Роль холінергічних механізмів у патогенезі епілептичного синдрому (експериментальне дослідження)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

Одеський державний медичний університет

Автореферат

дисертації на здобуття наукового

ступеня кандидата медичних наук

14.03.04 - патологічна фізіологія

Роль холінергічних механізмів у патогенезі епілептичного синдрому (експериментальне дослідження)

Кащенко Ольга Анатоліївна

Одеса 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Одеському державному медичному університеті Міністерства охорони здоров'я України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України, Шандра Олексій Антонович, Одеський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри нормальної фізіології

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України

Гоженко Анатолій Іванович, Одеський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри загальної та клінічної патологічної фізіології

доктор медичних наук Кришталь Микола Васильович, Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця МОЗ України, м. Київ, професор кафедри патологічної фізіології

Провідна установа: Донецький державний медичний університет ім.

М. Горького МОЗ України, кафедра патологічної фізіології, м.Донецьк

Захист відбудеться “18” лютого 2004 р. о 11.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01 при Одеському державному медичному університеті МОЗ України (65026, м. Одеса, пров. Валіховський,2).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Одеського державного медичного університету: (65026, м. Одеса, Валіховський пров.,3).

Автореферат розісланий “16” січня 2004 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради к.мед.н., доцент Годован В.В.

1. Загальна характеристика роботи

хронічний епілептичний пілокарпін судомний

Актуальність теми. За даними Міжнародної Протиепілептичної Ліги і Всесвітньої Організації Охорони здоров'я, епілепсія відноситься до одного з найбільш поширених порушень діяльності ЦНС і є тривалим, схильним до прогресування нервово-психічним захворюванням різної етіології, яке проявляється пароксизмальними і більш-менш стійкими психічними порушеннями (Бурд Г.С., 1995; Janca A. et al., 1997; Engel J.Jr., 1998). Захворюваність на епілепсію в різних країнах коливається від 49 до 100 випадків на 100000 населення (Sirven J.I., Glosser D.S., 1998) і трохи вища в розвиваючихся країнах, а також в країнах Сходу (Jallon P., 1997;Wieser H.G., Silfvenius H., 2000 ).

Частота захворювання на хронічну епілепсію складає від 1 на 200 пацієнтів (Lhatoo S.D. et al., 1999) до 4-10 на 1000 пацієнтів (Everitt A.D., Sander J.W., 1999). Серед численних ускладнень при хронічній епілепсії найбільш загрозливим є епілептичний статус (Scott R.C., Neville B.G., 1999; Tuunanen J. et al., 1999; Tagawa T. et al., 1999; van Stuijvenberg M. et al., 1999). Пов'язана з ним смертність залишається досить значною (Tomson T., 2000) і складає за даними P.Kwan & M.J.Brodie (2000) - 30-50% усіх смертей при хронічній епілепсії. Наведені дані свідчать про необхідність детального вивчення механізмів хронічної епілептичної активності (ЕпА), умов і механізмів її формування і припинення.

Слід зазначити, що дані про причини і механізми формування підвищеної судомної готовності та ЕпА залишаються недостатньо вивченими і суперечливими. У ряді досліджень розпочата спроба дослідження ролі різних медіаторних систем мозку в поширенні ЕпА. Подібність поведінкових і електрографічних змін, що спостерігаються при електростимуляційному кіндлінзі, а також при хімічному кіндлінзі, викликаному мікроін'єкцією карбахолу до мигдалика, дозволило висловити припущення про участь холінергічної системи в розвитку кіндлінга (McNamara J.O., 1999; Engelborghs S., D'Hooge R., De Deyn P.P., 2000). Доведено також зниження активності холінестерази в деяких утвореннях мозку при кіндлінгових судомах (Noda Y. et al., 1982) , яке може бути проявом компенсаторних механізмів, які впливають на рівень синтезу ацетилхоліну. З іншого боку, не виявлено змін активності ацетилхолінестерази при кіндлінзі (Hayes R.L., Jenkins L.W., Lyeth B.G., 1992). Виявлена знижена здатність до зв'язування мускарінових рецепторів є минаючою і неспецифічною для кіндлінга (McNamara J.O., 1999). Досить імовірно, що зазначені зміни холінергічної системи є наслідком повторних судом, етіологічно не пов'язаних з кіндлінгом.

Однією з адекватних моделей для з'ясування участі холінергічних механізмів в епілептогенезі є пілокарпінова модель (Turski W.A. et al., 1983, 1984, 1991). Наявні дані не дозволяють зробити висновок про провідну структуру мозку, з якої починається ЕпА та/або яка детермінує формування епілептичної системи при пілокарпін-викликаному епілептичному синдромі.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом НДР кафедри нормальної фізіології Одеського державного медичного університету, затвердженої МОЗ України “Вивчити механізми розвитку резистентних форм епілепсії на прикладі експериментального епілептичного статуса посткіндлінга у щурів різного віку з метою розробки фармакологічних методів їх корекції” (№ державної реєстрації 0100U006465). Дисертант є співвиконавцем даної теми.

Мета роботи полягає у з'ясуванні ролі холінергічних механізмів у розвитку судомної активності та змін поведінки у тварин в умовах пілокарпін-викликаного епілептичного синдрому, а також ролі фронтального відділу кори великих півкуль та вентрального гіпокампа в механізмах хронічної епілептизації мозку за даних умов.

Завдання дослідження:

1. Вивчити електроенцефалографічні зміни в корі головного мозку щурів за умов відтворення хронічної ЕпА, викликаної агоністом холінергічних рецепторів пілокарпіном.

2. Дослідити зміни характеру несудомних форм поведінки у щурів у інтеріктальному періоді пілокарпін-викликаної хронічної ЕпА.

3. З'ясувати роль фронтального відділу кори великих півкуль і вентрального гіпокампу в модуляції несудомних форм поведінки у щурів в інтеріктальному періоді при пілокарпін-викликаній хронічній ЕпА.

4. Провести аналіз електричної активності переживаючих зрізів гіпокампу у щурів в умовах індукції хронічної ЕпА пілокарпіном.

5. Дослідити вплив травматичного ушкодження мозку у молодих щурів на формування пілокарпін-викликаної хронічної ЕпА.

Об'єкт дослідження - гостра й хронічна епілептична активність, відтворена в експериментальних умовах.

Предмет дослідження - холінергічні механізми у патогенезі епілептичного синдрому, що характеризують судомний синдром у щурів в умовах пілокарпін викликаної хронічної ЕпА.

Методи дослідження. Для досягнення поставленої мети були використані патофізіологічні, електрофізіологічні, поведінкові й статистичні методи.

Наукова новизна. Вперше встановлено, що початкова стадія хронічної пілокарпін-викликаної ЕпА електрографічно характеризується переважною гіперактивацією вентрального гіпокампу та фронтальної кори, а інтеріктальний період - зниженням потужності потенціалів у зазначених утвореннях. За ЕЕГ-даними пілокарпін-спричинена ЕпА розпочинається переважно в вентральному гіпокампі. Вперше показано, що інтеріктальний період пілокарпін-викликаної хронічної ЕпА характеризується появою таких несудомних поведінкових і рухових порушень як зниження показників вертикальної і горизонтальної рухової активності в тесті “відкритого поля”, виразності емоційної, стереотипної й агресивно-оборонної поведінки, так і зростання кількості пасивно-адаптивних елементів плавальної поведінки, утруднення здатності щурів до переключення на активно-адаптивну плавальну поведінку, а також перевагою нейролептичних компонентів у структурі позно-тонічних реакцій.

Вперше встановлено, що ранніми ознаками змін поведінки в інтеріктальному періоді хронічної пілокарпін-спричиненої ЕпА є зміна плавальної поведінки щурів. Вперше показано, що характер плавальної поведінки, а також здатність щурів до переключення на активно-адаптивну плавальну поведінку визначається активацією холінергічної і дофамінергічної та пригніченням ГАМК-ергічної нейромедіаторних систем хвостатого ядра.

Вперше виявлено, що травматичне ушкодження мозку у дорослих щурів, на відміну від молодих тварин, сприяє збільшенню інтенсивності судом, викликаних пілокарпіном, а також пікротоксином і каїновою кислотою, що свідчить про викликаний травматичним ушкодженням головного мозку загальний дизрегуляційний ефект. При цьому, у мозку молодих щурів відзначається недостатня активність холінергічної нейромедіаторної системи порівняно з її активністю в мозку дорослих щурів. Вперше показано, що виразність несудомних форм поведінки у щурів в інтеріктальному періоді пілокарпін-викликаної хронічної ЕпА залежить від функціонального стану фронтальної кори великих півкуль і вентрального гіпокампу, що підтверджує важливу роль зазначених утворень у формуванні різних форм несудомної поведінки протягом інтеріктального періоду пілокарпін-викликаних судом.

Науково-практичне значення роботи. Одержано нові фундаментальні дані, які являють собою обґрунтування патофізіологічних механізмів формування несудомних форм поведінкових порушень при пілокарпін-викликаному хронічному епілептичному синдромі. Одержані нові дані є патогенетичним обгрунтуванням для розробки нових методів фармакотерапії епілепсії. Використана модель та отримані результати поглиблюють уявлення про патогенез судомних та несудомних порушень відповідних клінічних форм епілептичного синдрому.

На підставі отриманих результатів визначено, що холінергічні механізми відіграють важливу роль як в “запуску” ЕпА, так і в підтримуванні її генерації, а також у розвитку поведінкових порушень при епілептичному синдромі. Результати роботи впроваджено у навчальний процес на кафедрах фізіології та патологічної фізіології Донецького державного медичного університету ім. М.Горького.

Особистий внесок здобувача. Автор здійснила патентно-інформаційний пошук, підготовила матеріали планування роботи. Самостійно визначені напрямки досліджень та проведений огляд літератури, здійснено основні експериментальні дослідження, проведено статистичну обробку отриманих результатів, сформульовані основні положення і висновки дослідження, оформлено дисертаційну роботу та автореферат.

Апробація роботи. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися й отримали позитивну оцінку на IV Європейському конгресі епілептологів (Флоренція, 2000); III Національному конгресі патофізіологів України з міжнародною участю (Одеса, 2000); ІІ конференції українського товариства нейронаук, присвяченій 70-річчю кафедри фізіології ДонДМУ ім. М.Горького (Донецьк, 2001); ІІ Міжнародному Конгресі студентів і молодих вчених (Львів, 2001); Науково-практичній конференції з міжнародною участю “Сучасні аспекти лікування епілепсії” (Одеса, 2001); V Європейському конгресі епілептологів (Мадрид, 2002); Пленумі Правління Національного товариства патофізіологів України (Одеса, 2002); ІІ Всеукраїнській конференції “Актуальні питання невідкладної і відновної медицини” (Ялта, 2002); Науково-практичній конференції з міжнародною участю “Фізіологія регуляторних систем” (Чернівці, 2003); VIII міжнародній конференції “Центральні і периферичні механізми вегетативної нервової системи” (Донецьк, 2003).

Публікації. Результати дисертації опубліковано у 14 наукових працях, з яких 5 статей у фахових наукових журналах.

Обсяг і структура дисертації. Дисертацію викладено на 172 сторінках машинопису; вона складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, п'яти розділів результатів дослідження, аналізу й узагальнення результатів, висновків, списку використаних джерел. Роботу ілюстровано 19 таблицями і 23 рисунками. Список використаної літератури нараховує 327 джерел, з яких 63 - вітчизняні, 264 - іноземні.

2. Основний зміст роботи

Матеріали та методи досліджень. Експерименти виконані за умов гострого і хронічного експерименту на 284 статевозрілих щурах-самцях лінії Віcтар масою 200-220 г і 40 щурах віком 30-40 діб масою 30-40 г, яких утримували в звичайних умовах віварію.

Моделювання епілептичного синдрому здійснювали за допомогою агоністу холінорецепторів пілокарпіну. Пілокарпіна гідрохлорид (”Sigma”, USA) готували в 0,9 % розчині NaCl і вводили внутрішньочеревно (в/чер) в дозі 280 мг/кг. Тваринам контрольної групи вводили еквівалентний об'єм фізіологічного розчину. Час спостереження за щурами після введення пілокарпіну складав 3 год. Судоми у щурів спостерігали в середньому протягом 2-3 год. Гострі пілокарпін-викликані генералізовані судоми розвивалися, як правило, протягом 20 хв і тривали протягом 2 год (цей часовий інтервал складав іктальний період). Потім з латентним періодом, у середньому, 30 хв розвивалися мимовільні судоми, що дозволило нам цей інтервал часу оцінити як інтеріктальний період.

Гострі cyдoми викликали за допомогою агоністу рецепторів збуджуючих амінокислот каїнової кислоти, використовуючи розчин, який містив 1 мг препарату в 1 мл. Каїнову кислоту (”Sigma”, USA) розчиняли в 0,9% фізіологічному розчині NаСl і вводили в/чер дозою 15 мг/кг (дорослим щурам) і 5 мг/кг (30-денним щурам): розчини готували безпосередньо перед введенням. Крім того, для індукції гострих генералізованих судом у дорослих щурів використовували також пікротоксин (”Sigma”, USA; 2,0 мг/кг, в/чер, дорослим щурам і 1 мг/кг - 30-денним щурам). Ефекти конвульсантів реєструвалися візуально протягом 30 хв після їх застосування й оцінювали за загальноприйнятою шкалою (Шандра О.А., 1986).

Імплантацію електродів і канюль робили за Вoлoшиним М.Я. (1987), у відповідності до атласу L.Kruger (1995) за такими координатами: фронтальна кора великих півкуль - АР=2,4; L=0,8; H=1,2; тім'яна кора великих півкуль - АР=0,8; L=1,5; H=1,4; потилична кора великих півкуль - АР=-4,6; L=1,3; H=1,4; чорна речовина - АР=-4,8; L=2,5; H=8,0; вентральний гіпокамп - AP=-4,8; L=4,5; H=7,0; мигдалик - АР=-2,5; L=5,0; H=8,0; хвостате ядро - АР=+0,8; L=3,0; H=4,5. Реєстрацію електричної активності, внутрішньомозкові введення препаратів і вивчення поведінкових реакцій здійснювали через 7-10 днів після стереотаксичних втручань. В окремих серіях досліджень за вказаними стереотаксичними координатами здійснювали електричну стимуляцію (ЕС; чаcтoта 60 Гц, cила струму 20-40 мкА, тривалість прямoкутнoгo імпyльcа 0,25 c, тривалість подразнення - 1c) та селективну деструкцію (введенням розчину іботенової кислоти) фронтальної кори великих півкуль та вентрального гіпокампу. Локалізацію розташування електродів та місця деструкції веріфікували на серійних зрізах замороженого мозку.

Для оцінки ЕЕГ використовувалася частота опитування 256 імп/с за допомогою АЦП (National Instruments, USA). Частотний діапазон сигналів склав 0,5-40 Гц. 16-секундні епохи запису ЕЕГ піддавали аналізу Фур'є (“Labview-5,0”, США). При цьому, на основі візуального аналізу виключали ділянки ЕЕГ, що містили артефакти і визначали показники загальної і спектральної потужності ЕЕГ (мкВ2), досліджувані показники представляли у виді відносних величин (контроль - 100%). Частотні діапазони класифікували в такий спосіб: 0,5-4, 4-8, 8-12, 12-25, 25-40 Гц.

Підготовку переживаючих зрізів гіпокампу та дослідження популяційної активності пірамідних нейронів провадили за методикою Митюшова М.И. (1985). Колатералі Шаффера стимулювали парними прямокутними електричними імпульсами (тривалість 50 мкс, інтервали між імпульсами 10 мс) за допомогою біполярних електродів, виготовлених з ніхромового дроту. Перша серія визначень здійснювалася за умов інкубації зрізів гіпокампу без додавання препаратів, після чого здійснювали підведення пілокарпіну (50 нM) і проводили другу серію стимуляцій протягом 20 хв, після чого реєстрували відповідні зміни популяційної активності. Для кількісної оцінки ефекту введення пілокарпіну визначали відносну зміну амплітуди 10-ти послідовно усереднених популяційних спайків за формулою (V. Armand et al., 1999)

Q = (АО- АК)/АК х 100%,

де АО - амплітуда спайка в досліджуваній серії (при додаванні в інкубаційне середовище препаратів),

АК - амплітуда спайків до моменту додавання препаратів в інкубаційне середовище.

Травматичне ушкодження мозку викликали за методом Лукьянова Т.Т. (1979). Щурам різного віку, зафіксованим у стереотаксичному апараті, ЧМТ здійснювали механічно вантажем масою 5 г. Травматичні впливи здійснювали на тім'яно-потиличну ділянку.

У щурів із пілокарпін-спричиненою ЕпА в інтеріктальному періоді досліджували спонтанну рухову активність в тесті “відкритого поля” за Ж.Г.Александровою і співавт. (1984). Виразність агресивно-оборонної поведінки оцінювали за характером поведінкової відповіді тварин на спробу взяття в руку і виражали в балах за шкалою R. M. Post (1981). Вивчення плавальної поведінки здійснювалося за методом M.Vrijmoed-de Vries, A.Cools (1986). Крім того, у тварин в інтеріктальному періоді оцінювали поведінкові позно-тонічні реакції (M.Myslobodsky et al., 1981).

Всі отримані результати обробляли за допомогою параметричних і непараметричних методів статистичного аналізу. Статистичну обробку здійснювали на персональному комп'ютері за допомогою програми статистичного аналізу “SigmaStat” (“Jandel Scientific”, 1994).

Результати досліджень та їх обговорення.

Зміни біоелектричної активності мозку щурів в умовах хронічного епілептичного синдрому, викликаного за допомогою пілокарпіну. У середньому через (18,5±3,5) хв після введення пілокарпіну (280 мг/кг) у 10 з 12 щурів відзначалися безперервні міоклонічні скорочення м'язів передніх кінцівок, що розвивалися на фоні посилених дрібно-амплітудних рухів голови. Протягом наступних 20-25 хв у всіх тварин клонічні скорочення м'язів передніх кінцівок трансформувалися, причому у 7 щурів з'явилися клонічні скорочення м'язів тулубу, передніх і задніх кінцівок. У 1 щура з 12 на 34-й хв після введення пілокарпіну розвився генералізований судомний приступ. Середня інтенсивність судомних реакцій у групі склала (3,40,4) бала. У середньому через (92,0±7,0) хв судомні реакції у всіх щурів дослідної групи носили характер міоклонічних скорочень м'язів морди і передніх кінцівок, які тривали в середньому протягом (112,810,2) хв. По закінченні іктальних судомних процесів поведінка щурів характеризувалася адінамією, що тривала протягом (31,53,0) хв. Після цього у щурів мимовільно відновлялися судомні прояви, котрі мали характер періодичних міофасціальних скорочень м'язів морди і передніх кінцівок.

Після введення тваринам пілокарпіну характер ЕЕГ протягом перших

16-20 хв істотно не змінювався у всіх досліджуваних структурах мозку.

На 20-25-й хв після введення пілокарпіну відзначалося поступове збільшення потужності біоелектричної активності, що було найбільш значним у вентральному гіпокампі, фронтальному і тім'яному відділах кори великих півкуль. У всіх щурів на 25-30-й хв після введення пілокарпіну відзначається чітко виражена синхронізація електричної активності у фронтальній і тім'яній ділянках кори великих півкуль, а також у хвостатому ядрі й гіпокампі. Частотно-амплітудний аналіз електричної активності довів істотне посилення потужності потенціалів

Виявлені ЕЕГ-зміни на 32-38 хв співпадають з максимальними судомними проявами і виявляються збільшенням амплітуди електричних потенціалів, що генеруються у фронтальній корі великих півкуль, хвостатому ядрі та вентральному гіпокампі. Зокрема, у більшості дослідів (у 7 щурів із 12) ЕпА появляється спочатку в вентральному гіпокампі. де реєструвалися епілептичні потенціали амплітудою до 0,8-1,0 мВ і частотою 12-17 на с. У 3 щурів із 12 максимальні пілокарпін-спричинені судоми мали ініціацію у ділянці правої тім'яної кори. Зокрема, в ділянці правої тім'яної кори реєструвалися спайкові потенціали з амлітудою 0,5-0,6 мВ та частотою 2-3 на с. При цьому ще у 2 випадках пілокарпінові судоми реєструвалися спочатку в чорній речовині. Так, спайкові потенціали на даний інтервал часу в ділянці чорної речовини мали амплітуду 0,35-0,45 мВ та частоту 2-3 на с. ЕЕГ зміни, виявлені нами на 100-110 хв після введення щурам пілокарпіну, полягали в десинхронізації активності в більшості досліджуваних структур мозку з амплітудою від 150-180 мкВ (потилична кора) до 300-350 мкВ (вентральний гіпокамп), що генерувалася з частотою від 4 до 9 на с. На цьому фоні в чорній речовині генерувалися потенціали з амплітудою 450-550 мкВ із частотою в середньому 6-9 на с. Таким чином, отримані результати свідчать про те, що внаслідок одноразового введення щурам агоністу холінергічних мускарінових рецепторів пілокарпіну відзначається посилення процесів біоелектрогенезу в утвореннях вентрального гіпокампа, а також фронтальної і тім'яної кори великих півкуль мозку щурів, що узгоджується з даними Крижанівського Г.М. і співавт. (1985), Шандри О.А. та співавт. (1985) про детермінантну роль гіпокампу в механізмах ЕпА при кіндлінзі.

Дослідження поведінки щурів у інтеріктальному періоді в умовах хронічного епілептичного синдрому, викликаного за допомогою пілокарпіну.

Дослідження поведінки щурів в тесті “відкрите поле”. Середнє число пересічених квадратів у щурів, яким вводили пілокарпін, складало (14,181,06), що було на 44% менше відповідних показників у тварин контрольної групи (P<0,001). При цьому, слід зазначити, що тварини пересувалися в основному по центральних квадратах “відкритого поля” і практично не заходили в периферичні його сектори. Число вертикальних стійок у щурів дослідної групи було в 3,2 рази менше щодо аналогічних показників у тварин контрольної групи (P<0,01). При цьому, тварини здійснювали в середньому (1,050,26) заглядань в отвори в підлозі “відкритого поля”, що також було істотно менше (у 2,6 рази) у порівнянні за такі показники в контролі (P<0,05). Кожен щур після введень пілокарпіну демонстрував у середньому 1-3 епізоди грумінга, що було в 4,8 рази менше щодо відповідних показників у щурів контрольної групи (P<0,01). Середнє число фекальних болюсів у щурів після введення їм пілокарпіну склало (1,730,46), що було істотно менше (у 2,8 рази) у порівнянні з показниками у тварин контрольної групи.

Отже, отримані результати свідчать про те, що у щурів після введення пілокарпіну в інтеріктальному періоді відзначаються виражені зміни емоціонального стану і поведінки. Відзначені порушення виявлялися переважно зниженням основних показників горизонтальної і вертикальної рухової активності, епізодів грумінга, а також зниженням виразності показників емоційної поведінки. Усе відзначене вище свідчить у цілому про адекватність моделі пілокарпін-викликаних судом окремим клінічним формам епілептичного синдрому.

Дослідження агресивно-оборонної поведінки. При спробі взяття в руку щурів дослідної групи в інтеріктальному періоді 12 тварин із 14 не робили вираженого опору і продовжували нерухомо сидіти в куті камери. Ще в 2 тварин у відповідь на спробу взяття в руку виникали оборонні реакції у виді відхилення від руки. Середня виразність агресивно-оборонної поведінки у щурів після введення пілокарпіну склала (0,140,10) бала, що було в 4,8 рази менше відповідного показника у щурів контрольної групи (P<0,01).

Таким чином, проведені дослідження показали порушення характеру агресивно-оборонної поведінки в щурів у інтеріктальному періоді пілокарпін-викликаних судом. Відзначені зміни даного виду поведінки полягали в ослабленні його виразності, що певним чином підтверджує отримані нами раніше дані про редукцію показників рухової активності щурів у тесті “відкритого поля”, оскільки в обох випадках в інтеріктальному періоді пілокарпін-викликаної хронічної ЕпА у щурів у цілому відзначається пригнічення рухової активності.

Дослідження плавальної поведінки. Серед тварин дослідної групи тільки у одного щура з 13 після введення пілокарпіну відзначалися 2 пасивно-адаптивних плавальних акти, у інших щурів дослідної групи число пасивно-адаптивних плавальних актів перевищувало 3. При цьому, середнє число пасивно-адаптивних актів у щурів дослідної групи вдвічі перевищувало відповідний показник у щурів контрольної групи (P<0,05). Показники варіабельності і максимальної варіабельності складали, відповідно, 92 % і 23 %, що також істотно (P<0,05) перевищувало аналогічні дані, які ми одержали в контрольних спостереженнях. Характер плавальної поведінки тварин значним чином змінювався у випадку внутрішньостріарних мікроін'єкцій субстанцій, які модулюють активність визначених нейромедіаторних систем. А саме, введення в хвостаті ядра щурів агоністів холінергічної і дофамінергічної нейромедіаторних систем (відповідно, карбахолу й апоморфіну) сприяло збільшенню, а введення агоніста ГАМК-ергічної нейромедіаторної системи (мусцимолу) - зниженню числа щурів, які демонстрували 3 і більш форм пасивно-адаптивного плавання. У випадку введення антагоністів відповідних нейромедіаторних систем реєструвалися протилежні ефекти.

Дослідження здатності до переключення на активно-адаптивну поведінку. Ступінь контакту з мотузкою, яка була необхідна для виходу з води щурів дослідної групи після введення пілокарпіну, становила (2,92±0,18) балів, що було у 3,4 рази більше відповідного показника у щурів контрольної групи (P<0,001). Тобто, у щурів в інтеріктальному періоді в умовах пілокарпін-викликаної хронічної ЕпА відзначалося утруднення здатності до переключення на активно-адаптивну поведінку в плавальному тесті, що виявлялося в зростанні показників ступеня контакту з мотузкою, необхідного для уникання з води. Слід також зазначити, що здатність щурів до переключення на нові програми поведінки істотно змінювалася у випадку внутрішньостріарних мікроін'єкцій речовин, які модулюють активність окремих нейромедіаторних систем. Так, введення в хвостаті ядра щурів агоністів холінергічної і дофамінергічної нейромедіаторних систем полегшувало, а введення агоніста ГАМКергічної нейромедіаторної системи - утрудняло здатність тварин до переключення на активно-адаптивну плавальну поведінку. Після введення антагоністів відповідних нейромедіаторних систем відзначалися протилежні ефекти.

Дослідження позно-тонічної поведінки. В інтеріктальному періоді пілокарпін-викликаних судом спостерігалися суттєві зміни в структурі позно-тонічного поведінкового синдрому, що виявляється змінами пози, больової чутливості й очних симптомів. Виявлені зміни поведінки в запроваджених тестах - відведення задніх кінцівок, нормальний або ослаблений тонус хвоста, здатність утримувати позу “місток”, а також утримування на верхівці “вертикального стрижня” і деякі інші у своїй сукупності - свідчать про нейролептичний характер поведінки, що демонструють щури після введенням пілокарпіну.

Особливості пілокарпін-викликаної електричної активності переживаючих зрізів гіпокампа. Стимуляція колатералей Шаффера викликала синаптичну відповідь у зоні СА1 пірамідних нейронів, яка у ділянці розташування соми реєструвалася у виді популяційного спайку. Введення в інкубаційне середовище пілокарпіну (50 нМ) супроводжувалося значним зростанням амплітуди соматичного популяційного спайка, викликаного за умов стимуляції при 10-мс інтервалах стимулів. За даних умов відзначався розвиток додаткових розрядів. Ці дані дозволяють припустити, що в основі формування хронічної пілокарпін-викликаної ЕпА можуть полягати синаптичні зміни в зоні соми пірамідних нейронів гіпокампа. В умовах зниження вмісту Са2+ і Mg2+ після припинення стимуляції колатералей Шаффера в зрізах гіпокампу контрольних щурів через 20-25 хв спостереження відзначалася поява спочатку нерегулярних, а потім регулярних спонтанних високоамплітудних (2-5 мВ) спайків, частотою 4-7 на хв. Причому, ця частота зберігалася протягом наступних 60 хв спостереження. Отже, вилучення з перфузійного розчину іонів Са2+ і Mg2+, які мають провідне значення в передачі імпульсів через синапс, супроводжується розвитком спонтанної епілептиформної активності. Розвиток такої активності, за умов повної блокади синаптичної трансмісії може бути зумовлений втратою вхідного гальмівного впливу і, як наслідок, збільшенням збудливості нейронів. За умов відсутності іонів Mg2+, які обмежують активність системи збуджуючих амінокислот, спонтанне збудження пірамідних нейронів лише підсилюється. Результати дослідження амплітуди спонтанних спайків при додаванні за даних умов розчину пілокарпіну свідчать про збільшення збудливості мембрани нейронів під впливом холіноміметика. Таким чином, механізми реалізації конвульсивних ефектів пілокарпіну, окрім впливу на синаптичну трансмісію, можуть бути пов'язані з його безпосередньою збуджуючою дією на мембрану нейронів гіпокампу.

Дослідження ролі деяких структур мозку у формуванні несудомних форм поведінки в інтеріктальному періоді у щурів в умовах пілокарпін-викликаної хронічної ЕпА. Дослідження впливу фронтального відділу кори великих півкуль. Внаслідок ЕС фронтальної кори у щурів відзначається підвищення показників горизонтальної і вертикальної рухової активності щурів. За цих умов відзначається посилення виразності пасивно-адаптивної поведінки щурів у плавальному тесті, а також поліпшення їх здатності до уникання по мотузці з басейну, що свідчить про кращу здатність тварин до переключення на активно-адаптивну плавальну поведінку. У щурів в умовах селективної білатеральної деструкції даного відділу кори великих півкуль відзначаються протилежні ефекти стосовно рухової поведінки. З огляду на саногенне значення інтеріктальних форм несудомної поведінки, а також їх ролі у механізмах припинення епілептогенезу, можливо припустити, що в цьому аспекті фронтальна кора грає швидше за все “пускове” значення в розвитку складних механізмів, спрямованих на гальмування епілептиформної активності в умовах пілокарпін-викликаних хронічних судом, і є складовою частиною антиепілептичної системи мозку (Крыжановский Г.Н., Шандра А.А., Годлевский Л.С. и др., 1992).

Дослідження впливу вентрального гіпокампа. Після активації вентрального гіпокампа у щурів відзначалося посилення виразності емоційної поведінки в тесті “відкритого поля”, стереотипної й агресивно-оборонної поведінки. У щурів в умовах білатеральної деструкції вентрального гіпокампа відзначалися протилежні поведінкові ефекти, що в підсумку підтверджує важливу роль вентрального гіпокампа як релейної структури після фронтального відділу кори великих півкуль у формуванні різних форм несудомної поведінки протягом інтеріктального періоду.

Особливості пілокарпін-спричинених судом у щурів різного віку в умовах відтворення посттравматичної судомної активності. Середня інтенсивність і латентний період перших пілокарпін-індукованих судомних реакцій в молодих щурів із ЧМТ не відрізнялися від таких показників у щурят в контрольних спостереженнях (таблиця). Латентний період перших пілокарпін-індукованих судомних реакцій у дорослих щурів із ЧМТ був на 38% коротший за аналогічного показника в контрольних спостереженнях (P<0,05). У цих умовах пілокарпін-спричинені судомні реакції у всіх щурів виявлялися у вигляді генералізованих клоніко-тонічних судомних приступах, причому у 6 щурів - повторно. Середня інтенсивність судомних реакцій була більш вираженою порівняно з таким показником у щурів контрольної групи (P<0,05).

Таблиця 1 Виразність гострих генералізованих судом, індукованих за допомогою пілокарпіну в щурів різного віку після нанесення ЧМТ

Тобто, травматичне ушкодження мозку в дорослих щурів спричинює зростання інтенсивності судом, викликаних пілокарпіном, і не впливає на пілокарпін-спричинені судомні реакції в молодих щурят. Проведені порівняльні експериментальні спостереження показали, що в дорослих щурів ЧМТ підвищує інтенсивність пікротоксин- і каїнат-спричинених судомних реакцій. Відзначене, на наш погляд, може свідчити про викликаний травматичним ушкодженням головного мозку загальний дизрегуляторний ефект, який виражається компрометацією активності холін-, ГАМК-ергічних нейромедіаторних систем і системи збуджуючих амінокислот.

На підставі отриманих результатів визначено, що холінергічні механізми відіграють важливу роль як в “запуску” ЕпА, так і в підтримуванні її генерації, а також у розвитку поведінкових порушень при епілептичному синдромі.

Висновки

В дисертації наведено узагальнення і нове вирішення проблеми дослідження ролі холінергічних механізмів у виникненні та утриманні на сталому рівні хронічної епілептизації утворень головного мозку. Отримані результати свідчать, що інтеріктальний період пілокарпін-спричиненої хронічної форми епілептичної активності є адекватною моделлю дослідження змін несудомних форм поведінки, що відображують активність ендогенної антиепілептичної системи. Показані поведінкові ефекти при модуляції функціональної активності фронтальної кори великих півкуль свідчать про доцільність пошуку регуляторних впливів на дане утворення головного мозку з метою ініціації складних механізмів, спрямованих на ліквідацію епілептиформної активності в умовах пілокарпін-викликаних хронічних судом.

1. Хронічна епілептична активність, яка викликана системним застосуванням агоніста холінергічних рецепторів пілокарпіна, характеризується появою генералізованих судомних реакцій у щурів з наступним інтеріктальним періодом тривалістю 30-35 хвилин. Початкова стадія хронічної пілокарпін-викликаної епілептичної активності електрографічно характеризується переважною гіперактивацією вентрального гіпокампу та фронтальної кори, а інтеріктальний період - зниженням потужності потенціалів у зазначених утвореннях. За електрографічними даними пілокарпін-спричинена епілептична активність розпочинається в вентральному гіпокампі. Механізми реалізації конвульсивних ефектів пілокарпіну за умов хронічної епілептичної активності, окрім впливу на синаптичну трансмісію, можуть бути пов'язані із його безпосередньою збуджуючою дією на мембрану нейронів.

2. Інтеріктальний період пілокарпін-викликаної хронічної епілептичної активності характеризується появою несудомних поведінкових рухових порушень у вигляді зниження показників вертикальної і горизонтальної рухової активності в тесті “відкрите поле”, зниження виразності емоційної, стереотипної й агресивно-захисної поведінки, зростанням кількості пасивно-адаптивних елементів плавальної поведінки, утруднення здатності щурів до переключення на активно-адаптивну плавальну поведінку, а також перевагою нейролептичних компонентів в структурі позно-тонічних реакцій.

3. Ранніми ознаками змін поведінки в інтеріктальному періоді хронічної пілокарпін-спричиненої епілептичної активності є зміна плавальної поведінки щурів. Характер плавальної поведінки, а також здатність щурів до переключення на активно-адаптивну плавальну поведінку при цьому визначається активацією холінергічної і дофамінергічної та зниженням активності ГАМК-ергічної нейромедіаторних систем хвостатого ядра.

4. Виразність несудомних форм поведінки щурів в інтеріктальному періоді пілокарпін-викликаної хронічної епілептичної активності залежить від функціонального стану фронтальної кори великих півкуль і вентрального гіпокампу. Активація фронтальної кори великих півкуль сприяє посиленню горизонтальної і вертикальної рухової активності щурів, виразності пасивно-адаптивної поведінки щурів у плавальному тесті, а також поліпшенню їх здатності до переключення на активно-адаптивну плавальну поведінку; активація вентрального гіпокампу сприяє посиленню виразності емоційних реакцій у тесті “відкрите поле”, стереотипної й агресивно-захисної поведінки. Внаслідок білатеральної деструкції зазначених утворень мозку відзначаються протилежні поведінкові ефекти, що вказує на їх важливу роль у формуванні різних форм несудомної поведінки в інтеріктальному періоді пілокарпін-викликаних судом.

5. Травматичне ушкодження мозку у дорослих щурів, на відміну від молодих тварин, сприяє збільшенню інтенсивності судом, викликаних пілокарпіном, а також пікротоксином і каїновою кислотою, що свідчить про викликаний травматичним ушкодженням головного мозку загальний дизрегуляційний ефект. При цьому, у мозку молодих щурів відзначається недостатня активність холінергічної нейромедіаторної системи порівняно з її активністю в мозку дорослих щурів.

6. Інтеріктальний період хронічної форми епілептичної активності, яка викликана за допомогою пілокарпіну, є адекватною моделлю дослідження змін несудомних форм поведінки, що відображують активність ендогенної антиепілептичної системи. З огляду на саногенне значення інтеріктальних форм несудомної поведінки, а також належність фронтальної кори і вентрального гіпокампу до структур, що модулюють епілептичну активність, відзначені поведінкові ефекти при модуляції функціональної активності фронтальної кори та гіпокампу свідчать про доцільність пошуку шляхів цілеспрямованого впливу фармакологічних препаратів на вказані утворення головного мозку з метою ініціації механізмів, спрямованих на ліквідацію хронічної епілептиформної активності.

Перелік робіт, опублікованих за матеріалами дисертації

1. Кащенко О.А., Олійник А.А., Вастьянов Р.С. Зміни біоелектричної активності головного мозку за умов хронічного епілептичного синдрому, викликаного застосуванням пілокарпіну // Одеський медичний журнал. -2002. -№4. -С.33-37. (Внесок автора - здійснено збір та аналіз результатів експериментальних досліджень, проведено статистичну обробку результатів).

2. Кащенко О.А., Олійник А.А., Вастьянов Р.С. Іктальні та інтеріктальні поведінкові розлади у щурів за умов пілокарпін-викликаної моделі епілепсії // Вестник неотложной и восстановительной медицины. -2002. -Т.3, №3. -С.432-435. (Внесок автора - проведено експериментальні дослідження, виконано статистичну обробку результатів).

3. Вастьянов Р.С., Олійник А.А., Кащенко О.А. Зміни поведінки щурів протягом плавання при пілокарпінових судомах // Одеський медичний журнал. -2002. -№6. -С. 11-15. (Внесок автора - проведено експериментальні дослідження, виконано статистичну обробку результатів).

4. Протисудомні ефекти карбамазепіну, але не вальпроєвої кислоти в умовах відтворення пікротоксин- та пілокарпін-спричинених моделей хронічної епілептичної активності у щурів різного віку / Вастьянов Р.С., Черненко Н.А., Кащенко О.А., Олійник А.А., Волохова Г.О. // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. -2003. -№1. -С. 29-38. (Внесок автора - здійснено збір та аналіз результатів експериментальних досліджень, проведено статистичну обробку результатів).

5. Кащенко О.А. Модулюючий вплив фронтального відділу кори великих півкуль на інтеріктальні несудорожні прояви у щурів при пілокарпін-індукованій хронічній епілептичній активності // Буковинський медичний вісник. -2003. -Т.7, №1-2. -С.65-67.

6. Шандра О.А., Кащенко О.А. Моделі й основні патофізіологічні механізми хронічної епілепсії // Досягнення біології та медицини. -2003. -№1. -С.80-88. (Внесок автора - здійснено збір та аналіз результатів досліджень, аналіз наукової літератури, виконано статистичну обробку результатів).

7. Vastyanov R.S., Shandra A.A., Kashchenko O.A. Comparison of in vivo vs in vitro mechanisms underlying the development of experimental status epilepticus in rats: Contribution to human epileptogenesis // Epilepsia. -2000. -Vol.41, Suppl. -P.14. (Внесок автора - проведено експериментальні дослідження, виконано статистичну обробку результатів).

8. Бекало М., Кащенко О., Загоруй В. Особливості поведінки у щурів з резистивною формою епілепсії // Фізіол. журн. -2000. -Т.46, №2. -С.68-69. (Внесок автора - проведено експериментальні дослідження, виконано статистичну обробку результатів).

9. Кащенко О.А. Влияние МК-801 и NMDA на каинат-провоцированную эпилептическую активность при киндлинге у крыс // Архив клин. и эксперим. медицины. -2001. -Т.10, №2. -С.162-163.

10. Kashchenko O.A. MK-801 and NMDA influence on kainic acid-provoced epileptic activity in kindled rats // Abstracts of the 2nd Int. Congress of the students and young scientists. -Lviv, 2001. -P.41-42.

11. Кащенко О.А. Поведінкові та ЕЕГ зміни за умов хронічного епілептичного синдрому, сформованого застосуванням Li-пілокарпіну // Тези науково-практ. конф. з міжнародн. участю “Сучасні аспекти лікування епілепсії”. -Одеса, 2001. -С.18-19.

12. Кащенко О.А., Олійник А.А., Вастьянов Р.С. Розлади поведінки в інтеріктальному періоді у щурів при судомах, ініційованих пілокарпіном // Фізіол. журн. -2002. -Т.48, №4. -С.121. (Внесок автора - проведено експериментальні дослідження, виконано статистичну обробку результатів).

13. Behavioural interictal changes in rats with Li-pilocarpine model of epilepsy / Shandra A.A., Kashchenko O.A., Oleynik A.A., Vastyanov R.S. // Epilepsia. -2002. -Vol.43, Suppl.8. -P.80. (Внесок автора - проведено експериментальні дослідження, виконано статистичну обробку результатів).

14. Кащенко О.А. Влияние стимуляции фронтальной коры на выраженность интериктального поведения у крыс при пилокарпин-вызванном эпилептическом статусе // Архив клин. и эксперим. медицины. -2003. -Т.12, №1. -С.15.

Анотація

Кащенко О.А. Роль холінергічних механізмів в патогенезі епілептичного синдрому (експериментальне дослідження). - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.04 - патологічна фізіологія. - Одеський державний медичний університет МОЗ України, Одеса, 2004.

В роботі доведено, що хронічна епілептична активність (ЕпА), яка викликана системним застосуванням агоніста холінергічних рецепторів пілокарпіна, характеризується появою перших генералізованих судомних реакцій у щурів з наступним інтеріктальним періодом тривалістю 30-35 хвилин. Початкова стадія хронічної пілокарпін-викликаної ЕпА електрографічно характеризується переважною гіперактивацією вентрального гіпокампу та фронтальної кори, а інтеріктальний період - зниженням потужності потенціалів в 2-2.5 разів у зазначених утвореннях.

Показано, що інтеріктальний період пілокарпін-викликаної хронічної ЕпА характеризується появою несудомних поведінкових рухових порушень у вигляді зниження в 1.7-2.8 разів показників вертикальної і горизонтальної рухової активності в тесті “відкрите поле”, зниження виразності емоційної (в 2.8 разів), стереотипної (в 4.8 разів) й агресивно-захисної поведінки (в 2 рази), зростання кількості пасивно-адаптивних елементів плавальної поведінки, утруднення здатності щурів до переключення на активно-адаптивну плавальну поведінку, а також переваги нейролептичних компонентів в структурі позно-тонічних реакцій. Виразність несудомних форм поведінки щурів в інтеріктальному періоді пілокарпін-викликаної хронічної ЕпА залежить від функціонального стану фронтальної кори великих півкуль і вентрального гіпокампу.

Зроблено висновок про те, що інтеріктальний період пілокарпін-спричиненої хронічної форми ЕпА є адекватною моделлю дослідження змін несудомних форм поведінки, що відображують активність ендогенної антиепілептичної системи. Показані поведінкові ефекти при модуляції функціональної активності фронтальної кори великих півкуль свідчать про доцільність пошуку регуляторних впливів на дане утворення головного мозку з метою ініціації складних механізмів, спрямованих на ліквідацію епілептиформної активності в умовах пілокарпін-викликаних хронічних судом. На підставі отриманих результатів визначено, що холінергічні механізми відіграють важливу роль як в “запуску” ЕпА, так і в підтримуванні її генерації, а також у розвитку поведінкових порушень при епілептичному синдромі.

Ключові слова: пілокарпін, судоми, хронічна епілептична активність, інтеріктальний період, поведінка, зрізи гіпокампа.

Аннотация

Кащенко О.А. Роль холинергических механизмов в патогенезе эпилептического синдрома (экспериментальное исследование). - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.04 - патологическая физиология. - Одесский государственный медицинский университет МЗ Украины, Одесса, 2004.

В работе показано, что хроническая эпилептическая активность (ЭпА), вызванная системным применением агониста холинергических рецепторов пилокарпина, характеризуется появлением первых генерализованных судорожных реакций у крыс с последующим интериктальным периодом продолжительностью 30-35 минут. Начальная стадия хронической пилокарпин-вызванной ЭпА электрографически характеризуется гиперактивацией лобной коры и вентрального гиппокампа, а интериктальный период - снижением мощности потенциалов в 2-2,5 раза в указанных структурах.

Показано, что интериктальный период пилокарпин-вызванной хронической ЭпА характеризуется появлением несудорожных поведенческих и двигательных нарушений в виде снижения в 1,7-2,8 раз показателей вертикальной и горизонтальной двигательной активности в тесте “открытого поля”, снижения выраженности эмоционального (в 2,8 раз), стереотипного (в 4,8 раз) и агрессивно-оборонительного поведения (в 2 раза), возрастания числа пассивно-адаптивных элементов плавательного поведения, затруднения способности крыс к переключению на активно-адаптивное плавательное поведение, а также преобладания нейролептических компонентов в структуре позно-тонических реакций.

Ранними признаками изменения поведения в интериктальном периоде в условиях применения пилокарпина является изменение поведения крыс при плавании. Установлено, что характер плавательного поведения, а также способность крыс к переключению на активно-адаптивное плавательное поведение определяется активацией холинергической и дофаминергической и угнетением активности ГАМК-ергической нейромедиаторных систем хвостатого ядра.