Цитоморфологічні, морфометричні і цитогенетичні ознаки медіастинальних дрібноклітинних пухлин

Матеріал і методи дослідження. Дослідження проводили за архівними і поточними цитологічними препаратами від 103 онкологічних хворих на дрібноклітинні новоутворення середостіння, з них від 28 хворих ЛТ, 43 - ДНЛ (пролімфоцитарною) та 32 - НДРЛ. Хворі обстежувались і лікувались в Інституті онкології АМН України за період з 1977 по 2004 роки. Матеріалом для дослідження служили трансторакальні пунктати ЛТ (від 28 хворих) і НДРЛ (від 32 хворих) та пунктати лімфатичних вузлів від 43 хворих ПЛ. Всього вивчено 374 цитограми. У 91 хворого (88,3 %) клінічний діагноз верифікований гістологічним методом, у інших підтверджений клінічними проявами і рентгенологічними даними.

У більшості досліджених хворих спостерігався широкий віковий діапазон, від 0 до 79 років. Однак найбільш часто ПЛ діагностувалась в віковій групі до 10 років (32,56 %), ЛТ - в віковому діапазоні від 0 до 29 років (60,71 %) і НДРЛ - від 50 до 59 років (46,87 %), при цьому остання нозологічна форма до 30 років не спостерігалась. При ЛТ середній вік хворих склав 27,07 ± 3,05 років, чоловіків було 9 (32,1 %), жінок - 19 (67,9 %); при ПЛ показник середнього віку пацієнтів склав 26,33 ± 2,28 років, чоловіків було 31 (72,2 %), жінок - 12 (27,8 %); а при НДРЛ значення середнього віку хворих склало 54,59 ± 1,32 років, при цьому серед них переважали чоловіки - 30 (93,8 %). Співвідношення чоловіків і жінок при ЛТ склало, відповідно, 1:2,1; при ПЛ - 2,6:1; а при НДРЛ - 15,0:1.

Цитоморфологічні ознаки вивчались за пофарбованими методом Паппенгейма препаратами. Нозологічну форму тимом, лімфом і рака легень визначали за основними цитологічними критеріями з урахуванням сучасних міжнародних гістологічних класифікацій новоутворень вилочкової залози (ВООЗ, 1999), легень (ВООЗ, 1999) і пухлинних захворювань кровотворної і лімфоїдної тканини (REAL, 1994; ВООЗ, 2001).

Морфометричні дослідження виконані за допомогою цитоаналізатора “Интеграл-2МТ” в режимі “Маркер”. В зв'язку з наявністю вираженого лізису цитоплазми клітин проведена лише каріометрія з визначенням показників площі, периметру і коефіцієнта форми ядра. Одиницею виміру є мкм. Крім того, з метою більш легкого впровадження результатів досліджень в практику цитологічних лабораторій, визначався діаметр ядра шляхом перерахунку показників площі ядра за відомою математичною формулою (S=рRІ) для порівняння його з діаметром еритроцита. В кожному випадку досліджено, як правило, по 100 клітинних елементів. Всього поміряно 8610 пухлинних клітин у 87 хворих дрібноклітинними медіастинальними новоутвореннями, з них 2500 злоякісних елементів у 25 хворих на ЛТ, 3550 - у 36 хворих на ПЛ і 2560 - у 26 хворих на НДРЛ.

Для вивчення цитогенетичної характеристики клітин проводили фарбування цитологічних препаратів сріблом за загальноприйнятою методикою за Howell W.M., Black D.A. (1980) в модифікації Болгової Л.С., Туганової Т.М., Кузіної І.С. (2001) з урахуванням рекомендацій по стабілізації розчину срібла за Likovsky Z., Smetana K. (1981). За вищеозначеною модифікацією фарбувався архівний цитологічний матеріал, попередньо пофарбований методом Папенгейма. Вивчення цитограм здійснювалось за допомогою світлової мікроскопії на мікроскопі МБИ-15-2 при збільшенні х1350. В кожному випадку проаналізовані ядерця в 100 ядрах злоякісних клітин. Основні морфофункціональні типи ядерець оцінені згідно класифікації П.В.Челідзе і О.В.Зацепіної (1988). Підрахована загальна кількість ядерець на одне ядро і відсотковий вміст кожного типу ядерець: компактного, нуклеолонемного, кільцеподібного і мікроядерець. Крім того, визначали відсоткове співвідношення активних (компактних і нуклеолонемних) і неактивних (кільцеподібних і мікроядерець) ядерець в їх загальній структурі, а також вміст власне нуклеолонемних і перехідних нуклеолонемно-компактних форм. Всього досліджено 24594 ядерця в 4300 ядрах пухлинних елементів дрібноклітинних медіастинальних новоутворень за цитологічними препаратами 43 хворих, з них - 6355 ядерець в 1200 ядрах злоякісних клітин ЛТ у 12 хворих, 15714 ядерець в 1800 ядрах малігнізованих елементів ПЛ у 18 хворих і 2525 ядерець в 1300 ядрах пухлинних клітин НДРЛ у 13 хворих.

Статистичне обчислення отриманих результатів проводили з використанням t-критерія Ст'юдента з рівнем вірогідності р<0,05.

Результати досліджень та їх обговорення

1. Цитоморфологічні особливості дрібноклітинних медіастинальних новоутворень. При цитологічному дослідженні виявлені ознаки основних клітин злоякісного варіанту ЛТ, при якому в цитограмах відмічалась велика кількість помірно поліморфних пухлинних елементів, більших за розміром порівняно з такими при типовій формі захворювання та з вираженими дистрофічними змінами. При цьому ядра мали нерівний контур, нерівномірну брильчату щільну структуру хроматину і 1 - 2 відносно великих округлих блакитних ядерця. У великій кількості спостерігались лептони, виявлено збільшене число епітеліальних клітин та поява епітеліальних “клітин - няньок”.

Проведені цитоморфологічні дослідження дрібноклітинних медіастинальних новоутворень дали змогу виявити їх загальні і диференційно-діагностичні цитоморфологічні ознаки. Загальними ознаками для ЛТ, ДНЛ і НДРЛ є наявність великої кількості пухлинних елементів в цитограмах, клітини мають дрібні розміри і розташовуються в цитологічних препаратах як порізно, так і в скупченнях. Клітинні елементи цих нозологічних форм характеризуються, як правило, невеликим поліморфізмом і вираженими дистрофічними змінами.

Установлені найбільш значимі цитоморфологічні диференційні показники дрібноклітинних пухлин середостіння: ступінь поліморфізму (найбільш поліморфними є клітини НДРЛ, менше - елементи ДНЛ і найменше - клітини ЛТ), розміри (найбільшими є елементи ДНЛ, меншими - клітини НДРЛ і найменшими - елементи ЛТ), структурні ознаки (при ДНЛ клітини розташовуються переважно порізно, при ЛТ - порізно і в невеликих скупченнях, а при НДРЛ - порізно, в скупченнях і в пластах) та наявність додаткових клітинних і фонових компонентів (в цитограмах ЛТ присутні поодинокі характерні епітеліальні клітини тимусу та окремі епітеліальні “клітини - няньки”, при ДНЛ клітинні елементи розташовуються серед великої кількості лептонів, а при НДРЛ - серед дрібних фрагментів ядер і окремих дрібних перинуклеарних включень), які при достатній кількості клітинного матеріалу дозволяють визначити гістологічний тип цих новоутворень.

За такими цитоморфологічними критеріями, як кількість клітин та їх взаєморозташування, характер дистрофічних змін, розміри, форма і забарвленність ядер, наявність і число ядерець, нами була проведена кількісна оцінка пухлинних елементів дрібноклітинних медіастинальних новоутворень за 5-бальною шкалою, використання якої може сприяти диференційній діагностиці між цими пухлинами (табл.).

Таблиця. Кількісна оцінка цитоморфологічних ознак дрібноклітинних медіастинальних новоутворень

Примітка. Оцінка ознак проводилась за 5-бальною системою: (-) - відсутність ознаки; (+) - ознака представлена в поодиноких клітинах; (++) - ознака зустрічається в половині клітин; (+++) - ознака зустрічається в 2/3 клітин; (++++) - ознака зустрічається майже у всіх клітинах.

2. Морфометричні параметри дрібноклітинних медіастинальних пухлин. Проведені морфометричні дослідження пухлинних клітин дрібноклітинних медіастинальних новоутворень дозволили встановити їх характерні каріометричні показники площі, периметра і діаметра, які мають статистично вірогідні відмінності і об'єктивізують отриману диференційно-діагностичну інформацію. Доведено, що для пухлинних клітин ЛТ середніми каріометричними параметрами є: площа - 57,83±0,68 мкм², периметр - 28,54±0,17 мкм, діаметр - 8,75±0,05 мкм. Виявлено, що середні розміри ядер елементів ДНЛ в порівнянні з попередньою гістологічною формою дрібноклітинних пухлин середостіння мали більші морфометричні показники: площа - 100,61±1,65 мкм², периметр - 37,76±0,31 мкм, діаметр - 11,29±0,09 мкм. Визначено, що середні каріометричні показники клітин НДРЛ становлять: площа - 88,75±1,77 мкм², периметр - 35,26±0,33 мкм, діаметр - 10,57±0,10 мкм.

Також відмічені відмінності за характером розподілу діаметрів ядер елементів цих пухлин (рис.). Встановлено, що розмір діаметру ядер клітин ЛТ мав показники, в основному, від 7,10 до 10,00 мкм, елементів ПЛ - від 9,10 до 15,00 мкм, а клітин НДРЛ - від 8,10 до 15,00 мкм. Застосування цього розмірного параметру дозволяє порівнювати пухлинні клітини з відомим діаметром еритроцитів (7,5 мкм), які постійно присутні в кожному трансторакальному пунктаті, що дає змогу більш об'єктивно визначити гістологічну форму цих новоутворень.

Виявлено, що додатковою морфометричною ознакою є визначення кількості поліморфних ядер за показником коефіцієнта форми від 1,28 до 1,34 відносних одиниць в дослідженій популяції клітинних елементів. Показано, що найбільша їх кількість спостерігається при ПЛ (2,28±0,44 %), менша - при НДРЛ (1,76±0,30 %) і найменша - при ЛТ (0,64±0,25 %).

3. Цитогенетичні показники дрібноклітинних медіастинальних пухлин. При цитогенетичному дослідженні пухлинних клітин дрібноклітинних медіастинальних новоутворень встановлено, що найвищий рівень злоякісної трансформації мають клітини НДРЛ, які характеризувались перевагою нуклеолонемних ядерець серед всіх визначених типів ядерець, при середньому значенні (39,80±0,93) %; високим рівнем активних ядерець (компактних і нуклеолонемних), які склали в середньому (61,85±3,02) % на 100 досліджених ядер та великою кількістю перехідних нуклеолонемно-компактних ядерець при середньому показнику (75,50±4,91) % серед всіх нуклеолонемних ядерець. Отримані цитогенетичні дані клітин НДРЛ корелюють з клінічним перебігом цього захворювання.

В клітинах ПЛ виявляється дещо нижчий рівень функціональної активності ЯОР. При цьому визначені найбільш значимі цитогенетичні показники клітин ПЛ: переважання мікроядерець серед всіх визначених типів ядерець, при середньому значенні (70,07±0,65) %; низький рівень активних ядерець, які склали в середньому (19,97±1,98) % та велика кількість перехідних нуклеолонемно-компактних ядерець при середньому показнику (94,97±2,23) % серед всіх нуклеолонемних ядерець. Ці дані відповідають клінічній характеристиці ДНЛ, згідно якої ПЛ відноситься до НЗЛ низького ступеня злоякісності.

Рис. Розподіл діаметрів ядер пухлинних клітин при лімфоїдній тимомі, пролімфоцитарній лімфомі та недиференційованому дрібноклітинному раку легень.

Незрілі лімфоїдні елементи ЛТ є найменш функціонально активними з досліджених пухлинних клітин дрібноклітинних медіастинальних новоутворень. Характерними цитогенетичними ознаками клітин ЛТ є: високий рівень мікроядерець серед всіх визначених типів ядерець, які склали в середньому (40,65±1,18) %; невелика кількість активних ядерець (компактних і нуклеолонемних) при середньому значенні (23,87±0,82) % на 100 досліджених ядер; та низька експресія перехідних нуклеолонемно-компактних ядерець (29,47±5,71) %, що співпадає з найбільш доброякісним клінічним перебігом ЛТ серед трьох гістологічних форм цих пухлин.

За результатами проведених цитогенетичних досліджень ядер пухлинних клітин дрібноклітинних медіастинальних новоутворень визначено, що загальна кількість ядерець в одному ядрі в клітинах ДНЛ є найбільшою (8,73±0,63), меншою - в ядрах клітин ЛТ (5,30±0,25) і найменшою - в елементах НДРЛ (1,94±0,12). При цьому більшість ядерець в ядрах клітин НДРЛ склали нуклеолонемні форми ((39,80±0,93) %), а в клітинах лімфоїдної тимоми і пролімфоцитарної лімфоми переважали мікроядерця (відповідно, (40,65±1,18) % і (70,07±0,65) %).

При співставленні отриманих цитогенетичних показників клітин ЛТ з клінічним перебігом захворювання визначено, що в групі хворих, в цитограмах яких визначена середня кількість компактних ядерець до 2,0 % та вміст перехідних нуклеолонемно-компактних ядерець до 5,0 % переважно були відсутні скарги при первинному обстеженні хворих, пухлина середостіння виявлялась випадково, не відмічались також ранні метастази і рецидиви. При подальшому наростанні числа перехідних нуклеолонемно-компактних ядерець та при середньому показнику компактних ядерець в клітинах ЛТ від 2,0 % до 4,0 % пухлина метастазувала через 2 - 6 місяців, а у хворих з середнім показником компактних ядерець від 4,0 % і більше метастатичні ураження лімфатичних вузлів спостерігались при первинному обстеженні хворих.

При порівнянні отриманих цитогенетичних показників клітин ПЛ з клінічним перебігом захворювання виявлено, що при значенні компактних ядерець від 8,0 % і більше спостерігалась швидка генералізація злоякісного лімфопроліферативного процесу з утворенням конгломератів уражених лімфатичних вузлів та появою плевриту і асциту.

Виявлений значний вплив дистрофічних змін на функціональну активність клітин НДРЛ за показниками компактних і нуклеолонемних ядерець. Так, при наявності збережених елементів пухлини виявлялись великих розмірів компактні та нуклеолонемні ядерця, представлені переважно їх перехідними нуклеолонемно-компактними формами. В клітинах НДРЛ з частково вираженими явищами дистрофії спостерігались нуклеолонемні ядерця, в яких гранули срібла розташовувались по периферії, утворюючи “ланцюжок” та окремі дрібні компактні ядерця. При виражених дистрофічних змінах клітин виявлялись поодинокі дрібні як компактні, так і нуклеолонемні ядерця. Крім того, серед ядер пухлинних клітин спостерігались перинуклеарні включення.

Таким чином, використання всіх цитоморфологічних характеристик при достатній кількості клітинного матеріалу дозволяє визначити гістологічну форму дрібноклітинного медіастинального новоутворення до початку спеціального лікування, що підвищує ефективність цитологічної діагностики цих пухлин до 83,5 %. При складнощах в диференційній діагностиці ЛТ, ДНЛ і НДРЛ необхідно застосовувати їх морфометричні критерії і цитогенетичні параметри. Встановлено, що використання комплексу цитоморфологічних, морфометричних і цитогенетичних диференційних ознак клітин цих новоутворень дозволяє отримати оптимальну інформацію для постановки морфологічного діагнозу, що підвищує цитологічну діагностичну ефективність до 93,4 %, яка на 39,6 % більше від первинної.

ВИСНОВКИ

Робота присвячена визначенню комплексу цитоморфологічних, морфометричних і цитогенетичних показників дрібноклітинних пухлин середостіння.

Створена семіотика цитоморфологічних, морфометричних і цитогенетичних ознак дрібноклітинних медіастинальних новоутворень - лімфоїдної тимоми, дрібноклітинної неходжкінської лімфоми і недиференційованого дрібноклітинного раку легень сприяє підвищенню ефективності цитологічної діагностики цих пухлин до 93,4 %.

Найбільш характерними цитоморфологічними ознаками при лімфоїдній тимомі є: дрібні, мономорфні, округлі лімфоїдні клітини, розташовані порізно і в невеликих скупченнях та поодинокі характерні епітеліальні клітини; при пролімфоцитарній лімфомі - помірно поліморфні лімфоїдні клітини більші за розміром, ніж при тимомі, часто з вираженими ознаками дистрофії, переважно порізно розташовані на фоні лептонів; при недиференційованому дрібноклітинному раку легень - невеликі поліморфні гіпер- і гіпохромні ядра епітеліальних клітин, часто з фасеткованими поверхнями, розташовані порізно, в скупченнях і в пластах серед дрібних фрагментів ядер і окремих дрібних щільних округлих перинуклеарних включень, що є діагностично значимими відмінностями.

Злоякісний варіант лімфоїдної тимоми характеризується великою кількістю помірно поліморфних, переважно округлих пухлинних елементів, більших за розміром порівняно з такими при доброякісній формі захворювання; наявністю ядер з нерівним контуром оболонки, нерівномірною брильчатою структурою хроматину і з 1 - 2 відносно великими округлими блакитними ядерцями; збільшеною кількістю лептонів і епітеліальних клітин та поодинокими епітеліальними “клітинами - няньками”.

Установлені статистично вірогідні відмінності між середніми морфометричними показниками площі, периметра і діаметра ядер клітин дрібноклітинних медіастинальних пухлин (при лімфоїдній тимомі площа - 57,83±0,68 мкм², периметр - 28,54±0,17 мкм і діаметр - 8,75±0,05 мкм; при дрібноклітинній неходжкінській лімфомі площа - 100,61±1,65 мкм², периметр - 37,76±0,31 мкм і діаметр - 11,29±0,09 мкм; при недиференційованому дрібноклітинному раку легень площа - 88,75±1,77 мкм², периметр - 35,26±0,33 мкм і діаметр - 10,57±0,10 мкм). Найбільша кількість поліморфних ядер спостерігається при дрібноклітинній неходжкінській лімфомі (2,28±0,44 %), менша - при недиференційованому дрібноклітинному раку легень (1,76±0,30 %) і найменша - при лімфоїдній тимомі (0,64±0,25 %).

Доведено, що найбільша кількість ядерець в одному ядрі міститься в ядрах клітин пролімфоцитарної лімфоми (8,73±0,63), менша - в клітинах лімфоїдної тимоми (5,30±0,25) і найменша - в ядрах недиференційованого дрібноклітинного раку легень (1,94±0,12). В ядрах клітин недиференційованого дрібноклітинного раку легень переважають нуклеолонемні ядерця (39,80±0,93 %), а в клітинах лімфоїдної тимоми і пролімфоцитарної лімфоми - мікроядерця (відповідно, 40,65±1,18 % і 70,07±0,65 %).

Рівень злоякісної трансформації клітин за показниками кількості ядерець з високою функціональною активністю (компактних і нуклеолонемних) і експресії перехідних нуклеолонемно-компактних ядерець є високим при недиференційованому дрібноклітинному раку легень (відповідно, (61,85±3,02) % і (75,50±4,91) %), меншим - при пролімфоцитарній лімфомі (відповідно, (19,97±1,98) % і (94,97±2,23) %) і найменшим - при лімфоїдній тимомі (відповідно, (23,87±0,82) % і (29,47±5,71) %), що співпадає з клінічними проявами вищевказаних захворювань.

Ризик виникнення раннього рецидиву і метастазів в регіонарні лімфатичні вузли лімфоїдної тимоми підвищується при збільшенні показників компактних ядерець від 2,0 % і більше та перехідних нуклеолонемно-компактних ядерець від 5,0 % і більше в ядрах пухлинних клітин, а ймовірність генералізації дрібноклітинної неходжкінської лімфоми стає високою при збільшенні кількості компактних ядерець від 8,0 % і більше в клітинах, що має прогностичне значення.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ