Київ - 2004

Дисеpтацією є pукопис

Pоботу виконано у відділі експериментальної кардіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН Укpаїни.

Науковий кеpівник: академік НАН України, доктор медичних наук Мойбенко Олексій Олексійович, Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН Укpаїни, завідувач відділом експериментальної кардіології/

Офіційні опоненти: доктор медичних наук Соловйов Анатолій Іванович, Інститут фармакології та токсикології АМН України, головний науковий співробітник відділу експериментальної терапії;

доктор медичних наук Орлова Ніна Миколаївна, Інституту кардіології ім. М.Д. Стражеска АМН України, провідний науковий співробітник;

Провідна установа: Кафедра патологічної фізіології Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця АМН України.

Захист відбудеться 24 лютого 2004 p. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої pади Д-26.198.01 пpи Iнституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН Укpаїни за адpесою: 01024, м. Київ-24, вул. Богомольця, 4.

З дисеpтацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту фізіології
ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ-24, вул. Богомольця, 4.

Автоpефеpат pозісланий "22" січня 2004 p.

Вчений секpетаp спеціалізованої вченої pади, доктоp біологічних наук Соpокіна-Маpіна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Оцінити вплив системного інгібування NOS на характер порушень функцій серцево-судинної системи, біохімічні зміни в міокарді і розмір пошкодження серця.

Встановити вплив активації синтезу оксиду азоту шляхом введення L-аргініну на характер порушень функцій серцево-судинної системи, біохімічні і морфологічні зміни в міокарді.

Дослідити дію препарату корвітину - водорозчинного кверцетину на характер порушень функцій серцево-судинної системи, біохімічні і морфологічні зміни в міокарді.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено, що при експериментальній гострій ішемії-реперфузії міокарда відбувається зниження активності NOS та зменшення вмісту NO2- в прилеглій та некротичній зонах і підвищення активності аргіназ в уражених ділянках серця. В пошкодженному міокарді зростає вміст кінцевого продукту аргіназної реакції - сечовини.

Отримало подальший розвиток дослідження впливу L-NNA (інгібітор NOS) і L-аргініну на перебіг експериментальної гострої ішемії-реперфузії міокарда. Встановлено, що L-NNA негативно впливає на показники кардіогемодинаміки, підвищуючи коронарний судинний опір, загальний судинний опір, значно збільшучи порушення ритму серцевої діяльності, особливо при реперфузії міокарда. Тоді як введення L-аргініну (за цих же умов) покращує показники кардіогемодинаміки і знижує постнавантаження на серце, має виражену антиаритмічну дію, в 2,5 рази зменшує зону некрозу.

Вперше показано, що при гострій ішемії-реперфузії міокарда введення як L-аргініну, так і L-NNA призводить до зниження в зоні некрозу активності аргінази і вмісту сечовини, дієнових кон'югатів, лейкотриєну С4 і тромбоксану В2.

Вперше встановлено, що введення L-NNA (в дозі 50,0 мг/кг ваги, в/в) призводить до зникнення вазодилятоторної реакції коронарних судин неішемізованої ділянки міокарда і до зростання коронарного судинного опору в неішемізованому міокарді.

Вперше одержано дані, про те, що застосування корвітину - нового, розробленого нами кардіопротекторного препарату, призводило до зменшення зони некрозу, стабілізації системного артеріального тиску, тиску в лівому шлуночку, збереження активності NOS та вмісту нітрит-аніону в пошкоджених ділянках міокарда, зниження активності аргінази і вмісту сечовини в пошкодженому міокарді.

Теоретичне i практичне значення роботи. Отримані результати розкрили NO-залежні ланки патологічного процесу в серцево-судинній системі. Система NO є необхідною для функціонування міокарда у нормі і визначальною за патологічних умов (таких як гостра ішемія-реперфузія). Пошкодження вивільнення NO, яке пов'язане з погіршенням коронарного кровотоку є фактором ризику при інфаркті міокарда. Недостатнє вивільнення NO може бути наслідком пошкодження самого міокарда і є важливим в патогенезі ішемічної хвороби серця. Надлишок L-аргініну - субстрату для NO в коронарному руслі вносить позитивний вклад в перебіг експериментальної гострої ішемії-реперфузії міокарда, що має фундаментальне значення для розуміння механізмів розвитку інфаркту міокарда.

Доказана кардіопротекторна роль нового препарату корвітину, яка полягає у збереженні активності нітрикоксидсинтаз та вмісту нітрит-аніону в пошкодженому міокарді та зниженні вмісту потужних вазоконстрикторів та хемоатрактантів, таких як ЛТС4 та ТхВ2, а також у вірогідному зменшенні розмірів некротично ураженого міокарда.

Запропонована нами експериментальна модель для вивчення експериментальної гострої ішемії-реперфузії може бути використана для досліджень впливу факторів, які є важливими для збереження функції міокарда, а також для прикладних досліджень і розробок нових підходів у терапії гострого інфаркту міокарда.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно здійснено науковий пошук та обгрунтування напрямку досліджень. Самостійно проведені експериментальні дослідження, статистична обробка одержаних результатів та їх аналіз, сформульовано основні висновки роботи, підготовлено до публікації матеріали стосовно основних положень експериментальних досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні положення й окремі фрагменти роботи дисертації доповідалися: на Українській Науковій конференції “Мікроциркуляція та її вікові зміни” (Київ, 1999), XVI Світовому конгресі Міжнародного товариства по дослідженню серця (Маастріхт, 1999); ІІ Російському Конгресі по патофізіології (Москва, 2000), 11 Міжнародній конференції “Досягнення у вивченні простагландинів та лейкотриєнів” (Флоренція, 2000), VI Конгресі кардіологів України, (Київ, 2000), ІІІ національному конгресі патофізіологів України, (Одеса, 2000), XVII Світовому конгресі (Canada 2001), ІІ міжнародній науково-практичній конференції “Дисфункция эндотелия” (Витебск, 2002), V Всеукраїнській конференції молодих учених “Сучасні проблеми гігієни, токсикології та аналітичної хімії” (Київ, 2003), Науково-практичній конференції з міжнародною участю “Фізіологія регуляторних систем” (Чернівці, 2003), VII з'їзді Всеукраїнського лікарського товариства (Тернопіль, 2003), ІІІ конгресі Федерації європейських товариств фізіологів (Ніца, 2003)

Публікації. Результати дисертації викладено в 6 статтях у наукових фахових виданнях, 1 статті в збірнику наукових праць та 11 тезах доповідей на конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, розділів описання матеріалів і методів дослідження, результатів досліджень, аналізу і узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаних джерел. Робота викладена на 162 сторінках машинописного тексту та ілюстрована 12 рисунками і 17 таблицями. Список літератури містить 54 джерелa українською та російською мовами і 260 іноземних джерела.

ішемія реперфузія міокард інгібітор

ОСновний зміст роботи

Матеріали та методи досліджень. Досліди виконувалися на безпородних собаках-самцях, вагою від 16 до 23 кг під хлоралозо-уретановим наркозом (0,07 та 0,7 г/кг ваги, внутрішньовенно). Після введення гепарину (500 од/кг) крізь стегнову артерію катетеризували черевний відділ аорти та через ліву сонну артерію - лівий шлуночок серця, для реєстрації системного артеріального тиску та тиску в лівому шлуночку, відповідно. Металевий катетер через праву сонну артерію ретроградно вводили в гирло лівої коронарної артерії. Після чого, внутрішній пластиковий зонд з потовщенням на кінці, що знаходився в просвіті металевого катетера просували вперед на 1 см і розпочинали перфузію коронарної судини, власною кров'ю тварини із плечової артерії через помпу з постійним об'ємом. Зовнішній кінець металевого катетера був сполучений через трійник з манометром, що дозволяло реєструвати тиск в коронарному руслі і з гнучким тефлоновим катетером, що знаходився в правій плечевій артерії. Подальше просування внутрішнього зонда з обтуратором приводило до заклинювання дистального відділу судини і відповідно ішемії ділянки міокарда. Через декілька секунд після заклинювання розвивалися характерні ЕКГ-ознаки ішемії. Реперфузії досягали шляхом підтягування внутрішнього зонда до вихідного рівня.

Рєєстрація гемодинамічних параметрів проводилася за допомогою полікардіографа “Mingograph-82”, фірми Siemens-Elema (Швеція). Запис ЕКГ здійснювався у І та ІІІ стандартних відведеннях, реєстрували коронарний перфузійний тиск (КПТ), середній артеріальний тиск (САТ), тиск у порожнині лівого шлуночка (ТЛШ). Скоротливу функцію лівого шлуночка оцінювали за змінами першої похідної внутрішньошлуночкового тиску та індексу скоротливості міокарда - (dp/dtmax)/р. Хвилинний об'єм крові (ХОК) визначали методом термодилюції. За отриманими даними ХОК та САТ розраховували показник загального периферичного опору.

Протягом експерименту провадився забір артеріальної крові для визначення сумарної активності NOS, аргінази, вмісту сечовини, NO2-, лейкотрієну С4 (ЛТС4), тромбоксану В2 (ТхВ2), дієнових конюгатів (ДК) Визначення біохімічних параметрів проводилися при консультативній допомозі ст.н.с. Інституту біохімії ім. В.П. Паладіна НАН України Коцюруби А.В.. Ті ж параметри визначали також в гомогенатах серця некротичної, прилеглої та „інтактної” (контрольної) зони. Для визначення активності NOS використовували комбінацію класичного методу [Selter M., 1991] та сучасну його модифікацію [Chin S. et al., 1999], пристосовану для спектрофотометричного вимірювання продуктів реакції - нітрит-аніона [Vodovotz Y. et al., 1994]. Активність NOS представляли в наномолях NO, що утворювався за 1 хв на 1 мг загального білка гомогенату серця. Вміст загального білка в пробах визначали загальновживаним методом Бредфорда [Bradford M., 1976]. Активність аргінази визначали за кількістю сечовини - одного з продуктів реакції L-аргінін сечовина+орнітин, яку визначали колориметричним методом [Колб В.Г., 1976.] за кольоровою реакцією з диацетилмонооксимом. Вміст дієнових кон'югатів визначали спектрофотометрично [Гаврилов В.Б. и др., 1988]. Вміст ЛТС4 та ТхВ2 визначали в пробах за допомогою РІА-методу з застосуванням добірки реактивів фірми “Amersham” i “Du Pont”, відповідно. Площу некротичної зони та площу зони “ризику” розраховували планіметрично. Зону “ризику” виявляли шляхом забарвлення інтактних ділянок міокарда за допомогою введення 80-100 мл 1% розчину метиленового синього в аорту безпосередньо після вилучення серця із грудної порожнини при затягнутому турнікеті в місці оклюзії коронарної артерії. Виділяли лівий шлуночок та розрізали його перпендикулярно його осі на блоки товщинною 0,5 см. Непошкоджений міокард забарвлювався у темносиній колір, а зона “ризику” залишалася незабарвленою. Після вимірювання площі зони “ризику” зразки фарбували нітросинім тетразолієм, який виявляє сумарну активність дегідрогеназ; некротичні ділянки залишались незабарвленими.

Експерименти проведені в 4 серії: 1 - регіональна ішемія міокарда (90 хв) з наступною реперфузією (180 хв); 2 - регіональна ішемія міокарда (90 хв) з наступною реперфузією (180 хв), на фоні введення 50 мг/кг ваги тіла тварини L-- nitro-arginine (L-NNA) - неселективного інгібітора нітрикоксидсинтаз (за 20 хв до початку ішемії і через 2 год по ходу досліда); 3 - регіональна ішемія міокарда (90 хв) з наступною реперфузією (180 хв), на фоні введення L-аргініну (1000 мг в/в одномоментно з подальшим внутрішньокоронарним введенням препарату в дозі 1 мг/кг/хв протягом всього експерименту; 4 - регіональна ішемія міокарда (90 хв) з наступною реперфузією (180 хв), на фоні введення корвітину (5 мг/кг ваги тіла, в/в). Дані представлені як середнє значення 9-12 повторів (n) середня квадратична похибка. Статистичний аналіз отриманих результатів проводився за допомогою методів варіаційної статистики з використанням t-критерію Стьюдента для оцінки вірогідності відмінностей груп даних. Статистично вірогідними вважалися результати для яких Р<0,05.

Основні результати дослідження та їх обговорення

Показники кардіогемодинаміки, розміри уражень серця та біохімічні параметри за умов експериментальної гострої ішемії-реперфузії міокарда. Результати вимірювання показників кардіогемодинаміки за умов експериментальної гострої ішемії-реперфузії міокарда показали, що після оклюзії коронарної артерії відбувається прогресивне падіння хвилинного об'єму крові (ХОК) який до кінця реперфузійного періоду знижується на 33,13% (Р<0,05) і зростання загального периферичного опору на 41,47% (Р<0,05).

Аналіз змін коронарного судинного опору (КСО), про які судили за змінами коронарного перфузійного тиску (КПТ), показав наявність зниження з початком ішемії на 12,3%, а саме відразу після заклинювання значення КПТ становило 150,236,17 мм рт.ст у порівнянні з вихідним значенням 171,37,2 мм рт.ст (P<0,05). КПТ залишається на низькому рівні протягом всього періоду ішемії і піднімається вище вихідного рівня тільки з початком реперфузії.

Розрахунок величин ішемічного ураження міокарда показує, що після ішемії-реперфузії площа зони некрозу по відношенню до площі лівого шлуночка становить 10,51,9%, а по відношенню до площі зони ризику - 40,94,1% (Р<0,05). Зона ризику становить 35,13,6% до площі лівого шлуночка.

Встановлено, що в пошкодженому міокарді знижується активність нітрикоксидсинтаз (рис.1), яка в некротичній та прилеглій зонах в порівнянні з “інтактною” зоною, зменшується на 60,0% і 31,7%, відповідно (Р<0,05). Аналогічні зміни характерні для концентрації стабільного метаболіту NO - NO2-. В некротичній ділянці рівень NO2- знижується на 57%, а в прилеглій до некротичної зони - зоні ризику на 31,3% (Р<0,05).

Активність аргінази підвищується в некротичній ділянці у 5,87 разів і в пограничній ділянці у 2,58 раз у порівнянні з її значенням в інтактній ділянці. Кількість одного з кінцевих продуктів аргіназної реакції - сечовини підвищується в прилеглій та некротичній зонах у 1,75 раз та 7,65 раз (Р<0,05), відповідно, у порівнянні з “інтактною”зоною.

Таким чином, за умов експериментальної гострої ішемії-реперфузії міокарда досить чітко простежена закономірність: зниження активності ферментів, відповідальних за синтез оксиду азоту, та навпаки активація ферментів, які продукують сечовину (аргінази). Це призводить до різкого зменшення вмісту оксиду азоту в ішемізованих ділянках серця та, відповідно, до збільшення концентрації сечовини в зоні ураження.

Причин такої спрямованості змін активності ферментів системи оксиду азоту може бути декілька. По-перше, ішемія гальмує активність NOS та утворення NO в зв'язку з нестачею кисню, необхідного для реалізації окисного NO-синтазного шляху утворення NO, що повинно мати найбільше значення в період ішемії міокарда. При подальшій реперфузії дуже важливим для продукції NO був розвиток окисного стресу та продукції АФК, зокрема, супероксидного радикала, який, як відомо, зв'язує NO з утворенням токсичної речовини -- пероксинітриту (ОNОО-), що призводить у кінцевому результаті до зменшення вмісту NO в тканинах серця [Brovkovych V. et al., 1999]. Крім того відомо, що продукт аргіназної реакції -- сечовина може пригнічувати активність NOS і, таким чином, також спричиняти зменшення продукції оксиду азоту [Prabhakar S. et al., 1997].

Аналіз біохімічних змін у міокарді при ішемії-реперфузії серця дозволив вважати, що процеси утворення вільних радикалів кисню є активованими, про що свідчило збільшення кінцевих продуктів окисного стресу -- ДК в прилеглій та некротичній зонах. Так в “інтактній” зоні вміст ДК становить 0,0760,009 нмоль/мг білка, в прилеглій - 0,1500,009 нмоль/мг білка (Р<0,05), а в некротичній - 0,2390,013 нмоль/мг білка (Р<0,05). Подібним чином в прилеглій та некротичній зонах підвищується вміст і ЛТС4 та ТхВ2. Так вміст ЛТС4 в “інтактній” зоні складає 0,0520,008 нмоль/мг білка, тоді як в прилеглій - 0,0740,012 нмоль/мг білка, а в некротичній - 0,1950,033 нмоль/мг білка (Р<0,05). Вміст ТхВ2 в прилеглій та некротичній зонах становить 0,0950,012 нмоль/мг білка (Р<0,05) і 0,1500,019 нмоль/мг білка (Р<0,05) відповідно, у “інтактній” - 0,0590,008 нмоль/мг білка.

Відмічено швидке зниження активності NOS у крові тварин в динаміці ішемії та реперфузії міокарда, вже на 10-й хвилині ішемії активність фермента була всього 58% від вихідної, а на 90-й хвилині ішемії зменшувалась у 5 разів (Р<0,05). Водночас відбувалася вельми інтенсивна активація аргінази (збільшення активності в 6,5 разів), а співвідношення активності аргінази та NOS збільшувалося в 27 разів. Співвідношення вмісту сечовина/NO2- у крові досить інтенсивно підвищувалося, становлячи в кінці реперфузії 276% від вихідного. Таким чином, зміщення системи в бік активації аргінази й інгібування NOS, а також накопичення сечовини та зниження вмісту NO2- спостерігалось і в крові.

Слід зазначити, що подібні зміни активності аргінази та NО-синтази можуть розвиватися за деяких інших патологічних процесів [Сагач В.Ф. та ін., 2000; Rodriguez S. et al., 2000]. Виходячи з цих даних, а також з наших результатів можна висунути положення про конкурентні відношення між ферментами, що продукують оксид азоту та сечовину -- нітрикоксидсинтазами та аргіназами за один і той же субстрат -- L-аргінін. У такому разі за допомогою модуляції активності аргінази можна було б змінювати продукцію оксиду азоту та використовувати цей підхід при лікуванні захворювань серцево-судинної системи.

Вплив інгібітора NOS на зміни кардіогемодинаміки, розмір уражень серця та зміну біохімічних параметрів в різних зонах серця за умов експериментальної гострої ішемії-реперфузії міокарда. Представлені в попередньому розділі результати наших досліджень, які привели нас до висновку про наявність суттєвих порушень біосинтезу оксиду азоту в ішемізованому серці спонукали нас до проведення досліджень зі штучною модифікацією цього біосинтезу та впливу цієї модифікації на розвиток ішемічно-реперфузійного синдрому.

В наших дослідах інгібування продукції оксиду азоту при ішемії та реперфузії міокарда приводила до суттєвих змін параметрів функції серцево-судинної системи. Якщо в контрольних (без інгібування NOS) дослідах САТ та ТЛШ змінювалися незначно в динаміці ішемії-реперфузії, то після гальмування продукції NO спостерігалося досить чітке, хоча і не вірогідне зниження цих показників в кінці досліду. Найбільше після введення L-NNA змінювалися показники ХОК, ЗПО та КПТ. Так в контрольних дослідах на 10 хвилині ішемії ХОК знижувався на 8,9% і в кінці реперфузії на 33,5%, а в дослідах з інгібуванням NOS вже на 10 хвилині ішемії ХОК був нижче вихідних даних на 26%, а в кінці реперфузії знижувався більше як у два рази (-53%, Р<0,05).

В серії наших дослідів введення L-NNA мало виражений вплив на судинний тонус; так, на всіх етапах досліду після інгібування NOS загальний периферичний опір був значно вищим ніж в контрольних експериментах. Ще більше ускладнювало роботу серця суттєве підвищення коронарного судинного опору після інгібування NOS впродовж всього досліду і, особливо, в кінці експерименту (на 43,8%, Р<0,05). Це могло бути обумовлено як гальмуванням вазодилятаторних реакцій коронарних судин, залежним від блокування дії ендотелій-залежного розслабляючого фактору, так і нейрогенним активуванням симпатичних регуляторів коронарного судинного тонусу. В той же час є дані, що введення інгібіторів NOS без супутньої ішемії не призводить до змін коронарного кровотоку у собак [Kitakaze M. et al., 1996]. Таким чином, NO-залежні механізми вазодилятації набувають виняткової ваги в умовах ішемії міокарда.

Як було показано раніше роботами в нашому відділі [Азаров В.І. та ін., 1999, Мойбенко О.О. та ін., 2000] закупорка дрібної коронарної артерії супроводилася зниженням судинного опору в коронарних артеріях неішемізованого міокарда. Реакція виникала через декілька секунд після емболізаціі і зберігалася протягом всього періоду оклюзії, поступово зменшуючись. Коронарний судинний опір знову зростав на початку реперфузії. Було показано, що ні простациклін, ні АТФ-залежні калієві канали не відіграють суттєвої ролі в розвитку даної дилятаторної реакції коронарних судин неішемізованого міокарда, також атропінізація і двостороння ваготомія не знімали розширення коронарних судин неішемізованої ділянки міокарда при оклюзії дрібної гілки коронарної артерії [Мойбенко О.О., та ін., 2003].

В наших дослідах встановлено, що системне інгібування активності NOS призводить до зникнення і навіть “спотворення” даної реакції, тобто перетворення її в констрикторну. Таким чином, домінуючу роль в розширенні коронарних судин неішемізованого міокарда і відповідному збільшенню коронарного кровотоку відіграють NO-залежні реакції.

Погіршення коронарного кровотоку після інгібування продукції NO супроводжувалось зниженням показника dP/dtmax, як на етапі ішемії, так і під час реперфузії, що свідчить про погіршення скоротливої функції серця.

Як показали наші досліди введення L-NNA провокує інтенсивні порушення ритму. Як правило це були політопні екстрасистоли, переважно шлуночкові, часто з явищами порушень провідності по пучку Гіса, спостерігалась бі- та тригемінія. На всіх етапах дослідження кількість екстрасистол після інгібування продукції NO значно перевищувала цей показник в контрольних дослідах (без інгібування NOS) з початком реперфузії ця різниця була особливо виражена.

Серед значної кількості робіт, присвячених ролі оксиду азоту при ішемії-реперфузії, тільки в незначній їх частині проводилось вимірювання активності NOS та кінцевих продуктів NO [Zhang Y. et al., 2001; Stevens R. et al., 2002], і майже зовсім не висвітлено роль аргінази - альтернативного до NOS фермента, що бере участь в метаболізмі L-аргініну. В нашій роботі показано, що ведення L-NNA суттєво знижує активність NOS в усіх ділянках лівого шлуночка. Так в „інтактній” зоні активність фермента знижується на 82,25% у порівнянні з контрольною групою (без введення L-NNA).

На відміну від контрольної групи, де виявлено зростання активності аргінази в прилеглій та некротичній ділянках, в групі тварин, яким вводили L-NNA спостерігається зниження активності аргінази в цих же зонах. Так активність аргінази після введення L-NNA знижується на 43,33% (Р<0,05) в прилеглій зоні і на 40,33% (Р<0,05) в некротичній зоні, по відношенню до “інтактної”. Не спостерігається вірогідних відмінностей між некротичною і прилеглою зоною.

Нами не відмічено зниження рівня NO2 (у тварин яким вводили L-NNA) в некротичній зоні у порівнянні з його рівнем в “інтактній” зоні. Тоді як, порівнюючи некротичні зони тварин двох груп можна говорити навіть про деяке зростання вмісту NO2 в некротичній зоні групи L-NNA, у порівнянні з тою ж зоною контрольної групи. Це, ймовірно, пояснюється включенням нітритредуктазних механізмів. Так встановлено, що збільшення вмісту NО при гіпоксії може відбуватися незалежно від NОS через його утворення з нітриту у ході нітрит-редуктазної реакції [Реутов В. П. и др., 1998] або неферментативно - через відновлення нітриту в кислому середовищі та при наявності високих концентрацій “відновних” еквівалентів за умов гіпоксії.

Після введення L-NNA в некротичній зоні вірогідно знижується вміст сечовини у порівнянні з таким в контрольній групі (143,6±38,0 нмоль/мг білка і 730,0±85,1 нмоль/мг білка відповідно, Р<0,05).

Інгібування NOS супроводжувалась також змінами вмісту ейкозаноїдів в серці. Так, після введення L-NNA вміст ЛТС4 в усіх трьох зонах був значно меншим ніж у відповідних зонах в контрольних дослідах; в некротичній зоні це зниження становило 79,69% по відношенню до вмісту ЛТС4 в некротичній зоні контрольної групи (Р<0,05).

Введення L-NNA призводить і до зниження (Р<0,05) вмісту тромбоксану В2 у всіх трьох зонах у порівнянні з його вмістом у відповідних зонах контрольної групи. Так, в некротичній зоні групи L-NNA вміст ТхВ2 на 28,5% нижче такого в тій же зоні контрольної групи (рис.6). Такий ефект, мабуть, певним чином пояснює деяке зниження зони інфаркту, так як відомо, що ці ендогенні речовини є потужними вазоконстрикторами.

У наших дослідах відношення зони некрозу до зони ризику зменшується на 41,82% (Р<0,05), а відношення зони некрозу до площі лівого шлуночка - на 30,67% і у порівнянні з контрольною групою. Зменшення розмірів уражень серця за умов ішемії-реперфузії після введення неселективного інгібітора NOS, інші автори пояснюють вивільненням аденозину, оскільки цей ефект повністю блокується застосуванням блокатора аденозинових рецепторів SPT (8-р-сульфофенілтеофелін) [Gourine A. et al., 2001]. Ще одним поясненням зменшення площі пошкодження міокарда після пригнічення NOS може служити підвищення активності циклооксигенази і зростання вивільнення простацикліну [Aitchison K. et al., 1999].

Вплив L-аргініну на зміни кардіогемодинаміки, розмір уражень серця та зміну біохімічних параметрів в різних зонах серця за умов експериментальної гострої ішемії-реперфузії міокарда. Нами встановлено, що активація продукції оксиду азоту шляхом введення L-аргініну суттєво змінює характер порушень кровообігу та біохімічних зрушень при гострій ішемії-реперфузії міокарда. Так, введення L-аргініну призводить до вірогідного зниження загального периферичного опору (ЗПО). В цих дослідах вже 10 хв. ішемії ЗПО знижувався на 17,7% (Р<0,05) по відношенню до вихідного рівня, тоді як в контрольній групі ЗПО зростав на 11,25%. Протягом ішемії опір судинного русла в групі тварин з внутрішньовенним введенням L-аргініну вірогідно не відрізнявся від вихідного рівня, в той час як в контрольній групі зберігалося підвищення ЗПО. Між змінами хвилинного об'єму крові (ХОК) не було вірогідної різниці в двох групах.

В групі L-аргініну з початком ішемії знижувався і коронарний судинний опір (КСО), що в свою чергу вело до покращення перфузії неішемізованого міокарда. Так, було відмічено, що тривала внутрішньокоронарна інфузія L-аргініну призводила до покращення графіки ЕКГ під час реперфузії, а саме зменшення зміщення інтервалу ST від ізолінії в кінці реперфузії в порівняння з її початком, та зменшення величини зубця Т, а також очевидного збільшення індексу скоротливості міокарда.

Звертає на себе увагу той факт, що в групі тварин, яким вводили L-аргінін практично повністю відсутні порушення ритму. В період ішемії екстрасистоли носили поодинокий характер, їх кількість незначно зростала в період реперфузії і становила на першій годині реперфузії 22 за 10 хв, на другій годині - 27. На третій годині екстрасистоли майже повністю були відсутні.

Встановлено, що після введення L-аргініну сумарна активність NOS знижувалася у всіх трьох зонах у порівнянні з її активністю в контрольній групі. Вміст стабільного метаболіту NO - NO2- вірогідно не відрізнявся в “інтактній” зоні у двох групах, але в контрольній групі вміст NO2- знижувався в некротичній зоні, тоді як в групі L-аргініну не встановлено вірогідної різниці вмісту NO2- у некротичній та в “інтактній” зонах.

В групі тварин, яким вводили L-аргінін, активність аргінази некротичній і прилеглій зонах по відношенню до її активності в „інтактній” зоні знижувалася на 13,69% і 8,33%, відповідно, на відміну від контрольної групи, де виявлено зростання активності фермента. Такої ж спрямованності були і зміни вмісту сечовини. В групі L-аргініну встановлено зниження вмісту сечовини в некротичній зоні до 40,53,5 нмоль/мг білка (Р<0,05) по відношенню до її вмісту в „інтактній” зоні (65,07,0 нмоль/мг білка).

Відмічено також зниження вмісту ЛТС4 та ТхВ2 прилеглій та некротичній зонах міокарда після введення L-аргініну у порівнянні з їх вмістом у відповідних зонах в контрольній групі тварин.

Введення L-аргініну суттєво зменшувало розміри зони інфаркту в порівнянні з такими в контролі - некротична зона по відношенню до зони ризику становила 13,791,38 % в групі тварин, що отримували L-аргінін, тоді як в контролі - 35,13,6%.

Отримані нами дані свідчать про те, що інтенсифікація продукції ендогенного NO шляхом введення L-аргініну зменшує гемодинамічні порушення при гострій ішемії та реперфузії міокарда у собак (зниження постнавантаження на серце за рахунок незначного росту загального периферичного опору, покращення коронарного кровотоку), має антиаритмогенну дію, а також, що дуже важливо, значно зменшує об`єм некротично зміненого міокарда. До кардіопротекторних змін слід також віднести зменшення вмісту тромбоксану В2 та лейкотриєну С4, що може слугувати попередженням подальших порушень коронарного кровообігу.

При достатньому поступленні кисню в клітину активується переважно NO-синтазний шлях метаболізму L-аргініну; в даному випадку аргіназа мало активна. В умовах недостатнього поступлення кисню ефективнішим стає аргіназний шлях метаболізму тієї ж амінокислоти. Не виключено, що рівновага між двома названими ферментними системами стабільно порушується тільки при певних патологічних станах. Зокрема в щурів з генетично детермінованою гіпертензією активований аргіназний і пригнічений NO-синтазний шлях метаболізму в аорті [Сагач В.Ф. та ін., 2000; Rodriguez S. et al., 2000]. Не виключено, що ситуація в клітинах серця аналогічна: відомо, що генетично детерміноване пригнічення активності ендотеліальної NO-синтази (eNOS) може бути одним із механізмів розвитку ішемічної хвороби серця [Досенко В.Є. та ін., 2002], причому можливо, що відношення між eNOS і аргіназою в кардіоміоцитах носить більш складний характер і визначається додатковими факторами. Отримані нами нові дані підтверджують можливість реалізації ефектів NO в міокарді через NO-синтазний шлях метаболізму L-аргініну, а також ставлять питання про принципово можливий і практично не вивчений аргіназний шлях метаболізму тієї ж амінокислоти. Нам видається, що така можливість заслуговує на увагу і подальше детальне вивчення.

Вплив активації системи оксиду азота за допомогою корвітину на зміни біохімічних параметрів в різних зонах серця, розмір уражень та зміну кардіогемодинаміки за умов експериментальної гострої ішемії-реперфузії міокарда. Отримані нами дані про позитивний вплив L-аргініну, який є попередником NO на показники кардіогемодинаміки при експериментальній гострій ішемії-реперфузії міокарда спонукали нас на пошук та дослідження кардіопротеторних властивостей препаратів, здатних стимулювати продукцію оксиду азоту або зберігати його вміст при гострому інфаркті міокарда. Як виявилося, розроблений та апробований нами, препарат корвітин [Максютина Н.П. та ін., 2000] поряд з антиоксидантними властивостями та здатністю інгібувати активність ліпоксигенази, може підвищувати продукцію оксиду азоту як in vitro (в культурі ендотеліальних клітин) [Brovkovych V. et al., 1999], так і in vivo в ішемізованій ділянці міокарда [Huk I. et al., 1997, Moibenko O.O., 1998, Мойбенко О.О. та ін., 1999]. Виходячи з цього в нашій роботі цей препарат був детальніше вивчений в дослідах на собаках.

Показано, що корвітин зменшував гемодинамічні зрушення і призводив до суттєвого зниження площі некротичної зони міокарда. В дослідах з корвітином хвилинний об'єм крові при експериментальному інфаркті міокарда знижувався не так інтенсивно як в дослідах з експериментальною гострою ішемією-реперфузією міокарда (-20,21% порівняно з -31,25% на 120 хв реперфузії, відповідно). Значно меншими були і порушення ритму в дослідах з корвітином.

Як видно з таблиці 1, відношення некротичної зони до площі лівого шлуночка та відношення зони некрозу до зони ризику різко, більш ніж в два рази зменшувалося в дослідах з корвітином (10,51,9 % та 40,94,1 % в контрольних дослідах та відповідно 4,60,4% та 15,12,2% в дослідах з корвітином).

При порівнянні цих даних з даними, отриманими в дослідах з активацією продукції NO шляхом введення L-аргініну можна побачити певну схожість. Зокрема, як і в дослідах з L-аргініном, так і в дослідах з корвітином значно меншими були порушення ритму, майже співпадали по величині зменшення некротичного ураження міокарда (в 2,5 рази в дослідах з L-аргініном, та в 2,4 рази в дослідах з корвітином).

Таблиця 1. Вплив корвітину на розмір зон уражень серця за умов експериментальної гострої ішемії-реперфузії міокарда

-р<0.05-вірогідність різниці показників по відношенню до їх значень в контрольній групі

Можна припустити, що саме активація продукції NO в двох серіях дослідів (з аргініном та корвітином) є фактором кардіопротекції, який реалізується в більшій мірі за рахунок дії на судинну компоненту реакції гемодинаміки при експериментальній ішемії-реперфузії міокарда. Певне підтвердження цьому положенню випливає із досліджень змін в системі оксиду азоту в дослідах з використанням корвітину при ішемії-реперфузії міокарда.

Нами вперше, в дослідах in vivo були простежені співвідношення між NOS та аргіназою при використання корвітину в динаміці експериментальної гострої ішемії-реперфузії міокарда. Як виявилося, корвітин дозо-залежно підвищує знижену активність NOS та знижує активність аргінази в некротичній та прилеглій зонах міокарда. Активність NOS в групі корвітину становить 0,6910,055 нмоль/хв/мг білка (Р<0,05) в прилеглій та 0,6940,057 нмоль/хв/мг білка (Р<0,05) в некротичній у порівнянні зі значеннями активності в контрольній групі 0,5080,042 нмоль/хв/мг білка і 0,2970,034 нмоль/хв/мг білка, відповідно. Вірогідно відрізняється і вміст нітрит-аніону в некротичній зоні між двома групами, так в групі корвітину це значення становить 0,1840,025 нмоль/мг білка (Р<0,05), тоді як в контрольній групі - 0,1080,013 нмоль/мг білка.

Після введення корвітину знижується активність аргінази в прилеглій та некротичній зонах до 4,820,36 нмоль/хв/мг білка і 5,120,64 нмоль/хв/мг білка (Р<0,05) по відношенню до активності цього фермента в цих же зонах у контрольній групі, а саме - 10,521,13 нмоль/хв/мг білка і 23,932,25 нмоль/хв/мг білка. Подібним чином, після введення корвітину, зменшується і вміст сечовини у пошкодженому міокарді. Так, в прилеглій зоні вміст сечовини складає 116,410,5 нмоль/мг білка по відношенню її вмісту в прилеглій зоні контрольної групи (167,215,4 нмоль/мг білка) (Р<0,05). В некротичній зоні ця зміна ще більше виражена і вміст сечовини в групах корвітину і контролю складає 92,38,7 нмоль/мг білка і 730,085,1 нмоль/мг білка, відповідно (Р<0,05).

Таким чином, корвітин компенсує біохімічні зміни в ішемізованому міокарді. Якщо при експериментальній гострій ішемії-реперфузії наявний зсув в системі NO в напрямках зменшення активності NOS та зменшення NO, а також збільшення активності аргінази та її продукту сечовини, то корвітин гальмує цей зсув, збільшуючи активність NOS і кількість NO і зменшуючи активність аргінази і кількість сечовини.

В той же час слід мати на увазі, що корвітин є досить інтенсивним інгібітором таких ферментів, як ліпоксигеназа та циклооксигеназа, що підтверджується зниженням вмісту лейкотрієну С4 в групі корвітину в некротичній зоні до 0,0910,016 нмоль/мг білка (Р<0,05) у порівнянні з його вмістом у контрольній групі - 0,1950,033 нмоль/мг білка та тромбоксану В2 - 0,0750,012 нмоль/мг білка і 0,1500,019 нмоль/мг білка в групі корвітину та контрольній групі, відповідно (Р<0,05).

Отже, кардіопротекторна дія корвітину має комплексний характер, а активація системи оксиду азоту вносить вірогідний вклад в захист міокарда від ішемічного пошкодження. В усякому разі підвищення продукції оксиду азоту в початковій стадії розвитку гострого інфаркту міокарда слід вважати позитивним фактором.

ВИСНОВКИ

В експериментах з використанням методу, що дозволяє відтворювати оклюзію коронарної артерії за умов дослідів без розкриття грудної порожнини, зі збереженням спонтанного дихання у собак проведено функціональні, біохімічні та планіметричні дослідження щодо вивчення ролі системи оксиду азоту в патогенезі порушень функцій серцево-судинної системи при гострій ішемії (90 хв) та реперфузії (180 хв) міокарда.

Вперше встановлено, що поряд з порушеннями кардіогемодинаміки при експериментальній гострій ішемії-реперфузії міокарда відбувається зниження активності нітрикоксидсинтаз та зменшення вмісту стабільного метаболіту NO - NO2- в прилеглій та некротичній зонах, в той же час має місце підвищення активності аргіназ та рівня сечовини в уражених ділянках серця. Це може визначати напрямки корекції ішемічних уражень міокарда.

Порушення кардіо- та гемодинаміки при експериментальній гострій ішемії-реперфузії міокарда значно посилюються після системного інгібування NOS за допомогою введення L-NNA (50 мг/кг маси тіла). Особливо різко підвищується опір коронарних судин та загальний периферичний опір, що значно підвищує післянавантаження на серце. Суттєво зростають порушення ритму.

Вперше показано, що компенсаторна дилатація коронарних судин неішемізованих ділянок міокарда при його локальній ішемії зникає після системного інгібування NOS, що вказує на NO-залежний характер цієї дилататорної реакції.

Активація продукції системи оксиду азоту шляхом введення субстрату NOS L-аргініну значної мірою коригує порушення кардіогемодинаміки при експериментальній гострій ішемії-реперфузії міокарда, значно зменшуючи вазоконстрикторні реакції коронарних та периферичних судин та порушення серцевого ритму, а також зменшує розміри некротичної ділянки міокарда (в 2,4 рази).

Встановлено, що активація NOS, поєднана з антиоксидантною дією та інгібуванням ліпоксигенази при внутрішньовенному введенні, розробленого нами препарату корвітину, виявляє виразний кардіопротекторний ефект при експериментальній гострій ішемії-реперфузії міокарда.

Система оксиду азоту виявляє значний протекторний ефект при експериментальній гострій ішемії-реперфузії міокарда (перші 5 годин). До найбільш виражених важливих захисних механізмів у цих умовах слід віднести коронарну вазодилатацію в неішемізованих ділянках міокарда та вазодилататорні реакції периферичних судин, тобто судинний компонент реакції, а також стабілізацію ритму діяльності серця.

Перелік публікацій за темою дисертації