Корекція порушень антиоксидантної системи крові та клітин кісткового мозку нікотинамідом

Размещено на http://www.allbest.ru/

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

КОРЕКЦІЯ ПОРУШЕНЬ АНТИОКСИДАНТНОЇ СИСТЕМИ КРОВІ ТА КЛІТИН КІСТКОВОГО МОЗКУ НІКОТИНАМІДОМ

Спеціальність: Гематологія та біохімія

БІРОНТ НАДІЯ ВОЛОДИМИРІВНА

Львів, 2004 рік

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Згідно з даними ВООЗ цукровий діабет (ЦД) посідає третє місце за поширенням після серцево-судинних і онкологічних захворювань. У 2000 р. у світі налічувалось 177 млн. хворих, з них 1 млн. в Україні. Поєднання екологічних чинників і спадковості сприяє розвитку автоімунних процесів, які викликають руйнування в-клітин підшлункової залози у генетично чутливих осіб, що є головною причиною ЦД І типу (Балаболкин М.И., 2000).

У таких хворих у разі тривалої хвороби часто розвиваються анемії, переважною причиною яких є зміни в кровопостачанні нирок та розвиток у них деструктивних процесів, діабетичні нефропатії, дія уремічних токсинів (Смикодуб О.І., 2002). Суттєві порушення у постачанні тканин киснем, які виявляються за цієї патології (Браславская Г.М., 1980), можуть зумовити зміни в процесах кровотворення в кістковому мозку (Гущин В.А., 1984). Однак ці процеси на сьогодні досліджені недостатньо.

Головними підходами до лікування ЦД I типу є інсулінотерапія, проте, паралельне застосування інших препаратів може впливати на потребу організму в інсуліні (Корпачев В.В., 2001). Застосування нікотинаміду (НАм) - водорозчинного аміду нікотинової кислоти - сприяє тимчасовим послабленням чи зникненням ознак діабету за введення інсуліну (Нагорна О.О., 2003).

Постульовано декілька можливих механізмів захисної дії НАм за умов діабету: антиоксидантний ефект (Farber J., 1990), регулювання процесів полі(ADP)-рибозилювання (Virбg L., 2002), безпосереднє поповнення запасів клітинного NAD+ (Могилевич С.Е., 1981), регулювання редокс-стану NAD(P), регулювання поліолового шляху метаболізму глюкози. З'ясовано, що введення НАм пацієнтам з ЦД I типу та щурам з експериментальним стрептозотоциновим діабетом сприяє зниженню вмісту антитіл до в-клітин та гальмуванню автоімунних процесів (Reddy S., 1995).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є частиною фундаментальних досліджень науково-дослідної лабораторії “Радіаційної та молекулярної біології” Львівського національного університету імені Івана Франка за темою: “Регуляторна дія НАД та гістидинвмісних дипептидів у корекції метаболічних порушень при гіпоксії різної етіології” (№ державної реєстрації 0100U001443). Автор дисертаційної роботи є одним з виконавців названого вище дослідження.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи - з'ясувати участь НАм у процесах перекисного окислення ліпідів і в функціонуванні системи антиоксидантного захисту клітин еритроїдного (ЕР) та гранулоцитарно-моноцитарного (ГМР) рядів кісткового мозку й еритроцитів за умов стрептозотоцинового діабету.

Відповідно до поставленої мети вирішували такі завдання:

- Дослідити вміст продуктів ПОЛ та активність ферментів антиоксидантного захисту в еритроцитах і клітинах ЕР та ГМР кісткового мозку щурів зі стрептозотоциновим діабетом;

- З'ясувати можливий коригувальний вплив НАм на процеси ПОЛ та функціонування системи антиоксидантного захисту як в еритроцитах, так у клітинах ЕР та ГМР кісткового мозку;

- Дослідити вплив НАм на процес кислотного гемолізу еритроцитів за умов стрептозотоцинового діабету;

- Визначити в еритроцитах тварин вміст креатину як показника інтенсивності еритропоезу;

- Вивчити особливості нітрозилювання дезоксигемоглобіну оксидом азоту in vitro, а також вплив НАм на цей процес;

- У дослідах in vitro дослідити нітритредуктазну активність дезоксигемоглобіну за умов діабету і введення НАм.

Об'єкт досліджень - оксидаційний стрес за умов стрептозотоцинового діабету та внутрішньо-м'язового введення НАм в еритроцитах та їхніх попередниках у кістковому мозку. Морфологічний стан кровотворної тканини кісткового мозку. Предмет досліджень - продукти ПОЛ та ферменти антиоксидантного захисту як показники оксидаційного стресу, морфологічні показники препаратів КМ, вміст креатину та стійкість еритроцитів до кислотного гемолізу як показники активності еритропоезу, дезоксигемоглобін як джерело синтезу оксиду азоту за нітритредуктазним механізмом, нітрозогемоглобін.

Методи досліджень. Цитологічні дослідження клітин кісткового мозку, які отримували гравіметричним методом розділення. Кількісна оцінка біохімічних показників та інтенсивності еритропоезу із застосуванням методів спектрофотометрії, колориметрії для дослідження модифікацій Hb in vitro та оцінки ефективності застосування нікотинаміду.

Наукова новизна одержаних результатів. Виконаними дослідженнями вперше виявлено зміни в активності головних антиоксидантних ферментів та підвищення вмісту первинних продуктів ПОЛ у кровотворних клітинах КМ за умов експериментального стрептозотоцинового діабету. Визначено підвищення нітритредуктазної активності дезоксигемоглобіну за умов стрептозотоцинового діабету.

З'ясовано, що введення НАм підвищує стійкість еритроцитів до кислотного гемолізу, водночас збільшується вміст креатину в еритроцитах щурів, що свідчить про активацію еритропоезу. Зафіксовано, що введення НАм зменшує інтенсивність відновлення нітрит-іона за участю дезоксигемоглобіну, що може запобігати виникненню структурних модифікацій цього білка, зумовлених оксидом азоту за умов розвитку в разі діабету нітрозативного стресу.

Практичне значення одержаних результатів.

Отримані дані підтверджують перспективність застосування НАм з метою корекції порушень системи антиоксидантного захисту клітин КМ та попередження розвитку анемій, як ускладнень цукрового діабету І типу.

Результати досліджень нітрозилювання дезоксигемоглобіну in vitro та впливу НАм на цей процес доповнюють відомості про можливість модифікації молекул гемоглобіну метаболітами оксиду азоту за цієї патології. Отримані результати дають змогу рекомендувати НАм для застосування в комплексній терапії ЦД І типу та його ускладнень, зокрема анемії. Їх використовують у навчальному процесі під час викладання спецкурсів з біохімії у Львівському національному університеті імені Івана Франка.

Особистий внесок здобувача. У всіх серіях досліджень здобувач самостійно моделювала стрептозотоциновий діабет і виконувала його корекцію НАм. Здобувач особисто виділяла клітини КМ, визначала ферментативну активність глутатіонредуктази, глутатіонпероксидази, каталази та вміст відновленого глутатіону і продуктів ПОЛ. Морфологію клітин КМ та крові щурів досліджували спільно з канд. біол. наук, доцентом Н.О. Сибірною. Побудову спектрів нітрозильованого гемоглобіну та НАм, визначення супероксиддисмутазної та глюкозо-6-фосфатдегідрогеназної активності виконано спільно із співробітниками науково-дослідної лабораторії Радіаційної та молекулярної біології. Аналіз та обговорення отриманих результатів проведено за участю наукового керівника, д-ра біол. наук В.М. Коробова. У процесі виконання дисертації автор особисто проаналізувала джерела вітчизняної та зарубіжної літератури на тему дисертації і підготовлювала публікації до друку.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 5 статей у фахових наукових виданнях і 11 тез доповідей у матеріалах з'їздів та конференцій.

Структура та обсяг роботи.

Дисертація викладена на 125 сторінках друкованого тексту і складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів дослідження та їхнього обговорення, висновків, а також списку використаних джерел (266 найменувань).

Робота ілюстрована 6 рисунками та 11 таблицями, які займають 8 сторінок друкованого тексту.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

В огляді літератури висвітлена інформація стосовно етіології цукрового діабету І типу та його ускладнень, пов'язаних із системою крові, описано сучасні уявлення про оксидаційний стрес і роль антиоксидантної системи. Особлива увага приділена застосуванню нікотинаміду в клініці та за умов експериментального діабету.

Матеріали і методи досліджень. Дослідження виконані на безпородних білих щурах-самцях масою 100-120 г., яких розділяли на три групи: “контроль”, “діабет”, “діабет+нікотинамід”. Експериментальний ЦД спричинювали введенням стрептозотоцину фірми "Sigma" в розрахунку 7 мг. на 100 г. маси внутрішньочеревно. Розвиток діабету контролювали за зростанням рівня глюкози в крові, який визначали глюкозооксидазним методом (Trinder P., 1969). У дослід брали тварин через два тижні після введення препарату при концентрації глюкози 10-15 мМ. Нікотинамід фірми “Sigma” вводили внутрішньо-м'язово в дозі 200 мг на 1 кг., маси щоденно протягом 14 діб щурам з розвиненою гіперглікемією.

Клітини ЕР та ГМР отримували центрифугуванням суспензії клітин КМ у тришаровому градієнті густини фіколу та суміші фіколу-верографіну (d1 = 1,03 г/cм. куб., d2 = 1,09 г/cм. куб., d3 = 1,1 г/cм. куб.) (Сибірна Н.О., 1991). Для отримання цитологічних препаратів клітин КМ застосовували комбіноване фарбування за Папенгеймом. Вміст ретикулоцитів визначали за модифікованими методиками Л. Гейльмейєра та Зінгера (Сибірна Н.О., 1997), кислотну резистентність еритроцитів - за їхньою стійкістю до 0,004 Н соляної кислоти у фізрозчині (Терсков И.А., 1959).

Активність супероксиддисмутази (СОД) визначали за допомогою реакції відновлення нітротетразолію синього до нітроформазану (Чевари С., 1991), каталази - з використанням реакції Н2О2 з молібдатом амонію (Королюк М.А., 1991). Для визначення активності глутатіонпероксидази (ГПО) (Моин В.И., 1986) та вмісту відновленого глутатіону (G-SH) (Thamas D.S., 1960) застосовували реактив Елмана (5,5'-дитіобіс-2-нітробензойну кислоту), який взаємодіє з сульфгідрильними групами. Активність глутатіонредуктази (ГР) визначали за зменшенням вмісту NADPH при 340 нм у реакції з окисленим глутатіоном (Путилина Ф.Е., 1982), глюкозо-6-фосфатдегідрогеназну активність - за швидкістю утворення NADPH при 340 нм за надлишку глюкозо-6-фосфату і NADP (Путилина Ф.И., 1982), вміст креатину - спектрофотометрично після його взаємодії з діацил-б-нафтолом (Виноградова И.Л., 1983), вміст кон'югованих дієнових структур гідроперекисів ліпідів - за інтенсивністю поглинання в ділянці 232 - 234 нм (Гаврилов В.Б., 1983), рівень ТБК-позитивних продуктів - за інтенсивністю забарвлення при взаємодії продуктів ПОЛ з тіобарбітуровою кислотою (Тимирбулатов Р.А., 1981), вміст глікозильованого Hb - колориметричним методом, що грунтується на утворенні забарвленої сполуки при взаємодії продукту кислотного гідролізу - 5-оксиметилфурфуролу з 2-тіо-барбітуровою кислотою (Dormandy T.L., 1965).

Процес дезоксигенації Hb проводили у вакуумі (Федорович І.П., 1996) і контролювали спектрофотометрично.

Концентрацію Hb визначали спектрофотометрично, використовуючи молярний коефіцієнт екстинкції для ціаноферигему 1 Ч 1 (Van Kampen E.I., 1961). Реакцію відновлення NO2-аніонів за участю дезоксигемоглобіну (R-Hb) ініціювали додаванням до гемолізату розчину NaNO2 (6мМ) і реєстрували зростання оптичної густини розчину при 480 нм (Zijlstra W.G., 1981). Електронні адсорбційні спектри нітрозо-Hb реєстрували на спектрофотометрі UV-VIS “Specord M-40” (Німеччина). HbNO отримували пропускаючи через відновлений дитіонітом натрію R-Hb (7,5 мМ) оксид азоту, отриманий шляхом відновлення нітроксильного іона молекули NaNO2 аскорбіновою кислотою (Krхncke K.D., 1996). Варіаційно-статистичне опрацювання одержаних результатів виконали з використанням критерію Стьюдента за допомогою комп'ютерної програми Origin. Уведення НАм діабетичним щурам гальмувало швидкість відновлення нітрит-аніонів R-Hb крові (2,78 ± 0,33, 1 Ч 10^-4). Очевидно, це пов'язано з гіпоглікемічними ефектами препарату, оскільки рівень глікозильованого Hb при введенні останнього становить 2,05-0,17%. За умов збільшення рівня оксиду азоту можлива модифікація молекули Hb цим реактивним радикалом чи його метаболітами. Перебіг цих процесів та здатність Hb взаємодіяти з NO за цих умов оцінено експериментально у дослідах in vitro.

З'ясовано, що нітрозилювання R-Hb щурів зі стрептозотоциновим діабетом супроводжується гіперхромним ефектом у ділянці поглинання ароматичних аміно-кислот і появою широкої смуги поглинання при 334 нм порівняно з нітрозо-Hb конт-рольних тварин. Очевидно, зміни в ультрафіолетовій ділянці спектра виникають унаслідок взаємодїї NO з білковою частиною молекули. Відомо, що в ділянці 320-360 нм поглинають світло S-нітрозотіольні похідні білків (Stamler J.S., 1992). Зміни типового електронного адсорбційного спектра в ділянці 280 нм можуть бути пов'язані, частково, з розгортанням білкової глобули, індукованим нітрозилюванням амінокислотних залишків у складі гідрофобного ядра глобіну. У спектрах нітрозо-Hb щурів, яким уводили НАм, посилення поглинання світла при 334 нм не зафіксовано. Різниці в поглинанні ароматичних амінокислот у спектрах нітрозо-Hb тварин, яким уводили НАм, та нітрозо- Hb тварин зі стрептозотоциновим діабетом не виявлено. Отже, введення НАм упродовж двох тижнів тваринам з розвинутим стрептозотоциновим діабетом запобігало тим структурним модифікаціям Hb, які можуть виникати в умовах хвороби.

фармакологічний стрес нікотинамід

ВИСНОВКИ

1. У дисертації наведено узагальнення і нове вирішення проблеми порушень гемопоезу за умов експериментального стрептозотоцинового діабету шляхом корекції змін в антиоксидантній системі крові та клітинах кісткового мозку;

2. Виявлено, що введення нікотинаміду щурам із експериментальним діабетом у дозі 200 мг на кг., маси щоденно впродовж двох тижнів стимулює еритропоез, про що свідчить збільшення відносного вмісту поліхроматофільних (на 21,7%) та оксифільних (приблизно в 2 рази) нормоцитів у кровотворній тканині і поява в крові значної кількості еритроцитів з підвищеною стійкістю до кислотного гемолізу, а також вірогідного підвищення креатину в цих клітинах;

3. З'ясовано розвиток оксидаційного стресу як у крові, так і в клітинах кісткового мозку за умов експериментального діабету, про що свідчить збільшення вмісту дієнових кон'югатів в еритроцитах на 83%, у клітинах ЕР на 33,8% та в клітинах ГМР - на 70,9% і ТБК-позитивних продуктів у плазмі крові (на 42,2%). Водночас простежується зростання каталазної активності в досліджуваних клітинах (на 53,5, 36,6 і 82,6%, відповідно) та глутатіонпероксидазної активності в клітинах ГМР, що можна розцінювати як компенсаторну реакцію на зменшення супероксиддисмутазної активності в досліджуваних клітинах (на 34, 36, і 28%, відповідно);

Уведення нікотинаміду призводить до зменшення глутатіонпероксидазної активності в клітинах кісткового мозку, каталазної активності і вмісту дієнових кон'югатів у всіх досліджуваних клітинах, а також ТБК-позитивних продуктів у плазмі крові;

4. Стрептозотоциновий діабет супроводжується підвищенням рівня відновленого глутатіону в клітинах кісткового мозку та глутатіонредуктазної активності в еритроцитах та клітинах ЕР. Уведення нікотинаміду призводить до вірогідного збільшення вмісту відновленого глутатіону в еритроцитах та клітинах ГМР кісткового мозку на відміну від умов експериментального діабету;

5. Виявлено підвищення нітритредуктазної активності дезоксигемоглобіну на 87,5% у крові тварин з експериментальним стрептозотоциновим діабетом. Під впливом нікотинаміду швидкість відновлення нітрит-аніонів дезоксигемоглобіном крові зменшується на 33,4%;

6. Визначено, що нітрозилювання in vitro дезоксигемоглобіну діабетичних щурів супроводжується утворенням S-нітрозотіольних похідних глобіну, про що свідчить гіперхромний ефект у типовому електронному адсорбційному спектрі при 334 нм. Уведення нікотинаміду запобігає модифікації гемоглобіну за його нітрозилювання in vitro.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Нітритредуктазна активність дезоксигемоглобіну при діабеті та її корекція нікотинамідом / В.М. Коробов, Н.В. Біронт, А.М. Федорович, В.А. Бурда // Укр. біохім. журн. - 2002. - Т. 74, №6. - С. 125-127.

2. Характеристика динамічного стану еритрону за умов експериментального стрептозотоцинового діабету / Бурда В.А., Біронт Н.В., Великий М.М., Сибірна Н.О., Клевета Г.Я., Федорович А.М // Труды научной конф. "Научное наследие академика И.Н. Буланкина и его развитие в современной биохимии". - Харьков: Харьков. нац. ун-т. - 2001. - С. 24-25.

3. Біронт Н., Бурда В., Великий М. Вміст продуктів перекисного окислення ліпідів і активність ферментів антиоксидантного захисту крові та кісткового мозку щурів за умов експериментального стрептозотоцинового діабету і введення нікотинаміду // Вісник Львів. ун-ту. Сер. біол. - 2000. - Вип. 25. - С. 11-17.

4. Вплив нікотинаміду на активність ферментів антиоксидантного захисту при експериментальному діабеті / Великий М.М., Бурда В.А., Біронт Н.В., Оліярник О.Д., Великий А.М. // Укр. біохім. журн. - 1996. - Т.68, №2. - С. 109-114.

5. Корригирующий эффект никотинамида на процессы гликозилирования гемоглобина при стрептозотоциновом диабете у крыс / Великий Н.Н., Бурда В.А., Обросова И.Г., Биронт Н.В., Федык М.Я. // Вопр. мед. химии. - 1995. - Т. 41, №1. - С. 36-38.

6. Nitrosohemoglobin's spectral рroperties of rats with streptozotosin-induced diabetes / V. Korobov, N. Biront, A. Phedorovуch, V. Burda // 4nd - Parnas conf. - Wroclav (Poland). - 2002. - Р. 115.

Размещено на Allbest.ru