Органні особливості раннього гістогенезу первиної та кінцевої нирки у людини

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал і методи дослідження. Вивчені 121 зародок людини, що розвивалися в матці за відсутності явно виражених ушкоджувальних чинників зовнішнього і внутрішнього середовища, отриманих при медичних абортах в 1-му пологовому будинку і в гінекологічному відділенні 6-ої міської лікарні м. Сімферополя. Одночасно були використані серійні зрізи з колекції «Крим» Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгієвського. Зародки фіксували 10% нейтральним формаліном. Оглядові препарати забарвлювали гематоксиліном і еозином. Колагенові волокна визначали методом фарбування пікрофуксином за Ван-Гізоном та по Маллорі. Аргирофільні волокна визначали імпрегнацією сріблом згідно методу Гоморі (В. В. Семченко та співавт., 2006).

Лектиногістохімічні методи дослідження. Серійні зрізи після депарафінізації занурювали в 96 градусний етанол, а потім для інактивації ендогенної пероксидази інкубували 20 хвилин в метанолі, що містить 0,3% перекиси водню. Препарати обробляли із застосуванням стандартних наборів НВК «Лектінотест» м. Львів в розведенні лектину 1:50 за рекомендованою методикою (А.Д. Луцик, Е.С. Детюк, М.Д. Луцик, 1989). Візуалізацію місць скріплення лектину проводили в системі діамінобензидин-перекис водню. Контроль специфічності реакції здійснювали шляхом виключення з схеми обробки препаратів діамінобензидину. Використовували: лектин бузини чорної (SNA), специфічний до кінцевих нередукуючих залишків N-ацетилнейрамінової (сіалової) кислоти глікополімерів; лектин арахісу (PNA), специфічний до -D-галактози: лектин рицину (RCA), специфічний до -D-галактози, екранованої сіаловою кислотою; лектин чечевиці харчовий (LCA), специфічний до -D-маннози; лектин сої (SBA) і лектин виноградного равлика (HPA), специфічні до N-ацетил-D-галактозаміну; лектин бульб картоплі (STA), специфічний до N-ацетил-D-глюкозаміну; лектин зародків пшениці (WGA), специфічний до N-ацетилнейрамінової кислоти і у меншій мірі - до N-ацетил-D-глюкозаміну і лектин бобчука анагиролистного (LABA), специфічний до -L-фукози. Інтенсивність фарбування зрізів різними лектинами оцінювалася в балах методом напівкількісної оцінки.

Гістохімічні методи дослідження. Глікоген і глікопротеїни виявляли ШІК-реакцією з ферментативним контролем (А. Хем, Д. Кормак, 1983). Кількість ШІК-позитивних речовин в зрізах вимірювали за допомогою цитоспектрофотометру, сконструйованого на базі ультрафіолетового мікроскопа МУФ-3М і спектрофотометра СФ-4А при довжині хвилі 575 нм. Цифрові дані піддавали статистичній обробці з обчисленням перших параметрів розподілу. Глікозаміноглікани визначали за допомогою забарвлення толуїдиновим синім при різних значеннях рН (від 2,0 до 8,0) буфера Міхаєліса з контролем тестикулярної і стрептококовою гіалуронідазою.

Способи отримання морфометричної інформації і методи математичної обробки. Всі морфометричні вимірювання робилися в зрізах зародків людини, забарвлених гематоксиліном і еозином. Такі препарати піддані світлооптичному аналізу і морфометрії з використанням програми Image Tool Version 2.0 (alpha 2) фірми UTHSCSA. У зрізах первинної і постійної нирок визначали площу мезонефральних і метанефральних ниркових тілець, просвітів капсул тілець і судинних клубочків. У мезонефральних тільцях також визначали площу зовнішнього листка капсул тілець. У кожному об'єкті дослідження (мезонефрос, метанефрос) вимірювали 30-100 тілець. Всього в кожній віковій групі вимірювали 180-500 тілець залежно від числа об'єктів.

Статистична обробка даних морфометрії проведена на IBM PC з використанням електронних таблиць “Microsoft Excel”. Визначали середні величини площ, середні величини об'ємних показників, помилку середнього, середнє квадратичне відхилення.

Незалежні варіаційні ряди інтенсивності фарбування клітин епітеліальних і мезенхімних закладок первинної і кінцевої нирок різними лектинами, оцінювана в балах, також піддана статистичному аналізу на предмет приналежності до однієї або різним генеральним сукупностям за допомогою непараметричного статистичного парного T-критерію Вілкоксона.

Результати роботи та їх аналіз. Мезонефрос - провізорний орган, який існує в організмі обмежений час. У кожен момент існування він є результатом динамічної рівноваги процесів морфогенезу, функціонування та інволюції. У первинній нирці одночасно відбувається формування нових нефронів в каудальній частині, функціонування диференційованих структур центральної частини, інволюція мезонефральних нефронів краніальної частини. Диференційований мезонефрон має S-подібні контури, починається мезонефральним тільцем, з якого виходить каналець, здійснює вигин, продовжується в дорсальному напрямі, робить другий вигин, йде вентро-латерально і відкривається в мезонефральну протоку. Принципово мезонефральне тільце має таку ж будову, що і ниркове тільце постійної нирки, проте, мезонефральні тільця мають відмітні ознаки, до яких ми відносимо гістотопографію і перерозподіл глікополімерів, - рецепторів лектинів, варіабельність розмірів і форми тілець. Важливою ознакою, що володіє значною інформативністю, є розміри елементів мезонефросу: середня площа мезонефральних тілець є інтегральним показником, складовими якого є площі судинного клубочка, епітелію зовнішнього листка капсули, сечового простору тільця. Нами виділений органотиповий інтервал розмірів ниркових тіл мезонефронів, в межах якого величина кожного параметра тільця мезонефрону більше або рівна різниці між його середнім арифметичним значенням і середнім квадратичним відхиленням (М-?), але менша або рівна сумі його середнього арифметичного значення і середнього квадратичного відхилення (М+?). В межах органотипового інтервалу розташовуються мезонефрони, чиї морфометричні характеристики найчастіше зустрічаються, а значить і найбільш типові для даного органу.

На основі аналізу змін морфометричних показників компонентів мезонефрального нефрону нами виділено протягом всього терміну спостереження наступні етапи: до 5 тижнів (зародки 35 діб, 6,5 мм довжини), 5,5 - 9 тижнів (зародки 37 - 62 діб, 9-32 мм довжини), після 9,5 тижнів (зародки 45 мм довжини) пренатального онтогенезу.

До 5 тижнів відбувається зростання структурно-функціональних одиниць органу. Структури досягають розмірів, що забезпечують об'єм мезонефральної ультрафільтрації, адекватний рівню метаболізму ембріона. У метанефральному зачатку в цей час відбувається галуження метанефритичної протоки і початок формування кулястих зачатків нефронів.

Другий етап з 5,5 до 9 тижнів пренатального онтогенезу ми розцінюємо як етап структурно-функціональної стабільності мезонефросу. У цей період абсолютні величини і співвідношення компонентів мезонефрального тільця зберігають відносну стабільність. Частка судинного клубочка в об'ємі тельця складає 41,62 - 50,60%, частка сечового простору - 3 1,88 - 41,51%, частка епітелію зовнішнього листка - 17,94 - 21,18%. Найбільше число мезонефральних нефронів мають параметри в межах органотипового інтервалу. У зачатку постійної нирки активізуються органогенез і диференціювання зачатків нефронів на тлі зростання кінцевих гілок дивертикула Вольфової протоки. Виявляються перші ознаки функціонування нефронів першої генерації. Цей етап розвитку характеризується тим, що в організмі зародка функціонують два екскреторних органи. Існує унікальна екскреторно-гомеостатичні система, що складається з функціонуючих мезонефросу, - первинної нирки і метанефросу - постійної нирки. Структурно морфометричні характеристики мезонефральних і метанефральних тілець мають загальні стандарти. Це розцінюється нами як ознака того, що реалізація даних морфогенезів відбувається за єдиними принципами. До 9 тижнів у зародків у віці 62 діб (32 мм довжини) в метанефросі присутньо дві генерації нефронів, перша з яких розташована на межі з мозковою речовиною, друга, - по периферії органу. Перша генерація нефронів представлена диференційованими нирковими тільцями і канальцями, що обумовлює збільшення середніх площ ниркових тілець і судинних клубочків.

Переважання інволюції над морфогенетичними і функціональними процесами виявляється в мезонефросі після 9 тижнів (зародки 32 мм довжини). Наростає колапс гломерулярних капілярів, зменшуються розміри судинних клубочків. З цієї причини тельця при збереженні відносно незмінними загальних розмірів мають великий об'єм сечового простору. Частина канальців запустівають, інша частина канальців зберігає просвіт.

Найбільш демонстративно ця періодизація виявляється при порівнянні середніх величин площ судинних клубочків мезонефральних тілець і ниркових тілець постійної нирки у зародків людини. З 4,5 до 7,5 тижнів в організмі зародка (5,5-23 мм довжини) присутні тільки мезонефральні структури, з 7,5 тижнів до 9,5 тижнів (зародки 23-33 мм довжини) присутні і мезонефральні, і метанефральні судинні клубочки, при цьому структури мезонефросу зберігають морфометричну стабільність, а судинні клубочки постійної нирки динамічно ростуть. Після 10 тижнів (зародки 45 мм довжини) зростання метанефральних судинних клубочків зберігається на тлі зменшення розмірів мезонефральних судинних клубочків. Виявляється дегенерація тілець метанефронів першої і другої генерацій.

Гістохімічне диференціювання клітинних елементів і міжклітинної речовини мезо- і метанефросу зумовлює морфологічну. Нами вивчені і зіставлені закономірності гістохімічного диференціювання мезонефросу , що розвиваються, і метанефросу з урахуванням топографії органів, що змінюється. У найранішого з вивчених нами зародків у віці 24 діб (3,2 мм довжини) при забарвленні реактивом Шиффа в клітинах канальців мезонефросу, що формуються, і Вольфової протоки в наявних в цьому віці краніальних відділах виявляється невелика кількість глікогену у вигляді червоно-фіолетових гранул. Мала кількість дрібно розпорошеного глікогену визначається в клітинах мезенхіми. Глікопротеїни відсутні.

У 35-39 денних зародків (6,5-10 мм довжини) в первинній нирці виявляється високо диференційована ембріональна сполучна тканина (ЕСТ), до складу якої входять клітини фібробластичного ряду і волокнисті елементи. Колагенові волокна залишаються незрілими. У клітинах строми рано починають з'являтися різні комплекси полісахаридів, причому зміна біосинтезу одних груп іншими відбувається дуже швидко. Початок другого місяця ембріогенезу є періодом найбільш інтенсивних обмінних процесів. У цей же період в сполучній тканині первинної нирки відбувається найбільш прискорений процес волокноутворення, тоді як в остаточній нирці він розтягнутий в часі. органогенез проміжний мезодерма епітеліальний

В остаточній нирці найбільш прискорено розвивається ЕСТ перших галужень метанефритичної протоки, що дають початок баліям і великим чашкам. На 11-12-у тижні виявляються ознаки зниження обмінних процесів і дегенерації нефронів перших двох генерацій.

Таким чином, у міру розвитку ЕСТ мезонефросу і метанефросу відбувається послідовне ускладнення процесів біосинтезу полісахаридів: глікоген - глікопротеїни - гіалуронова кислота - хондроїтинсульфати А і С. Затем синтезуються аргирофільні і колагенові волокна. Епітеліальні закладки обох нирок багатше ШІК- позитивними речовинами, ніж мезенхімні закладки, на всіх етапах розвитку. Вміст ШІК- позитивних речовин в епітеліальних закладках завжди вищий, ніж в мезенхімних у вивчений відрізок пренатального онтогенезу. Мезенхімні закладки по рівню синтезу глікогену і глікопротеїнів не досягають епітеліальні закладки. Періепітеліальна мезенхіма диференціюється швидше, ніж така, що не має контакту з епітеліальними закладками. Диференціювання мезенхіми в ЕСТ в мезонефросі відбувається в краніо-каудальному напрямі.

За допомогою набору лектинів з вуглеводною специфічністю до всіх можливих моносахаридним залишкам, присутніх в глікополімерах людських тканин, нам вдалося простежити послідовні етапи морфогенетичних перетворень епітеліальних і мезенхімних закладок мезонефросу і метанефросу. Виявлений ефект поступової зміни глікоконюгатів на поверхні і в цитоплазмі клітин в процес їх диференціації та органної спеціалізації, що відображають послідовність включення різних механізмів диференціювання.

Проведене нами порівняльне дослідження змісту рецепторів лектинів WGA, SNA і STA в епітеліальних і мезенхімних закладках мезонефросу і метанефросу дозволило виявити, що гістогенетичні формоутворюючі процеси, пов'язані з міграцією і диференціюванням епітеліоцитів, створюючих нефрони, корелюються з біосинтезом і перерозподілом сіалоконюгатів і N-ацетил-D-глюкозаміноконюгатів.

З літературних джерел відомо, що сіалування залишків D-галактози зв'язано з підвищенням міграційних характеристик клітин (N. Milos, H.C. Wilson, 1986; Р.Э. Якшибаєва, 2006). Співвідношення D-галактоза / сіалова кислота на поверхні клітин може служити регулятором рівноважної системи адгезія-міграція у складі ранніх зародків (D.W. De Simone, M. Spiegel, 1986; N. Milos, H. C. Wilson, 1986). Порівняльне дослідження гістотопографії рецепторів лектину арахісу і лектину рицини показало, що процес розквіту і регресії нефронів первинної нирки, закладка і розвиток нефронів кінцевої нирки в перші 12 тижнів ембріогенезу пов'язаний з редукцією або відщеплюванням сіалової кислоти і оголенням кінцевого нередукуючого залишку -D-галактози, що, за даними літератури, свідчить про зниження міграційних характеристик клітин і підвищення їх адгезії.

Присутність на цитолеммі клітин глікоконюгатів з кінцевими залишками N-ацетил-D-галактозаміну (рецептори лектинів сої і виноградного равлика) багато дослідників пов'язують з підвищенням агрегаційних характеристик клітин (О.А. Хомутовский та співавт., 1986; И. В. Твердохлеб, И.С. Шпонька, 1998). В період розквіту нефронів зростає впорядкованість структур, що призводить до значної експресії N-ацетил-D-галактозаміноконюгатів, що забезпечують адгезію клітин. В процесі регресії спостерігається розпад впорядкованої структури, можливо, за рахунок редукції рецепторів лектинів сої і виноградного равлика.

Відомо, що в ембріональному періоді маннозомісткі глікоконюгати (рецептори лектину сочевиці) грають роль в специфічному пізнаванні клітиною її мішеней і в підвищенні міжклітинної адгезії (M.M. Brysk, S. Rajaraman, 1986; M. Webb, V. Gallo, 1985). Маннозокон'югати з'являються в невеликій кількості тільки під час розквіту мезонефросів. Найбільш багата LCA-позитивним матеріалом апікальна поверхня канальців. Фібробласти періепітеліальній ЕСТ мають глікополімери з кінцевим залишком альфа-D-маннози в невеликих кількостях на цитолеммі. Регрес мезонефронів не призводить до повного зникнення фукозоконюгатів в зредукованих залишках нефронів.

У кінцевій нирці закладка нефронів чотирьох генерацій у вивчених відрізок ембріогенезу супроводжується помірним, а потім сильним накопиченням маннозомістких біополімерів.

Конкретну функцію фукозоконюгатів в пренатальному онтогенезі за даними літератури простежити не вдається. Закладка мезонефронів первинної нирки супроводжується помірним накопиченням глікополімерів з кінцевими нередукуючими залишками альфа-L-фукози на цитолеммі клітин клубочків. У цитоплазмі цих клітин таких з'єднань менше. Клітини ЕСТ мають фукозоконюгати у великих кількостях на цитолеммі. У кінцевій нирці закладка нефронів перших чотирьох генерацій супроводжується аналогічною експресією рецепторів лектину бобчука анагиролистного. На 10-му і 11-му тижнях виявлено зниження концентрації LABA-позитивних макромолекул описаної гістотопографії.

Нами отримано, що послідовність експресії і редукції глікополімерів, що є рецепторами лектинів бульб картоплі, арахісу, рицини, сої і виноградного равлика та їх кількість у міру розвитку зародків в перші 12 тижнів ембріогенезу в закладках мезонефронів статистично вірогідно не відрізняється від таких в закладках метанефронів, а для рецепторів лектинів зародків пшениці, бузини чорною, бобчука анагиролистного і сочевиці статистично вірогідно такої закономірності немає (рис. 1 і рис. 2).

Рис. 1 - Вміст рецепторів лектинів на цитолеммі клітин судинних клубочків мезонефронів мезонефросу.

Рис. 2 - Вміст рецепторів лектинів на цитолеммі клітин судинних клубочків метанефронів метанефросу.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі представлено комплексне дослідження органних особливостей раннього гістогенезу первинної і кінцевої нирки у людини, що дозволяє узагальнити і поглибити знання на морфологічному, лектиногістохімічному, гістохімічному і морфометричному рівнях про те, що мезонефрос слід розглядати як модель-попередник постійної нирки, а структурно-функціональні мезонефральні одиниці - мезонефрони як базисну передумову формування функціонально - виправданих структур постійної нирки, які закріплюються і забезпечують еволюцію органів сечовиділення.

1. Реалізація провізорних і дефінітивах органогенезів проміжної мезодерми при формуванні мезо- і метанефросу відбувається за допомогою однакових формоутворюючих процесів, ознакою яких є послідовне формування зачатків у вигляді щільних кулястих структур, епітеліальних бульбашок і S-подібних структур. Органоспецифічне диференціювання мезонефральних епітеліальних похідних реалізується в краніо-каудальному напрямі, а метанефральних - від центру до периферії, аналогічно краніо-каудальному напряму.

2. Мезонефрос є провізорним органом, що існує в ембріональному і початку плодового періодах пренатального онтогенезу, формується в результаті реалізації провізорних гісто- і органогенезів, що виконує екскреторно-гомеостатичну і морфогенетичні функції. Розвиток мезонефросу характеризується етапністю і складається з періодів становлення, структурно-функціональної стабільності та інволюції: закладка і структурне становлення відбувається до 5 тижнів ембріогенезу, період структурно-функціональної стабільності органу - з 5,5 до 9 тижнів, після 9,5 тижнів наростають інволютивні процеси.

3. Структурно-функціональною одиницею мезонефросу є мезонефральний нефрон, що складається з мезонефрального тільця і канальця. Мезонефральні тільця характеризуються варіабельністю розмірів і форми тілець, судинних клубочків і сечових просторів, висоти епітелію парієнтального листка капсули, але на етапі структурно-функціональної стабільності мезонефросу існує закономірний діапазон величин морфометричних параметрів елементів мезонефрального нефрону, визначуваний як органотиповий інтервал, який може розглядатися як критерій завершеності провізорного органогенезу мезонефросу.

4. При формуванні постійної нирки здійснюються дефінітиви гісто- і органогенези, основу яких складають формооутворюючі процеси, еволюційно закріплені в ході реалізації мезонефральних провізорних гісто- і органогенезів. Утворення нефронів постійної нирки відповідає етапам мезонефрального морфогенезу з подальшим морфологічним прогресом і придбанням ознак дефінітиву органогенез. Становлення різних генерацій нефронів постійної нирки є реалізацією краніо-каудального морфогенетичного мезонефрального градієнта. Постійна нирка на ранніх етапах ембріогенезу є балансом процесів новоутворення, функціонування і інволюції нефронів аналогічно життєвому циклу мезонефросу.

5. Епітеліальні закладки обох нирок багатші ШІК-позитивними речовинами, ніж мезенхімні закладки, на всіх етапах розвитку. Вміст ШІК-позитивних речовин в епітеліальних закладках завжди вищий, ніж в мезенхімних. Особливості ускладнення вуглеводного обміну аналогічні у міру розвитку ЕСТ і включають синтез глікогену - глікопротеїнів - гіалуронової кислоти - хондроїтинсульфатів А і С. Потім синтезуються аргирофільні і колагенові волокна. Диференціювання мезенхіми в ЕСТ в мезонефросі відбувається в краніо-каудальному напрямі.

6. Послідовність експресії і редукції глікополімерів, що є рецепторами лектинів бульб картоплі, арахісу, рицини, сої і виноградного равлика та їх кількість у міру розвитку зародків в перші 12 тижнів ембріогенезу в закладках мезонефронів статистично вірогідно не відрізняється від таких в закладках метанефронів, а для рецепторів лектинів зародків пшениці, бузини чорної, бобчука анагиролистного і сочевиці статистично вірогідно такої закономірності немає.

7. Дегенерація нефронів перших двох генерацій метанефросу пов'язана з редукцією в епітеліальних і мезенхімних закладках сіалоконюгатів (рецептори лектину зародків пшениці і бузини чорної), фукозоконюгатов (рецептори лектину бобчука анагиролистного), N-ацетил-D-глюкозаміноконюгатів (рецептори лектину бульб картоплі) і N-ацетил-D-галактозаміноконюгатів (рецептори лектинів сої і виноградного равлика).