Практичне значення одержаних результатів. Показано, що при стафілококовій інфекції відбувається зміна показників гуморальної імунної відповіді на ПлФ, що мають діагностичне та прогностичне значення. В експериментальних дослідженнях доведено доцільність використання рекомбінантного антигену в комплексній діагностиці стафілококової інфекції. Оптимізовано процес одержання рекомбінантного антигену ПлФ, розроблено ТІФА для визначення антитіл до ПлФ, що дозволяє ефективно реалізувати завдання серологічної діагностики стафілококової інфекції.

Розроблена на основі рекомбінантного ПлФ експериментальна модель системи ТІФА для виявлення сироваткових анти-ПлФ-антитіл впроваджена в роботу лабораторії мікробіології та хіміотерапії інституту травматології та ортопедії АМН України і використовується в межах комплексного клініко-лабораторного дослідження для підвищення точності етіологічної діагностики стафілококових захворювань.

Матеріали роботи використовуються в навчальному процесі кафедри мiкробiологiї та загальної імунології Київського університету імені Тараса Шевченка (при викладанні спецкурсів “Імунобіотехнологія”, “Біологічні основи інфекційних процесів”).

Особистий внесок здобувача. Автором особисто здійснені підбір та аналіз даних літератури, обґрунтовані адекватні методи досліджень, сплановані і виконані експериментальні дослідження, проведений аналіз експериментального первинного матеріалу, статистична його обробка, сформульовані положення та висновки роботи. Аналіз та обговорення проведено спільно з науковим керівником.

Лабораторні дослідження з діагностики кістково-гнійної стафілококової інфекції проведено автором на базі інституту травматології та ортопедії АМН України (зав. лабораторії, д.м.н. Бідненко С.І.), з діагностики інфекції верхніх дихальних шляхів - спільно із співробітником Київської академії післядипломної освіти імені П.Л. Шупика, к.м.н. Марушко Т.В.

Дослідження з оптимізації експресії рекомбінантного ПлФ, розробки ТІФА для визначення анти-ПлФ-антитіл виконано автором особисто на базі наукового відділу АТЗТ НВК “Діапроф Мед” (зав. відділу к.б.н. Пилипенко В.Г., зав. лаб., к.б.н. Раєвська Г.Є.).

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи було представлено та обговорено на конференції-конкурсі молодих вчених Інституту біохімії імені О.В. Палладіна НАН України “Актуальні проблеми фундаментальної та прикладної біохімії” (Київ, 2001 р.), на міжнародній конференції для студентів, аспірантів та молодих вчених з молекулярної біології та генетики (Київ, 2001 р.), на VIII з`їзді українського біохімічного товариства (Чернівці, 2002 р.), на науковій конференції біологічного факультету Київського університету імені Тараса Шевченка, присвяченій “Дню Університету” (Київ, 2002 р.).

Публікації. Основний зміст дисертаційної роботи викладено у 9 наукових працях, серед яких 6 статей у провідних фахових виданнях, тезах 3 вітчизняних та міжнародних конференцій та з`їздів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 175 сторінках машинописного тексту. Вона складається з вступу, огляду літератури (1 розділ, 6 підрозділів), експериментальної частини (5 розділів), що містить виклад матеріалів та основних методів досліджень (1 розділ, 15 підрозділів), чотири розділи власних досліджень та їх обговорення (9 підрозділів), заключення, висновків, списку використаних джерел (226 посилань), 4 додатків. Роботу ілюстровано 28 рисунками та 7 таблицями.

2. Основний зміст роботи

Огляд літератури. В огляді літератури розглянуто фізико-хімічні властивості, молекулярну організацію, функціональну активність ПлФ, регуляцію його експресії у клітинах, вплив на імунну систему та роль у патогенезі стафілококової інфекції.

Матеріали і методи досліджень. У дослідженнях як антигени використані:

1) рекомбінантний ПлФ S. aureus, синтезований у клітинах E. coli, що відповідає нативному ПлФ і містить його повний лігандзв`язуючий домен (221_559 амінокислотні залишки), а також фрагмент з 6 залишків гістидину на N-кінці,

2) рекомбінантний білок А (БА) S. aureus м. м. 40 кДа, синтезований у клітинах E. coli (штам SpA-1) („ДіаПроф Мед”, Україна).

Штам-продуцент, отриманий на основі реципієнта E. coli XLI-Blue (supE44, hsdR17, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1, lac [F,' proAB⁺, lacI^q, lacZM15, Tn10 (tet^r)]), люб`язно наданий проф. Т. Фостером (Дублін, Ірландія). Він містить плазміду pCF41, в якій під контролем промотору фага Т5 та подвійного модуля операторів лактозного оперона міститься ген, що кодує фрагмент ПлФ (O'Connell et al., 1998). Генетичним маркером плазміди pCF41 є ген bla (-лактамази), що забезпечує стійкість трансформованих клітин до ампіциліну. Реципієнтні штами E. coli - M15 (nal^s str^s rif^s lac- ara⁺ gal⁺ mtl^_ F'-, recA⁺, uvr⁺ lon⁺), що містить плазміду-репресор pREP4 (“Qiagen”), та BL21(DE3)Gold (F^- dcm ompT hsdS(rb^- mb^-) gal EndA (DE3)) використані для трансформації плазмідою pCF41 та експресії рекомбінантного білка, XLI-Blue - для отримання білків лізату клітин E. coli. Виділення плазміди здійснювали за методом (Kado, Liu, 1981), трансформацію проводили за стандартною схемою (Chung et al., 1989).

Ферментацію продуцента E.coli XLI-Blue (pCF41) проводили на середовищах LB, 2YT та М9 з додаванням гідролізату казеїну (до 1 %), дріжджового екстракту (до 0,5 %) і глюкози (до 1 %), продуцентів на основі E. coli M15, BL21(DE3)Gold - на середовищі LB. У всі середовища додавали ампіцилін (200 мкг/мл), а при вирощуванні продуцента на основі штаму М15 додатково - канаміцин (25 мкг/мл). Для індукції синтезу рекомбінантного білка додавали ізопропілтіо--D-галактозид (ІПТГ, “Pharmacia”, Швеція) до концентрації 0,5 мM.

З метою оцінки виживання клітин, які містять плазміду (Ap^r), та динаміки росту культури визначали співвідношення між оптичною густиною (ОГ₆₀₀) суспензії та кількістю колонієутворюючих одиниць (КУО) в одиниці об`єму. Для цього по 0,1 мл розведених фізіологічним розчином клітинних суспензій (10^-1_10^-7) висівали на агаризоване поживне середовище (LB з 2 % бактоагару) з додаванням антибіотика або без нього. Долю Ap^r_клітин визначали поділом кількості клітин, що виросли на селективному середовищі, на кількість клітин, які виросли на середовищі без антибіотика. Концентрацію КУО в нерозведеній суспензії визначали як сумарну кількість всіх підрахованих колоній за кожного розведення суспензії (Kaplan et al., 1975). З метою одержання кривих росту штаму-продуцента через кожну годину від початку культивування вимірювали ОГ₆₀₀ на спектрофотометрі “Ultrospec 2000”.

Рекомбінантний білок очищували на колонці з IDA-сефарозою-6В, зарядженій Ni²⁺. Для елюції білка застосовували ступінчастий градієнт імідазолу (5_300 мM). Концентрацію білків визначали біуретовим методом (Досон и др., 1991), вміст синтезованих у клітині білків - скануванням електрофоретичного гелю та аналізом його доріжок за допомогою розробленої нами комп`ютерної програми “Densitometer”. Аналіз бактеріальних білків та контроль чистоти препарату рекомбінантного білка проводили електрофоретично (Laemmli, 1970), специфічність визначали методом імуноблотингу (Towbin et al., 1979), використовуючи поліклональні афінноочищені антитіла до ПлФ кроля, люб`язно надані проф. Т.Фостером (Дублін, Ірландія).

Експериментальні дослідження проведені на сироватках крові хворих на кістково-гнійну інфекцію (69 зразків, що отримані з інституту травматології та ортопедії АМН України) віком 20-50 років, дітей віком 8-16 років із стафілококовою інфекцією верхніх дихальних шляхів (26 зразків - з дитячої клінічної лікарні № 5 м. Києва) та клінічно здорових дітей, що проходили обстеження у плановому порядку (32 зразки, що отримані з дитячої клінічної лікарні № 1 м. Києва), здорових донорів віком 20-50 років (74 зразки, що отримані зі станції переливання крові). Сироватки 8 хворих на остеомієліт досліджено в динаміці інфекційного процесу. Хворих обстежували в перші дні госпіталізації, для дослідження сироваток у період реконвалесценції кров у пацієнтів брали через 15-30 днів після госпіталізації у клініку.

Стафілококова етіологія захворювання встановлювалась на основі клінічних спостережень, даних анамнезу i підтверджувалась за допомогою мікробіологічних та/або серологічних досліджень. Мікробіологічні дослідження проводили за діючими методиками (Приказ № 535 МЗ СССР, 1985). Серологічні дослідження включали вивчення сироваток у реакції аглютинації (РА) з живою та грітою культурами ізольованих від хворих мікроорганізмів та в реакції пасивної гемаглютинації (РПГА) з видоспецифічним антигеном S. aureus виробництва НДІ епідеміології, мікробіології та інфекційних хвороб МОЗ Казахстану (Дерябин и др., 1988). За діагностичний титр антитіл у РА для S. aureus приймали наявність аглютинації у розведенні сироватки хворого не нижче за 1 : 640, Pseudomonas aeruginоsa - 1 : 160, бактерій роду Proteus - 1 : 80 і більше. Діагностичним титром РПГА вважали - 1 : 6400 та вище. Антитіла до Streptococcus pyogenes групи А визначали за рівнем АСЛ-О в сироватках крові з комерційним препаратом стрептолізину виробництва Ленінградського НДІ вакцин і сироваток (Росія) або методом латекс-аглютинації за допомогою діагностичного тест-набору виробництва ТОВ “Ольвекс Діагностикум” (Росія). За діагностичний рівень АСЛ-О приймали розведення 1:250 МО/мл (міжнародних одиниць в 1 мл) і вище.

Визначення С-реактивного білка як показника гострої фази запалення, в сироватці крові проводили за допомогою реакції преципітації у капілярі з використанням діагностичної антисироватки до С-реактивного білка виробництва Санкт-Петербурзького НДІ вакцин і сироваток (Росія) або методом латекс-аглютинації з діагностичним тест-набором виробництва ТОВ “Ольвекс Діагностикум” (Росія).

Титри антитіл класу G до ПлФ у сироватці крові визначали за допомогою ТІФА (Engvall, 1971), який проводили на полістиролових планшетах Polysorp, MaxiSorp виробництва фірми “Nunc” (Данія). Лунки планшету сенсибілізували розчином рекомбінантного білка в 0,05 М карбонат-бікарбонатному буфері протягом 16_18 годин при 4 ⁰С. Досліджувані сироватки розводили від 1 : 25 до 1 : 12800 та інкубували 60 хв при 37 ⁰С. Ставили контролі на неспецифічну сорбцію: контроль сироватки (лунки не сенсибілізували антигеном), контроль кон`югату (не вносили сироватку). Антитіла виявляли за допомогою кон`югатів білка А S. aureus або моноклональних анти-IgG-антитіл людини з пероксидазою хрону (“Sigma”, США, “ДіаПроф Мед”, Україна). Значення оптичної густини (ОГ) вимірювали на спектрофотометрі “Multiscan MS” (“Labsystems”, Фінляндія) за основної довжини хвилі 492 нм та від`ємної - 620 нм. Для обліку реакції визначали титр антитіл, яким вважали розведення сироватки, за якого ОГ перевищувала суму значень двох контролів.

Наявність перехресної взаємодії анти-ПлФ-антитіл сироватки хворих на кістково-гнійну стафілококову інфекцію з іншим поверхневим адгезином S.aureus - білком А (БА) визначали за допомогою конкурентного ТІФА. Різні розведення антигенів - ПлФ та БА (від 10 до 0,012 мкг/мл) та розчин для розведення сироватки без антигену (контроль) змішували з сироваткою хворого, розведеною 1 : 50, та інкубували протягом 40 хв при 37 ⁰С. Після інкубації кожен зразок вносили в лунки планшету, сенсибілізованого ПлФ, - кількість антитіл, що не зв`язуються з вільним антигеном, визначали за допомогою непрямого ТІФА, як описано вище. Антитіла виявляли за допомогою кон`югату моноклональних анти-IgG-антитіл людини з пероксидазою хрону (“Sigma”, США).

Визначення фібриногензв`язуючої активності ПлФ проводили за допомогою ТІФА (Engvall, 1971) з використанням фібриногену (люб`язно наданого відділом молекулярної імунології Інституту біохімії імені О.В. Палладіна НАН України), поліклональних антитіл кроля до ПлФ. Здатність рекомбінантних білків - БА та ПлФ - неспецифічно взаємодіяти з IgG людини визначали методом конкурентного ІФА. Планшети MaxiSorp (“Nunc”, Данія) сенсибілізували розчином очищених IgG людини (в концентрації 10 мкг/мл). Препарати рекомбінантних білків титрували п`ятикратно, починаючи з концентрації 100 мкг/мл. У лунки планшету вносили по 100 мкл кожного розведення антигену на 0,02 М фосфатному буфері з 0,15 М NaCl, 5 % бичачого сироваткового альбуміну та 0,05 % Твіну-20 або вказаний розчин без антигену (контроль кон`югату). Планшети інкубували протягом 60 хв при 37 ⁰С, відмивали, додавали розчин кон`югату білка А з пероксидазою хрону. Далі всі операції проводили, як описано вище.

Константу дисоціації (Kd) сироваткових анти-ПлФ-антитіл визначали методом інгібіції (Friguet et al., 1985) у модифікації (Kim et al., 1990).

Статистичну обробку результатів проводили згідно рекомендацій Т.Сайдулдіна (1981), Монцевічуте-Ерінгене (1964) з використанням t-критерію Стьюдента за допомогою комп`ютерної програми Statgraphics 2.6.

Експресія рекомбінантного пластівцевоутворюючого фактора у клітинах E. coli та його імунохімічні властивості. Нами виявлено, що генно-інженерна конструкція, яка забезпечує експресію рекомбінантного ПлФ, є недостатньо стабільною, тому перед отриманням біомаси слід попередньо проводити відбір клонів штаму з найбільш вираженою здатністю до продукції рекомбінантного білка (18_20 % всіх білків клітини). Встановлено, що нестабільність експресії не пов'язана з базальним синтезом рекомбінантного ПлФ, оскільки на електрофореграмі зразків культур, відібраних до індукції синтезу білка ІПТГ, відсутні смуги, які відповідають цьому білку. В результаті дослідження вмісту антибіотикорезистентних клітин у популяції, з`ясовано, що у процесі культивування відбувається швидка елімінація плазміди з клітин, яка є основною причиною зниження рівня продуктивності штаму.

Визначено, що однократне додавання антибіотика (100 мкг/мл) на початку ферментації, як це прийнято, недостатнє для забезпечення істотного переважання в популяції продуктивних клітин, які містять плазміду (Ap^r). Розроблено оптимальну схему внесення ампіциліну у процесі культивування (200 мкг/мл на початку та через кожні 2 години культивування, а після індукції ІПТГ - через 1 годину), у разі застосування якої зменшення накопичення безплазмідних клітин не позначається на швидкості приросту біомаси.

З метою підбору оптимального середовища культивування продуцента (яке, з одного боку, дозволяло б отримувати найбільшу щільність культури у процесі вирощування, а з іншого - більш ефективний біосинтез продукту) випробувано середовища LB, 2YT та М9 із додаванням гідролізату казеїну до 1 %, дріжджового екстракту до 0,5 % і глюкози до 1 % (М9+ГК+ДЕ+Гл). Найбільший вихід біомаси спостерігається за використання середовища 2YT, проте, максимальний біосинтез рекомбінантного ПлФ має місце у разі вирощування E. coli на середовищі М9+ГК+ДЕ+Гл протягом 4 годин після індукції ІПТГ. При цьому вміст білка за даними денситометрії складає 30 % всіх клітинних білків, тоді як на середовищах LB та 2YT - лише 18 % і 23 % відповідно.

З метою спрощення схеми одержання рекомбінантного ПлФ та зниження його собівартості нами апробовано експресійні системи двох штамів-реципієнтів E. coli - M15, що є суперпродуцентом репресора lac-оперона, та BL21(DE3)Gold, в якого синтез репресора не відбувається. Штам-продуцент М15 (pCF41) є достатньо стабільним при культивуванні, проте експресія рекомбінантного ПлФ у його клітинах є менш ефективною порівняно з системою XLI-Blue: вміст ПлФ у клітинах цього продуцента на 4 годину після індукції ІПТГ складає 13,8 % всіх клітинних білків, тоді як у клітинах XLI-Blue (pCF41) - 18 %.

Після трансформації клітин-реципієнтів BL21(DE3)Gold одержано клони трансформантів, які конститутивно синтезують рекомбінантний ПлФ. При аналізі електрофореграм встановлено, що рівень рекомбінантного білка у клітинах продуцента BL21(DE3)Gold (pCF41) складає 20 % всіх клітинних білків, а отже, порівняний з аналогічною величиною, отриманою в системі XLI-Blue за індукції ІПТГ, і перевищує таку, отриману в системі М15. Отже, сконструйована система для конститутивної експресії рекомбінантного ПлФ, є технологічнішою (а процес ферментації - простішим, зручнішим та - за рахунок відмови від ІПТГ, що є дорогим препаратом, - економічно вигіднішим), що визначає її пріоритетне використання для одержання рекомбінантного ПлФ у значній кількості.

За допомогою імуноблотингу зі специфічними до ПлФ антитілами кроля встановлено, що у клітинах E. coli рекомбінантний білок знаходиться в розчинній формі (22% всіх білків клітини) і частково у вигляді тілець включення (8 % всіх білків клітини). Білок очищено на колонці з ІDA-сефарозою-6В з високим виходом (78-80 %). Він виходив трьома піками при концентраціях імідазолу в буфері для елюції 80, 90, 300 мМ. Препарат білка має достатньо високу ступінь чистоти. За допомогою імуноблотингу показано специфічність очищеного препарату рекомбінантного ПлФ, за допомогою ТІФА встановлено, що білок взаємодіє з фібриногеном, а отже відповідає нативному ПлФ S. aureus. За допомогою конкурентного ТІФА, в якому антигеном слугували очищені IgG людини, визначено, що препарат рекомбінантного білка А (БА) блокує зв`язування пероксидазного кон`югату БА з IgG людини, тоді як ПлФ не впливає на цю взаємодію, оскільки нездатен неспецифічно взаємодіяти з IgG людини. Одержані результати узгоджуються з даними літератури щодо функціональної активності вказаних білків S. aureus і виключають можливість тотожності наявних у нас препаратів рекомбінантних білків.

Нами перевірено можливість існування неспецифічної перехресної взаємодії сироваткових анти-ПлФ-антитіл хворих на стафілококову інфекцію з іншим поверхневим антигеном S. aureus - БА. За допомогою конкурентного ТІФА встановлено, що мінімальна концентрація вільного ПлФ, що блокує зв`язування анти-ПлФ-антитіл з іммобілізованим на полістиролі ПлФ, складає 0,012 мкг/мл. Інкубація з сироваткою хворих на стафілококову інфекцію вільного БА (у концентраціях від 100 мкг/мл до 2 нг/мл) не призводить до зменшення сигналів ОГ у ТІФА для виявлення анти-ПлФ-антитіл. Отже, БА не здатен конкурувати з ПлФ за зв`язування з анти-ПлФ-антитілами класу G, що є доказом відсутності перехресної взаємодії вказаних антитіл з цим поверхневим адгезином S. aureus.

В імуноблотингу показано, що рекомбінантний ПлФ специфічно взаємодіє з сироватковими антитілами людей до нативного ПлФ S. aureus, а отже, може бути використаний у складі імуносорбенту в ТІФА для виявлення специфічних до нього антитіл у сироватці крові.

Розробка ТІФА для виявлення антитіл до пластівцевоутворюючого фактора S. aureus. При розробці ТІФА для виявлення антитіл, специфічних до ПлФ, досліджували сорбційні властивості полістиролових носіїв, визначали оптимальну сорбційну концентрацію рекомбінантного антигену, склад розчинів для розведення сироваток і кон`югату.

Порівняльний аналіз сорбційних властивостей планшетів MaxiSorp та PolySorp (“Nunc”) показав, що в ТІФА для виявлення анти-ПлФ-антитіл як тверду фазу доцільно використовувати планшети MaxiSorp, які характеризуються високою сорбційною ємністю. Встановлено, що при використанні планшетів PolySorp значення оптичної густини сироваток у ТІФА знижуються в середньому в 5 разів, що є істотним для даного методу аналізу і робить неможливим подальше використання носіїв цього типу (рис.1). Оптимальною сорбційною концентрацією ПлФ визначено 2 мкг/мл за співвідношенням оптичної густини досліджуваних зразків сироваток хворих на стафілококову інфекцію до граничного значення ОГ у системі - суми середнього значення ОГ сироваток здорових людей (ОГ_зд) та двох середньоквадратичних відхилень (2).

З метою зменшення неспецифічного зв`язування в системі визначали вміст бичачого сироваткового альбуміну (БСА), білків лізату E. coli, детергенту у складі розчинів для розведення сироваток та кон`югату. Збільшення сигналу оптичної густини сироваток хворих на стафілококову інфекцію та співвідношення середнього значення оптичної густини сироваток хворих (ОГ_хв) до середнього значення оптичної густини сироваток здорових людей (ОГ_зд) (ОГ_хв / ОГ_зд) одержане за додавання у вказані розчини твіну-20, тому саме цей детергент використовували у подальшій роботі.

Визначали оптимальну для блокування вільних місць зв`язування носія концентрацію БСА у вказаних розчинах та доцільність введення до їх складу білків лізату E. coli у концентрації 1 мг/мл. Останні, за даними літератури (Каральник и др, 1991), перешкоджають взаємодії антигенів E. coli, що в невеликих кількостях містяться у препаратах рекомбінантних білків, з антитілами до них, що наявні в сироватці крові людей. Результати дослідження показали (рис. 2), що додавання в розчини для розведення кон`югату та сироваток білків лізату E. coli (1 мг/мл) сприяє збільшенню співвідношення ОГ_хв / ОГ_зд, а найоптимальнішим є використання розчинів, що одночасно з білками лізату E. coli містять БСА в концентрації 1,7 мг/мл.

Антитіла до пластівцевоутворюючого фактора у хворих на гнійну стафілококову інфекцію та діагностичне значення їх виявлення в сироватці крові людей. За результатами комплексного обстеження хворих на кістково-гнійну інфекцію розподілено на три групи: першу склали хворі на остеомієліт стафілококової етіології (31 чоловік), другу - особи (10 чоловік) з інфекцією, викликаною асоціацією S. aureus та грамнегативних мікроорганізмів (E. coli, P. aeruginosa, Proteus mirabilis), третю - пацієнти, в яких гнійний процес викликаний мікроорганізмами виду S. pyogenes та S. aureus (28 чоловік). У 8 (25,8 %) хворих І групи з досліджуваного матеріалу виділено S. aureus у монокультурі й підтверджено етіологічну роль цих бактерій серологічно в РА з аутокультурою та в РПГА з видоспецифічним антигеном S. aureus. У 23 (74,2 %) хворих І групи збудників гнійно-запальних процесів не виділено, а стафілококову етіологію захворювання доведено виявленням у сироватках крові високих діагностичних титрів (1:12800 та 1:25600) антистафілококових антитіл в РПГА. Етіологічну роль стафілокока у всіх хворих ІІ групи підтверджено за допомогою комплексу мікробіологічних та серологічних досліджень. У 10 (35,7 %) хворих ІІІ групи етіологічний діагноз встановлено за результатами мікробіологічних та серологічних досліджень, у 18 (64,3 %) хворих, від яких культуру S. aureus та S. pyogenes не виділено, етіологічну роль збудників доведено відповідно в РПГА та за допомогою реакції нейтралізації АСЛ-О. В сироватці всіх 28 (100 %) хворих цієї групи виявлено високий рівень антистрептолізину-О, що перевищує 625 МО/мл.

Результати дослідження методом ІФА показали, що IgG-антитіла до ПлФ золотистого стафілокока виявляються у сироватці крові всіх здорових донорів. При цьому їх титри варіюють, а максимальний та мінімальний титри складають відповідно 1 : 50 (8 % осіб) і 1 : 800 (9,5 % осіб) (табл. 1). При визначені в ТІФА рівнів анти-ПлФ-антитіл у здорових людей різних вікових категорій (дорослих - 20-50 років, дітей - 8-16 років) залежності зміни досліджуваного показника від віку не зафіксовано. Вірогідної різниці між значенням середніх титрів антитіл до ПлФ у групах здорових дітей та здорових дорослих немає (табл. 1).

Ми вважаємо, що головною причиною наявності антитіл до ПлФ у сироватці здорових людей є природна імунізація організму цим антигеном внаслідок носійства бактерій, проте високі титри антитіл (1 : 800) можуть бути й наслідком нещодавно перенесеної інфекції, адже встановлено (Colque-Navarro et al., 2000), що рівень анти-ПлФ-антитіл у сироватці пацієнтів, що одужують, вищий, ніж під час гострої фази інфекції.

У групі хворих на остеомієліт також спостерігається значне коливання титрів антитіл до ПлФ, проте максимальним титром, що виявляється у 3 % хворих І, 3,6 % - ІІІ та 10 % - ІІ груп, є 1 : 6400, а мінімальним - титр 1 : 400, який виявлено у 39 % хворих І, 30 % - ІІ та 18 % - ІІІ груп. Встановлено, що титри анти-ПлФ-антитіл у хворих на кістково-гнійну інфекцію вірогідно вищі (р 0,01) за такі здорових осіб (табл. 1).

При дослідженні рівня анти-ПлФ-антитіл у хворих на остеомієліт у динаміці інфекційного процесу виявлено протилежні тенденції зміни показника: в частини пацієнтів (50 %) титри антитіл у період одужання знижуються порівняно з гострою фазою інфекції, у решти - титр анти-ПлФ-антитіл зростає (25 %) або залишається на незмінному рівні (25 %). Зафіксовані нами зміни рівня антитіл до ПлФ збігаються з результатами проведених мікробіологічних та серологічних досліджень, які мають обґрунтовану інформативність у прогнозуванні наслідків інфекційного запалення, отже, можна говорити про прогностичне значення виявлення анти-ПлФ-антитіл у сироватці крові й доцільність повторного визначення показника у хворих з інтервалом в 3-4 тижні.

З метою з`ясування інформативності ТІФА з виявлення антитіл до ПлФ S. aureus для діагностики стафілококової інфекції у дітей досліджено сироватки 26 хворих на гнійний гайморит. Встановлено, що максимальний та мінімальний титри у групі хворих дітей складають відповідно 1 : 200 і 1 : 1600, при цьому середнє значення титру в них (1 : 400) вірогідно вище (p < 0,01), ніж у здорових дітей (1 : 245) (табл. 2). Виявлення в частини хворих дітей антитіл у низькому титрі (1 : 200) може свідчити про початкову стадію інфекції, наявність асоційованої стафілококової інфекції або пов`язане з індивідуальними особливостями організму.

Порівняння титрів анти-ПлФ-антитіл у хворих на кістково-гнійну інфекцію та інфекцію верхніх дихальних шляхів показало, що середній титр антитіл у хворих на остеомієліт (1 : 1055) є вірогідно вищим (p < 0,01), ніж у хворих на гайморит (1 : 400). На нашу думку, достовірність різниці за даним показником між групами хворих може вказувати на залежність рівня гуморальної імунної відповіді на цей антиген від локалізації інфекції. Ймовірно, глибокі ураження при остеомієліті обумовлюють можливість виникнення потужнішого та тривалішого антигенного стимулу для утворення антитіл.

Одержані дані свідчать про те, що під час кістково-гнійної стафілококової інфекції відбувається значне підвищення рівня антитіл до ПлФ. Результати визначення в ТІФА титрів сироваткових антитіл до ПлФ у хворих на стафілококову інфекцію співвідносяться з результатами дослідження мікрофлори та з даними серологічних досліджень, що свідчить про інформативну цінність цього тесту. Враховуючи результати дослідження сироваток здорових донорів, мінімальним діагностичним титром анти-ПлФ-антитіл, що вказує на стафілококову етіологію при кістковій локалізації, можна вважати титр 1 : 800, при інфекції верхніх дихальних шляхів - 1 : 400. Титри антитіл до ПлФ, вищі за 1 : 800, що характерні тільки для хворих на стафілококову інфекцію, можуть слугувати надійним діагностичним критерієм при підтвердженні даної етіології захворювань. Виявлення анти-ПлФ-антитіл у нижчих титрах (при гаймориті - 1 : 200, при остеомієліті - 1 : 400) за наявності у хворого комплексу клінічних та мікробіологічних критеріїв захворювання також є цінним при встановленні етіологічного діагнозу і повинно враховуватись під час динамічного спостереження.

З огляду на наявність антитіл до ПлФ у сироватці здорових донорів ТІФА для виявлення анти-ПлФ-антитіл може бути застосоване лише в межах комплексного лабораторного дослідження.

Афінність сироваткових антитіл, специфічних до пластівцевоутворюючого фактора золотистого стафілокока. З метою дослідження функціональної активності антитіл до ПлФ, визначали їх афінність у хворих на гнійну стафілококову інфекцію (58 чоловік) та здорових людей (29 чоловік).

У відповідності з модифікацією метода Фріке (Friguet et al., 1985) визначення константи зв`язування (Kd) антитіл здійснювали шляхом побудови прямої у координатах Х = 1 / [Аг], Y = А₀ / (А₀ - А_х), де [Аг] - молярні концентрації антигену, А₀ - ОГ сироватки без антигену, А_х - ОГ сироватки за додавання різних концентрацій ПлФ. Значення Kd антитіл визначали за тангенсом кута нахилу прямої.

Встановлено, що сироваткові анти-ПлФ-антитіла хворих на стафілококову інфекцію осіб є високоафінними. Проте значення їх констант зв`язування коливаються в межах одного порядку (від 10<sup>-11</sup> до 10<sup>-10</sup> М). Максимальне значення константи зв`язування - (3,76±0,4)10^-11 М характерне для 64 % хворих. Група здорових донорів виявилася гетерогенною за афінітетом антитіл, специфічних до ПлФ: значення Kd антитіл змінюються в межах 4 порядків - від 10^-7 до 10^_10 М.

На практиці прийнятий умовний розподіл антитіл на високо- та низькоафінні залежно від величини константи дисоціації: якщо значення константи зв`язування комплексів антиген-антитіло менші за 10<sup>-8</sup> М, то антитіла є високоафінними (Егоров и др., 1991). Отже, сироваткові анти-ПлФ-антитіла біля 21 % здорових осіб є низькоафінними (Kd - 10<sup>-7</sup>_10<sup>-8</sup> М), тоді як у більшості (79 % осіб) антитіла - високоафінні (із значеннями Kd у межах 10<sup>-9</sup>-10<sup>-10</sup> М). Значення констант зв`язування низькоафінних та високоафінних антитіл змінюються в межах одного порядку. В 10 % здорових осіб значення Kd високоафінних антитіл відповідає такому хворих на стафілококову інфекцію і дорівнює (7,67±0,39)10^-10 М.

При визначенні афінності анти-ПлФ-антитіл виявлено тенденцію до збільшення її у хворих на гнійну стафілококову інфекцію: згідно одержаних даних, антитіла до ПлФ, які виявлено у хворих людей, є високоафінними з значеннями Kd, вірогідно вищими (p 0,01, р 0,001) за такі здорових донорів. Отже, можна вважати, що наявність у 10 % здорових осіб анти-ПлФ-антитіл із значеннями константи дисоціації на рівні групи хворих (р = 0,03) скоріше за все є наслідком нещодавно перенесеної інфекції.

Одержані дані узгоджуються з уявленням про те, що на пізніх етапах первинної імунної відповіді, і особливо при вторинних відповідях, IgG мають високу афінність (Тернер и др., 1983, Ройт и др, 2000). Широкий спектр значень константи дисоціації анти-ПлФ-антитіл здорових осіб, на нашу думку, є свідченням попередніх контактів їх організму з даним антигеном в результаті носійства стафілокока чи навіть перенесеної інфекції, адже відомо, що спорідненість антитіл до більшості тимусзалежних антигенів у ході імунної відповіді поступово зростає.

У нашому дослідженні залежності між титрами антитіл в ІФА та їх афінітетом не виявлено. На прикладі групи хворих на стафілококову інфекцію видно, що афінність антитіл за кожного з титрів приблизно однакова.

Значення константи дисоціації, які одержані для антитіл до ПлФ, знаходяться в межах, що характерні для всіх антибілкових антитіл. Цей результат є закономірним, адже ПлФ є білком з молекулярною масою 92 кДа. Можливість утворення антитіл до ПлФ з максимальним значенням константи зв`язування (3,810<sup>_11</sup> М) пояснюється тим, що більша частина молекули цього антигену - лігандзв`язуючий домен А - знаходиться на поверхні клітинної стінки S. aureus і бере участь у молекулярних взаємодіях та у процесі антитілогенезу (McDevitt et al., 1995), анти-ПлФ-антитіла є високоспецифічними саме до цієї частини молекули.

Висновки

Доведено, що виявлення антитіл до пластівцевоутворюючого фактора S. aureus у сироватці крові має діагностичне та прогностичне значення, що зумовлює використання пластівцевоутворюючого фактора в імуноферментному аналізі для діагностики інфекцій стафілококової етіології.

За допомогою імуноферментного аналізу встановлено, що антитіла класу G до пластівцевоутворюючого фактора S. aureus наявні у сироватках здорових донорів, титр їх коливається від 1:50 до 1:800 і не залежить від віку.

Встановлено, що при стафілококовій інфекції відбувається підвищення титру антитіл, специфічних до пластівцевоутворюючого фактора: у хворих на стафілококову інфекцію середні значення титру антитіл до пластівцевоутворюючого фактора є вірогідно вищими (1 : 1055 - при остеомієліті, 1 : 400 - при гаймориті) за цей показник у здорових осіб (1 : 188). Достовірність різниці за вказаним показником у хворих на кістково-гнійну стафілококову інфекцію та інфекцію верхніх дихальних шляхів вказує на існування залежності між рівнем гуморальної імунної відповіді на цей антиген та локалізацією інфекції.

Показано, що титри антитіл до пластівцевоутворюючого фактора, вищі за 1 : 800, визначені за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу, можуть слугувати надійним діагностичним критерієм при підтвердженні стафілококової етіології захворювань. Нижчі за 1 : 800 титри антитіл, що співвідносяться з клінічними ознаками захворювання, також мають діагностичне значення і повинні враховуватись під час динамічного спостереження.

У хворих на кістково-гнійну стафілококову інфекцію сироваткові анти-ПлФ-антитіла є високоафінними із значеннями константи дисоціації, що вірогідно вищі за такі 90 % здорових донорів. Для здорових людей характерна наявність у сироватці крові високо- та низькоафінних антитіл до пластівцевоутворюючого фактора. Залежності між титрами анти-ПлФ-антитіл та їх афінністю не виявлено.

Досягнута ефективна експресія рекомбінантного пластівцевоутворюючого фактора в системі E. coli XLI-Blue (біля 30 % всіх клітинних білків) за рахунок розробленої схеми культивування штаму-продуцента.