Мутаційні спектри у різних груп дітей, які зазнали впливу низькодозового іонізуючого випромінення

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

03.00.15 - Генетика

Мутаційні спектри у різних груп дітей, які зазнали впливу низькодозового іонізуючого випромінення

Настюкова Вікторія Володимирівна

Київ 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі молекулярно-генетичних досліджень Інституту агроекології та біотехнології УААН, м. Київ

Науковий керівник: доктор сільськогосподарських наук, професор Глазко Валерій Іванович, Інститут агроекології та біотехнології УААН, завідувач відділу молекулярно-генетичних досліджень.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук Кучук Микола Вікторович, Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАНУ, м. Київ в.о. завідувача відділу генетичної інженерії;

доктор медичних наук, професор Замостьян Віталій Павлович, Національний університет “Києво-Могилянська Академія”, завідувач кафедри екології.

Провідна установа: Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, м. Київ

Захист відбудеться 24.04.2003 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.202.01 в Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАНУ за адресою: 03143, Київ-143, вул. акад. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАНУ

Автореферат розісланий 21.03.2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук Кравець О.А.

1. Загальна характеристика роботи

мутаційний чорнобильський поліморфізм цитогенетичних

Актуальність теми. Однією з центральних проблем генетичних наслідків техногенного забруднення довкілля є виявлення і контроль його мутагенних ефектів у людини. Особливу актуальність ця проблема набула після Чорнобильської катастрофи. Серед фахівців дотепер немає однозначної думки про те, до якого накопичення мутацій у поколіннях людей, в тому числі і конститутивних цитогенетичних аномалій, може призвести підвищення фонового рівня іонізуючого випромінення (Шевченко, 2001).

Як традиційний метод оцінки ефектів різних доз іонізуючого випромінення у людей використовується підрахунок клітин із цитогенетичними аномаліями в соматичних клітинах, що діляться, найчастіше - у клітинах периферичної крові. Такі аномалії, як дицентрики і кільцеві хромосоми, навіть одержали назву “променеві маркери” і часто застосовуються для індивідуальної ретроспективної реконструкції поглинутих доз опромінення (Пілінська та співавт., 1995, 1999).

Загалом, цитогенетичні дослідження у ссавців дозволяють вирішувати кілька взаємозалежних завдань: виявлення носіїв конститутивних цитогенетичних аномалій; аналіз зв'язків між ними і генетично детермінованими захворюваннями (Бочков та співавт., 1999); вивчення мутагенезу в соматичних клітинах окремих особин і дослідження можливостей використання цих даних для прогнозу різних захворювань, накопичення “генетичного вантажу” у популяціях, народження потомства із вродженими дефектами.

Такі дослідження ширше проводилися у людей і на лабораторних лініях мишей. Як показник мутагенезу в соматичних клітинах розглядають частоти зустрічальності інтерфазних клітин та метафазних пластинок із цитогенетичними дефектами серед клітинних популяцій периферичної крові або кісткового мозку. Описані кореляційні зв'язки між мутагенезом у соматичних клітинах і частотами зустрічальності різних аномалій у генеративних клітинах і гаметах (Gaulden, 1992). Однак і до цього часу проблема оцінки мутагенезу щодо цитогенетичних аномалій в соматичних клітинах з метою прогнозу ступеня ризику розвитку різних захворювань у даної особи та її нащадків залишається недостатньо вивченою.

Основною проблемою такої оцінки, напевно, є складність самих ознак, за якими оцінюють частоту мутацій, у тому числі і цитогенетичних аномалій. Можливості використання мутацій, які спостерігаються в соматичних клітинах у особин, що зазнали генотиксичного впливу, для прогнозу розвитку різних патологій ускладнюються, в основному, відсутністю даних про зв'язки між мутаціями, що спостерігаються, і патологією та про залежність появи генетичних дефектів у генеративних і соматичних клітинах від функціонального стану ряду фізіологічних систем, котрі контролюють “генетичний гомеостаз” багатоклітинних організмів.

Тому головним завданням цієї роботи був порівняльний аналіз характеристик нестабільності генетичного апарату в клітинах периферичної крові людей з використанням методів цитогенетичного аналізу і залученням молекулярно-генетичних маркерів фрагментів ДНК, що фланковані мікросателітними локусами.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано відповідно до: тематичного плану наукових досліджень Інституту агроекології та біотехнології УААН за N 0196U012073 “Вивчити генетичні наслідки екологічних стресів у різних видів тварин”; відповідно до договорів між Інститутом агроекології та біотехнології УААН і Чорнобильським Науковим Центром Міжнародних Досліджень за N 143 “Генетичні наслідки екологічного стресу в зоні відчуження Чорнобильської АЕС”; відповідно до міжнародного договору між Україною і Росією Міністерства науки й освіти України за N 2м/96-98 “Розробка методів вивчення молекулярно-генетичних механізмів дестабілізації каріотипу в умовах генотоксичних впливів”, а також темою НДР “Оцінка та прогноз здоров'я дітей та підлітків у віддалені строки післяаварійного періоду” (шифр 311, замовник МНС України), що виконувалась відділенням уродженої та спадкової патології Наукового центру радіаційної медицини АМН України.

Мета і завдання дослідження. Метою даного дослідження був порівняльний аналіз спектра мутаційних подій серед груп дітей, народжених до і після Чорнобильської аварії, а також оцінка інформативності різних типів характеристик мутагенезу в соматичних клітинах як показників генотоксичних впливів.

У роботі вирішувались такі завдання:

оцінити специфіку змін частот зустрічальності носіїв конститутивних цитогенетичних аномалій у дітей, які народжені до і після Чорнобильської катастрофи у Київській області та деяких інших регіонах України;

проаналізувати зв'язок між носійством визначених типів цитогенетичних аномалій і наявністю фенотипових відхилень у дітей за деякими анатомо-фізіологічними характеристиками;

оцінити частоти участі індивідуальних хромосом у конститутивних цитогенетичних аномаліях;

порівняти спектри цитогенетичних аномалій у клітинах периферичної крові дітей, які зазнали впливу іонізуючого випромінення, і оцінити участь у них індивідуальних хромосом у зв'язку із припущенням про залежність між розміром хромосоми і частотою її ушкоджень (теорія мішені);

співставити специфіку поліморфізму деяких анонімних фрагментів ДНК (ISSR-PCR маркери) у дітей із вродженими вадами розвитку (ВВР), у яких не виявлені конститутивні цитогенетичні аномалії.

Об'єктом дослідження в даній роботі були групи дітей та їхніх батьків, які звернулися за генетичною консультацією.

Предметом дослідження являлися спектри мутацій, що виявлялись в клітинах периферичної крові дітей та їхніх батьків, а також генотипи щодо маркерів анонімних фрагментів ДНК, фланкованих мікросателітними локусами (ISSR-PCR).

Методи досліджень. У роботі ми використовували цитогенетичний аналіз із застосуванням методу диференційного фарбування хромосом для виявлення G- покреслення, а також полімеразну ланцюгову реакцію з використанням праймерів з коровими послідовностями мікросателітних локусів довжиною 19-23 нуклеотида.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше доведено, що у дітей із ВВР, народжених після Чорнобильської катастрофи, не виявляється істотного підвищення носійства конститутивних цитогенетичних аномалій; відсутні виражені асоціації між наявністю визначеного хромосомного дефекту і специфічними анатомо-фізіологічними особливостями вроджених вад розвитку. Отримані дані свідчать про наявність загального зв'язку між порушеннями у розвитку та появою конститутивних цитогенетичних аномалій з неспецифічною дестабілізацією генетичного матеріалу.

Вперше показано, що в дітей, які зазнали впливу іонізуючого випромінення, спостерігається широкий спектр різних типів цитогенетичних аномалій в соматичних клітинах. Отримані дані вказують на те, що підвищена частота хромосомних аномалій в клітинах периферичної крови може відображати неспецифічну дестабілізацію генома, пов'язану з опроміненням in utero (перша група обстежених дітей), та впливом хронічного низькодозового іонізуючого випромінення (друга - мешканців забруднених радіонуклідами територій).

Вперше показано, що розмах мінливості щодо поліморфізму фрагментів ДНК, фланкованих мікросателітними локусами (ISSR-PCR), залежить від нуклеотидної послідовності мікросателітного локусу, який використовували в як праймер, та різниця складнощів спектрів продуктів ампліфікації при використанні різних праймерів, виявляється істотно більшою, ніж у різних індивідуумів при використанні праймера однієї і тієї ж послідовності.

Теоретичне і практичне значення одержаних результатів. Результати виконаних досліджень можуть бути безпосередньо використані для розробки методів оцінки дестабілізації генетичного матеріалу і, відповідно, прогнозу появи дітей із ВВР. Виявлені в роботі відмінності серед людей за наявністю індивідуальних хромосом, які частіше втягуються в цитогенетичні аномалії (“гарячих” хромосом), необхідно враховувати при вивченні генетичних наслідків екзогенних генотоксичних впливів. Отримані експериментальні дані свідчать про те, що як один з показників неспецифічної дестабілізації хромосомного апарату може бути використана оцінка участі в конститутивних цитогенетичних аномаліях хромосоми 9.

Аналіз складності спектрів продуктів ампліфікації анонімних фрагментів ДНК (ISSR-PCR) свідчить про те, що маркери ISSR-PCR у даний час не можуть бути використані для виявлення мутаційних подій, які індукуються генотоксичними впливами зовнішнього середовища, у зв'язку з такими обставинами: 1) недостатністю вивчення механізмів формування спектрів продуктів ампліфікації фрагментів ДНК, фланкованих мікросателітними повторами, і джерел лабільних, артефактних зон, що виявляються на фореграмах; 2) залежністю появи артефактних зон від нуклеотидної послідовності праймера; 3) відсутністю універсального стандарту спектра продуктів ампліфікації у людей, що отримуються при використанні конкретного праймера.

Особистий внесок здобувача. Здобувач є безпосереднім виконавцем експериментальної роботи. Їм особисто розроблені робочі гіпотези, отримані, проаналізовані, обговорені та узагальнені результати, підготовлені та написані наукові повідомлення.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційного дослідження доповідалися на: конференції “Актуальні проблеми діагностики, лікування і профілактики спадкоємних захворювань у дітей” (Москва, 1998); ІІІ Міжнародній конференції “Молекулярно-генетичні маркери тварин” (Київ, 1999); “The Second European Cytogenetics conference” (Vienna, Austria, 1999); науково-практичному семінарі Інституту землеробства УААН (Київ, 1999); конференції “Гигиена населенных мест” (Київ, 2000); II Конгресі Української асоціації спеціалістів УЗД у перинатології, генетиці та гінекології (Харків, 2000); VII з'їзді Українського товариства генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавілова (Крим, 2002); звітних сесіях Інституту агроекології і біотехнології УААН та засіданнях відділу молекулярно-генетичних досліджень і вченої ради Інституту агроекології і біотехнології УААН (1999-2002 рр.).

Публікації. Результати дисертаційної роботи опубліковані в 5 статтях періодичних наукових видань та 8 тезах доповідей на наукових форумах.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, 5 основних розділів (огляд літератури, об'єкти і методи досліджень, результати досліджень, їх обговорення та висновків). Рукопис дисертації викладено на 144 сторінках тексту комп'ютерного набору. Результати досліджень наведені в 18 таблицях. Ілюстративний матеріал представлено 18 рисунками. Список літератури містить 222 джерел, у тому числі 135 зарубіжних.

2. Основний зміст

Матеріали і методи. Дослідження виконувалися на метафазних пластинках периферичної крові у дітей та їхніх батьків, які мешкають в різних регіонах України (табл. 1).

Таблиця 1 Кількість обстежених осіб

Групи обстежених	Кількість осіб	Дата народження	Кількість метафаз
		до 1986	після 1986
Діти з ВВР	382	23	359	11078
Батьки дітей с ВВР	153	153		4437
Особи с порушенням статевого розвитку	128	112	16	3712
Діти, які опромінені in utero	8		8	1600
Діти, які мешкають на забруднених радіонуклідами територіях	8		8	1600
Особи, у яких виявлявся поліморфізм фрагментів ДНК	48	39	9	1392
Всього	727	327	400	23819

Діти з ВВР мали різні за характером фенотипові відхилення. Ідентифікація різних типів ВВР виконувалася за стандартними клінічними протоколами (Марінчева, 1988, Лазюк, 1991, Козлова, 1999).

Серед дітей, які зазнали генотоксичного впливу іонізуючого випромінення виділені дві групи: перша - опромінені внутрішньоутробно, друга - мешканці забруднених радіонуклідами територіях. Що стосується першої групи, то згідно з даними лабораторії непрямих і розрахункових методів дозиметрії НЦРМ АМН України, граничні величини доз загального опромінення плоду у вагітних жінок, евакуйованих з м. Пріп'яті, знаходяться в діапазоні від 5 до 376 мЗв, дорівнюючи в середньому 31,87 ± 14,46 мЗв. Гестаційний вік плоду на момент аварії склав: до 7 тижнів у 4,3 % випадків; 8-15 тижнів - 9,9 %; 16-25 тижнів - 41,5 %; більше 25 тижнів - 44,3 %. У другу групу увійшли діти, які постійно мешкають в с.м.т. Народичи і м. Овруч Житомирської області. Середньорічні паспортні дози від зовнішнього і внутрішнього опромінення для м. Овруч і с.м.т. Народичи становили 0,77 і 1,5 мЗв, відповідно.

Для оцінки успадкування продуктів ампліфікації ISSR-PCR проведено сімейний аналіз на 3 поколіннях голштинських корів, які вибрані як модельний об'єкт (10 тварин). Батьківське покоління склали бугай “Уран” та корови “Альфа” і “Бета”. Нащадки першого покоління від корови “Альфа” - № 120, №105, “Роза”; від корови “Бета” - № 49; друге покоління - корова № 113 і бугай № 144. Нащадок третього покоління представлений бугаєм № 155. Покоління великої рогатої худоби відтворювалося в умовах підвищеного радіонуклідного забруднення (близько 200 Кі/км2 при усередненій поглиненій дозі 0,6 - 1,0 Гр за рік) в експериментальному господарстві “Новошепеличи”.

Цитогенетичні дослідження виконувалися з використанням стандартного мікрометоду короткострокового культивування цільної периферичної крові. Хромосоми людини підрозділяли відповідно за їх розмірами на сім груп: група А (1-3); В (4-5); С (6-12, Х); D (13-15); Е (16-18); F (19-20); G (21-22). Хромосома У визначалась як самостійна. Ідентифікацію G-диференційно пофарбованих індивідуальних хромосом та їхніх перебудов здійснювалась відповідно до “An International System for Human Cytogenetic Nomenclature” (1995).

Пофарбовані цитогенетичні препарати аналізували за допомогою бінокулярних мікроскопів “Karl Ceiss”, “ЛЮМАМ”, “Nikon” при збільшенні в 1000 разів. Метафазні пластинки фотографували на плівку “Мікрат-300”.

Поліморфізм фрагментів геномної ДНК (метод ISSR-PCR) виявляли в 12 осіб, яким було проведено цитогенетичне обстеження і конститутивні цитогенетичні аномалії не були виявлені. Вони склали дві групи - 5 дорослих осіб (умовно контрольна група) і 7 дітей із ВВР. Виділення ДНК здійснювали з використанням стандартного методу (Маниатис и др., 1984), що має етапи: руйнування клітин і екстракція ДНК фенолом, хлороформом та ізо-ацетиловим спиртом, а потім її переосадження 70% етанолом.

Ампліфікацію ДНК проводили методом полімеразної ланцюгової реакції (ISSR-PCR) з використанням праймерів (GAG)6C, (ACC)6G, а також двох пар праймерів однакової корової послідовності, що відрізняються тільки за позицією одного - двох "якірних" нуклеотидів на флангах: перша пара праймерів GT(CAC)7 і (CAC)7T, друга - (AGC)6C і (AGC)6G. Для визначення розмірів продуктів ампліфікації на кожному блоці використовували маркер молекулярних мас Step Ladder DNA S7025 (Sigma).

Якість і кількість продуктів реакції оцінювали шляхом аналізу реакційної суміші у 2% агарозному гелі з фарбуванням зон ДНК бромистим етідієм.

Здійснено також аналіз розподілу інвертних повторів фрагментів мікросателітних локусів, що використані як праймерів у секвенованих послідовностях людини, які знаходяться в GenBank з використанням програми “BLAST”.

Статистичну обробку отриманих даних здійснювали стандартними методами (Плохинский, 1974). Розраховували середнє значення частоти зустрічальності клітин з цитогенетичними аномаліями на одного індивіда в кожній групі обстежених (М) і стандартну помилку середнього (±m). Статистичну достовірність міжгрупових відмінностей оцінювали за критерієм Ст'юдента.

Результати дослідження та їх обговорення

Конститутивні цитогенетичні аномалії. Вважається, що виникнення цитогенетиних аномалій є однією з основних причин появи ВВР. Відомо, що у людини, за результатами дослідження спонтанно-абортованих ембріонів і плодів, мертвонароджених і живонароджених дітей, більш ніж у 55% носіїв ВВР виявляються конститутивні хромосомні аномалії (Кулешов, 1979). Однак досі не вдалося отримати однозначних даних що до змін зустрічальності ВВР у зв'язку із хронічним низькодозовим впливом іонізуючого випромінення, а також причинно-наслідкових зв'язків між появою різних варіантів ВВР і певними типами хромосомних аномалій.

Тому нами виконано аналіз частот зустрічальності носіїв конститутивних хромосомних аномалій у дітей із ВВР, їх змін при порівнянні груп дітей, народжених до і після Чорнобильської катастрофи, гетерогенності цитогенетичних дефектів у дітей із ВВР, а також здійснена порівняльна оцінка залучення індивідуальних хромосом у такі дефекти.

Конститутивні цитогенетичні аномалії аналізували тільки у тих дітей із ВВР, батьки яких мали нормальний каріотип. Взагалі, серед 663 досліджених батьків і дітей нами виявлено 260 носіїв конститутивних хромосомних аномалій, в батьківській групі - 26 чоловік. Відмічена певна тенденція до збільшення носіїв цитогенетичних аномалій серед дітей з ВВР, народжених після 1986 р. (табл. 2).

У табл. 2 наведено дані про частоту зустрічальності хромосомних аномалій аутосом у дітей, які народжені до і після 1986 року. В аналізі не враховували носіїв синдрому Дауна, оскільки трисомія по 21-ї хромосомі виявилася найбільш представленою серед носіїв із ВВР (синдром Дауна - 146 випадків). Порушення в системі аутосом у дітей із ВВР зустрілися у 37 випадках.

Таблиця 2 Частота зустрічальності носіїв хромосомних аномалій аутосом у групах дітей, які народжені до і після 1986 року

Народження	Мешкання	Всього
	Київ	Київська область	Інші області України
	n	n*	n	n*	n	n*
до 1986 р	13	1 (7,7 %)	4	0	6	1 (16,7 %)	23
після 1986 р	148	24 (16,2 %)	71	5 (7,0 %)	39	9 (23,0 %)	258

Для оцінки можливих зв'язків між ВВР і цитогенетичними аномаліями виконано аналіз частоти зустрічальності різних типів хромосомних ушкоджень у групах дітей зі схожими за виразністю певними анатомо-фізіологічними дефектами розвитку. Отримані дані свідчать про відсутність прямих зв'язків між типом хромосомних аномалій і характеристиками дефектів розвитку. Так, в групах дітей зі схожими клінічними проявами ВВР спостерігали різні типи цитогенетичних аномалій. Наприклад, черепно-лицьові дисморфії були виявлені у усіх носіїв різних типів хромосомних дефектів, пороки ЦНС, головного і спинного мозку, кінцівок відзначалися при різних типах цитогенетичних аномалій (табл.3). Таким чином, не виявлено таких анатомо-фізіологічних порушень, які можна було б пов'язати з визначеним типом порушення хромосом.

Таблиця 3 Анатомо-фізіологічні дефекти (ВВР) та носійство конститутивних цитогенетичних аномалій аутосом

Анатомо-фізіологічні дефекти	Типи хромосомних аномалій
	Інверсії	Делеції	Дуплікації	Транслокації	Невідомий	Всього
				робертсонівські	реципрокні
Черепно-лицьові дисморфії	4	8	8	3	3	1	27
ЦНС	7	15	3	-	-	3	28
Серцево-судинна система	1	3	-	2	-	-	6
Шлунково-кишковий тракт	-	5	2	-	2		9
Сечовидільна система	2	-	-	-	-	-	2
Порушення росту	3	-	-	-	-	-	3
Всього	9	11	9	3	3	3	75

Таблиця 4 Типи структурних перебудов аутосом, які виявлено цитогенетичним методом

Типи перебудов
Інверсії	Делеції	Дуплікації	Транслокації
			робертсонівські	реципрокні
N	n*	N	n*	N	n*	N	n*	N	n*
2 7	inv (8) inv (9)	1 1 1 1 1 2 4	2p- 4p- 5p- 7q- 9q- 13q- 18q-	1 1 1 1 2 1 2	2p+ 3p+ 5p+ 8p+ 13q+ 14q+ 22p+	1 2	(14;21) (1;21)	1 2	(11;21) (5;6)
9	11	9	3	3

Аналіз гетерогенності хромосомних аномалій показав, що серед різних типів хромосомних перебудов найпоширенішими були інверсії (9 випадків), делеції (11) і дуплікації (9). Всього у виявлених цитогенетичних аномаліях брали участь 10 із 22 аутосом каріотипу людини (табл.4).

Щоб уточнити, чи реальна тенденція до зростання кількості носіїв цитогенетичних аномалій у народжених після 1986 р., зіставляли частоту зустрічальності трисомії 21-ї хромосоми серед дітей із ВВР (синдром Дауна). У даному випадку, такої тенденції не спостерігалось, тому що внесок носіїв трисомії 21-ї хромосоми у дітей із ВВР, які народилися в різні роки, виявився подібним (26,1% у народжених до 1986 р. по відношенню до 38,9% у тих, які народилися після 1986 р.).

У зв'язку з тим, що група дітей із ВВР, які народилися до 1986 р. малочислена (табл.2), нами розглянуто частота зустрічальності цитогенетичних аномалій статевих хромосом у осіб із дефектами розвитку статевої системи для з'ясування можливої обумовленості тенденції до збільшення носійства цитогенетичних аномалій у дітей із ВВР після 1986 р.(табл.5).

Таблиця 5 Частота зустрічальності осіб з порушенням статевого розвитку

Народження	Київ	Київська область	Інші області України
	n	n*	n	n*	n	n*
до 1986 р.	59	30 (51,0%)**	34	5 (15,0%)***	19	5 (26,0%)
після 1986р.	10	7 (70,0%)**	3	2 (67,0%)***	3	1 (33,0%)

Примітки: n - кількість обстежених; n* - кількість носіїв аномалій статевих хромосом

Отримані дані свідчать про статистично істотне збільшення внеску носіїв аномалій статевих хромосом серед дітей із дефектами статевого розвитку, які народжені після 1986 р., у порівнянні з народженими до 1986 р., незважаючи на протилежне співвідношення в чисельності груп.

Можна було б очікувати, що тенденція до збільшення внеску носіїв цитогенетичних аномалій у дітей із ВВР зумовлена якимись віковими особливостями батьківських пар, оскільки відомо, що вік батьків має певний зв'язок із дестабілізацією хромосомного апарату у дітей. Зважаючи на це, проведено порівняльний аналіз зустрічальності цитогенетичних аномалій у дітей із ВВР, які народжені від батьків різних вікових груп із нормальним каріотипом. Він свідчить про відсутність виражених відмінностей між частотою носійства цитогенетичних аномалій в групах дітей із ВПР, які народжені рівно і різновіковими батьками. У групі рівновікових батьків (до 35 років) зареєстровано: 43 дитини із ВВР, які були носіями цитогенетичних аномалій і 57 дітей з ВВР без цитогенетичних аномалій; а серед різновікових (один із батьків віку більше 35 років) - 15 і 16, відповідно.

Таким чином, не виявлено прямих зв'язків між виразністю дефектів розвитку анатомо-фізіологічних систем і ушкодженням індивідуальних хромосом, між внеском носіїв цитогенетичних аномалій в групі дітей з ВВР і віком їхніх батьків. Отримані результати, в цілому, вказують на відсутність безпосередніх зв'язків між ВВР і виявленими цитогенетичними аномаліями, помірне зростання котрих у дітей із ВВР, народжених після 1986 р., може відображати загальну неспецифічну дестабілізацію систем, що контролюють ембріональний розвиток.

Особливості мутаційних спектрів у соматичних клітинах дітей, які зазнали впливу іонізуючого випромінення. Збільшення індивідуальної і групової мінливості за комплексом цитогенетичних характеристик у соматичних клітинах традиційно розглядається як показник наявності генотоксичних впливів. Передбачається, що частоти зустрічальності мутацій в соматичних клітинах можуть бути певною мірою пов'язані із народженням носіїв конститутивних цитогенетичних дефектів. У той же час, особливості цитогенетичних наслідків хронічної дії низькодозового іонізуючого випромінення залежно від стадії розвитку організму та часу впливу досі залишаються недостатньо вивченими. У зв'язку з цим виконані дослідження частот зустрічальності різних типів цитогенетичних аномалій у клітинах периферичної крові дітей, які зазнали впливу низькодозового іонізуючого випромінення у зв'язку з аварією на Чорнобильській АЕС. В одну були об'єднані діти, які зазнали короткочасної дії іонізуючого випромінення внутрішньоутробно (1986 р. народження), в другу - що постійно мешкають на забруднених радіонуклідами територіях і народжені після 1987 р. Виконано аналіз частот зустрічальності стабільних (транслокацій, інверсій, інсерцій) і нестабільних (ацентриків, дицентриків, кілець) аберацій (табл.6), проведено порівняльну оцінку залучення індивідуальних хромосом в аберації та анеуплоідію у цих груп дітей (табл.7, 8).

Таблиця 6 Частота аберацій хромосом у лімфоцитах периферичної крові у дітей, які опромінені in utero (1) і мешкають на забруднених радіонуклідами територіях (2) (M m)

Типи аберацій	Група 1 (n=8, 1600 метафаз)	Група 2 (n=8, 1600 метафаз)
	n*	% від загальної n*	Частоти зустрічальності (%)	n*	% від загальної n*	Частоти зустрічальності (%)
Транслокації	6	14,2	0,37 0,10	3	14,2	0,18 0,10
Делеції	20	47,6	1,25 0,30	11	52,3	0,68 0,20
Інверсії	5	11,9	0,31 0,10	2	9,5	0,12 0,07
Дицентрики	1	2,3	0,06 0,05	1	4,7	0,06 0,05
Кільця	2	4,7	0,12 0,07	-	-
Інсерції	5	11,9	0,31 0,12	-	-	-
Парні фрагменти	1	2,3	0,06 0,05	3	14,2	0,18 0,10
Одиночні фрагменти	2	4,7	0,12 0,07	1	4,7	0,06 0,05
Всього	42			21

В цілому різні типи хромосомних аберацій в середньому на одну дитину частіше зустрічаються у дітей, опромінених in utero (2,50,4%), ніж у мешканців забруднених територій (1,30,4%), однак ці розбіжності статистично не достовірні (значення критерію Ст'юдента tS = 2,06). Отже в цілому можна говорити тільки про тенденцію до збільшення різних хромосомних аберацій у соматичних клітинах дітей, опромінених in utero.

Аналіз гетерогенності хромосомних аномалій показав, що серед різних типів хромосомних перебудов найпоширенішими були делеції (як і у групі з конститутивними перебудовами) та транслокації (табл.6).

В зв'язку з цим треба зазначити, що дві групи дітей практично не відрізнялись за частотами зустрічальності нестабільних хромосомних аберацій. Так, дицентрики, кільцеві хромосоми, парні і одиночні фрагменти в першій групі зустрічались в середньому на одну дитину з близькими частотами (табл.6). У той же час, стабільні маркери, такі як транслокації, інверсії, інсерції в групі дітей опромінених in utero, сумарно виявлялись приблизно в три рази частіше (1,00,2%), ніж у дітей, які мали тривалий контакт з іонізуючим випроміненням (0,30,1; Р<0,02).

Отримані дані свідчать про те, що при гострому внутрішньоутробному опроміненні у дітей більшою мірою накопичуються стабільні цитогенетичні дефекти в клітинах периферичної крові порівняно з групою дітей, які зазнали впливу хронічної дії низькодозового іонізуючого випромінення.

Раніше в деяких дослідженнях було виявлено, що під впливом хронічної дії низькодозового іонізуючого випромінення відбувається істотне збільшення пошкодження окремих індивідуальних хромосом (наприклад, хромосом 3-ї і 6-ї в дослідженнях Ильинских и соавт., 1996). Для того, щоб оцінити особливості участі індивідуальних хромосом у цитогенетичних аномаліях у досліджених двох групах дітей, нами виконано підрахунок частот залучення індивідуальних хромосом у різні типи цитогенетичних аномалій. Оцінка участі індивідуальних хромосом в цитогенетичних аномаліях дозволила отримати наступні дані (табл.7).

Таблиця 7 Залучення індивідуальних хромосом у різні типи хромосомних аберацій у дітей

Типи аномалій	Групи дітей
	опромінені in utero	мешкають на забруднених територіях
	Номери хромосом, залучених в цитогенетичні аномалії
Делеції	1 [2], 2 [2], 4 [2], 7 [2], 8, 10, 12, 13 [4], 15, 16 [2], 17, 18	5, 6, 8, 11,14 [2], 15,16 [2], 18, 22
Інсерції	2, 13, 15, 16, 17	-
Інверсії	1 [2], 2, 4, 10	3, 10
Кільця	r(?), r(15)	-
Дицентрики	dic (12;15)	dic (4;9)
Транслокації	t(1;2), t(1;7), t(2;22), t(5;10), t(13;2), t(22;11)	t(2;1), t(5;7), t(12;3)

У дітей обох груп взагалі у внутрішньохромосомні дефекти і міжхромосомні обміни частіше залучались хромосоми груп А, В, С і D, ніж E, F, G. Участь хромосом різного розміру в цитогенетичних аномаліях мала чітко виражену індивідуальну специфіку і широко варіювала від одного індивідуума до другого.

Відмічались певні відмінності між цими групами дітей щодо делецій різних груп хромосом: у дітей, які були опромінені внутрішньоутробно, 20% делецій виявлені в найбільших за розміром хромосомах групи А, чого не сталось у дітей - мешканців забруднених радіонуклідами територій (табл.7).

У цих дітей зроблено також аналіз частот зустрічальності анеуплоїдних клітин (табл.8) і участі в анеуплоїдії різних хромосом.

Таблиця 8 Частота зустрічальності анеуплоїдії у обстежених дітей

Діти	n	n*	Частота анеуплоїдних клітин	Ч-та гіпоплоїдних клітин	Ч-та гіперплоїдних клітин
опромінені in utero	1600	119	9,1%	8,9%	0,2%
мешканці забруднених територій	1600	102	7,8%	7,7%	0,1%

З'ясувалось, що в анеуплоїдію найчастіше залучаються проміжні та найменші за розміром хромосоми груп E, F і G.

Отримані дані свідчать про те, що частота участі індивідуальних хромосом у внутрішньохромосомних пошкодженнях варіює від одної хромосоми до другої і не є прямо пов'язаною з розмірами хромосом.

Таким чином, результати виконаного порівняльного дослідження спектрів цитогенетических аномалій в клітинах периферичної крові свідчать про відсутність прямих зв'язків між тривалістю опромінення (гострого або хронічного), його характером (зовнішнім або внутрішнім) і сумарними частотами зустрічальності різних типів цитогенетичних аномалій. Підвищена частота стабільних хромосомних аномалій (транслокації, інверсії, інсерції) у дітей, опромінених внутрішньоутробно порівняно з групою дітей, які зазнали хронічного впливу низькодозового іонізуючого випромінення, певним чином, може відображати загальну неспецифічну дестабілізацію геному і тенденцію до накопичення клонів клітин, які несуть стабільні хромосомні дефекти.

Розмах індивідуальної мінливості щодо участі в хромосомних аномаліях хромосом різного розміру свідчить про те, що уявлення про прямий зв'язок між цими параметрами потребують подальшого уточнення.

Загалом, в наших дослідженнях, на відміну від робіт Ильинских и соавт. (1996 г.), нам не вдалося виявити підвищення частоти участі в хромосомних абераціях хромосом 3 і 6; у окремих індивідів такими “гарячими” хромосомами були різні аутосоми (табл. 7).

Аналіз мутаційних подій із використанням даних щодо поліморфізму анонімних послідовностей ДНК, фланкованих мікросателітними локусами (ISSR-PCR). Для оцінки конститутивних мутаційниих подій у людей, у яких не виявляють конститутивні цитогенетичні аномалії з використанням сучасних молекулярно-генетичних методів, в наших дослідженнях проведено аналіз поліморфізму фрагментів ДНК (метод ISSR-PCR).

На першому етапі наших досліджень на модельному об'єкті вивчали спадковість продуктів ампліфікації (ISSR-PCR), що отримані за допомогою двох пар фрагментів мікросателітних локусів (GT(CAC)7 і (CAC)7T; (AGC)6C і (AGC)6G) у представників трьох поколінь великої рогатої худоби, які зростали в умовах хронічної дії низькодозового іонізуючого випромінення (0,5 - 1,0 Гр на рік)

Згідно результатів проведеного аналізу, спектр продуктів ампліфікації (ампліконів) ділянок ДНК, фланкованих мікросателітними локусами, істотно залежить від особливостей нуклеотидної послідовності, котру використовують в якості праймера. Виявилось також, що в залежності від неї можна отримувати спектри, всередині яких окремі амплікони відрізняються один від одного за стабільністю відтворювання. Зокрема, при використанні як праймера послідовності (AGC)6C у спектрі тварини за № 120 реєструвались “легкі” амплікони, котрі були відсутніми у її батьків Альфи та Урану. У іншого нащадка за №105 один із цих ампліконів також був присутнім, але не відтворювався при повторній процедурі ампліфікації. Слід очікувати, що такий нестабільний спектр ампліконів, котрий отримувався при використанні послідовності (AGC)6C як праймера, на відміну від інших послідовностей пов'язаний з можливістю формування “мінішпильки” на 3' кінці цього праймера.

У зв'язку з цим у людей для аналізу спектрів фрагментів ДНК, фланкованих мікросателітними локусами, як праймери використали тільки одну пару мікросателітних фрагментів - GT(CAC)7 і (CAC)7T. Цю пару взяли тому, що в сімейному аналізі великої рогатої худоби вона призводила до формування найменш суперечливих для інтерпретації спектрів продуктів ампліфікації. Досліджували продукти ампліфікації ДНК зразків крові дітей із ВВР, які не були носіями конститутивних цитогенетичних аномалій, і благополучних в фенотиповому та цитогенетичному відношенні людей (умовно контрольна група). Отримані результати свідчать про високу точність відпалу, оскільки формування у одних і тих же людей різних спектрів залежить від одного або двох “якірних” нуклеотидів у праймерах, довжиною в 22-23 нуклеотиди (ампліфікацію проводили тричі). Кількість продуктів ампліфікації у спектрах, що отримані при використанні послідовності GT(CAC)7 як праймера, в обох досліджених групах виявилася майже в два рази більше, ніж при використанні як праймера послідовності (САС)7Т (6,2 ± 0,9 і 3,2 ± 0,5 у контрольній групі та у дітей з ВВР - 6,4 ± 0,7 і 2,7 ± 0,7 відповідно). Відмічено, що у дітей з ВВР, як і в контрольній групі, довжини ампліконів спектра (САС)7Т праймера збігались з довжинами частини ампліконів, представлених у спектрах продуктів ампліфікації, котрі отримані з використанням послідовності GT(CAC)7 як праймера. Якщо розглядати довжини ампліконів і передбачати на цій основі гомологію фрагментів ДНК однакової довжини, можна сподіватись, що спектр ампліконів праймера (САС)7Т є частиною спектра, котрий отримується з праймером GT(CAC)7. На основі цих даних важко знехтувати припущенням що в послідовності GT(CAC)7 також можуть виникати “мінішпильки” вже на 5'-кінці, що, в свою чергу може призводити до появи нестабільних ампліконів.

Результати досліджень на людях підтверджують експериментальні дані про те, що, незважаючи на ідентичні корови послідовності, наявність різних якорів на флангах мікросателітного праймеру призводить до отримання якісно різних спектрів ампліконів. Звертає на себе увагу також, та обставина, що ці спектри у людини є істотно більш складними, ніж у модельних об'єктів

У той же час, якщо використати в реакції ПЛР для ампліфікації інший праймер, наприклад, (GAG)6C, то в представників великої рогатої худоби формуються спектри ампліконів навіть більш складні (з відносно великою кількістю ампліконів), ніж у людини.

Причому, якщо порівняти спектр продуктів ампліфікації, що отримуються з використанням послідовності (GAG)6C як праймера (у якої, очевидно, не утвориться “міні-шпилька” на 3' кінці з участю “якірного” нуклеотида), з кількістю ампліконів, що отримуються при використанні праймера (ACC)6G (у якого можливе формування такої “мінішпильки” ) у одних і тих же індивідів, то виявляється, що спектр ампліконів у разі використання праймера (ACC)6G в більшості випадків також виходить більш складним, ніж для праймера (GAG)6C

Отримані дані свідчать на користь висловленого вище припущення про те, що елементи первинної послідовності фрагмента мікросателітного локуса, з урахуванням “якірного” нуклеотида на 3' кінці фрагмента, привертаючи до формування на цьому кінці “мінішпильки”, сприяють формуванню більш складних спектрів продуктів ампліфікації, мабуть, включаючи присутність і артефактних зон, в порівнянні з праймерами, у яких така можливість відсутня. У цьому випадку під артефактними зонами ми маємо на увазі амплікони, ампліфіковані на послідовностях геному, фланкированих не інвертним повтором праймера, що використовується, а продуктами його повторної модифікації.

Виконаний нами спеціальний аналіз розподілу інвертних повторів фрагментів мікросателітних локусів, які використані як праймери в секвенованих послідовностях людини (представлених в GenBank), показав реальну присутність у геномі людини деяких ампліфікованих фрагментів. Зокрема, фрагмент (САС)7Т має повний збіг із фрагментом, локалізованим у хромосомі 14, і з двома різними фрагментами хромосом 20, 21 і 1.

Одержані дані свідчать про те, що спектр продуктів ампліфікації (ISSR-PCR маркери) насамперед визначається специфікою первинної послідовності праймера. Джерелом помилкової діагностики мутаційних подій може бути здатність праймера утворювати повторні структури (наприклад, “мінішпильки”). Важлива властивість ISSR-PCR, а саме, формування полілокусних спектрів, нівелюється високою індивідуальною мінливістю їх представленості, що призводить до неможливості порівняння з певним “еталонним” зразком, як, зокрема, у випадку аналізу цитогенетичних аномалій, у якому таким зразком є видоспецифічний каріотип людини.

На підставі виконаного аналізу можна дійти висновку, що використання явища поліморфізму фрагментів ДНК, фланкованих мікросателітними локусами, для оцінки частот індукованих іонізуючим випроміненням мутаційних подій є досить перспективним, однак вимагає подальшого всебічного вивчення та розробки чітких критеріїв спонтанного й індукованого мутагенезу.

Висновки

Порівняльний аналіз конститутивних мутацій у дітей із вродженими вадами розвитку (ВВР), народжених до і після Чорнобильської катастрофи, і спектрів цитогенетичних аномалій в соматичних клітинах у дітей, які зазнали впливу іонізуючого випромінення, свідчить про відсутність прямого зв'язку між їх появою і змінами радіаційного фону.

Найпоширенішими хромосомними перебудовами у обстежених груп дітей є делеції, інверсії і транслокації. У дітей із ВВР серед конститутивних цитогенетичних аномалій їх частота становила, відповідно, 31,4 %, 25,7 %, 17,1 %; а у соматичних клітинах периферичної крові дітей, які зазнали впливу іонізуючого випромінення - 49,2 %, 11,1 %, 14,2 %.

У дітей із ВВР при схожих анатомо-фізіологічних дефектах розвитку виявлені різні типи цитогенетичних аномалій, що вказує на відсутність прямих зв'язків між цитогенетичними аномаліями і типами ВВР.

Не виявлено прямих зв'язків між народженням дітей із ВВР, які є носіями конститутивних цитогенетичних аномалій, і віком їхніх батьків.

Серед дітей із ВВР у конститутивні хромосомні аномалії найчастіше залучаються хромосоми 9, 13, 18 (відповідно 22,8 %, 11,4% і 11,4 %), що може свідчити про певну незалежність механізмів формування цитогенетичних дефектів і ВВР. Слід очікувати, що феноменологічний збіг вказаних явищ в значній мірі зумовлений загальним підвищенням нестабільності генетичного матеріалу.

Групи дітей, які були опромінені внутрішньоутробно і ті, які мешкають на забруднених радіонуклідами територіях, не відрізнялися за сумарними частотами зустрічальності цитогенетичних аномалій у клітинах периферичної крові (2,50,4 % і 1,30,4 відповідно), однак у перших майже в тричі частіше (Р<0,02) зустрічались стабільні хромосомні аберації (транслокації, інверсії, інсерції) (1,00,2% проти 0,30,1).

У дітей, які зазнали радіаційного впливу на різних етапах онтогенезу, внутрішньохромосомні дефекти та міжхромосомні обміни найчастіше виявляли в хромосомах груп А, В, С і D, а анеуплоідію - у групах Е, F, G, на тлі вираженої індивідуальної мінливості. Це не відповідає припущенню щодо прямого зв'язку між розміром хромосоми і її участю в мутаційних подіях.

Аналіз поліморфізму фрагментів ДНК, фланкованих мікросателітнимі локусами (ISSR-PCR маркери), в теперешній час не може застосовуватися для оцінки частот спонтанних та індукованих мутаційних подій. Для удосконалення цього методу необхідне подальше вивчення механізмів формування нестабільних продуктів ампліфікації, що ускладнюються наявністю у людей вираженої індивідуальної мінливості та істотних відмінностей при оцінці поліморфізму залежно від особливостей нуклеотидної послідовності праймера.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

Настюкова В.В., Степанова Е.И., Глазко В.И. Цитогенетические эффекты у детей при разных условиях воздействия малых доз ионизирующего излучения// Цитология и генетика. - 2002. -Т.6 -С. 45-52.

Настюкова В.В., Степанова Е.И, Глазко В.И. Хромосомные аномалии у детей, подвергшихся воздействию малых доз ионизирующей радиации.// Доп. НАНУ. -2002. - № 11. -С. 187-193.

Настюкова В.В. Поліморфізм фрагментів ДНК, фланкованих мікросателітними повторами САС та GTG у людини (ISSR-PCR маркери)// Генетика і селекція в Україні на межах тисячоліть.К. “Логос” - 2001. - Т.1 -С.391-397.

Настюкова В.В., Баронова Е.В. Распространенность цитогенетических аномалий у детей с врожденными пороками развития (ВПР)// Цитология и генетика. - 2000. -Т. 34, № 3.-С.49-54.

Ковалева О.А., Настюкова В.В., Баронова Е.В., Глазко Т.Т. Хронические низкодозовые воздействия ионизирующего облучения как индуктор цитогенетических аномалий// Гигиена населенных мест. - 2000.- Т. 36 - С. 99-104.

Баронова Е.В., Настюкова В.В., Коблянская Г.Н. Цитогенетическое обследование в Киевском межрегиональном медико-генетическом центре за 6 лет (1991-1997 г.г.)// Тез. док. Актуальные проблемы диагностики, лечения и профилактики наследственных заболеваний у детей. - Москва Россия - 1998. -С.5.

Nastjukova V., Baronova E. Frequency of cytogenetic anomalies in children with inborn malformation// Cytogenetics and cell genetics. Оf the second european cytogenetics conference.-Vienna (Austria). -1999. - Р.157.

Баронова Е.В., Настюкова В.В., Підченко Т.Ю. Випадок транслокації між хромосомами 15 та 21// Ехографія в перінатології, гінекології та педіатрії. 5 збірник наук. праць укр. асоціації лікарів УЗД в перінатології та гінекології. Кривий Ріг. -1999. -С.172.

Баронова Е.В., Настюкова В.В., Коблянская Г.Н. Цитогенетические исследования в киевском медико-генетическом центре // Ехографія в перінатології, гінекології та педіатрії. 5 збірник наук. праць укр. асоціації лікарів УЗД в перінатології та гінекології. Кривий Ріг. -1999. -С.171-172.

Настюкова В.В., Дубин А.В., Глазко В.И. Анализ некоторых характеристик ISSR-PCR маркеров// Тез. докл. III Межд. конференции Молекулярно-генетические маркеры животных. Киев. -1999.- С.19-20.

Ковалева О.Н., Настюкова В.В., Баронова Е.В., Глазко Т.Т. Генетические аспекты дестабилизации кариотипа в условиях хронического низкодозового воздействия ионизирующего облучения// Тез. докл. III Межд. конференции Молекулярно-генетические маркеры животных. Киев. - 1999. -С.58-59.

Ковалева О.А., Настюкова В.В., Баронова Е.В., Глазко Т.Т. Конститутивные цитогенетические аномалии и хроническое воздействие ионизирующего облучения// Матеріали науково-практичного семінару І-ту землеробства УААН. Киев. -1999. -С. 288-289.

Баронова В.В., Настюкова В.В., Цыганкова М.А., Радзиховская Е.В. Цитогенетическая характеристика пациентов, обследованных в киевском МГО УДСБ “ОХМАТДЕТ”// Збірник тез II-й Конгресу Української асоціації спеціалістів УЗД в перинатології, генетиці та гінекології. Харків. - 2000. -С.235-236.

Анотація

Настюкова В.В. Мутаційні спектри у різних груп дітей, які зазнали впливу низькодозового іонізуючого випромінення - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук зі спеціальності 03.00.15.- генетика. Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАНУ, Київ, 2003.

Дисертація присвячена виявленню специфічних особливостей розподілу цитогенетичних мутаційних спектрів у груп дітей, які народилися до, або після Чорнобильської аварії (діти із ВВР, опромінені внутрішньоутробно, та діти, які мешкають на забруднених радіонуклідами територіях). Оцінено інформативність спектрів різних типів цитогенетичних аномалій та поліморфізму фрагментів анонімної ДНК. Отримані дані свідчать про те, що частоти зустрічальності різних цитогенетичних аномалій мають складну характеристику. Відсутні прямі зв'язки між носійством певних цитогенетичних аномалій та наявністю анатомо-фізіологічних дефектів; не виявлено статистично достовірних відмінностей у опромінених груп дітей у клітинах крові щодо загальної зустрічальності різних типів хромосомних аномалій. Оцінка спектрів продуктів ампліфикації фрагментів ДНК, фланкованих мікросателітними локусами, з метою виявлення індукованих мутацій в групах людей є досидь складною і залежить від особливостей нуклеотидної послідовності, що використовується як праймер.

Ключові слова: каріотип, вроджені вади розвитку, цитогенетичні аномалії, іонізуюче випромінення.

Аннотация

Настюкова В.В. Мутационные спектры у разных групп детей, подвергшихся воздействию низкодозового ионизирующего излучения. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15. - генетика. Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАНУ, Киев, 2002.

Проблема изучения последствий генотоксических воздействий у людей, в частности, ионизирующего излучения, приобрела особую актуальность после Чернобыльской катастрофы. До сих пор остаются недостаточно изученными генетические последствия у потомков людей, попавших под воздействие повышенного ионизирующего излучения. Одной из причин этого является сложность методов выявления таких последствий.

В этой связи в настоящей работе выполнен сравнительный анализ спектров конститутивных цитогенетических аномалий у детей с врожденными пороками развития, родившихся до и после Чернобыльской аварии, различных типов цитогенетических аномалий в клетках периферической крови у групп детей, подвергавшихся действию острого (in utero) и хронического ионизирующего излучения, а также рассмотрена возможность привлечения к оценке генотоксических эффектов метода анализа полиморфизма фрагментов ДНК, фланкированных микросателлитными локусами (ISSR-PCR).

При сравнительном анализе хромосомных патологий у групп детей с врожденными пороками развития (ВПР), рожденных до и после Чернобыльской аварии, не обнаружено появления таких цитогенетических аномалий, которые можно было бы рассматривать как специфическое последствие действия ионизирующего излучения. Не выявлено прямых связей между носительством определенных цитогенетических аномалий и характеристиками анатомо-физиологических дефектов. Не обнаружено прямых связей между рождением детей с ВПР, несителей конститутивных цитогенетических аномалий, и возрастом их родителей. В конститутивные хромосомные аномалии чаще всего вовлекаются хромосомы 9, 13, 18, что может свидетельствовать об определенной независимости механизмов формирования цитогенетических дефектов и формирования врожденных пороков развития. Отмечается тенденция к увеличению носителей конститутивных хромосомных аномалий у детей с ВПР, родившихся после 1986. Можно ожидать, что такое увеличение отражает общую неспецифическую дестабилизацию генетического материала, приводящую и к формированию конститутивных цитогенетических аномалий, и к возникновению ВПР.

При оценке цитогенетических последствий воздействия ионизирующего излучения в соматических клетках у двух групп детей (первая - облученные in utero, вторая - проживающие на загрязненной радионуклидами территории), в клетках периферической крови не выявлено статистически достоверных различий между этими группами по частотам встречаемости в среднем на одного ребенка различных типов хромосомных аномалий, однако после острого облучения (in utero) у детей статистически достоверно чаще, чем во второй группе, встречаются стабильные хромосомные аномалии (транслокации, инверсии, инсерции). Вовлечение хромосом разного размера в цитогенетические аномалии имело индивидуальную специфику и широко варьировало от одного индивидуума к другому. Не выявлено прямой зависимости участия хромосом в мутационных событиях от их размера.

Семейный анализ передачи спектров продуктов амплификации фрагментов ДНК, фланкированных микросателлитными локусами (ISSR-PCR) на модельном объекте свидетельствует о возможности формирования нестабильных ампликонов, которые могут ошибочно рассматриваться как индуцируемые мутации. Результаты исследований на людях подтверждают экспериментальные данные о том, что, несмотря на идентичные коровые последовательности, наличие разных якорей на флангах микросателлитного праймера приводит к получению качественно разных спектров ампликонов. Обращает на себя внимание также то обстоятельство, что эти спектры у людей являются существенно более сложными, чем у модельных объектов. Обнаружено, что полиморфизм и воспроизводимость спектров ампликонов зависит от особенностей нуклеотидной последовательности, используемой в качестве праймера и, кроме того, имеет широкую индивидуальную изменчивость у исследованных групп людей. Сложность использования ISSR-PCR маркеров для выявления последствий генотоксических воздействий, по-видимому, обусловлена недостаточной изученностью механизмов формирования продуктов амплификации при использовании в качестве праймеров фрагментов микросателлитных локусов.

Ключевые слова: кариотип, врожденные пороки развития, цитогенетические аномалии, ионизирующее излучение.

Summary

Nastjukova V.V. Mutation spectra in different children groups experiencing influence of low dose ionizing irradiation - Manuscript.

Thesis on competition of a scientific degree of candidate in biological sciences with specialities 03.00.15.- genetics. Institute of cell biology and gene engineering NASU, Kiev, 2002.

Dissertation is devoted to investigation of specific peculiarities of cytogentic mutation spectra distribution in different children groups, which were born before and after Chernobyl's accident (children with inborn defect development - IDD, ones ionizing in utero and children, which lived on the radionuclic pollution zones). The informativity of spectra of different cytogenetic anomaly types and polymorphous DNA fragments (ISSR-PCR markers) was evaluated. It was revealed, that the frequencies of different cytogenetic anomalies had the complex characters. The direct relation between carrying of determined type of cytogenetic anomalies and the presence of specific anatomy-physiological defects was absent; the differences in ionizing children groups on the frequencies of different cytogenetic anomalies (in summary) were not revealed. The evaluation of amplification spectra of DNA fragments, which flanking by microsatellite loci with the aim of inducing mutation revealing in people was very complex and related from nucleotide sequences, which used as primer.

...