Размещено на http://www.allbest.ru/

Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

03.00.04 - Біохімія

Стан вільнорадикальних процесів у мітохондріальній фракції карциноми Герена і печінки попередньо опромінених щурів при онкогенезі

Волощук Оксана Миколаївна

Чернівці 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі біохімії Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича Міністерства освіти і науки України

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор Марченко Михайло Маркович, Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича, біологічний факультет, завідувач кафедри біохімії, декан.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Великий Микола Миколайович, Інститут біохімії імені О.В. Палладіна НАН України, провідний науковий співробітник відділу біохімії коферментів.

доктор біологічних наук, професор Столяр Оксана Борисівна, Тернопільський національний педагогічний університет імені Володимира Гнатюка, професор кафедри хімії.

Захист відбудеться „ 27 ” лютого 2008 року о 12 00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 76.051.05 у Чернівецькому національному університеті імені Юрія Федьковича за адресою: 58012, м. Чернівці, вул. Лесі Українки, 25, корпус 3, біологічний факультет, ауд. 81.

З дисертацією можна ознайомитися в науковій бібліотеці Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича за адресою: м. Чернівці, вул. Лесі Українки, 23.

Автореферат розісланий „ 24 ” січня 2008 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук Легета У.В.

1. Загальна характеристика роботи

карцинома герена печінка опромінений

Актуальність теми. Одним із механізмів онкогенезу є активація в мітохондріях вільнорадикальних пероксидних процесів, які ведуть до неспецифічних змін клітинного окисного метаболізму (Гжегоцький М.Р., Клес О.В., 2005, Лю М.Б. и др., 2005). Послідовність біохімічних реакцій у мітохондріях, які визначають розвиток та реалізацію клітинної деструкції при онкогенезі, є не до кінця вирішеним питанням і тому потребує подальшого вивчення. Особливу увагу заслуговує питання ролі попереднього низькодозового опромінення у інтенсифікації пухлинного росту, оскільки саме віддалені наслідки опромінення малими дозами є ініціюючими у прогресії раку. Враховуючи, що пусковою ланкою у реалізації цито- і генотоксичного ефекту іонізуючої радіації є генерація активних кисневих метаболітів (Betteridge D.J., 2000, Bonner W.M., 2003), основним джерелом яких є мітохондрії (Lenaz G., 2001, Genova M.L. et al., 2003), очевидно, що дослідження цих органел при онкогенезі у віддалені терміни після опромінення є вкрай важливим.

Радіаційно-індуковані зміни функціональної активності мітохондрій пов'язані зі зміною структури мембранних білків та ліпідів (Миронова Н.Г. и др., 2000), а саме зростанням конформаційної рухливості молекул білків внутрішньої мітохондріальної мембрани, зміною жирнокислотного складу фосфоліпідів, активацією процесів пероксидного окиснення ліпідів. Окрім того, чутливою мішенню для дії радіації є мітохондріальна ДНК (мтДНК) (DeHaan C. et al., 2004, Iborra F.J. et al., 2004). Чутливість мтДНК зумовлена тим, що вона не захищена білками, не містить некодуючих ділянок і механізми її репарації менш ефективні, ніж яДНК (May A., Bohr V.A, 2000, Wilding C.S. et al., 2006). Такі зміни у мітохондріях за умов впливу іонізуючої радіації виявляються ініціюючими у раковому переродженні клітин, а клітину з мутантним набором мітохондрій розглядають як початок росту пухлини (Carew J.S., Huang P., 2002).

Проте слід відмітити, що питання щодо особливостей окиснювального пошкодження мтДНК та мітохондріальних білків у процесі інтенсифікації пухлиногенезу, особливо за умов попереднього впливу малих доз радіації, залишається недостатньо вивченим. Виходячи з вищесказаного, актуальним видається вивчення стану вільнорадикальних процесів у мітохондріях трансформованої тканини і печінки, як основного гомеостатичного органу, при онкогенезі за умов попереднього фракціонованого опромінення малими дозами іонізуючої радіації та при введенні протипухлинного засобу гідробромід 5-(5', 6'-бензокумароїл-3') метиламіноурацилу.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема дисертаційної роботи затверджена на засіданні Вченої ради Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича МОН України, протокол № 1 від 12.02.2004 р. Робота виконана в рамках наукових тематик кафедри біохімії біологічного факультету Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича: кафедральної теми “Біохімічна адаптація організмів за умов дії стресорних факторів різної природи” (номер державної реєстрації 0103U004526, 2003 - 2005 рр.), кафедральної теми “Біохімічні особливості онкогенезу та його корекція речовинами природного та синтетичного походження” (номер державної реєстрації 0103U012349, 2006 - 2008 рр.), держбюджетної теми “Біохімічні особливості онкогенезу при опроміненні та застосуванні протипухлинних комплексів” (номер державної реєстрації 0102U004994, 2003 - 2005 рр.), держбюджетної теми “Системний вплив злоякісних новоутворень на біохімічні характеристики органів попередньо опромінених пухлиноносіїв” (номер державної реєстрації 0106U001452, 2006 - 2008 рр.).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було встановлення особливостей перебігу вільнорадикальних процесів у мітохондріальній фракції трансформованої тканини та печінки щурів у динаміці розвитку карциноми Герена на фоні попереднього фракціонованого опромінення малими дозами радіації.

Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:

1. Вивчити інтенсивність генерації супероксид аніон-радикалу мітохондріальним електронотранспортним ланцюгом, набухання мітохондрій, сукцинатдегідрогеназну та Н+-АТР-азну активності мітохондріальної фракції карциноми Герена і печінки попередньо опромінених щурів-пухлиноносіїв у динаміці розвитку онкозахворювання.

2. Встановити ступінь фрагментації мтДНК карциноми Герена та печінки щурів-пухлиноносіїв на різних стадіях пухлиногенезу (латентній, логарифмічній та термінальній стадії розвитку злоякісного новоутворення) за умов попереднього рентгенівського фракціонованого опромінення малими дозами.

3. Визначити інтенсивність включення [3Н]-тимідину в ДНК мітохондріальної фракції пухлини та печінки попередньо опромінених щурів-пухлиноносіїв.

4. Вивчити особливості окиснювальної модифікації мітохондріальних білків, нерозчинних у 0,05 М Na-фосфатному буфері (рН 11,5), пухлини та печінки в динаміці росту карциноми Герена на фоні попереднього опромінення малими дозами.

5. Провести електрофоретичний аналіз мітохондріальних білків, нерозчинних у 0,05 М Na-фосфатному буфері (рН 11,5), трансформованої тканини і печінки щурів з трансплантованою карциномою Герена за умов попереднього опромінення.

6. Дослідити вплив протипухлинного засобу гідробромід 5-(5', 6'-бензокумароїл-3') метиламіноурацилу на стан мітохондріальних процесів вільнорадикального окиснення в пухлинній тканині та печінці в динаміці розвитку карциноми Герена.

Об'єкт дослідження - онкогенез за умов попереднього фракціонованого опромінення малими дозами.

Предмет дослідження - вільнорадикальні процеси у мітохондріальній фракції карциноми Герена та печінки попередньо опромінених тварин-пухлиноносіїв.

Методи досліджень - диференційне центрифугування (виділення мітохондріальної фракції), спектрофотометричні (вивчення набухання мітохондрій, рівня окиснення мітохондріальних білків, сукцинатдегідрогеназної активності мітохондрій, вивчення Н+-АТР-азної активності мітохондрій, інтенсивності продукції супероксидного аніон-радикалу мітохондріальним електронотранспортним ланцюгом), радіоізотопні (визначення інтенсивності включення [3Н]-тимідину в мтДНК), метод електрофорезу (дослідження фракційного складу мтДНК і електрофоретичних спектрів мітохондріальних білків) та статистичні методи аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. У дисертаційній роботі вперше показано, що різні стадії онкогенезу супроводжуються зміною інтенсивності вільнорадикальних процесів у мітохондріальній фракції карциноми Герена та печінки пухлиноносіїв. Вперше встановлено, що в попередньо опромінених щурів на початкових етапах росту карциноми Герена в пухлині відбувається посилення генерації О2- мітохондріальним електронотранспортним ланцюгом, набухання мітохондрій та гальмування Н+-АТР-азної і сукцинатдегідрогеназної активностей. Поряд з цим вперше виявлено зниження інтенсивності включення [3Н]-тимідину та посилення фрагментації мтДНК з появою фрагментів розмірами 13,5 - 14,5 т.п.н. на стадії активного росту пухлини з тенденцією до накопичення гетерогенних фрагментів різних розмірів на термінальних етапах онкогенезу за умов попереднього опромінення. У роботі вперше показано посилення рівня окисної модифіції мітохондріальних білків, нерозчинних у 0,05 М Na-фосфатному буфері (рН 11,5), та зміну їх фракційного складу, а саме зниження інтенсивності забарвлення смуг в межах високих молекулярних мас (30 - 66 кДа) та значне зростання вмісту низькомолекулярних компонентів (8 - 16 кДа) на термінальних етапах онкогенезу. Вперше встановлено, що введення протипухлинного засобу гідробромід 5-(5', 6'-бензокумароїл-3') метиламіноурацилу зумовлює посилення фрагментації мтДНК пухлини з накопиченням молекул розміром 12,5 т.п.н. та зникнення на електрофореграмах білкових смуг з молекулярними масами 32, 47, 63,5 кДа з тенденцією до посилення генерації супероксид аніон-радикалу на термінальних етапах розвитку новоутворення, що може лежати в основі сповільнення темпів росту карциноми Герена та, з іншого боку, веде до посилення вільнорадикального пошкодження мітохондрій печінки.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати щодо особливостей окиснювального пошкодження мітохондріальної ДНК та білків при онкогенезі стали базою для створення і використання комплексного протипухлинного засобу на основі похідних урацилу та кумарину.

Протипухлинний ефект при застосуванні засобу гідробромід 5-(5', 6'-бензокумароїл-3') метиламіноурацилу проявлявся гальмуванням росту карциноми Герена, проте супроводжувався вільнорадикальним пошкодженням мітохондрій печінки, і на практиці може бути рекомендований до застосування в комплексі з гепатопротекторами.

Окремі положення роботи та методи досліджень, теоретичні узагальнення роботи використовуються у навчальному процесі при викладанні дисциплін “Біохімія”, “Біоорганічна хімія” на кафедрі біохімії біологічного факультету Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича.

Особистий внесок здобувача. Підбір та аналіз літературних джерел, експериментальна частина роботи, статистична обробка отриманих даних виконані дисертантом. Планування експериментальної частини роботи, аналіз та інтерпретація результатів досліджень, формулювання висновків та підготовка матеріалів до друку проведено з науковим керівником д.б.н., професором Марченком М.М. та к.б.н., доцентом Копильчук Г.П.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, основні положення та висновки дисертаційної роботи апробовувались на Міжнародній конференції “Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics” (Київ, 2003), Міжнародній науково-теоретичній конференції молодих вчених “Молодь і досягнення науки у вирішенні проблем сучасності” (Чернівці, 2003), конференції-конкурсі робіт молодих вчених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології” (Київ, 2005, 2007), ІІ та ІІІ Міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів “Молодь та поступ біології” (Львів, 2006, 2007), ІХ Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006), 6th Parnas Conference “Molekular mechanism of cellular signalling” (Krakow, Poland, 2007), 11-й Міжнародній школі-конференції молодих вчених “Биология - наука ХХІ века” (Пущино, 2007), 2-му з'їзді Українського товариства клітинної біології (Київ, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 6 статей у фахових наукових виданнях і 8 тез доповідей у збірниках матеріалів вітчизняних та міжнародних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, обговорення результатів роботи, узагальнень та висновків, списку використаних джерел літератури (загальна кількість - 255, з них 124 - надрукованих іноземною мовою). Робота викладена на 151 сторінках, проілюстрована 1 таблицею та 56 рисунками.

2. Основний зміст роботи

В огляді літератури проаналізовано сучасні уявлення щодо ролі малих доз іонізуючої радіації в ініціації вільнорадикального окиснення біомолекул і онкогенезу та ролі радіаційного пошкодження мітохондрій у віддалених наслідках опромінення, розкрито біохімічні особливості пухлинного росту та структурної організації мітохондрій трансформованої тканини.

Матеріали та методи досліджень. Дослідження проводили на білих безпородних щурах-самках масою 110-130 г та віком 2,5-3 місяці, яких утримували на стандартному раціоні віварію.

Тварини були поділені на групи: І - інтактні тварини (К), ІІ - опромінені щури (К+Р), ІІІ - опромінені щури, яким на 1-шу добу після припинення опромінення трансплантували карциному Герена (П+Р), IV - щури з трансплантованою карциномою Герена (П), V - щури, яким вводили протипухлинний засіб гідробромід 5-(5', 6'-бензокумароїл-3') метиламіноурацил (П+БКУ).

Трансплантацію карциноми Герена здійснювали методом підшкірного введення в ділянку стегна задньої кінцівки 0,5 мл 30% суспензії пухлинних клітин у фізіологічному розчині. Штам пухлини наданий Інститутом експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Опромінення проводили протягом семи діб щоденно в дозі 36,12·10-4 Кл/кг через 24 години на рентгенівській діагностичній установці 12П6 („Lachema”, Чехія) при потужності дози 2,58·10-4 Кл/кг (0,93 сГр/с), напрузі 80 кВ, силі струму 40 мА, шкірно-фокусній відстані 40 см з використанням фільтрів 0,5 мм Сu. На першу добу після припинення опромінення проводили трансплантацію карциноми Герена.

Гідробромід 5-(5', 6'-бензокумароїл-3') метиламіноурацил вводили тваринам щоденно per os в дозі 6 мг/кг маси тіла, починаючи з 7 доби після трансплантації пухлини.

Тривалість експерименту становила 21 добу. Евтаназію тварин І, ІІІ та IV групи під легким ефірним наркозом здійснювали на 7 (латентна стадія пухлинного росту), 14 (логарифмічна стадія пухлинного росту), 21 (термінальна стадія пухлинного росту) добу після імплантації пухлини, тварин ІІ групи - на 1, 7, 14, 21 добу після зняття радіаційного чинника, тварин V групи - на 7 та 14 добу з часу введення засобу.

Мітохондріальну фракцію гомогенатів печінки і карциноми Герена отримували стандартним методом диференційного центрифугування. Інтенсивність продукції супероксидного аніон-радикалу (О2-) мітохондріальним електронотранспортним ланцюгом оцінювали в тесті з нітросинім тетразолієм (Костенко В.О. та ін., 2000). Набухання мітохондрій реєстрували за їх здатністю до розширення-скорочення і зміни оптичної густини (Лидер В.А. и др., 1985). Сукцинатдегідрогеназну активність [КФ 1.3.99.1] визначали за інтенсивністю відновлення ферицианіду калію (Ещенко Н.Д., Вольський Г.Г., 1982), Н+-АТФ-азну активність [КФ 3.6.1.3] - за накопиченням неорганічного фосфату і виражали в нмоль Рі на 1 мг білка за 1 хв (Габибов М.М., 1986). Вміст білка визначали за методом Lowry O.H. et.al., 1951.

Виділення мтДНК здійснювали фенольним методом (Palva T.K., Palva E.T., 1985). До суспензії мітохондрій додавали подвійний об'єм свіжоприготованого розчину (0,1 М трис-НСІ (рН 7,5), 5 % SDS, 0,1 М ЕДТА) та десятикратний об'єм охолодженого до 0 0С 0,3 М ацетату натрію, 0,1 М ЕДТА (рН 7,5), перемішували і витримували на льоду 10 хв. мтДНК депротеїнізували підігрітим до 65 0С свіжоперегнаним водонасиченим фенолом (рН 7,8) і двічі сумішшю хлороформ-ізоаміловий спирт (24:1). мтДНК із водної фази осаджували двома об'ємами етанолу. Виділену мтДНК переосаджували етанолом, сушили і розчиняли в буфері, що містив 10 мМ трис-НСІ (рН 7,6), 1 мМ ЕДТА, 2,5 мкг/мл РНКазу А (“Serva”, Німеччина).

мтДНК розділяли методом електрофорезу в 0,8 % агарозному гелі. Електрофорез проводили в трис-боратному буфері, рН 8,0, при напрузі електричного поля 5 В/см. Для розділення використовували горизонтальні пластини (12,5Ч8,5 см), товщина гелю 5 мм. У ролі маркерів використовували препарати ДНК фага л, отримані при розщепленні рестриктазами EcoRI та HindIII. Гелі зафарбовували розчином бромистого етидію і сканували на апараті „GelDoc 2000” та аналізували з використанням програми „Quantity One” („Bio-Rad”, США).

Мічений попередник [3Н]-тимідин з локалізацією тритію в метильній групі тиміну та питомою радіоактивністю 3,15 ТБк/ммоль („Amersham Biosciences”, Велика Британія) вводили внутрішньочеревно за 2 години до забою з розрахунку 1,85 МБк на 100 г маси тіла тварини (Остерман С.А., 1983). Радіоактивність в пробах вимірювали на лічильнику „Бета-1” у рідкому діоксановому сцинтиляторі (ЖС 8).

Виділення мітохондріальних білків, які кодуються мтДНК, проводили за методом Kitagawa Y., Sugimoto E. (1980), що базується на нерозчинності цих білків у 0,05 М натрій-фосфатному буфері (рН 11,5). Рівень карбонілювання білків оцінювали за кількістю похідних 2,4-динітрофенілгідразону, які утворюються в результаті взаємодії окиснених амінокислотних залишків з 2,4-динітрофенілгідразином (Дубинина Е.Е. и др., 1995), вміст білкових SH-груп - за методом, який базується на взаємодії реактиву Елмана (5,5/-дітіобіс-2-нітробензойної кислоти (ДТНБ)) з SH-групами (Murphy M.E. et al, 1989).

Осад мітохондріальних білків розчиняли в буфері для зразків: 0,0625 М трис-НСІ (рН 6,8), 5 % 2-меркаптоетанол, 2 % SDS, 10 % гліцерол, 0,005 % бромфеноловий синій, 8 М сечовина. Електрофорез в поліакриламідному гелі проводили в системі Леммлі в пластинах (13Ч12Ч0,1 см) у 10 % розділяючому гелі. Як маркери молекулярної маси використовували білки: бичачий сироватковий альбумін (Mr 66 кДа), овоальбумін (Mr 45 кДа), апротінін (Mr 6,5 кДа). Після електрофорезу гелі фіксували сумішшю 25 % ізопропанол та 10 % ацетат протягом години, забарвлення поліпептидів проводили Coomassie blue R-250. Сканування електрофореграм проводили на приладі “GelDoc 2000” (“Bio-Rad”, США) та аналізували з використанням програми “Quantity One”.

Достовірність різниці показників між групами тварин оцінювали з використанням критерію Стьюдента (Лакин Г.Ф., 1990).

Розрахунки та побудову графіків виконували на комп'ютері з використанням прикладної програми „Microsoft Excel 98”.

Результати досліджень та обговорення

Інтенсивність вільнорадикальних процесів та активність мембраннозв'язаних мітохондріальних ферментів карциноми Герена та печінки в динаміці розвитку онкозахворювання за умов попереднього опромінення. При вивченні передуючого трансплантації впливу малих доз іонізуючої радіації встановлено, що в динаміці розвитку карциноми Герена в мітохондріальній фракції спостерігається інтенсифікація генерації О2- порівняно з неопроміненими пухлиноносіями. Посилення генерації супероксид аніон-радикалу в пухлині в цей період з одного боку проявляє токсичну дію на внутрішньоклітинні біомолекули, а з іншого - веде до послаблення міжклітинних контактів, тобто до змін, які причетні до інвазивності та метастазування неоплазм. Максимальна інтенсивність генерації супероксид аніон-радикалу як в пухлині, так і в печінці спостерігається на стадії активного росту пухлини

Встановлене набухання мітохондрій може призводити до втрати органелами їх основної функції - здатності синтезувати АТР. Результати проведених досліджень показали, що розвиток карциноми Герена супроводжується порушенням Н+-АТР-азної та СДГ-ої активностей, які визначають ефективність енергетичного забезпечення мітохондрій. Вплив попереднього опромінення на рівні досліджуваних показників у пухлиноносіїв проявляється у зміні Н+-АТР-азної та СДГ-ої активностей з початкових етапів онкогенезу, проте характер встановлених змін у тканині пухлини і печінки відрізняється. Якщо у трансформованій тканині вплив опромінення проявляється у більш вираженому гальмуванні досліджуваних ферментативних активностей протягом експерименту, то у печінці при попередньому опроміненні у пухлиноносіїв спостерігається активація Н+-АТР-ази на фоні гальмування СДГ-ої активності.

Зростаючі дисфункції мітохондрій призводитимуть до розвитку дефіциту енергії, в умовах якого баланс в системі про- і антиоксидантів в тканинах щурів буде порушуватися в бік перших, що в свою чергу буде призводити до поглиблення оксидативного стресу. Посилена генерація О2- може призводити до пошкодження молекулярних структур мітохондрій, викликаючи окиснювальне пошкодження білків і ДНК.

Виходячи з вищесказаного, метою нашої подальшої роботи було вивчення особливостей вільнорадикального пошкодження мтДНК та білків, які синтезуються у мітохондріях, на різних стадіях онкогенезу та за умов попереднього фракціонованого опромінення малими дозами.

Ступінь фрагментації мтДНК та інтенсивність включення [3Н]-тимідину в мтДНК пухлини та печінки при онкогенезі в попередньо опромінених тварин. Аналіз електрофоретичних спектрів мтДНК пухлинних клітин показав, що уже на початкових етапах росту карциноми Герена спостерігається деградація мтДНК з утворенням високомолекулярних фрагментів. Попереднє опромінення організму зумовлює пригнічення процесів фрагментації мтДНК на початкових етапах онкогенезу.

Водночас розвиток карциноми Герена у попередньо опроміненому організмі супроводжується інтенсифікацією включення міченого попередника в мтДНК трансформованих клітин порівняно з неопроміненими тваринами на 7 добу експерименту. Так, рівень включення [3Н]-тимідину в мтДНК трансформованих клітин опромінених пухлиноносіїв в цей період на 45 % перевищує значення, встановлені для неопромінених пухлиноносіїв. Подальші етапи розвитку пухлини супроводжуються гальмуванням інтенсивності включення міченого тимідину в мтДНК ракових клітин, проте досліджувані процеси односпрямовані як у групі опромінених, так і неопромінених пухлиноносіїв.

У печінці попередньо опромінених пухлиноносіїв при дослідженні характеру накопичення фрагментів мтДНК встановлено, що на початкових етапах онкогенезу процеси фрагментації мтДНК є слабко вираженими. При подальшому дослідженні особливостей протікання процесів фрагментації мтДНК виявлено їх посилення, що проявляється накопиченням молекул з контурною довжиною 10,5 т.п.н., тобто з вкороченою контурною довжиною порівняно з неопроміненими пухлиноносіями. Отже, попереднє опромінення малими дозами призводить до посилення фрагментації мтДНК печінки на термінальних етапах розвитку карциноми Герена, що можна розглядати як віддалений ефект радіації, оскільки наслідки опромінення не зникають, а лише віддаляються у часі.

Трансплантація карциноми Герена на фоні опромінення призводить до інтенсифікації процесів включення міченого попередника в мтДНК печінки. Максимальна інтенсивність включення [3Н]-тимідину спостерігається в період активного росту пухлини, тоді як на термінальних етапах знижується до рівня неопромінених тварин з карциномою Герена. Отже, розвиток злоякісного новоутворення супроводжується зміною фракційного складу мтДНК як пухлинних клітин, так і клітин печінки, проте характер встановлених змін у досліджуваних тканинах відрізняється.

Так, якщо в мітохондріальній фракції пухлинної тканини спостерігається посилена фрагментація мтДНК з накопиченням гетерогенних фрагментів різних розмірів і гальмування включення міченого попередника в мтДНК, то в тканині печінки розвиток новоутворення зумовлює накопичення молекул з контурною довжиною 10,5 т.п.н. та посилення включення [3Н]-тимідину в мтДНК.

Вплив попереднього низькоінтенсивного рентгенівського опромінення на ступінь окиснювального пошкодження та фракційний склад мітохондріальних білків тканин щурів-пухлиноносіїв. Результати проведених досліджень показали, що розвиток карциноми Герена у попередньо опроміненому організмі супроводжується посиленням рівня окиснення мітохондріальних білків трансформованої тканини.

Зокрема, у попередньо опромінених пухлиноносіїв спостерігається інтенсивніше накопичення карбонільних похідних та зниження вмісту вільних сульфгідрильних груп порівняно з неопроміненими пухлиноносіями, проте по мірі віддалення від терміну опромінення відмінності між досліджуваними групами тварин поступово нівелюються. Підвищена інтенсивність окиснення досліджуваних мітохондріальних білків супроводжується зміною їх фракційного складу, однак електрофоретичний аналіз цих білків виявив відмінності між пухлиноносіями та попередньо опроміненими пухлиноносіями лише на 7 добу експерименту. В досліджуваний період онкогенезу у попередньо опромінених тварин спостерігається поява ряду додаткових смуг в межах молекулярних мас 30-40 кДа, тоді як на подальших етапах пухлиногенезу відмінностей у електрофоретичних спектрах білків обох досліджуваних груп не спостерігається. Слід зазначити, що в динаміці росту пухлини змінюється інтенсивність забарвлення смуг з молекулярними масами 32-66 кДа та спостерігається значне підвищення вмісту низькомолекулярних компонентів з молекулярними масами від 8 до 24 кДа.

У печінці пухлиноносіїв інтенсифікація продукування О2- супроводжується посиленням вільнорадикального окиснення мітохондріальних білків, нерозчинних у 0,05 М натрій фосфатному буфері, рН 11,5. У попередньо опромінених пухлиноносіїв зменшеншується вміст вільних SH-груп, а рівень карбонільних похідних значно перевищує показники, встановлені для неопромінених тварин з пухлиною. Водночас виявлено зміни фракційного складу досліджуваних мітохондріальних білків, зокрема зниження інтенсивності забарвлення білкових смуг з молекулярними масами 30, 32, 45, 47, 50 та 57 кДа.

Отже, попереднє опромінення організму малими дозами радіації є визначальним фактором у формуванні окиснювального пошкодження мітохондріальних білків та ДНК лише на початкових етапах онкогенезу, тоді як по мірі прогресії пухлини інтенсивність вільнорадикальних процесів визначається умовами розвитку новоутворення.

Зміна структурно-функціонального стану мітохондрій при онкогенезі за його корекції протипухлинним засобом БКУ.

Результати проведених досліджень засвідчили, що застосування протипухлинного засобу гідробромід 5-(5', 6'-бензокумароїл-3') метиламіноурацилу (БКУ) зумовлює посилення окиснювальних процесів у мітохондріальній фракції трансформованої тканини, що проявлялося у інтенсифікації генерації О2- на кінцевих етапах онкогенезу в 2,1 рази порівняно з тваринами, що не отримували БКУ.

На фоні інтенсифікації продукування О2- в мітохондріях пухлинної тканини відбувається посилення процесів фрагментації мтДНК. Так, на 7-му добу введення засобу у фракції мтДНК виявляються молекули розміром 12,5 т.п.н., тобто вкорочені на 2 т.п.н. порівняно з пухлиноносіями, які не отримували БКУ.

Водночас відбувається зміна електрофоретичних спектрів мітохондріальних білків, що проявляється у зникненні на електрофореграмах білкових смуг з молекулярними масами 32, 47, 63,5 кДа та зниженні інтенсивності забарвлення смуг в межах 50 - 57 кДа, у порівнянні з тваринами, які не отримували БКУ. Отже, введення БКУ порушує умови, за яких відбувається розвиток пухлини, що ймовірно, може визначати протипухлинний ефект досліджуваного засобу. З іншого боку, введення БКУ призводить до інтенсифікації вільнорадикальних процесів у мітохондріальній фракції печінки, що в свою чергу супроводжується посиленням окиснювального пошкодження і зміною фракційного складу як мтДНК, так і мітохондріальних білків. Пошкодження біомолекул мітохондріальної фракції печінки при використанні даного тумороактивного засобу може лежати в основі його гепатотоксичності.

Висновки

У дисертаційній роботі вперше показано особливості перебігу вільнорадикальних процесів у мітохондріальній фракції пухлини та печінки в динаміці онкозахворювання за умов впливу попереднього семиденного низькодозового фракціонованого рентгенівського опромінення.

1. У мітохондріальній фракції карциноми Герена в динаміці росту пухлини на фоні попереднього опромінення відбувається інтенсифікація генерації О2-, набухання мітохондрій, гальмування Н+-АТР-азної і сукцинатдегідрогеназної активностей, в той час як у мітохондріальній фракції печінки попередньо опромінених пухлиноносіїв фіксується активація Н+-АТР-азної на фоні гальмування сукцинатдегідрогеназної активності.

2. Встановлено, що в динаміці росту новоутворення спостерігається посилення фрагментації мтДНК карциноми Герена з накопиченням гетерогенних фрагментів різних розмірів на фоні гальмування включення [3H]-тимідину в мтДНК, тоді як у печінці передуюче трансплантації карциноми Герена опромінення малими дозами призводить до інтенсифікації процесів включення міченого попередника з максимумом на логарифмічній фазі пухлинного росту.

3. Ріст карциноми Герена супроводжується накопиченням карбонільних похідних та зниженням вмісту SH-груп мітохондріальних білків, нерозчинних у 0,05 М Na-фосфатному буфері (рН 11,5), пухлини і печінки, причому рівень окиснювальної модифікації у попередньо опромінених пухлиноносіїв перевищує показники, встановлені для неопромінених тварин з пухлиною.

4. Виявлено зміни фракційного складу мітохондріальних білків, нерозчинних у 0,05 М Na-фосфатному буфері (рН 11,5), в динаміці росту карциноми Герена, які проявляються у зниженні інтенсивності забарвлення смуг в межах високих молекулярних мас (30 - 66 кДа) та значному зростанні вмісту низькомолекулярних компонентів (8 - 16 кДа) на термінальних етапах онкогенезу. Відмінності між групою опромінених і неопромінених пухлиноносіїв виявлялися лише на латентній стадії пухлинного росту і полягали у зміні інтенсивності забарвлення смуг з молекулярними масами 30-40 кДа.

5. Введення гідробромід 5-(5', 6'-бензокумароїл-3') метиламіноурацилу (БКУ) зумовлює інтенсифікацію фрагментації мтДНК з появою молекул розміром 12,5 т.п.н. та зміну електрофоретичних спектрів мітохондріальних білків, зокрема зникнення на електрофореграмах білкових смуг з молекулярними масами 32, 47, 63,5 кДа, з тенденцією до посилення генерації супероксид аніон-радикалу на термінальних етапах розвитку карциноми Герена.

Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Марченко М.М., Копильчук Г.П., Волощук О.М. Особливості окиснювальної модифікації продуктів мітохондріальної трансляції у щурів з трансплантованою карциномою Герена // Доповіді НАН України. - 2004. - № 10. - С. 183 - 185. (Дисертант визначила рівень карбонільних похідних та вільних сульфгідрильних груп мітохондріальних білків, провела статистичну обробку результатів).

2. Марченко М.М., Копильчук Г.П., Волощук О.М. Функціональний стан мітохондріальних мембран печінки попередньо опромінених щурів з трансплантованою карциномою Герена // Доповіді НАН України. - 2007. - № 2. - С. 174 - 177. (Дисертант проводила трансплантацію карциноми Герена, визначила інтенсивність набухання мітохондрій та Н+-АТР-азну активність, провела статистичну обробку результатів).

3. Марченко М.М., Копыльчук Г.П., Волощук О.Н. Особенности окислительной деструкции продуктов митохондриальной трансляции в условиях предварительного фракционированного облучения крыс-опухоленосителей // Бюлл. эксперим. биол. мед. - 2007. - № 10. - С. 401 - 403. (Дисертант проводила опромінення тварин, визначила рівень карбонільних похідних та вільних сульфгідрильних груп мітохондріальних білків у опромінених пухлиноносіїв, підготувала матеріал до друку).

4. Копильчук Г.П., Бойчук О.М. Співвідношення вмісту ДНК та білкових продуктів експресії мітохондріального геному в печінці та пухлині щурів у процесі росту карциноми Герена // Науковий вісник Чернівецького університету. - 2003. - Вип. 169. Біологія. - С. 3 - 8. (Дисертант провела кількісне визначення вмісту мтДНК та білків, які кодуються мтДНК, у печінці та трансформованій тканині щурів-пухлиноносіїв, підготувала матеріал до друку).

5. Копильчук Г.П., Бойчук О.М. Окиснювальна модифікація білків мітохондрій печінки та карциноми Герена // Науковий вісник Чернівецького університету. - 2004. - Вип. 193. Біологія. - С. 3 - 7. (Дисертант визначила ступінь окиснювальної модифікації загальних мітохондріальних білків, провела статистичну обробку результатів).

6. Копильчук Г.П., Волощук О.М. Окиснювальна модифікація продуктів мітохондріальної трансляції у щурів з трансплантованою карциномою Герена // Науковий вісник Чернівецького університету. - 2004. - Вип. 223. Біологія. - С. 266 - 271. (Дисертант визначила рівень карбонілювання білків, які кодуються мтДНК, провела статистичну обробку результатів).

7. Boychuk O.M., Kopylchuk G.P. Mitochondria genome expression in the process of malignant swelling growth // Conference for young scientist, phD students on molecular biology and genetics, September 25-27, Kyiv, 2003. - P.237.

8. Волощук О.М., Копильчук Г.П., Чернега І.І. Активність Н+-АТР-ази мітохондрій пухлини та печінки в динаміці розвитку карциноми Герена // Збірник тез ІІ Міжнародної наукової конференції студентів і аспірантів “Молодь та поступ біології”. - Львів, 2006. - С.41 - 42.

8. Копильчук Г.П., Волощук О.М. Сукцинатдегідрогеназна і Н+-АТР-азна активність мітохондрій печінки щурів-пухлиноносіїв за умов попереднього опромінення малими дозами // Матеріали ІХ Українського біохімічного з'їзду. - Харків, 2006. - С. 198 - 199.

9. Marchenko M.M., Kopylchuk G.P., Voloschuk O.M. Liver mtDNA synthesis and degradation under condition of previous irradiation and oncogenesis // 6th Parnas conference. - Acta Biochimica Polonika. - 2007. - Vol. 54, № 2. - Р. 62.

10. Копильчук Г.П., Волощук О.М., Чернега І.І. Зміни електрофоретичних спектрів мітохондріальних білків печінки в динаміці розвитку карциноми Герена // Збірник тез ІІІ Міжнародної наукової конференції студентів і аспірантів “Молодь та поступ біології”. - Львів, 2007. - С. 63 - 64.

11. Волощук О.М., Копильчук Г.П., Марченко М.М. Ступінь фрагментації та синтезу мтДНК пухлинної тканини попередньо опромінених щурів // Збірник тез конференції-конкурсу “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2007”. - Київ, 2007. - С. 8.

12. Копыльчук Г.П., Волощук О.Н. Изменение структурно-функционального состояния митохондрий печени в условиях предварительного низкодозового облучения // Материалы 11-й Пущинской школы-конференции молодых ученых “Биология - наука ХХІ века”. - Пущино, 2007. - С.135.

13. Марченко М.М., Волощук О.М., Чернега І.І. Мітохондріальні процеси вільнорадикального окиснення у трансформованій тканині попередньо опромінених пухлиноносіїв // Збірник тез 2-го з'їзду Українського товариства клітинної біології. - Київ, 2007. - С. 74.

Анотація

Волощук О.М. Стан вільнорадикальних процесів у мітохондріальній фракції карциноми Герена і печінки попередньо опромінених щурів при онкогенезі. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04. - біохімія. - Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича, Чернівці, 2008.

Дисертація присвячена вивченню інтенсивності вільнорадикальних процесів у мітохондріальній фракції карциноми Герена та печінки, фракційного складу мтДНК та білків, які кодуються мтДНК, на різних етапах онкогенезу за умов попереднього фракціонованого опромінення в малих дозах, а також модифікуючому впливу гідробромід 5-(5', 6'-бензокумароїл-3') метиламіноурацилу. Встановлено, що онкогенез за умов попереднього опромінення супроводжується набуханням мітохондрій карциноми Герена, гальмуванням Н+-АТР-азної та сукцинатдегідрогеназної активностей. Показано, що розвиток злоякісного новоутворення супроводжується фрагментацією мтДНК, зміною інтенсивності включення [3Н]-тимідину в мтДНК як пухлини, так і печінки, проте характер встановлених змін у досліджуваних тканинах відрізняється. Встановлені особливості фрагментації та синтезу мтДНК в тканинах попередньо опромінених тварин з трансплантованою карциномою Герена порівняно з неопроміненими пухлиноносіями. Виявлено ступінь окиснювальної модифікації мітохондріальних білків, які кодуються мтДНК, та зміну їх фракційного складу на різних етапах онкогенезу.

Встановлено, що введення гідробромід 5-(5', 6'-бензокумароїл-3') метиламіноурацилу (БКУ) зумовлює індукцію вільнорадикальних процесів у мітохондріях, що супроводжується інтенсифікацією фрагментації мтДНК та зміною електрофоретичних спектрів мітохондріальних білків.

Ключові слова: вільнорадикальні процеси, малі дози радіації, карцинома Герена, печінка, мітохондріальна фракція, мтДНК, мітохондріальні білки, гідробромід 5-(5', 6'-бензокумароїл-3') метиламіноурацил.

Аннотация

Волощук О.М. Состояние свободнорадикальных процессов в митохондриальной фракции карциномы Герена и печени предварительно облученных крыс при онкогенезе. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04. - биохимия. - Черновицкий национальный университет имени Юрия Федьковича, Черновцы, 2008.

Диссертация посвящена изучению интенсивности свободнорадикальных процессов в трансформированной ткани и печени, фракционного состава мтДНК и белков, кодируемых мтДНК, на разных этапах онкогенеза в условиях предварительного фракционированного облучения в малых дозах, а также модифицирующему влиянию гидробромид 5-(5', 6'-бензокумароил-3') метиламиноурацила на состояние митохондрий тканей опухоленосителей.

Показано, что развитие карциномы Герена в предварительно облученном организме сопровождается интенсификацией генерации О2- в митохондриальной фракции опухолевой ткани, и ведет к высокоамплитудному набуханию митохондрий, уменшению Н+-АТР-азной и сукцинатдегидрогеназной активностей, тогда как в митохондриальной фракции печени на начальных этапах онкогенеза наблюдается усиление активностей исследуемых мембранносвязанных ферментов с тенденцией к торможению на терминальных этапах. На фоне установленных изменений наблюдается усиление фрагментации мтДНК трансформированной ткани в динамике розвития новообразования с накоплением гетерогенных фрагментов разных размеров на фоне снижения интенсивности включения [3H]-тимидина в мтДНК, тогда как в печени предварительное облучение малыми дозами приводит к интенсификации процессса включения метки с максимумом в логарифмическую фазу опухолевого роста.

Индукция генерации супероксид анион-радикала у опухоленосителей супровождается усилением окислительной модификации митохондриальных белков, кодируемых мтДНК, опухоли и печени, при этом уровень карбонильных производных у предварительно облученных опухоленосителей значительно превышает показатели, установленные для необлученных животных с опухолью. Кроме того, электрофоретический анализ исследуемых митохондриальных белков обнаружил значительные изменения их фракционного состава в динамике розвития новообразования, что проявлялось в снижении интенсивности окрашивания полос в области высоких молекулярних мас (30 - 66 кДа) и значительном возростании содержания низкомолекулярных компонентов (8 - 16 кДа) на терминальных этапах онкогенеза. Отличия между групой облученных и необлученных опухоленосителей обнаружены только на латентной стадии опухолевого роста и заключались в изменении интенсивности окрашивания полос с высокими молекулярными масами.

Ключевые слова: свободнорадикальные процессы, малые дозы радиации, карцинома Герена, печень, митохондриальная фракция, мтДНК, митохондриальные белки, гидробромид 5-(5', 6'-бензокумароил-3') метиламиноурацил.

Summary

Voloschuk O.M. The state of free radical processes in mitochondrial fraction of Guerin's carcinoma and liver of preliminary irradiated rats during oncogenesis.. - Manuscript.

Thesis for Ph.D. science degree of speciality 03.00.04 - biochemistry. - Chernivtsy national university named after Yuriy Fedkovich, Chernivtsy, 2008.

The thesis is dedicated to the studying of the intensity of free radical processes in mitochondria of Guerin's carcinoma and liver, fraction content of mtDNA and proteins, coded by mtDNA, at the different stages of oncogenesis under condition of preliminary fractionated low doses irradiation and modifying influence of hydrobromide 5-(5', 6'-benzocoumaroil-3') methylaminouracil (BCU). It was set, that the oncogenesis under condition of preliminary irradiation is accompanied with Guerin's carcinoma mitochondria swelling, Н+-АТР-ase and succinatedehydrogenase activities inhibition. It was shown, that the tumor development is accompanied with mtDNA fragmentation, changes in the intensity of [3H]-thymidine incorporation in mtDNA of tumor and liver, but the character of the defined changes is different in the tissues under study.

It was set, that BCU administration causes free-radical processes induction in mitochondria, which was accompanied with the intensification of mtDNA fragmentation and the changes of electrophoretical spectra of mitochondrial proteins.

Key words: free radical processes, low doses irradiation, Guerin's carcinoma, mitochondrial fraction, liver, mtDNA, mitochondrial proteins, hydrobromide 5-(5', 6'-benzocoumaroil-3') methylaminouracil.

Размещено на Allbest.ru