Експериментальна розробка методів ранньої діагностики і профілактики гострого панкреатиту

Размещено на http://www.allbest.ru

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

УДК 616.37- 002-036.11+557.146.1

Експериментальна розробка методів ранньої діагностики і профілактики гострого панкреатиту

14.03.04 - патологічна фізіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Кошельник Олена Леніанівна

Одеса 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Одеському державному медичному університеті МОЗ України.

Захист відбудеться “_17_”__травня_ 2005 р. о _13 00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01 при Одеському державному медичному університеті МОЗ України (65026, м. Одеса, пров. Валіховський, 2).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Одеського державного медичного університету (65026, м. Одеса, Валіховський пров., 3).

Автореферат розісланий “_17_” квітня____ 2005 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради к. мед. н., доцент В.В.Годован

інгібітор пухлина кров

АНОТАЦІЯ

Кошельник О.Л. Експериментальна розробка методів ранньої діагностики і профілактики панкреатиту. -- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.04. -- патологічна фізіологія. -- Одеський державний медичний університет МОЗ України, Одеса, 2005.

Дисертація присвячена дослідженню основних патогенетичніх ланок розвитку L-аргінін-індукованого ГЕП з ціллю розробки нових методів діагностики та профілактики гострого панкреатиту.

Показано, що зростання концентрації фактора некрозу пухлини альфа в крові щурів з L-аргінін-індукованим ГЕП є раннім показником, який можна використати для ранньої діагностики панкреатиту за клінічних умов. Блокування синтезу окису азоту застосуванням NG-нітро-L-аргініну дозозалежно нормалізує показники функціональної системи протеолізу, активність ферментів підшлункової залози (ПЗ) у крові, а також нівелює макро- та мікроскопічні зміни в тканинах ПЗ. Отримані дані є експериментальним обґрунтуванням можливого клінічного застосування інгібіторів синтезу окису азоту з метою профілактики гострого панкреатиту.

Застосування вільної та ліпосомальної форм даларгіну з профілактичною метою виявилося ефективним за всіма параметрами, які тестувалися, що є експериментальним обґрунтуванням доцільності вживання даларгіну з профілактичною метою при гострому панкреатиті. Показано, що профілактична дія даларгіну тривала впродовж 30 хв, а його ліпосомальної форми -72 год до відтворення L-аргінін-індукованого ГЕП. Отримані дані свідчать про те, що застосування вільної та ліпосомальної форм даларгіну з лікувальною метою при L-аргінін-індукованому ГЕП також сприяє нормалізації процесів протеолізу в крові, нормалізації макро- та мікроскопічних змін в тканинах ПЗ. При цьому ефективність ліпосомальної форми даларгіну в 1,5 раза перевищувала таку у вільної форми пептиду. Зроблено висновок про те, що отримані дані стосовно вираженої профілактичної та лікувальної ефективності ліпосомальної форми даларгіну, яка перевищує таку у вільної форми даларгіну, є експериментальним обґрунтуванням доцільності залучення даного препарату до комплексу профілактичних та лікувальних заходів при гострому панкреатиті за клінічних умов.

Ключові слова: L-аргінін, гострий експериментальний панкреатит, окис азоту, діагностика, профілактика.

АННОТАЦИЯ

Кошельник Е.Л. Экспериментальная разработка методов ранней диагностики и профилактики панкреатита. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.04. -- патологическая физиология. -- Одесский государственный медицинский университет МЗ Украины, Одесса, 2005.

Диссертация посвящена изучению основних патогенетических звеньев развития L-аргинин-индуцированного острого експериментального панкреатита с целью разработки новых методов ранней диагностики и профилактики острого панкреатита.

Данная работа продемонстрировала, что чрезмерные дозы L-аргинина приводят к патобиохимическим и патоморфологическим изменениям, характерным для острого воспалительного процесса в ткани поджелудочной железы, поскольку L-аргинин является субстратом для синтеза оксида азота, под влиянием которого развивается гипотензия, ишемия и повреждение тканей.

Показано, что динамика изменений концентрации фактора некроза опухоли альфа свидетельствует о вовлечении в патогенез ОЭП этого провоспалительного цитокина. Высокие показатели концентрации ФНО могут рассматриваться как проявление активности иммунной системы, которая организует ранние ответы в комплексе воспалительных реакций. Внутрибрюшное введение изотонического раствора хлорида натрия не повлияло на уровень ФНО в сыворотке крови, а результаты последующих лабораторных и гистологических исследований доказали, что биохимическим и морфологическим изменениям предшествовало увеличение концентрации ФНО. Отсюда следует, что изменение концентрации ФНО в сыворотке крови является ранним признаком, определение которого может быть использовано в клинической диагностике острого панкреатита на начальных стадиях развития заболевания.

Блокирование синтеза оксида азота путем введения NG-нитро-L-аргинин дозозависимым образом нормализует функциональную активность показателей системы сывороточного протеолиза, активность ферментов поджелудочной железы (ПЖ) в крови, а также нивелирует макро- и микроскопические признаки острого воспаления паренхимы ПЖ. Это может свидетельствовать о важной роли оксида азота в патогенезе L-аргинин-индуцированного острого экспериментального панкреатита как активного вещества, потенцирующего развернутую картину ОЭП. Полученные данные являются экспериментальным обоснованием клинического применения ингибиторов синтеза оксида азота для профилактики острого панкреатита.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что применение свободной и липосомальной форм даларгина с лечебной целью в условиях L-аргинин-индуцированного ОЭП способствует нормализации активности процессов сывороточного протеолиза, ферментов ПЖ в крови, а также макро- и микроскопических изменений в тканях ПЖ. Лечебная эффективность липосомальной формы даларгина превышала таковую у свободной формы пептида в среднем в 1,5 раза.

Применение свободной и липосомальной форм даларгина с профилактической целью оказалось эффективным по всем тестировавшимся параметрам, что является экспериментальным обоснованием целесообразности применения даларгина с профилактической целью при остром панкреатите. Показано, что профилактическое действие даларгина сохранялось в течение 30 минут, а его липосомальной формы - 72 часов до воспроизведения L-аргинин-индуцированного ОЭП.

Указанное позволяет сделать вывод о том, что препарат полностью отвечает требованиям, предъявляемым к веществам патогенетически направленного действия, что является экспериментальным обоснованием целесообразности использования данного лекарственного препарата в профилактических и лечебных мероприятиях при остром панкреатите в клинике.

Ключевые слова: L-аргинин, острый экспериментальный панкреатит, оксид азота, даларгин, диагностика, профилактика.

SUMMARY

Koshelnik E.L. The experimental performing of methods of early diagnosis and prophylaxis of pancreatitis. - Manuscript.

Dissertation for a scientific degree of kandidat of medical sciences in speciality 14.03.04 -- pathological physiology. -- Odessa State Medical University Ministry of Health Care of Ukraine, Odessa, 2005.

Dissertation dedicated to the L-arginine-induced acute experimental pancreatitis (AEP) and early diagnosis and prophylactic efficacy increasing through the dalargin using.

It was shown that the increase of tumor necrosis factor-alpha plasma level is one among the factors that might be used for the earliest diagnosis of pancreatitis in clinics.

Nitric oxide synthesis blockade by NG-nitro-L-arginine dose-dependently normalizes indexes of blood proteolytic system functional activity, pancreatic enzymes activity together with macro- and microscopic changes in pancreatic tissue. This positive effect is the experimental background in clinical use of nitric oxide blocking for prophylaxis of acute pancreatitis.

The obtained data indicate that using of free and liposomal forms of dalargin, with therapeutic aims, in conditions of L-arginine-induced AEP results in processes of blood proteolysis, pancreatic enzymes activity as well as macro- and microscopic changes in pancreatic tissue normalization. Liposomal dalargin efficacy significantly prevails the same of peptide's free form. Both forms of dalargin using with prophylactic aim was effective in all the tests that were performed which is also the experimental background of dalargin use for prophylaxis of acute pancreatitis. It was shown that dalargin prophylactic effects continued for 30 min after its injection while its liposomal form - 72 hrs before development of L-arginine-induced AEP. This is in favour of prevalence of prophylactic action of liposomal dalargin.

The conclusion was made that expressed therapeutic and prophylactic activity of liposomal dalargin, that exceeded the activity of free dalargin and native liposomes, is the experimental background of the compound use in the prophylactic and curing schemes for patients with acute pancreatitis.

Key words: L-arginine, acute experimental pancreatitis, nitric oxide, dalargin, diagnosis, prophylaxis.

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Лікування хворих на гострий панкреатит (ГП) є важливою проблемою сучасної медицини, що підтверджується неухильно зростаючою захворюваністю та стабільно високими показниками летальності. Такий стан речей обумовлений переважно складністю патогенезу ГП (Савельев В.С. и соавт., 1999; Imrie C.W., 1999). Сучасний рівень науки дозволив внести суттєві зміни в саме вчення про ГП, побудувати нову патогенетичну концепцію на біохімічній основі і, базуючись на неї, розробити раціональні методи лікування. Разом з тим, серед причин високої смертності, досягаючей при деструктивних формах ГП 30-40%, одно з важливих місць займає піздня діагностика або ії помилки, неадекватний вибір консервативної та оперативної лікувальної тактики, практична відсутність профілактики (Савельев В.С. и соавт., 1993--2001; Лищенко А.Н. и соавт., 1995; Шалимов А.А. и соавт., 1998; Запорожченко Б.С., 1998; Багненко С.Ф. и соавт., 2002; Norman J.G. et al.,1996; Gorry M.C. et al., 1997; Tsiotos G.G. et al., 1998). Основні труднощі в клініці, окрім точної та ранньої діагностики, пов'язані з вибором раціональної лікувальної тактики залежно від фази захворювання, важкості стану хворого, інформативності методів діагностики, ефективності консервативного (Савельев В.С. и соавт., 2001; Foitizik T. et al., 1995) та оперативного лікування (Кубышкин В.А., 1996; Филимонов М.И. и соавт., 2000; Farkas G., Marton J., 1998; Bassi C.et al., 1999).

Складність диференціальної діагностики ГП відмічена богатьма авторами (Шалимов А.А. и соавт., 1997; Брискин Б.С., Рыбаков Г.С., 2000; Гальперин Э.И. и соавт., 2001; McArthur A., 1996; Ogava M., 1998). Накопичений досвід клінічної, та в меншій мірі, рентгенологічної діагностики дозволяє у типових випадках розпізнавати ГП. Тяжкі, чи деструктивні форми ГП, є найбільш складними в діагностуванні. Так, за даними Jonson C.(1999), тільки 57% хворим, що померли від ГП, діагноз був поставлений прижиттєво. Тому й досі актуальною залишається розробка принципів та основних методологічних підходів, які дозволяють здійснювати ранню діагностику гострого ураження паренхіми підшлункової залози (ПЗ). За думкою деяких авторів, основним шляхом зниження летальності та підвищення ефективності лікування хворих на ГП є розробка та вдосконалення “нехірургічного” компонента лікування (Шалимов А.А. и соавт., 1997; Багненко С.Ф. и соавт., 2002; Jonson C.H. et al., 1999). Так, застосування синтетичних аналогів опіоїдних пептидів (даларгін, сандостатин та ін.) для консервативного лікування та в післяопераційному періоді для блокування панкреатичної секреції дозволяє знизити летальність на 15,6% (Побуцький О.О., 2000; Imrie C.W., 1999). Беручи до уваги результати власних досліджень, вказані автори вважають доцільним застосування аналогів опіоїдних пептидів при ГП.

Останніми роками отримані нові дані про патогенез гострого панкреатиту, де важлива роль у пусковому механізмі розвитку ГП відводиться оксиду азоту (NO). Це явилося підставою для вивчення основних патогенетичніх ланок перебігу ГП на моделі L-аргінін-індукованого гострого експериментального панкреатиту з ціллю пошуку нових методів діагностики, лікування та профілактики зазначеного патологічного процесу.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційні дослідження були виконані в межах науково-дослідницької роботи кафедри загальної хірургії Одеського державного медичного університету, затвердженою МОЗ України за темою “Розробка патогенетично обґрунтованих методів корекції ендотоксикозу і змін дифузної ендокринної системи у хворих з гострими захворюваннями черевної порожнини і запальними захворюваннями м'яких тканин” (№ держреєстрації 0196U001839) і Договору про наукове співробітництво між Одеським державним медичним університетом і Державним Підприємством НДІ фармакології РАМН “Принципы и методы фармакологической коррекции функций нервной системы в пред- и послеоперационном периоде у больных с острыми заболеваниями органов брюшной полости” по дослідженню регуляційних гормональних систем та їх природних метаболітів, впровадженню їх синтетичних аналогів у якості лікарських препаратів.

Дисертант є співвиконавцем вказаних наукових досліджень.

Мета дослідження. З'ясувати патофізіологічні механізми розвитку

L-аргінін-індукованого гострого експериментального панкреатиту для розробки патогенетично обгрунтованого методу ранньої діагностики і профілактики зазначеного патологічного процесу та довести доцільність застосування даларгіну з профілактичною та лікувальною метою за даних умов.

Завдання дослідження.

Вивчити динаміку зміни концентрації фактора некрозу пухлини альфа в сироватці крові щурів впродовж формування L-аргінін-індукованого гострого експериментального панкреатиту та встановити його патогенетичну роль в розвитку даної патології.

З'ясувати ефективність застосування інгібітору синтезу оксиду азоту за умов розвитку L-аргінін-індукованого гострого експериментального панкреатиту в щурів.

Вивчити вплив даларгіну на активність процесів сироваткового протеолізу та активність ферментів підшлункової залози у крові при L-аргінін-індукованому гострому експериментальному панкреатиті за умов профілактичної та лікувальної дії.

З'ясувати вплив даларгіну на морфологічні зміни в тканині підшлункової залози при L-аргінін-індукованому гострому експериментальному панкреатиті за умов профілактичної та лікувальної дії.

Обгрунтувати можливість застосування даларгіну для профілактики і лікування хворих на гострий панкреатит.

Об'єкт дослідження -- розробка нових методів діагностики і профілактики гострого панкреатиту.

Предмет дослідження -- патофізіологічні механізми розвитку ГП за умов L-аргінін-індукованого гострого експериментального панкреатиту.

Методи дослідження: патофізіологічні, біохімічні, морфологічні, імуноферментні, статистичні.

Наукова новизна отриманих результатiв. Вперше показано, що перебіг L-аргінін-індукованого гострого експериментального панкреатиту (ГЕП) супроводжується істотним зростанням концентрації фактора некрозу пухлини альфа (ФНП) в сироватці крові, що свідчить про участь у патогенезі ГЕП системи прозапальних цитокінів. Вперше доведено, що підвищення концентрації ФНП у сироватці крові щурів з L-аргінін-індукованим ГЕП є раннім діагностичним показником, визначення якого може бути використане як метод діагностики ГП на початкових стадіях розвитку захворювання.

Вперше було виявлено, що блокування синтезу NO в щурів шляхом лікувально-профілактичного застосування NG-нітро-L-аргініну дозозалежно нормалізує функціональну активність показників системи сироваткового протеолізу, активність ферментів підшлункової залози (ПЗ) у крові, а також нівелює макро- та мікроскопічні ознаки гострого запалення паренхіми ПЗ. Це свідчить про важливу роль NO в патогенезі L-аргінін-індукованого ГЕП.

Впродовж проведених досліджень вперше було показано, що застосування вільної та ліпосомальної форм даларгіну з профілактичною метою запобігає суттєвим порушенням в системі протеолізу крові при розвитку ГЕП, сприяє обмеженню патологічних макро- та мікроскопічних змін тканини ПЗ та нормалізує активність ферментів ПЗ у крові.

Вперше доведено, що застосування вільної та ліпосомальної форм даларгіну для лікування L-аргінін-індукованого ГЕП сприяє нормалізації функціональної активності системи сироваткового протеолізу, активності ферментів ПЗ у крові щурів, а також відновлює макро- та мікроскопічну структуру ПЗ.

Відзначено, що профілактичний ефект даларгіну зберігався протягом 30 хв, а його ліпосомальної форми протягом 72 год до відтворення

L-аргінін-індукованого ГЕП, що вказує на значну профілактичну ефективність ліпосомального даларгіну.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані розширяють наші уявлення про патогенез L-аргінін-індукованого ГЕП, оскільки свідчать про патофізіологічну роль синтезу NO в механізмах розвитку даного патологічного процесу. Результати експериментального дослідження дали можливість обґрунтувати доцільність профілактичного вживання NG-нітро-L-аргініну як блокатора синтезу NO, оскільки при цьому відбувається значне гальмування розвитку запально-некротичного процесу в тканині ПЗ.

Виявлена внаслідок проведених експериментальних досліджень виражена профілактична та лікувальна ефективність ліпосомальної форм даларгіну, яка перевершувала таку у вільної форми пептиду, свідчить, що препарат відповідає вимогам, які пред'являються до речовин патогенетично спрямованої профілактичної та лікувальної дії і служить експериментальним обґрунтуванням доцільності його залучення до комплексу профілактичних та лікувальних заходів при ГП в клініці (патенти України № 67631А, № 67628А).

Важливим з практичної точки зору є і те, що розкриті патогенетичні механізми підвищення концентрації одного із представників родини цитокінів-- фактора некрозу пухлини альфа в сироватці крові при L-аргінін-індукованому ГЕП. Значне зростання в крові концентрації ФНП може служити раннім гуморальним маркером розвитку гострого панкреатиту і бути використано в практичній медицині для вирішення питань ранньої діагностики ГП.

Результати дисертаційної роботи є експериментальним обґрунтуванням розробки діагностичних та профілактичних заходів при ГП у клінічних умовах.

Теоретичні положення дисертації впроваджені у навчальний процес на кафедрах загальної хірургії, оперативної хірургії та топографічної анатомії, загальної та клінічної патологічної фізіології Одеського державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною науковою працею автора, внесок якого полягає у виборі напряму, обсягу та методів дослідження, формуванні цілей та задач дослідження, науковому аналізі та узагальненні отриманих результатів, формулюванні основних положень та висновків дисертації. Дисертант самостійно здійснювала налогоджування експериментальної моделі, оволоділа методиками біохімічних, морфологічних та статистичних досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися та отримали позитивну оцінку на III Республіканській науково-практичній конференції “Новое в клинической фармакологии и фармакотерапии заболеваний внутренних органов” (Харьков, 2000); IX Всеукраїнській науково-методичній конференції “Актуальні питання викладання та сучасні проблеми хірургії” (Запоріжжя, 2003); Науково-практичній конференції, присвяченій 80-річчю з дня народження заслуженого діяча науки та техніки Украіни професора А.Ф.Греджева “Хирургия гепатопанкреатодуоденальной зоны” (Донецьк, 2003); Міжнародній науково-практичній конференції “Нерешенные и спорные вопросы хирургии гепатопанкреатодуоденобилиарной зоны” (Одесса, 2003), Х Всеукраїнській науково-практичній конференції “Сучасні методи діагностики і лікування в клініці внутрішніх хвороб”, присвяченій 80-річчю професора А.Я.Фіщенка (Вінниця, 2004).

Публікації. За матеріалами досліджень опубліковано 14 наукових праць, в том числі 10 статей у фахових журналах ВАК України, отримано 2 патенти України.

Об'єм та структура дисертації. Дисертація викладена на 164 сторінках машинописного тексту.

Складається із вступу, огляду літератури, описання матеріалів та методів досліджень, чотирьох розділів результатів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів, висновків та списку літератури, який містить 326 джерел, з них 203 іноземних. Дисертація ілюстрована 32 таблицями та 3 рисунками.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Експериментальні дослідження проведені на 602 статевозрілих щурах лінії Вістар масою 160--200 г на моделі ГП. Роботу з лабораторними тваринами проводили з додержуванням норм, прийнятих комісією з етики по проведенню експериментальних досліджень ОДМУ та правил, передбачених Європейською комісією з нагляду за проведенням лабораторних та інших дослідів з участю експериментальних тварин різних видів.

ГЕП у щурів відтворювали двома внутрішньоочеревинними інє'кціями 20 % розчину L-аргініну ('Sigma Chemical Co', USA) в сумарній дозі 5 г/кг, з інтервалом введення в 1 год за методикою Czako L. et al.(2000). Контрольним тваринам вводили по 2,5 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. Максимальна вираженість біохімічних, морфологічних та інших неспецифічних показників, що характеризують перебіг L-аргінін-індукованого ГЕП виявляється через 24 год з моменту його відтворення. Евтаназію тварин для подальших біохімічних та морфологічних досліджень здійснювали внутрішньоочеревинним введенням етаміналу натрію в дозі 100 мг/кг. З профілактичною метою ліпосомальну та вільну форми даларгіну, а також нативні ліпосоми вводили щурам за 96; 72; 48, 24 та 0,5 год до відтворення ГЕП внутрішньоочеревинно, в дозах 50 мкг/кг. Інгібітор NO-синтази NG-нітро-L-аргінін розчиняли в ізотонічному розчині натрію хлориду безпосередньо перед застосуванням і вводили внутрішньоочеревинно в дозах 10 та 20 мг/кг за 30 хв до відтворення ГЕП. З лікувальною метою вказані препарати вводили одноразово, через 30 хв після ін'єкції L-аргініну. Крім того, в окремій серії експериментів досліджували зміну концентрації ФНП у крові через 6; 12; 24 год, 2--5 діб з моменту індукції ГЕП.

У відповідності до мети та задач дослідження всі експериментальні тварини були розподілені на такі групи: 1 група -- контроль; 2 група -- щури з ГЕП; 3 група -- щури з ГЕП, яким вводили даларгін; 4 група -- щури з ГЕП, яким вводили ліпосоми; 5 група -- щури з ГЕП, яким вводили ліпосомальний даларгін; 6 група -- щури з ГЕП, яким вводили NG-нітро-L-аргінін (10 мг/кг); 7 група -- щури з ГЕП, яким вводили NG-нітро-L-аргінін (20 мг/кг). В кожну з названих груп входило не менше 10 тварин.

Методом твердофазного імуноферментного аналізу за допомогою стандартних наборів фірм "Amersham" (Англія) та "Immuno Nuclear Corporation" (США) в крові щурів визначали концентрацію ФНП. Загальноприйнятими методами визначали стан процесів сироваткового протеолізу - активність нейтральних, кислих протеаз, 1-антитрипсину (Левицький А.П., 1973), білка за Lowry O.H et al. (1951). Крім цього, в крові щурів визначали активність трипсину за Erlanger et al. (1961), інгібітору трипсину за Haverback et al. (1961) -- обидва методи в модифікації Шатернікова B.A. (1966), амілази за Caraway W.T. et al. (1959). Активність ліпази визначали за методикою Shihabi L.K. et Bishop C. (1971).

Після евтаназії у тварин виділяли ПЗ, за стандартною методикою готували зрізи тканини з подальшим фарбуванням гематоксилін-еозином (морфологічні дослідження проводилися на кафедрі патологічної анатомії ОДМУ, завідувач - професор Даниленко А.І.). Макро- та мікроскопічні зміни фіксували у балах за методикою Hughes C.B. et al. (1996). Поверхню залози умовно розділяли на квадранти площею 0,01 см2, у кожному з яких вивчали морфологічні зміни в паренхімі та морфофункціональні порушення мікросудинного русла ПЗ з кількісним визначенням запальних та післязапальних ознак. Підрахунок робили в 10 квадрантах ПЗ, узятої від кожного щура.

Всі одержані результати обробляли за допомогою загальноприйнятих в медико-біологічних дослідженнях параметричних методів статистичного аналізу. Статистичну обробку проводили за допомогою комп'ютерної програми статистичного аналізу "Statgraph".

Результати досліджень і їх обговорення.

Макро- та мікроскопічні зміни в ПЗ за умов цієї моделі ГЕП відповідали характерним змінам морфологічної будови залози при ГП. Через 24 год макроскопічно залоза була збільшена, щільна, на розрізі - темно-червоного кольору з ділянками незміненої структури. Гістологічно виявлялися різномасштабні вогнища геморагічного некрозу ацинарної тканини з геморагічним просиченням інтерстицію та жировими некрозами клітковини. В судинах органа виявлялися розповсюджені судинні зміни у вигляді повнокрів'я, агрегації формених елементів крові, тромбозу, а також ураження судинних стінок у вигляді фібриноїдного просичення.

У сироватці крові контрольних щурів концентрація ФНП становила (2,8±0,3) пг/мл (рис. 1). Через 1 год після введення тваринам L-аргініну величина досліджуваного показника зросла в 13,4 рази порівняно з початковим показником (p<0,001). Через 6 год з моменту відтворення ГЕП концентрація ФНП дорівнювала (68,2±7,4) пг/мл, що в 24,4 рази перевищило первинні показники (p<0,001). Концентрація ФНП надалі зростала ще більшою мірою, досягаючи максимального значення на 24 год з моменту введення L-аргініну, після чого відмічалося поступове зниження величини досліджуваного показника.

Рис. 1 Концентрація ФНП у сироватці крові щурів з L-аргінін-індукованим ГЕП. p<0,05 в усіх випадках порівняно з аналогічними показниками в контролі

Проте, на 5 день з моменту моделювання ГП концентрація ФНП в сироватці крові щурів дорівнювала (43,7±5,1) пг/мл, що продовжувало залишатися істотно більшим (в 15,6 рази; p<0,001) у порівнянні з аналогічними показниками в контролі (рис. 1).Таким чином, в процесі формування та розвитку гострого запального процесу в паренхімі ПЗ унаслідок введення L-аргініну в сироватці крові щурів відмічається значне зростання концентрації одного з представників прозапальних цитокінів - ФНП. Подібні гуморальні зміни виявляються починаючи з 1год перебігу ГЕП і досягають максимуму через 24 год з моменту його відтворення.

Внутришньоочеревинне введення фізіологічного розчину щурам контрольної групи не вплинуло на зміни концентрації ФНП у сироватці, а наступні біохімічні та морфологічні дослідження показали, що пошкодженню тканини ПЗ передувало збільшення рівня цитокіна в сироватці крові.

Така рання реакція організму оцінюється нами як включення однієї з перших патогенетичних ланок L-аргінін-індукованого ГЕП і дозволяє говорити про доцільність визначення концентрації ФНП в крові як ранньої діагностичної ознаки при ГП.

Перебіг L-аргінін-індукованого ГЕП у щурів супроводжується вираженою активацією кислих та нейтральних протеаз. Активність нейтральних протеаз крові в 5 разів перевищила аналогічний показник в контрольних групах тварин (p<0,001). При введенні щурам даларгіну досліджуваний показник дорівнював (10,4±0,8) нкат/л, що було на 21 % менше порівняно з такими даними у щурів з ГЕП (p<0,05). В результаті введення ліпосомальної форми даларгіну активність нейтральних протеаз крові була на 44 % менше, ніж у щурів з ГЕП без лікування (p<0,001) та на 29 % менше щодо даних, одержаних після вживання неліпосомальної форми даларгіну (p<0,05). Величина досліджуваного показника істотно не відрізнялася у групи щурів з ГЕП та у щурів з ГЕП на фоні попереднього введення інгібітору NO-синтази NG-нітро-L-аргініну. Активність кислих протеаз у крові щурів з ГЕП зростала в 2,7 рази (p<0,001). В разі вживання вільної та ліпосомальної форми даларгіну величина досліджуваного показника достовірно знижувалася порівняно з такою у групі щурів з ГЕП, відповідно, на 15 % та 33 % (p<0,05).При цьому активність ліпосомальної форми даларгіну на 21 % (p<0,05) перевищувала таку у пептиду, не вміщеного в ліпосомальну оболонку. Активність кислих протеаз істотно не відрізнялася в крові щурів з ГЕП на фоні введення даларгіну та тварин з введеним L-аргініном на фоні попереднього введення інгібітору NO-синтази. Активність сироваткового інгібітору трипсину (1-антитрипсину) у щурів з ГЕП знизилася в 3 рази (p<0,001). Внаслідок введення з лікувальною метою даларгіну та його ліпосомальної форми величина досліджуваного показника збільшилася в 1,7 та 2,5 рази, відповідно (p<0,001). В цьому відношенні превалююча активність ліпосомальної форми пептиду складала 40 % (p<0,01). Активність 1-антитрипсину істотно не відрізнялася в щурів з ГЕП на фоні введення даларгіну та у щурів з ГЕП на фоні блокади синтезу оксиду азоту NG-нітро-L-аргініном. У щурів при розвитку ГЕП виявлялося суттєве - на 28 % (p<0,01) зниження концентрації загального білка крові. При застосуванні даларгіну відмічається протекторний вплив пептиду на процеси протеолізу, в результаті чого рівень загального білка не відрізнявся від норми. Величина досліджуваного показника не відрізнялася в щурів з ГЕП на фоні введення даларгіну та у щурів з ГЕП при введенні NG-нітро-L-аргініну. Застосування даларгіну та його ліпосомальної форми з профілактичною метою за 0,5-96 год до індукції ГЕП виявилося ефективним у запобіганні активації системи сироваткового протеолізу, проте, виявлено часову залежність.

Таким чином, перебіг L-аргінін-індукованого ГЕП супроводжується різкою активацією функціональної системи сироваткового протеолізу, що виявляється в щурів підвищенням активності нейтральних та кислих протеаз, зниженням активності сироваткового інгібітору трипсину та концентрації загального білка крові. За цих умов вживання з лікувальною метою вільної та ліпосомальної форм даларгіну ефективно відновлює активність показників системи протеолізу, що має патогенетичне обгрунтування. При цьому слід зазначити велику активність ліпосомальної форми пептиду. Використання вказаних форм пептиду є ефективним і в профілактичному відношенні. Характерною особливістю було те, що профілактичний ефект даларгіну зберігався протягом 30 хв після введення, а його ліпосомальної форми протягом 72 год до індукції ГЕП. Блокування активності NO-синтази за допомогою введення NG-нітро-L-аргініну також надавало виражений дозо-залежний лікувально-профілактичний ефект.

Через 24 години після індукції ГЕП активність амілази в крові у 2,8 рази перевищила такий показник у контрольних щурів (p<0,001). Активність ліпази в крові щурів при цьому на 71 % перевищувала контрольний показник (p<0,001). Перебіг ГЕП також характеризувався істотним підвищенням активності трипсину (в 11 разів; p<0,001) та зниженням активності антитрипсину на 34 % (p<0,001) щодо аналогічних показників у щурів контрольної групи. Важливим було те, що вживання за ціх умов з лікувальною метою даларгіну та його ліпосомальної форми виявилося ефективним, оскільки обидва препарати сприяли зниженню в крові щурів з ГЕП активності амілази, ліпази, трипсину та підвищенню активності антитрипсину (p<0,05).Також ефективним оказалось лікувальне введення NG-нітро-L-аргініну в дозі 20 мг/кг.

Слід також відзначити, що всі досліджувані показники активності ферментів ПЗ у щурів з ГЕП, який відтворювали після попереднього вживання інгібітору синтезу оксиду азоту NG-нітро-L-аргініну, істотно не відрізнялися від таких, одержаних у контрольних щурів. Застосування вільної та ліпосомальної форм даларгіну з профілактичною метою виявилося ефективним в аспекті нормалізації активності ферментів ПЗ у крові щурів з L-аргінін-індукованим ГЕП (табл.1). Отримані результати підтвердили дані про те, що ефективність ліпосомальної форми даларгіну за умов ГЕП значно (p<0,05) перевищувала таку у вільної форми пептиду і зберігалася впродовж 72 год.

Таблиця 1 Профілактичний вплив даларгіну та його ліпосомальної форми на активність ферментів ПЗ у крові щурів з L-аргінін-індукованим ГЕП

Примітки:

1. ** - p<0,01; *** - p<0,001 - достовірність відміни в порівнянні з аналогічними показниками у контрольних тварин (статистичний критерій АНОВА);

2. - p<0,05; - p<0,01; - p<0,001 - достовірність відміни в порівнянні з аналогічними показниками в щурів з ГЕП

Показана нами зміна зовнішньосекреторної функції ПЗ, що виявилася зростанням активності амілази, ліпази, трипсину та зниженням активності антитрипсину у моделі L-аргінін-індукованого ГЕП була адекватною біохімічним змінам, які характерні для клінічного стану ГП. Вищезазначене являє собою одну з патогенетичних ланок обраної моделі ГЕП. Отже, даларгин та його ліпосомальна форма виявилися ефективними за умов лікувальної та профілактичної схем вживання. За умов дії обох схем, ефективнішою виявилася ліпосомальна форма пептиду, профілактичний ефект якої реалізовувався протягом 72 год, а у разі терапевтичного впливу спостерігалося зниження активності амілази, ліпази, трипсину та підвищення активності антитрипсину, що вказує на патогенетично спрямовану дію обраних препаратів. Попереднє вживання інгібітору синтезу NO при ГЕП мало позитивний ефект у стабілізації активності ферментів ПЗ, що може мати важливе, на наш погляд, профілактичне значення.

Виявлені морфологічні зміни в тканинах ПЗ в щурів за умов ГЕП подані в табл. 2.

Слід зазначити лікувальну активність даларгіну, яка знайшла морфологічне підтвердження в достовірному зниженні виразності набряку (p<0,01), геморагії (p<0,01) та жирового некрозу тканини ПЗ (p<0,05), а також у зменшенні проявів асциту (p<0,001) та ознак запалення (p<0,05).

Таблиця 2 Вплив даларгіну на вираженість морфологічних змін в тканині ПЗ щурів з L-аргінін-індукованим ГЕП

Примітка. * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001 - достовірність відміни від аналогічних показників у щурів з ГЕП

Вплив профілактичної дії неліпосомальної та ліпосомальної форм даларгіну проявився у вигляді обмеження розповсюдження патологічного процесу, розвитку переважно жирового некрозу та тенденції до швидкого обмеження осередків деструкції зі збереженням структури оточуючих тканин.За цих умов ефективність ліпосомальної форми пептиду відносно редукції вказаних макро- та мікроскопічних патологічних змін в тканинах ПЗ перевищувала таку у вільної форми пептиду (p<0,05). Профілактична активність даларгіну зберігалася протягом 30 хв до відтворення ГЕП. У цьому відношенні слід вказати на аналогічний, але більш тривалий ефект ліпосомальної форми даларгіну по запобіганню розвитку ГЕП, який виявився протягом 72 год. У разі вживання NG-нітро-L-аргініну також виявляється залежна від дози препарату редукція морфологічних показників запального процесу в тканині ПЗ, що свідчить про важливу патогенетичну роль оксиду азоту в механізмах формування L-аргінін-індукованого ГЕП.

Таким чином, у щурів з ГЕП у результаті вживання вільної та ліпосомальної форм даларгіну виявлялась істотна нормалізація морфологічних змін, які свідчили про пошкодження тканини ПЗ при розвитку ГЕП. Ефективність ліпосомального даларгіну перевищувала таку у його вільної форми, що виражалося зниженням показників набряку, геморагії та жирового некрозу ПЗ.

Аналогічну спрямованість мали результати дослідження профілактичної ефективності вільної та ліпосомальної форм даларгіну відносно обмеження та відновлення морфологічних змін тканини ПЗ у щурів з ГЕП. Профілактична ефективність ліпосомальної форми пептиду зберігалася протягом 72 год до відтворення ГЕП і перевищувала таку у вільної форми пептиду, яка виявлялася тільки протягом 30 хв до відтворення ГЕП.

Редукція основних макро- та мікроскопічних порушень морфофункціонального стану тканини ПЗ унаслідок попереднього вживання інгібітору ключового ферменту синтезу NO є важливим в аспекті можливого профілактичного вживання.

ВИСНОВКИ

У дисертації представлене нове рішення актуальної наукової проблеми - пошук нових методів та засобів підвищення ранньої діагностики і профілактики ГЕП, які базуються на дослідженні патогенетичних механізмів розвитку L-аргінін-індукованого гострого експериментального панкреатиту. Запропонований принципово новий, патогенетично обґрунтований ефективний метод ранньої діагностики панкреатиту через визначення вмісту в сироватці крові ФНП та новий метод профілактики ГП шляхом застосування ліпосомальної форми даларгіна.

Перебіг L-аргінін-індукованого гострого експериментального панкреатиту супроводжується істотним зростанням концентрації в сироватці крові ФНП, що свідчить про опосередкування патогенезу ГЕП цим прозапальним цитокіном та може розглядатися як проява активності імунної системи, що організує ранні відповіді у комплексі запальних реакцій. Підвищення концентрації ФНП у сироватці крові щурів з L-аргінін-індукованим гострим експериментальним панкреатитом є раннім діагностичним показником, визначення якого може бути використане у клінічній діагностиці гострого панкреатиту на початкових стадіях розвитку захворювання.

Блокування синтезу оксиду азоту шляхом застосування NG-нітро-L-аргініну дозозалежно нормалізує функціональну активність показників системи сироваткового протеолізу, активність ферментів підшлункової залози у крові, а також відновлює макро- та мікроскопічну структуру паренхіми підшлункової залози. Зазначені позитивні ефекти блокування синтезу оксиду азоту є експериментальним обґрунтовуванням до подальшого клінічного вживання інгібітору синтезу оксиду азоту для профілактики гострого панкреатиту.

Використання вільної та ліпосомальної форм даларгіну з лікувальною метою за умов L-аргінін-індукованого гострого експериментального панкреатиту сприяє нормалізації функціональної активності системи сироваткового протеолізу, активності ферментів підшлункової залози у крові щурів, а також макро- та мікроскопічних змін структури підшлункової залози. Лікувальна ефективність ліпосомальної форми даларгіну перевищила таку у його вільної форми у середньому в 1,5 раза.

Застосування вільної та ліпосомальної форм даларгіну з профілактичною метою запобігає істотним порушенням в системі протеолізу крові при розвитку гострого експериментального панкреатиту, сприяє обмеженню патологічних макро- та мікроскопічних змін тканини підшлункової залози та нормалізації активності ферментів підшлункової залози у крові. Профілактичний ефект даларгіну зберігався протягом 30 хв, а його ліпосомальної форми протягом 72 год до відтворення L-аргінін-індукованого гострого експериментального панкреатиту.

Виражена позитивна профілактична та лікувальна ефективність ліпосомальної форми даларгіну, яка перевершувала таку у вільної форми препарату, свідчить, що препарат відповідає вимогам, які пред'являються до речовин патогенетично спрямованої профілактичної та лікувальної дії і служить експериментальним обґрунтуванням доцільності його залучення до комплексу профілактичних та лікувальних заходів при гострому панкреатиті в клініці.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Ліпосомальні форми аналогів нейропептидів покращують основні біохімічні показники крові щурів під час гострого експериментального панкреатиту / В.М. Демидов, О.А. Синовець, О.Л. Кошельник, Д.Є. Лапшин // Вісник морської медицини. -- 1999. -- № 2. -- С. 84--86. Дисертантом проведено статистична обробка та аналіз отриманих даних, підготовка статті до друку.

2. Експериментальне обгрунтування лікування гострого експериментального панкреатиту шляхом застосування ліпосомальних форм коректорів нейропептидів / Демидов В.М., Попов О.Г., Синовець О.А., Кошельник О.Л., Лапшин Д.Є. // Одеський медичний журнал. -2000. -- № 3. -- С.13--16. Дисертантом проведено моделювання ГЕП, статистична обробка отриманих даних, аналіз даних літератури, підготовка статті до друку.

3. До питання про розробку комплексного лікування гострого панкреатиту з урахуванням патогенетичних особливостей захворювання / Демидов В.М., Демидов С.М., Кошельник О.Л., Синовець О.А., Ціпов'яз С.В. // Acta Medica Leopoliencia. - 2000. - Т. 6, № 3. - С. 49--50. Дисертантом проведено експериментальні дослідження, написання та підготовка статті до друку.

4. Демидов В.М., Кошельник О.Л. Експериментальне обгрунтування профілактичних заходів при гострому панкреатиті // Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики. - 2003. - Вип. 9. - С. 242--251. Матеріали IX Всеукраїнській науково-методичній конференції “Актуальні питання викладання та сучасні проблеми хірургії”, Запоріжжя, 2003. Дисертантом проведено аналіз даних літератури, моделювання ГЕП, експериментальні дослідження, аналіз результатів, статистична обробка даних, написання та підготовка статті до друку.

5. Подальше вивчення патофізіологічних механізмів формування гострого панкреатиту / В.М. Демидов, О.Л. Кошельник, Є.М. Разумна, О.М. Кулік // Вісник морської медицини. - 2003. -- № 2(21). - С. 133--135. Матеріали науково-практичної конференції “Нерешенные и спорные вопросы хирургии гепатопанкреатобилиарной зоны”, Одеса, 2003. Дисертантом проведено моделювання ГЕП, експериментальні дослідження та аналіз результатів.

6. Цитокін-спричинені регуляторні ефекти в щурів за умов L-аргінін-індукованого гострого панкреатиту / В.М. Демидов, В.В. Годован, С.М. Демидов, О.Л. Кошельник // Буковинский медичний вісник. - 2003. - Т.7, № 1--2. -- С. 40--42. Дисертантом проведено аналіз даних літератури, моделювання ГЕП, статистична обробка даних, підготовка статті до друку.

7. Демидов В.М., Кошельник О.Л. L-аргінін-індукований гострий експериментальний панкреатит: адекватність моделі патологічному стану // Одеський медичний журнал. - 2003. -- № 3. -- С. 10--14. Дисертантом проведено аналіз літературних даних, моделювання ГЕП, експериментальні дослідження, аналіз результатів, статистична обробка даних, написання та підготовка статті до друку.

8. Демидов В.М., Кошельник О.Л. Профілактична дія даларгіну за умов гострого панкреатиту у щурів // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2003. -- № 3. - С. 36--41. Дисертантом проведено аналіз даних літератури, моделювання ГЕП, експериментальні дослідження, аналіз та статистична обробка результатів, написання та підготовка статті до друку.

9. Лікувальні та профілактичні ефекти даларгіну за умов експериментального гострого панкреатиту / Демидов В.М., Торбинський А.М., Демидов С.М., Кошельник О.Л., Бондарєв А.І. // Вісник Вінницького Національного медичного університету. - 2004. -- № 8 (1). - С. 174--178. Матеріали Х Всеукраїнській науково-практичній конференції “Сучасні методи діагностики і лікування в клініці внутрішніх хвороб”, Вінниця, 2004. Дисертантом проведено експериментальні дослідження, статистична обробка отриманих даних, підготовка статті до друку.

10. Демидов В.М., Кошельник Е.Л., Марков В.О. Патогенетическая роль активации синтеза иммуноцитокинов при хроническом воспалении паренхимы поджелудочной железы у крыс // Збірник наукових праць співробітників КМАПО ім. П.Л.Шупика. - Київ, 2000. - Книга 4, Вип. 9. - С. 900--903. Дисертантом проведено моделювання ГЕП, експериментальні дослідження, аналіз результатів, підготовка статті до друку .

11. Пат. 67631 А Україна, МПК А 61 К 31/195. Спосіб корекції стресового компонента за умов експериментальної моделі L-аргінін-індукованого гострого панкреатиту: Пат. 67631 А Україна, МПК А 61 К 31/195 Демидов В.М., Кошельник О.Л. (Україна); -- № 20031110732; Заява 27.11.2003; Опубл. 15.06.2004, Бюл. № 6. Дисертантом проведено аналіз літератури, моделювання ГЕП, експериментальні дослідження, статистична обробка отриманих даних, підготовка матеріалів до друку.

12. Пат. 67628 А Україна, МПК А 61 К 31/195. Спосіб корекції стресового компонента за умов експериментальної моделі гострого травматичного панкреатиту: Пат. 67628 А Україна, МПК А 61 К 31/195 Демидов В.М., Кошельник О.Л., Коробка М.М., Лучков А.І., Касаткін О.І. (Україна); -- №20031110729; Заява 27.11.2003; Опубл. 15.06.2004, Бюл. № 6. Дисертантом проведено моделювання ГЕП, експериментальні дослідження та аналіз отриманих результатів.

13. Демидов В.М., Синовець О.А., Кошельник О.Л. Застосування фармакологічних засобів, які спроможні блокувати синтез окису азота, як перспективний напрямок у розробці комплексного патогенетичного лікування гострого експериментального панкреатиту // Новое в клинической фармакологии и фармакотерапии заболеваний внутренних органов: Материалы III Республиканской научно-практической конференции. - Харьков: Харьковский научн.-исслед. ин-т терапии, 2000. -- С. 295--297. Дисертантом проведено моделювання гострого панкреатиту, експериментальні дослідження, аналіз літературних даних, підготовка матеріалів до друку.

14. Демидов В.М., Кошельник О.Л. До питання про вживання профілактичних заходів за умов гострого панкреатиту // Хирургия гепатопанкреатодуоденальной зоны: Материалы научно-практической конференции, посвященной 80-летию со дня рождения заслуженого деятеля науки и техники Украины профессора Греджева А.Ф. - Донецк: Донецький гос. мед. ун-т, 2003. - С. 23--24. Дисертантом проведено експериментальні дослідження, статистична обробка даних, аналіз результатів, написання тез.

Размещено на Allbest.ru