30

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця

Функціональний стан лімфоїдної популяції вилочкової залози в динаміці адаптації до гіпоксичної гіпоксії і при введенні нейропептидів

14.03.04 - патологічна фізіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Камишний Олександр Михайлович

Київ - 2004

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Запорізькому державному медичному університеті МОЗ України.

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор Абрамов Андрій Володимирович, Запорізький державний медичний університет, професор кафедри патологічної фізіології.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Гриневич Юрій Акимович, завідуючий науково-дослідницькою лабораторією клінічної імунології Інституту онкології АМН України;

доктор медичних наук, професор Маньковська Ірина Микитічна, завідуюча відділом по вивченню гіпоксичних станів Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Провідна установа:

Інститут геронтології АМН України, м. Київ Захист дисертації відбудеться 18 травня 2004 року о 14 годині хвилин на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01. Інституту фізіології ім. О.О Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця,4.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О Богомольця НАН України

Автореферат розіслано 18 квітня 2004 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук З.О. Сорокіна-Маріна

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. В останній час все більшу увагу фізіологів, патофізіологів, лікарів різного профілю привертає проблема адаптації людини до гіпоксії різних типів і зростання в процесі такої адаптації функціональних можливостей зовнішнього дихання, кровообігу, транспорту кисню до тканин та його утилізація в мітохондріях клітин (Серебровська Т. В, 1992, Середенко М. М., 1998, Маньковська І. М., 2001). Вивчення патогенезу гіпоксичних станів показало, що в умовах адаптації організму до гіпоксичної гіпоксії відбуваються зміни в органах імунної та ендокринної систем (Колчинская А.З., 1999; Китаєв М.И., 2000; Закусило М.А., 2001; Hale L. P., 2002). Водночас, особливості функціонування імунної системи в динаміці адаптації організму до гіпоксичної гіпоксії вивчені недостатньо, а характер подібних змін і їхньої інтерпретації відрізняються деякою суперечливістю. Так, більшістю авторів признається гнітюча дія високогірної гіпоксії на всі ланки імунітету, викликана активацією гіпофізарно-надниркової системи та імуносупресивною дією стероїдних гормонів (Battelli M. G., 2001; Trubiani O., 2002). З іншого боку, ряд даних свідчить про те, що в результаті гіпоксичних тренувань (ГТ) у лімфоїдних органах збільшується число лімфоцитів, підвищується їх мітотична активність, що супроводжується вираженою активацією біосинтезу ДНК і РНК у лімфатичних клітинах (Torres-Roca J. F., 2000), - тобто гіпоксія може виступати як самостійний мітотичний чинник (Шевченко Ю.Л., 2000). У цьому зв'язку, представлялося доцільним вивчити вплив періодичних гіпоксичних тренувань на стан лімфоїдної популяції вилочкової залози щурів.

На сьогоднішній день доведено, що для імунної, нервової й ендокринної систем організму характерний ряд загальних регуляторних механізмів, реалізованих за допомогою нейропептидів центральної нервової системи, цитокинів клітин імунної системи і системою рецепторів до цих лігандів (Резников А. Г, 1993, Savino W., 1995; Arzt E., Dardenne M., 1999). Морфологічно існування єдиної нейроімунноендокринної системи підтверджується наявністю в лімфоїдних органах пептидергичних нервових терміналей (Besedovsky H. O., 1996), що можуть безпосередньо контактувати з лімфоцитами, макрофагами і клітинами строми (Blalock E. D., 1994). Спектр нейропептидів у цих терміналях дуже широкий і для усіх них описані імуномодуляторні функції (Гриневич Ю.А., 1989, Savino W., Dardenne M., 2000). Одним із представників сімейства нейропептидів, що мають, як вважають, важливе значення в регуляції функції вилочкової залози, є нейропептид Y (NPY), що надходить у залозу по симпатичних NPY-ергичних нервових волокнах (Petito J. M., 1994; Schwarz H., 1994), головним чином із гипоталамуса і довгастого мозку (Колесник Ю.М., Абрамов А.В., 2001). Окремі автори свідчать, що макрофаги і лімфоцити здатні самостійно синтезувати NPY (Romano T. A., 1994), що підтверджено методом гібридизації in situ (Kogner P., 1992). Вважають, що NPY є одним із найбільш активних імуномодуляторів, який впливає на розвиток лімфоцитів і макрофагів, стимулюючи їх проліферацію (Dureus P., 1993). Добре вивчений гіпоталамічний нейрогормон окситоцин так само бере участь у регуляції функції вилочкової залози. Вважають, що окситоцин регулює процеси внутрішньотимічного диференціювання і дозрівання Т лімфоцитів (Jenkins J. S., 1991). Крім того, було встановлено, що експресія гена окситоцина і синтез мРНК до нього спостерігається в нейроендокринних клітинах вилочкової залози (Dacosta A. P. C., 1996). Таким чином, нейроімуноендокринні взаємодії грають важливу роль у розвитку лімфоцитів і формуванні імунної відповіді в здоровому організмі (Rameshwar P., 1992). При цьому значний інтерес представляє вивчення впливу екзогенного введення гормонів центральної нервової системи нейропептида Y і окситоцина на процеси імуногенезу в вилочковій залозі.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження, результати яких відображені в даній роботі, виконувалися в рамках науково-дослідницької роботи кафедри патофізіології Запорізького державного медичного університету „Роль пептидергічної системи гіпоталамуса в регуляції ендокринної функції підшлункової залози і стану міокарда в нормі і при цукровому діабеті й обґрунтування способів корекції її порушень за допомогою синтетичних нейрогормонів" (№ держреєстрації 0198U004224) і „Роль порушень нейроімуноендокринних взаємовідносин у розвитку експериментальної і клінічної патології" (№ держреєстрації 0103U000937) ”, у яких дисертант був співвиконавцем.

Метою дослідження було вивчення структури і функціонального стану лімфоїдної популяції вилочкової залози в нормі, у динаміці адаптації до гіпоксії і після введення нейропептидів.

Задачі дослідження:

1. вивчити морфофункційний стан лімфоїдної популяції вилочкової залози у інтактних щурів і в динаміці адаптації організму до гіпоксичної гіпоксії;

2. вивчити особливості диференціювання лімфоцитів у вилочковій залозі і визначити їхню проліферативну активність у інтактних щурів і в динаміці гіпоксичних тренувань;

3. вивчити морфофункційний стан лімфоїдної популяції вилочкової залози щурів після багатоденного інтрацеребровентрикулярного і інтраперитонеального введення окситоцину і нейропептиду Y;

Об'єкт дослідження: вилочкова залоза щурів.

Предмет дослідження: структура і функціональний стан лімфоїдної популяції вилочкової залози щурів.

Методи дослідження: Для виконання поставлених у дисертації задач використовувалися сучасні морфометричні, гістохімічні та імуноцитофлюоресцентні методи аналізу гістологічного матеріалу і методи математичного класифікаційного і статистичного аналізу отриманих результатів.

вилочкова залоза лімфоцит гіпоксичний

Про функціональний стан лімфоїдних клітин вилочкової залози робили висновки на підставі вивчення серійних гістологічних зрізів із різних відділів залози і даних морфометричних і денситометричних характеристик при фарбуванні гематоксиліном-еозином, даних імунноцитофлюорисцентного виявлення клітинних антигенних маркерів CD4, CD8 і CD134, а також даних виявлення ядерного антигену клітинної проліферації PCNA.

Всі отримані експериментальні дані обробляли на IBM-сумісному персональному комп'ютері пакетом прикладних і статистичних програм VIDAS-2.5 (Kontron Elektronik, Німеччина) і EXCEL з пакета MS Office 2000 (Microsoft Corp., США). Статистичне оцінювання експериментальних даних і вірогідність відмін в групах визначали t-статистикою Ст'юдента.

Наукова новизна одержаних результатів. У цьому дослідженні були встановлені особливості функціонального стану лімфоїдної популяції вилочкової залози щурів в динаміці гіпоксичних тренувань і при багатократному введенні окситоцина і нейропептида Y. В результаті проведених досліджень були встановлені нові фундаментальні факти, основними з яких є наступні:

гіпоксичні тренування стимулюють зростання щільності популяції лімфоцитів у всіх морфофункціональних зонах вилочкової залози, що при тривалій кількості сеансів досягається за рахунок посилення проліферативної активності лімфоїдних клітин; при цьому істотної зміни процентної частки деструктивно змінених лімфоцитів і апоптотичних клітин не спостерігається;

у динаміці гіпоксичних тренувань у мозковій речовині вилочкової залози спостерігаються фазні зміни щільності популяції CD4 і CD8-імунопозитивних лімфоцитів різних класів, що характеризуються збільшенням чисельності імунопозитивних клітин після 5 гіпоксичних тренувань із наступним відновленням чисельності до кінця 20 гіпоксичних сеансів;

під впливом гіпоксичних тренувань у корковій речовині вилочкової залози спостерігаються різнонаправлені зміни щільності популяції CD4 і CD8-імунопозитивних лімфоцитів - стійка тенденція до зниження чисельності CD4 - імунопозитивних лімфоцитів при короткочасному наростанні кількості CD8-імунопозитивних лімфоцитів;

гіпоксичні тренування приводили до короткочасного наростання щільності популяції активованих CD134-імунопозитивних лімфоцитів у мозковій речовині і фазних змінах їхньої чисельності в корковій речовині вилочкової залози;

багатоденне введення окситоцина і нейропептида Y приводить до збільшення щільності популяції лімфоцитів у вилочковій залозі і зменшення частки деструктивно змінених і апоптотичних клітин.

Практичне значення одержаних результатів. У роботі був обґрунтований, розроблений і апробований алгоритм автоматизованого аналізу структури лімфоїдної популяції, що оснований на використанні системи цифрового аналізу зображень. Розроблена нами методика дозволяє швидко і якісно проводити комплексний цитологічний, морфометричний і денситометричний аналіз лімфоїдної популяції будь-якого органа імунної системи, що може застосовуватися в практичній роботі морфологами, гістологами й імунологами.

Проведені дослідження встановили позитивний вплив гіпоксичних тренувань на функціональний стан лімфоїдної популяції, що характеризувалося наростанням щільності популяції лімфоцитів у всіх морфофункціональних зонах вилочкової залози, посиленням проліферації лімфоцитів і їхнього диференціювання убік збільшення утворення CD4-імунопозитивних клітин (Т-хелперів) і помірного підвищення кількості CD8-імунопозитивних клітин (Т-кіллерів). Отримані дані свідчать про імуностимулюючий характер дозованих гіпоксичних тренувань, що може бути використане в практичній медицині в комплексному лікуванні імунодефіцитних станів.

У експерименті була встановлена спроможність синтетичних аналогів окситоцина і нейропептида Y стимулювати збільшення щільності популяції лімфоцитів вилочкової залози як при інтраперітонеальному їхньому введенні, так і при інтрацеребровентрікулярному введенні зазначених гормонів. Це свідчить про імуностимулюючу дію гіпоталамічних нейропептидів і відчиняє перспективні можливості для їхнього застосування з метою модуляції імунних процесів в організмі при патології.

Результати наукових досліджень, викладених у дисертації, впроваджені у навчальний процес на кафедрах патологічної фізіології Донецького і Одеського медичних університетів.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно була визначена актуальність теми, поставлені цілі і задачі дослідження, розроблені методи рішення поставлених задач, написані всі розділи дисертації. Дослідження структури лімфоїдної популяції вилочкової залози у всіх експериментальних серіях автором проведені самостійно. Автором самостійно було проведено імуноцитофлюоресцентне дослідження проліферативної активності лімфоцитів і імунофлюоресцентне виявлення їх CD-антигенів. Розробка алгоритмів автоматичного морфометричного і денситометричного аналізів параметрів клітин, а також їх математичного класифікаційного аналізу здійснювалася разом із співробітниками кафедри патофізіології Запорізького державного медичного університету.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи були повідомлені на 4-й Українській конференції молодих учених (Київ, 2003), на науково-практичній конференції “Сучасні питання ендокринології” (Харків, 2003), на науково-практичній конференції “Роль імунної, ендокринної та нервової систем у процесах морфогенезу та регенерації" (Запоріжжя, 2003), спільному засіданні кафедр патофізіології, нормальної фізіології, оперативної хірургії і топографічної анатомії, патологічної анатомії, фармакології, гістології й ембріології, ЦНДЛ Запорізького державного медичного університету (Запоріжжя, 2003), на засіданні сектору вісцеральних систем інституту фізіології ім. О.О. Богомольця (Київ, 2003).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 робіт, у тому числі 6 статей у профільних журналах, із яких 2 самостійно.

Структура й обсяг дисертації. Робота написана на 182 сторінках машинописного тексту й складається з вступу, огляду літератури, розділу, який висвітлює матеріали та методи дослідження, трьох розділів особистих досліджень, обговорення отриманих результатів і висновків. Матеріали дисертації проілюстровані 10 малюнками й 61 таблицею. Список літератури включає 273 джерела вітчизняних й зарубіжних авторів.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проведені на 132 самцях щурів лінії Вістар масою 230-250 г. Тварини знаходилися в умовах природного освітлення при вільному доступі до води і їжі. Об'єктом дослідження у експериментальних тварин була вилочкова залоза. Досліджувані тварини були розділені на одинадцять експериментальних груп: інтактні щури, що служили контролем (група 1); щури, що піддавалися гіпоксичним тренуванням різної тривалості - 5 (група 2), 10 (група 3), 15 (група 4) і 20 (група 5) сеансів на “висоті" 6000 м. Контрольні щури, яким інтрацеребровентрикулярно або інтраперитонеально вводили фізіологічний розчин (групи 6 і 7); щури, що піддавалися введенню нейропептидів - інтрацеребровентрикулярному (група 8) і інтраперитонеальному (група 9) введенню окситоцина, інтрацеребровентрикулярному (група 10) і інтраперитонеальному (група 11) введенню NPY. У всіх цих тварин була вивчена морфофункціональна характеристика лімфоїдної популяції вилочкової залози.

Гіпоксичні тренування проводилися в вентильованій барокамері об'ємом 1,0 мі за допомогою широко використовуваної моделі (Колесник Ю.М., Абрамов А.В., 1992). Режим гіпоксичних тренувань був таким: в 1-й день напруга О₂ у барокамері відповідала височіні 1 км, на 2-й день - 2 км, на 3-й - 3 км, на 4-й - 4 км, на 5-й - 5 км, на 6-й та в наступні дні - 6 км. Для вивчення впливу окситоцина і NPY на структури вилочкової залози застосовувалося багатократне інтрацеребровентрикулярне та інтраперитонеальне введення їхніх синтетичних аналогів. Добір доз для введення нейрогормонів здійснювався на підставі даних літератури (Zarjevski D., 1994) і попередніх експериментів, проведених на кафедрі патофізіології Запорізького медичного університету під керівництвом завідуючого кафедрою д. м. н., професора Колесника Ю.М. (Колесник Ю.М., Абрамов А.В., 2001). Для введення використовувалися пептиди виробництва фірми Peninsula Laboratories Ins., США. Для інтрацеребровентрикулярного введення нейрогормонів щурам попередньо імплантували стальну стерильну канюлю (калібр G 27) у правий латеральний шлуночок мозку під етаміналовим наркозом (35 мг/кг інтраперитонеально) за допомогою стереотаксичного апарату THORAX (Угорщина). На 8-й день після операції тварин відбирали до експерименту. Нейрогормони вводили в обє'мі 0,5мл водного розчину 0,9% NaCl один раз на день (с 10 до 12 годин) на протязі 10 днів. Щоденна доза нейрогормонів складала: синтетичного окситоцина - 0,3 нмоль, нейропептида Y - 2,3 пмоль. Багатократне інтраперитонеальне введення нейрогомонів здійснювали також на протязі 10 днів. Щоденна доза нейрогормонів складала: окситоцина - 3 нмоль, нейропептида Y - 0,6 нмоль в 0,5 мл 0,9% NaCl. Контрольним тваринам інтраперитонеально чи інтрацеребровентрикулярно на протязі 10 днів в такому ж обсязі вводили фізіологічний розчин.

Структуру лімфоїдної популяції вилочкової залози вивчали за допомогою морфометричного і денситометричного аналізу гістологічних зрізів, пофарбованих гематоксилін-еозином, і взятих із різних відділів вилочкової залози, із наступним математичним класифікаційним аналізом. Для проведення подібного аналізу використовували мікроскоп Axioskop (Zeiss, Німеччина), систему цифрового аналізу зображення VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Німеччина), а також оригінальне програмне забезпечення на основі макро-мови програмування і бібліотеки функцій із програмного пакета VIDAS 2.5 (Kontron Elektronik, Німеччина). Досліджували 4 морфологічні зони вилочкової залози - субкапсулярну, внутрішню кортикальну (зону глибокої кори), медулярну і внутрішньодолькові периваскулярні простори (ВПП). Ідентифікація клітин в отриманому зображенні проводилася в автоматичному режимі за допомогою пакета прикладних програм VIDAS-2.5 (Kontron Elektronik, Німеччина). Основними морфометричними характеристиками клітин були їхня площа, периметр, максимальний і мінімальний діаметри. Додатковими морфометричними характеристиками клітин були коефіцієнти форми, елонгації й еквівалентний діаметр. Денситометричними характеристиками клітин, обумовлених також в автоматичному режимі, були їх абсолютна і питома оптичні щільності. Крім зазначених характеристик лімфоїдних клітин ми обчислювали абсолютну кількість клітин (на 1 ммІ площі залози) і відносну (%) щільність розподілу кожного класу клітин в окремих зонах вилочкової залози.

Характеристику процесів антигенного диференціювання лімфоцитів оцінювали імуноцитофлюоресцентним методом ідентифікації поверхневих антигенних детермінант CD4, CD8 і CD134 у серійних гістологічних зрізах вилочкової залози за допомогою моноклональних антитіл, кон'югованих з FITC (Beckman Coulters, США) із наступним морфометричним аналізом і кількісною оцінкою імуноцитофлюоресцентної реакції. При цьому досліджуваними параметрами були - щільність CD-імунопозитивних лімфоцитів на 1 ммІ тканини залози і їхньої частки в структурі лімфоїдної популяції, щільність відповідних CD-рецепторів на клітинній мембрані лімфоцитів, відповідність визначеному морфофункціональному класу.

Стан проліферативної активності лімфоцитів вілочкової залози оцінювали на основі високочутливої методики імунофлюоресцентного виявлення ядерного антигену проліферуючих клітин PCNA за допомогою первинних моноклональних антитіл та вторинних антитіл, кон'югованих з FITC (Sigma Chemical, США).

Всі отримані експериментальні дані обробляли на IBM-сумісному персональному комп'ютері пакетом прикладних і статистичних програм VIDAS-2.5 (Kontron Elektronik, Німеччина) і EXCEL з пакета MS Office 2000 (Microsoft Corp., США). Статистичне оцінювання експериментальних даних і вірогідність відмін в групах визначали t-статистикою Ст'юдента.

Основні результати дослідження. Результати проведеного аналізу лімфоїдної популяції різних морфологічних зон вилочкової залози контрольних щурів показали, що у всіх зонах переважала кількість малих лімфоцитів, найбільш високі показники щільності популяції яких визначалися в зоні глибокої кори (7999±233 клітин на 1 мм² залози). Найвища щільність лімфобластів визначалася в субкапсулярній зоні вилочкової залози (667±47 клітин на 1 мм² залози), щільність популяції великих і середніх лімфоцитів була найбільш висока в медулярній зоні (2866±120 та відповідно 3213±150 клітин на 1 мм² залози). Щільність популяції апоптотичних клітин найбільш висока в зоні глибокої кори (1675±89 клітин на 1 мм² залози), а найнижча - у медулярній зоні (744±66 клітин на 1 мм² залози). Найбільш високі параметри сумарної питомої щільності лімфоцитів характерні для внутрішньої зони коркової речовини тимусу (15547±133 клітин на 1 мм² залози), а найменші - для медулярної зони (таблиця 1). Близьку гістофізіологічну картину тимусу описують і інші автори (Kendall M. D., 1990, Ивановская Т.Е., 1996, Сапин М.Р., 1996, Varas A., 2000). Отримані нами дані збігаються з результатами досліджень ряда авторів стосовно вмісту лімфобластів в тимусі і значною мірою не співпадають з кількісною оцінкою малих лімфоцитів та процентом деструктивно змінених і апоптотичних лімфоцитів (Іванов М. Є., 1996, Волошин Н.А., Григорьева Е.А., 2000). При цьому останній параметр на порядок вищий, ніж в цитованих дослідженнях. Це обумовлено тим, що застосування суворих математичних класифікаційних критеріїв сприяє диференціації групи деструктивно змінених клітин в кожному класі лімфоїдних клітин, які слід розглядати як апоптотичні лімфоцити. Так, звертає увагу той факт, що в результаті класифікаційного аналізу в кожному з диференційованих класів лімфоцитів чітко відокремлювалась група клітин, що відрізнялися від нормальних суттєвим, на 25-30%, зниженням показників коефіцієнтів форми та елонгації. При цьому частка таких клітин у різних зонах тимусу знаходиться в межах 20_23% від усієї популяції лімфоцитів і характеризує групу деструктивно змінених клітин.

Таблиця 1

Будова лімфоїдної популяції вилочкової залози у щурів в нормі (М±m)

Морфофункціональні зони	Сумарна щільність нормальних лімфоцитів	Сумарна щільність лімфоцитів з ознаками деструкції та апоптотичних лімфоцитів
Субкапсулярна зона	12141±153	3932±54 24,5±0,3%
Зона глибокої кори	15547±133	5677±61 26,7±0,3%
Внутрішньодолькові периваскулярні простори	12416±151	4271±63 25,6±0,4%
Медулярна зона	11282±131	3175±47 22,0±0,3%

Примітка: у чисельнику - щільність клітин (на 1 мм² площі зріза вилочкової залози), у знаменнику - їх процентна частка в будові лімфоїдної популяції.

По нашим даним, у корковій речовині тимусу виявляється до 1,5% деструктивно змінених лімфобластів, по 4,5% деструктивно змінених великих і середніх лімфоцитів і близько 13% деструктивно змінених малих лімфоцитів від загальної кількості клітин. Відомо, що в тимусі відбувається антигенна селекція Т-лімфоцитів, що супроводжується елімінацією аутоагресивних клонів (Ярилин А.А., 2003). Згідно з експериментальними даними, у тимусі гине до 25-29% лімфоцитів у добу (Aguilar L. K., 1994), при цьому основний механізм їхньої загибелі - апоптоз з наступним фагоцитозом їх макрофагами (Фильченков А.А., Стойка Р.С., 1999). Тому ми вважаємо, що однією з перших ознак розвитку апоптозу є деструктивні зміни у лімфоцитах вилочкової залози. В цілому, використання сучасних методів клітинного аналізу, які базуються на застосуванні комп'ютерних систем аналізу зображення, дозволяє виключити розбіжності, які створюються фактором людини, і досягти точних і статистично вірогідних результатів. Автоматичний морфометричний і денситометричний аналіз в поєднанні з класифікаційним аналізом дозволяє вивчити значну популяцію лімфоїдних клітин і одержати статистично стійку і вірогідну інформацію про структурно-функціональний стан лімфоїдних органів.

Сучасна оцінка функціонального стану процесів диференціації клітинних елементів вилочкової залози вимагає урахування фенотипу лімфоцитів, при цьому основні ознаки зрілих клітин виражаються синтезом CD4+ рецепторів Т - лімфоцитами хелперами і CD8+ рецепторів Т - лімфоцитами кіллерами (Punt J. A., Havran W., Abe R., 1997). Проведені нами дослідження процесів диференціації лімфоцитів у корковій і мозковій речовині вилочкової залози інтактних щурів показали, що синтез клітинних рецепторів спостерігається вже в лімфобластах і продовжується в клітинах інших класів. Це не суперечить тому факту, що поява CD4+ і СD8+ рецепторів є ознакою зрілої клітини, тому що моноклональні антитіла виявляють CD4+ і CD8+ антигени як на етапі їхнього внутрішньоклітинного синтезу, так і після їх презентації на клітинній мембрані (Van Meerwijk J. P., 1998).

На одиницю площі коркової речовини вилочкової залози ідентифікується в 2,4 рази більше CD4-імунопозитивних лімфоцитів, у тому числі в 2 рази більше великих, у 3 рази більше середніх і більш ніж у 3,5 рази більше малих лімфоцитів. Питома щільність CD8 - імунопозитивних лімфоцитів у досліджуваних зонах приблизно однакова. Звертало на себе увагу, що серед CD4 і CD8-імунопозитивних лімфоцитів коркової і мозкової речовини переважали великі лімфоцити.

Одним з важливих ознак активації Т-лімфоцитів є експресія поверхневого CD134+ антигену, що є рецептором до фактора некрозу пухлин альфа (TNFб). Імунофлюоресцентне виявлення CD134+рецептора в клітках дозволило ідентифікувати активовані лімфоцити, частка яких у корі тимусу в нормі складала 1% від загальної популяції лімфоцитів без ознак деструкції. Як ми установили, серед CD134-імунопозитивних клітин переважали малі лімфоцити, кількість яких була в 2 рази більша, ніж великих і середніх лімфоцитів і в 3 рази більша, ніж лімфобластів. Частка CD134-імунопозитивних лімфоїдних клітин у мозковій речовині вилочкової залози в нормі складала 2,6% від загальної популяції лімфоцитів без ознак дегенерації. Серед них переважали малі лімфоцити, відсоткова частка яких складала більш ніж 50% від усіх CD134-імунопозитивних лімфоцитів, у 3 рази менше було CD134-імунопозитивних великих і середніх лімфоцитів і в 4 рази менше - CD134-імунопозитивних лімфобластів. Визначення щільності CD134+ рецепторів у лімфоїдних клітках показало, що CD134-імунопозитивні лімфобласти характеризувалися найбільшою кількістю поданого показника, а в міру дозрівання лімфоїдних клітин щільність CD134+ рецепторів зменшувалася.

Важливою ознакою функціональної активності вилочкової залози є інтенсивність процесів ділення лімфоцитів. Імунофлюоресцентне виявлення ядерного антигену проліферуючих клітин (PCNA) дозволило оцінити проліферативну активність лімфоїдних клітин вилочкової залози, оскільки PCNA ідентифікується тільки в клітинах, що діляться, (Trauth В.С., 1995). Кількість лімфоїдних клітин, що діляться, у корі вилочкової залози в нормі складала 0,9% від загальної популяції лімфоцитів без ознак деструкції. В ідентифікованих PCNA-імунопозитивних лімфоцитах імунореактивний матеріал розподілявся рівномірно по ядру клітин, що дозволяло класифікувати клітини, що діляться. Визначено, що в корі вилочкової залози серед клітин, що діляться, переважали малі лімфоцити, на частку яких приходилося більш половини PCNA-імунопозитивних клітин. Кількість клітин інших класів, що діляться, було приблизно однаковим і складало 1/6 - 1/7 частину від кількості проліферуючих малих лімфоцитів. Вивчення проліферативної активності лімфоїдних клітин медулярної зони показало, що сумарна щільність PCNA-імунопозитивних клітин у цій зоні в контрольних щурів приблизно на 30% більше, ніж у корковій речовині, тоді як частка PCNA-імунопозитивних лімфоїдних клітин у загальній структурі лімфоїдної популяції клітин без ознак дегенерації вище в 3,1 рази, ніж у корі. При цьому в структурі PCNA-імунопозитивних лімфоцитів домінують малі лімфоцити, частка яких у 3-4 рази вище відсоткової частки проліферуючих клітин інших класів.

Аналізуючи динаміку щільності популяції лімфоїдних клітин у різних зонах вилочкової залози після гіпоксичних тренувань, можна виділити наступні закономірності: у всіх зонах і практично в усі терміни досліджень вірогідно збільшувалася в порівнянні з контрольною групою тварин сумарна щільність лімфоцитів (рис.1) та щільність популяції малих і середніх лімфоцитів. Так, в результаті гіпоксичних тренувань щільність лімфоцитів у корковій речовині тимуса збільшувалась на 45% (р<0,05), в мозковій речовині - на 60% (р<0,05) порівняно з контрольною групою тварин. Найбільш значні зміни у корковій речовині тимуса спотерігалися після п'яти ГТ і проявлялися зростанням щільності малих лімфоцитів на 56% (р<0,05), середніх лімфоцитів на 30% (р<0,05). Аналіз динаміки будови лімфоїдної популяції показав помірне зниження частки лімфобластів та великих лімфоцитів з зростанням частки малих лімфоцитів у корковій речовині тимуса. В мозковій речовині тимуса ГТ призводили до збільшення щільності малих лімфоцитів на 75-115% (р<0,05) і середніх лімфоцитів на 54-67% (р<0,05) без суттєвих змін щільності клітин інших класів. Разом з тим, тільки з боку малих лімфоцитів спостерігалось зростання їх частки в будові лімфоїдної популяції тимуса, тоді як частка лімфобластів та великих лімфоцитів достовірно знижувалась. Необхідно також відзначити, що в результаті гіпоксичних тренувань поряд зі збільшенням щільності популяції лімфоїдних клітин в субкапсулярній зоні та в зоні глибокої кори відмічалося помірне збільшення частки деструктивно змінених і апоптотичних лімфоцитів, а в медулярній зоні - зменшення їх кількості, тоді як частка цих клітин у структурі лімфоїдної популяції залишалася на рівні контролю чи навіть знижувалася. Таким чином, отримані нами дані свідчать про те, щ о дозовані ГТ призводять до зміни структурно-функціональної організації лімфоїдної популяції тимусу щурів, що виявляється збільшенням питомої щільності лімфоїдних клітин з перевагою

Таблиця 2

Сумарна щільність нормальних та деструктивно змінених і апоптотичних лімфоїдних клітин в різних морфофункціональних зонах вилочкової залози в динаміці гіпоксичних тренувань

Кількість гіпоксичних тренувань	Субкапсулярна зона	Зона глибокої кори	Внутрішньо долькові периваскулярні простори	Медулярна зона
Контроль	12141±153 3932±54	15547±133 5677±61	12416±151 4271±63	11282±131 3175±47
5 сеансів	17212±162* 5955±70*	18376±153 * 6710±67 *	20406±151 * 6271±69 *	18456±170 * 4712±60 *
10 сеансів	17375±155* 5436±68*	18223±151 * 7188±74 *	18033±158 * 6014±70 *	17236±147 * 4604±61 *
15 сеансів	16945±160 * 6075±73 *	18698±143 * 8096±79 *	19059±150 * 6300±75 *	17850±41 * 5079±65 *
20 сеансів	17105±134 * 5288±51 *	17836±120 * 7016±56 *	18212±125 * 5406±54 *	18055±129 * 4503±46 *

Примітка: у чисельнику - сумарна щільність нормальних лімфоцитів (на 1 мм² площі зріза вилочкової залози), у знаменнику - сумарна щільність деструктивно змінених і апоптотичних лімфоїдних клітин (на 1 мм² площі зріза вилочкової залози); достовірність параметрів р<0,05 по відношенню до контролю (*).

функціонально більш зрілих малих і середніх лімфоцитів. Отримані дані дають можливість висунути припущення про стимулюючий вплив дозованих ГТ на функцію імунної системи в цілому. Це узгоджується з даними інших дослідників, згідно яким у результаті ГТ у лімфоїдних органах збільшується число лімфоцитів, підвищується їх мітотична активність; активізація відновних процесів супроводжується вираженою активацією біосинтезу ДНК і РНК у лімфатичних клітинах (Китаев М.И., Собуров К.А., Гончаров А. Г, 1998).

У результаті гіпоксичних тренувань спостерігалися значні зміни процесів диференціювання лімфоцитів у порівнянні з контрольними тваринами, що виражалося в зміні абсолютної і відносної щільності CD4 і CD8-імунопозитивних лімфоцитів різних класів, а також їх денситометричних характеристик. Гіпоксичні тренування приводили до різнонаправленої зміни чисельності CD4-імунопозитивних лімфоцитів у морфофункціональних зонах вилочкової залози: зростанню щільності їхньої популяції в 2-3 рази в медулярній зоні, представленої в основному малими лімфоцитами, і зниженню в корковій зоні за рахунок зменшення кількості великих і середніх лімфоцитів (рис.2). Зміна щільності популяції CD8-імунопозитивних лімфоцитів у вилочковій залозі під впливом гіпоксичних тренувань характеризувалася достовірним наростанням чисельності малих лімфоцитів і лімфобластів, переважно в медулярній зоні. Комплексна оцінка даних змін дозволила нам стверджувати, що гіпоксичні тренування, вочевидь, значно прискорюють диференціювання тимоцитів, даючи тим самим імуностимулюючий ефект. Денситометричний аналіз показав, що в результаті гіпоксичних тренувань вірогідно зростала щільність CD-рецепторів у CD4 і CD8-імунопозитивних лімфоцитів різних класів у корковій і мозковій речовині тимусу в порівнянні з контролем, що свідчило про посилення експресії відповідних молекул на мембрані тимоцитів і прискоренні їхнього дозрівання (таблиця 2).

Гіпоксичні тренування призводили до короткочасного зростання щільності популяції CD134-імунопозитивних лімфоцитів у вилочковій залозі після п'яти сеансів з наступним відновленням їхньої чисельності в медулярній зоні і помірній депресії в корковій зоні.

Таблиця 3

Сумарна щільність проліферуючих та CD-імунопозитивних лімфоцитів різних класів у корковій та мозковій речовинах вилочкової залози в динаміці гіпоксичних тренувань

Кількість гіпоксичних тренувань	CD4-імунопозитивні лімфоцити	CD8-імунопозитивні лімфоцити	CD134-імунопозитивні лімфоцити	PCNA-імунопозитивні лімфоцити
Контроль	603±45 247±24	343±40 302±35	287±32 295±31	248±34 318±29
5 сеансів	507±36 634±46 *	389±36 455±38 *	370±32 * 436±47 *	278±33 342±41
10 сеансів	428±38 * 453±37 *	376±42 429±35 *	177±17 * 344±35 *	207±15 255±30
15 сеансів	515±46 564±43 *	424±36 * 487±39 *	275±30 302±38	256±30 261±28
20 сеансів	340±35 * 411±37 *	354±35 373±40 *	282±36 258±29	449±33 * 464±39 *

Примітка: у чисельнику - сумарна щільність проліферуючих та CD-імунопозитивних лімфоцитів різних класів у корковій речовині вилочкової залози (на 1 мм² площі зріза вилочкової залози), у знаменнику - сумарна щільність проліферуючих та CD-імунопозитивних лімфоцитів різних класів у мозковій речовині вилочкової залози (на 1 мм² площі зріза вилочкової залози); достовірність параметрів р<0,05 по відношенню до контролю (*).

У результаті гіпоксичних тренувань відзначалося зниження експресії рецепторів до фактора некрозу пухлини альфа на мембрані тимоцитів окремих класів, що, у свою чергу, знижувало імовірність апоптоза даних клітин (Тartaglia L. A., 1992). Остання обставина, вірогідно, свідчила про антіапоптогенний ефект гіпоксичних тренувань.

У результаті гіпоксичних тренувань спостерігалося підвищення проліферативної активності зрілих лімфоїдних клітин коркової і мозкової речовини вилочкової залози після 20 сеансів, що, на нашу думку, зв'язано з їх загальним імуностимулюючим ефектом (рис.3). У ці терміни збільшувалася також сумарна щільність PCNA-імунопозитивних лімфоїдних клітин. Разом з тим, 10 і 20 гіпоксичних тренувань викликали помірну депресію проліферативної активності серед лімфобластів і великих лімфоцитів.

Таблиця 4

Щільність CD-рецепторів (одиниць інтенсивності флюоресценції) CD4-імунопозитивних та CD8-імунопозитивних лімфоїдних клітин в корковій речовині вилочкової залози щурів в динаміці гіпоксичних тренувань (М ±m)

Кількість гіпоксичних тренувань	Лімфобласти	Великі лімфоцити	Середні лімфоцити	Малі лімфоцити
Контроль	0,484±0,004 0,613±0,001	0,592±0,006 0,613±0,007	0,621±0,007 0,591±0,009	0,674±0,006 0,662±0,008
5 сеансів	0,771±0,008 * 0,712±0,001 *	0,702±0,006 * 0,650±0,001 *	0,672±0,009 * 0,593±0,009	0,611±0,004 0,533±0,004 *
10 сеансів	0,743±0,001 * 0,811±0,001 *	0,660±0,009 * 0,703±0,001 *	0,634±0,009 0,672±0,001 *	0,552±0,005 * 0,612±0,008 *
15 сеансів	0,713±0,001 * 0,720±0,001 *	0,665±0,007 * 0,691±0,001 *	0,632±0,009 0,631±0,001 *	0,580±0,004 0,571±0,006 *
20 сеансів	0,823±0,001 * 0,801±0,001 *	0,774±0,001 * 0,713±0,001 *	0,691±0,001 * 0,644±0,008 *	0,592±0,007 0,581±0,005 *

Примітка: у чисельнику - щільність CD-рецепторів CD4-імунопозитивних лімфоїдних клітин, у знаменнику - щільність CD-рецепторів CD8-імунопозитивних лімфоїдних клітин; достовірність параметрів р<0,05 по відношенню до контролю (*).

В останні 10 років все більшу увагу привертає концепція про єдину нейроімуноендокринну систему. Вилочкова залоза, яка є центральним органом імуногенезу і, водночас, ендокринним органом, продукуючим власні тимічні гормони, займає одно із центральних міст в цій системі. При цьому очевидна регулююча дія таких гормонів центральної нервної системи як нейропептид Y і окситоцин на процеси імуногенезу, протікаючи в вилочковій залозі. Разом з тим, характер їх впливу на стан лімфоїдної популяції вилочкової залози при екзогеннім введені в організм не установлені. Тому, наступною задачею нашого дослідження було вивчити морфофункційний стан лімфоїдної популяції вилочкової залози щурів після багатоденного інтрацеребровентрікулярного та інтраперітонеального введення окситоцина і нейропептиду Y.

Багатоденне як інтрацеребровентрикулярне, так і інтраперитонеальне введення окситоцину збільшує питому щільність лімфоїдних клітин і зменшує частку деструктивно змінених і апоптотичних клітин у вилочковій залозі щурів (рис.4).

Введення окситоцину стимулює дозрівання лімфоцитів, а при інтрацеребровентрикулярном уведенні, крім того, підсилює їхню міграцію в периваскулярні простори з наступним надходженням у кровообіг. Отримані дані свідчать про істотний вплив гіпоталамічного гормону окситоцину на структуру лімфоїдної популяції вилочкової залози і підтверджують існуючі погляди, згідно з якими і гіпоталамічний, і тимічний окситоцин відіграють важливу роль у морфогенезі вилочкової залози (Robert F. , 1994].

Вважається, що після класичних тимічних гормонів окситоцин є одним з найбільш активно синтезованих гормональних факторів у вилочковій залозі, що стимулюють диференціювання і дозрівання Т - лімфоцитів. Крім того, ідентифіковані на CD8-імунопозитивних лімфоцитах рецептори до окситоцину припускають імуномодулюючу дію цього гормону в механізмах регуляції імунної відповіді (Savino W., 2000).

Багатоденне інтрацеребровентрикулярне та інтраперитонеальне введення NPY також збільшує питому щільність лімфоїдних клітин і зменшує частку деструктивно змінених і апоптотичних клітин у вилочковій залозі щурів. Введення NPY стимулює дозрівання лімфоцитів і, вочевидь, підсилює їхню проліферацію і міграцію з тимусу. Отримані нами дані свідчать про важливу роль NPY у регуляції фізіологічних процесів у вилочковій залозі, що можуть здійснюватися завдяки розвитій NPY-ергічній її іннервації. Джерелом останньої єадренергічні нервові волокна, у яких NPY виконує функцію ко-медіатора, а також парасимпатичні волокна блукаючого нерва (Dureus P., 1993). Таким чином, окситоцин і NPY дають імуностимулюючий ефект, діючи на процеси дозрівання тимоцитів, що відкриває перспективні можливості застосування цих нейрогормонів для модуляції імунних процесів в організмі при патології.

Таким чином, нейроендокринні впливи, безумовно, модулюють імуногенез у вилочковій залозі. Серед усього різноманіття гормональних впливів на тимус одне з найважливіших місць займають такі гормони як окситоцин і NPY, що і було показано в нашій роботі. Імуномодулюючий ефект, що дають гіпоксичні тренування на вилочкову залозу, на нашу думку, обумовлений стимулюючими впливами гіпоксії на гіпоталамо-гіпофізарну систему, що призводить до посилення біосинтезу окситоцина і нейропептида Y, в результаті чого реалізується пряма дія цих гормонів на лімфоцити вилочкової залози, проявом якої є прискорення їх дозрівання, диференціювання та проліферації.

Рис. 1. Сумарна кількість лімфоїдних клітин на 1 мм² площі зрізу вилочкової залози щурів після інтрацеребровентрікулярного та інтраперітонеального введення окситоцину.

Висновки

1. Особливості впливу гіпоксичних тренувань на функціональний стан лімфоїдної популяції вилочкової залози вивчені недостатньо і відрізняються суперечністю думок відносно характеру ендокринних впливів на лімфоцити при адаптації до гіпоксії.

2. Вирішення поставленої проблеми здійснювалося шляхом комплексної оцінки функціонального стану вилочкової залози, включаючи класифікаційний аналіз будови лімфоїдної популяції на основі морфометричних та денситометричних характеристик клітин, фенотипування лімфоцитів по CD-антигенам і оцінки їх проліферативної активності у динаміці багатоденних гіпоксичних тренувань і введення нейропептидів.

3. Гіпоксичні тренування призводили до збільшення щільності популяції лімфоцитів в вилочковій залозі щурів з переважанням серед них функціонально більш зрілих малих і середніх лімфоцитів. При цьому в субкапсулярній зоні та в зоні глибокої кори відмічалося помірне збільшення частки деструктивно змінених і апоптотичних лімфоцитів, а в медулярній зоні - зменшення їх кількості. Найбільш вражаючий ефект гіпоксичних тренувань на стан лімфоїдної популяції спостерігався протягом перших п'яти сеансів і в інші сроки експерименту мало змінювався.

4. Гіпоксичні тренування неоднаково впливають на диференціювання лімфоцитів в різних зонах вилочкової залози. В медулярній зоні кількість CD4 і CD8-імунопозитивних клітин зростає вже після п'яти гіпоксичних сеансів та зберігається у подальшому. У корковій речовині спостерігається зниження чисельності CD4-імунопозитивних лімфоцитів і тенденція до зростання кількості CD8-імунопозитивних клітин.

5. Гіпоксичні тренування призводять до короткочасного зростання щільності популяції CD134-імунопозитивних лімфоцитів у вилочковій залозі після п'яти сеансів з послідуючим відновленням їх чисельності у медулярній зоні та помірній депресії у корковій речовині.

6. Тривалий 20-денний період гіпоксичних тренувань призводить до двократного зростання кількості проліферуючих лімфоцитів у корковій та мозковій речовині вилочкової залози.

7. Десятиденне інтраперітонеальне та інтрацеребровентрикулярне введення окситоцину або нейропептиду Y призводить до наростання щільності популяції лімфоїдних клітин і зменшує частку деструктивно змінених і апоптотичних клітин у вилочковій залозі. При цьому ефект від інтрацеребровентрикулярного введення нейропептидів більш виразний, ніж при інтраперітонеальному їх введенні.

8. Проведені дослідження свідчать про імуностимулюючу дію дозованих гіпоксичних тренувань і багатоденного введення гіпоталамічних нейропептидів, що може бути перспективним шляхом корекції імунологічної недостатності у клініці.

Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Абрамов А.В., Камышный А.М., Любомирская В.А., Колесник Ю.М. Структурно-функциональная организация лимфоидной популяции тимуса: опыт применения математического классификационного анализа // Клін. експерим. патологія. - 2002. - Т.1, №1. - С.5-9 (внесок автора становить 30% і полягає в участі у розробці алгоритму автоматичного аналізу вилочкової залози, в отриманні експериментальних даних та проведенні їх статистичної обробки).

2. Абрамов А.В., Колесник Ю.М., Любомирська В.А., Камишний О.М. Алгоритм автоматичного аналізу лімфоїдної популяції тимуса // Вісник морфології. - 2002, № 2. - С.361-362 (внесок автора становить 30% і полягає в отриманні експериментальних даних та проведенні їх статистичної обробки)

3. Абрамов А.В., Колесник Ю.М., Любомирская В.А., Камышный А.М. Характеристика процессов дифференцировки лимфоцитов в вилочковой железе у крыс (светооптическое и иммуноцитохимическое исследование) // Запорожский медицинский журнал. - 2002. - №4. - С.10-13 (внесок автора становить 30% і полягає у проведенні імунофлюоресцентного дослідження вилочкової залози, проведенні статистичної обробки отриманих данних).

4. Камышный А.М. Влияние адаптации к гипоксической гипоксии на клеточный состав тимуса // Український медичний альманах. - 2002. - № 3. - С.67-70 (стаття написана самостійно).

5. Камышный А. М Особенности морфогенеза лимфоидной популяции вилочковой железы крыс при введении окситоцина // Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики. Збірник наукових статей. - 2003. - Випуск 11. - С.70-75 (стаття написана самостійно).

6. Камышный А. М Влияние гипоксических тренировок на клеточный состав и процессы дифференцировки лимфоцитов в вилочковой железе у крыс // Тезисы 4 украинской конференции молодых ученых, посвященной памяти академика В.В. Фролькиса, Киев, 2003. - С.103-104.

7. Абрамов А.В., Камышный А.М., Любомирская В.А., Колесник Ю.М. Эффекты многократного введения нейропептида Y на структуру лимфоидной популяции тимуса в норме и при экспериментальном сахарном диабете // Запорожский медицинский журнал. - 2003. - №5. - С.4-6 (внесок автора становить 30% і полягає у отриманні експериментальних даних та проведенні їх статистичної обробки).

Анотація

Камишний О.М. Функціональний стан лімфоїдної популяції вилочкової залози в динаміці адаптації до гiпоксичної гіпоксії і при введенні нейропептидів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.04. - патологічна фізіологія. Київ 2004

Дисертація присвячена вивченню особливостей будови і функціонального стану лімфоїдної популяції вилочкової залози щурів в нормі, в динаміці адаптації до гіпоксії і після введення нейропептидів. Для виконання поставлених у дисертації задач використовувалися сучасні морфометричні, гістохімічні та імуноцитофлюоресцентні методи аналізу гістологічного матеріалу і методи математичного класифікаційного і статистичного аналізу отриманих результатів. Про функціональний стан лімфоїдних клітин вилочкової залози робили висновки на підставі вивчення серійних гістологічних зрізів із різних відділів залози і даних морфометричних і денситометричних характеристик при фарбуванні гематоксиліном-еозином, даних імунноцитофлюорисцентного виявлення клітинних антигенних маркерів CD4, CD8 і CD134, а також даних виявлення ядерного антигену клітинної проліферації PCNA. У результаті роботи встановлено, що гіпоксичні тренування приводять до зміни структурно-функціональної організації лімфоїдної популяції вилочкової залози щурів, що виявляється збільшенням щільності клітин лімфоїдної популяції з перевагою функціонально більш зрілих малих і середніх лімфоцитів, прискорюють диференціювання та підвищують проліферативну активність зрілих лімфоїдних клітин коркової і мозкової речовини вилочкової залози. Десятиденне введення окситоцина та нейропептида Y збільшувало питому щільність лімфоїдних клітин і зменшувало частку деструктивно змінених і апоптотичних клітин у вилочковій залозі щурів як при інтраперитонеальному, так і при інтрацеребровентрикулярному введенні гормонів.

Ключевые слова: вилочковая железа, лимфоциты, гипоксические тренировки, нейропептид Y, окситоцин.

Аннотация

Камышный А.М. Функциональное состояние лимфоидной популяции вилочковой железы в динамике адаптации к гипоксической гипоксии и при введении нейропептидов. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.04. - патологическая физиология. Киев 2004

Диссертация посвящена изучению особенностей структуры и функционального состояния лимфоидной популяции вилочковой железы в норме, в динамике адаптации к гипоксии и после введения нейропептидов. Исследования проведены на 132 самцах крыс линии Вистар массой 230-250 г, которые подвергались гипоксическим тренировкам, а также интрацеребровентикулярному или интраперитонеальному введениям синтетических нейропептидов окситоцина и NPY. Гипоксические тренировки осуществляли в вентилируемой барокамере объемом 1,0 м³. При этом животные ежедневно в одно и то же время суток (с 10 до 16 часов) помещались в барокамеру. Режим гипоксических воздействий был следующим: в 1-й день напряжение О₂ в барокамере соответствовало высоте 1 км, на 2-й день - 2 км, на 3-й - 3 км, на 4-й - 4 км, на 5-й - 5 км, на 6-й и в последующие дни - 6 км. Для изучения влияния окситоцина и нейропептида Y на структуры вилочковой железы применялось многократное интрацеребровентрикулярное и интраперитонеальное введение их синтетических аналогов. Для введения использовались пептиды производства фирмы Peninsula Laboratories Ins., США. Для интрацеребровентрикулярного введения нейрогормонов крысам предварительно имплантировали стальную стерильную канюлю (калибр G 27) в правый латеральный желудочек мозга под этаминаловым наркозом (35 мг/кг внутрибрюшинно) с помощью стереотаксического аппарата THORAX (Венгрия). На 8-й день после операции животных отбирали в эксперимент. Нейрогормоны вводили в объеме 0,5мл водного раствора 0,9% NaCl один раз в день (с 10 до 12 часов) в течение 10 дней. Ежедневная доза нейрогормонов составляла: синтетического окситоцина - 0,3 нмоль, нейропептида Y - 2,3 пмоль. Многократное интраперитонеальное введение нейрогомонов осуществляли внутрибрюшинно в течение 10 дней. Ежедневная доза вводимых гормонов составляла: для окситоцина - 3 нмоль, NPY - 0,6 нмоль в 0,5 мл 0,9% NaCl. Контрольным животным этой и предыдущей серий интраперитонеально и интрацеребровентрикулярно в течение 10 дней в том же объеме вводили физиологический раствор.

Для выполнения поставленных в диссертации задач использовались современные морфометрические, гистохимические и иммуноцитофлюоресцентные методы анализа гистологического материала и методы математического классификационного и статистического анализа полученных результатов. О функциональном состоянии лимфоидных клеток вилочковой железы судили на основании изучения серийных гистологических срезов из различных отделов железы и данных морфометрических и денситометрических характеристик при окраске гематоксилином-эозином, данных иммуноцитофлюоресцентного выявления клеточных антигенных маркеров CD4, CD8 и CD134, а также данных выявления ядерного антигена клеточной пролиферации PCNA.

...