Інтерфероногенні властивості ротавірусів та стан системи інтерферону у новонароджених дітей при ротавірусній інфекції

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

Національний медичний університет імені О.О. Богомольця

удк 616.988:578.828.6-053.31.085.37:577.245

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

Інтерфероногенні властивості ротавірусів та стан системи інтерферону у новонароджених дітей при ротавірусній інфекції

03.00.06 -- вірусологія

Ковалюк Олена Володимирівна

Київ 2004

Загальна характеристика роботи

Для досягнення мети необхідно було вирішити наступні задачі.

1. Вивчити інтерфероногенні властивості ротавірусів в умовах експерименту на мишах in vivo.

2. Дослідити в динаміці ІФН статус у новонароджених дітей з ротавірусною інфекцією за рівнем циркулюючого ендогенного ІФН в крові, здатністю лейкоцитів крові до продукції альфа-ІФН (a-ІФН) та гама-ІФН (y-ІФН) в умовах in vitro.

3. Визначити рівень циркулюючого ендогенного ІФН в крові, здатність лейкоцитів крові in vitro до продукції a-ІФН та y-ІФН у новонароджених дітей з ротавірусною інфекцією при комплексному лікуванні з використанням вітчизняних препаратів рекомбінантного a₂-ІФН .

4. Проаналізувати вплив інтерферонотерапії із застосуванням вітчизняних препаратів рекомбінантного a₂-ІФН на клінічний перебіг і функціональний стан системи ІФН у новонароджених дітей з ротавірусною інфекцією.

5. Розробити оптимальні підходи до лабораторної діагностики ротавірусної інфекції у новонароджених дітей.

Об'єкт дослідження: доношені та недоношені новонароджені діти, хворі на РВІ; лабораторні тварини (нелінійні миші).

Предмет дослідження: ротавіруси людини та тварин; ІФН статус новонароджених дітей, хворих на РВІ; клітинні культури; матеріал від лабораторних тварин (сироватка крові).

Методи дослідження: експериментальні, вірусологічні, серологічні, клінічні, статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше досліджено стан системи ІФН через комплекс оціночних тестів “ІФН статус” у новонароджених дітей з клінічно вираженою та безсимптомною РВІ за рівнем циркулюючого ендогенного ІФН в крові, здатністю лейкоцитів крові до продукції a-ІФН та y-ІФН та їх прогнозуючу здатність по відношенню до перебігу інфекції. Обгрунтовано ректальне застосування препаратів рекомбінантного a₂-ІФН в комплексній терапії РВІ у новонароджених, яке повинно здійснюватися під контролем оціночних тестів ІФН статусу та вірусологічним контролем за елімінацією збудника.

Отримані новітні данні про інтерфероногенні властивості ротавірусів людини і тварин в експерименті на мишах in vivo. Вивчена динаміка та дозазалежний ефект індукції ІФН 5 штамів ротавірусів (HRV-134, SA-11, Лінкольн, Тіверваль, К). Доведено дозазалежний ефект індукції ІФН. Для індукції ІФН in vivo визначена оптимальна доза ротавірусу -- 5-6 lg ID₅₀. Встановлена наявність слабких інтерфероногенних властивостей у інфекційно активних ротавірусів штамів (HRV-134, SA-11, Лінкольн, Тіверваль, К), які були значно нижчими, ніж у інактивованого ротавірусу SA-11 та у відомих індукторів ІФН, зокрема вірусу хвороби Н'юкасла, полігуацилу, пірогеналу. Розроблена методика інактивації ротавірусу SA-11 за допомогою сполуки цис-дихлородіамінплатини з ДНК (МКП). Показано, що інактивація ротавірусу МКП, що супроводжується утворенням мультимерного комплекса, сприяє підвищенню його інтерфероногенних властивостей у 100 разів. В порівняльних дослідженнях інактивованого штаму ротавірусу SA-11-МКП з інфекційно активним штамом ротавірусу SA-11 в динаміці визначена індукція ІФН, яка найбільш активно здійснюється через 8 годин. Найбільш активним індуктором ІФН є ротавірус, інактивований МКП.

Практичне значення отриманих результатів. Розроблено новий метод інактивації ротавірусів за допомогою МКП, що може знайти впровадження у біотехнології отримання високоактивних лейкоцитарних ІФН. Запропоновано алгоритм лабораторної діагностики РВІ у новонароджених дітей. Враховуючи особливості забору крові у немовлят, модифіковано і впроваджено мікрометод визначення ІФН статусу у пробах цільної крові. Запропоновано та впроваджено у практику проведення моніторингу РВІ у новонароджених з перинатальною патологією.

За матеріалами дисертації у співавторстві надруковані та впроваджені у роботу багатьох вірусологічних лабораторій СЕС 5 методичних рекомендацій: “Лабораторна діагностика ротавірусної інфекції” (Київ, 2002 р.), “Інтерфероновий статус людини при вірусних інфекціях” (Київ, 2002 р.), “Лабораторна діагностика ротавірусної інфекції в умовах практичної вірусологічної лабораторії” (Київ, 2003 р.), “Епідеміологія і профілактика ротавірусної інфекції” (Київ, 2003 р.), “Ротавірусна інфекція: клініка, діагностика і комплексна терапія” (Київ, 2003 р.). За матеріалами дисертації видані 2 інформаційні листи: “Моніторинг ротавірусної інфекції у новонароджених з перинатальною патологією” (№71-2002) та “Використання лаферону в комплексній терапії ротавірусної інфекції у новонароджених” (№13-2004).

Результати досліджень впроваджені у педагогічний процес кафедр вірусології та неонатології КМАПО ім. П.Л.Шупика, у роботу лікувально-профілактичних та санітарно-епідеміологічних закладів України.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем самостійно проведено інформаційний пошук та аналіз наукової літератури за темою дисертації. Власноруч проведено вірусологічне та серологічне обстеження в динаміці 168 новонароджених дітей, визначені показники ІФН статусу в динаміці у 153 новонароджених, які знаходились у фізіологічному відділенні новонароджених акушерського стаціонару та у спеціалізованих відділеннях патології новонароджених і недоношених дітей УКСДЛ “ОХМАТДИТ” м. Києва у період з 2000 по 2002 роки.

Розроблено алгоритм лабораторної діагностики РВІ у новонароджених.

Автором визначені показники ІФН статусу у новонароджених дітей з РВІ. Особисто проведенні експериментальні дослідження при визначенні інтерфероногенних властивостей ротавірусів на лабораторних тваринах.

Здобувачем самостійно проведено систематизацію і узагальнення отриманих даних, їх статистичну обробку та спільно з науковим керівником сформульовано висновки.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались і обговорювались на науково-практичній конференції “Медикаментозна та немедикаментозна профілактика та відновне лікування в клінічній практиці” (Київ, 2001 р.); ІІІ Міжнародній конференції “Біоресурси та віруси” (Київ, 2001 р.); ІІІ науково-практичній медичній конференції “Сучасні проблеми клінічної фармакології, імунопрофілактики та імунотерапії”, присвяченій 160-річчю Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця (Київ, 2001 р.); нараді-семінарі лікарів-вірусологів “Сучасні методи діагностики поліомієліту та інших ентеровірусних інфекцій” (Київ, 2002 р.); нараді-семінарі з актуальних питань роботи епідеміологічних відділів і вірусологічних лабораторій установ державної санепідслужби МОЗ України (Дніпропетровськ, 2002 р.); міжнародній науково-практичній конференції “Новые технологии получения и применения биологически активных веществ” (Алушта, 2002 р.); науково-практичній конференції “Актуальні аспекти ротавірусної інфекції на сучасному етапі” (Київ, 2003 р.).

Публікації. Результати дисертаційної роботи повністю відображені у 11 наукових працях, в тому числі 7 статтях у наукових фахових виданнях, що входять до переліку, затвердженого ВАК України і тезах 4 вітчизняних та міжнародних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, аналітичного огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, трьох розділів власних досліджень, обговорення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел із 277 найменувань (185 вітчизняних і країн СНД та 92 іноземних) та додатків (15). Робота викладена на 174 сторінках (основний текст на 112 сторінках), ілюстрована 23 таблицями, 23 рисунками, 2 фотографіями.

Основний зміст роботи

У вступі обгрунтовано актуальність проблеми, визначені мета, задачі, об'єкт і предмет дослідження, сформульовано наукову новизну, розкрите теоретичне та практичне значення роботи, визначено особистий внесок автора, наведені дані про апробацію отриманих результатів.

В огляді літератури представлені новітні погляди на ротавіруси, їх властивості, патогенез та роль системи ІФН при РВІ. Наведені сучасні концепції клініки і лікування РВІ. Критичний огляд літератури висвітлив відсутність науково обгрунтованої інформації, щодо функціонального стану системи ІФН при РВІ у новонароджених дітей та ефективності застосування рекомбінантного a₂-ІФН при РВІ у немовлят, що зумовлює необхідність проведення наукових досліджень з даної проблеми.

Матеріали та методи досліджень. Під час виконання роботи використано 460 білих нелінійних мишей масою тіла 18±2 г, клінічний матеріал (кров та фекалії) від 168 новонароджених дітей віком від 1 до 30-ї доби життя, 1 первинно-трипсинізована культура клітин (ФЕК) та 4 перещеплювані лінії клітинних культур (НЕр-2, Vero, СНЕВ, L-929).

У роботі було використано мавпячий ротавірус штам SA-11 (ІА-105 ТЦД50/мл), отриманий з лабораторії етіології, епідеміології і профілактики ентеровірусних інфекцій Інституту поліомієліту та вірусних енцефалітів ім. М.П. Чумакова РАМН; ротавіруси великої рогатої худоби - штами Лінкольн (ІА-10⁴ ТЦД₅₀/мл), Тіверваль (ІА-10⁵ ТЦД₅₀/мл), свиней - штам К (ІА-10⁶ ТЦД₅₀/мл), отримані з Інституту ветеринарної медицини Української академії аграрних наук та ротавірус людини штам HRV-134 (ІА-103 ТЦД50/мл), який одержано з музею вірусів лабораторії поліомієліту та інших ентеровірусних інфекцій інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського АМН України.

ВВС штам Індіана та ВХН штам Канзас були люб'язно надані к.б.н. Кривохатською Л.Д. (Інститут отоларингології ім. О.С.Коломійченко АМН України). ВХН (ІА-10⁹ ТЦД₅₀/0,1мл) використовували для індукції a-ІФН в дозі 100 ТЦД₅₀/0,1мл. ВВС (ІА-10⁶ ТЦД₅₀/0,1мл) використовували для визначення антивірусної дії ІФН у робочій дозі 100 ТЦД₅₀/0,1мл.

При визначенні інтерфероногенних властивостей ротавірусів для порівняння використані: пірогенал (From Pseudomonas aeruginosa Serotype 10 L-9143), полігуацил (Polycytidylic-Polyguanilic acid (Poly[C]·Poly[G]) P 4038, виробництва “Sigma” (USA), вірус поліомієліту ІІ типу в дозі 10⁸ ТЦД₅₀/мл, ВХН в дозі 10⁶ ТЦД₅₀/мл.

В якості референс-ІФН використовували rHuIFN-a2b Recombinant Human Interferon - alpha 2b LOT# :502 PIFO1 content: 100 мg protein Sourse: E. Coli.

Для інтерферонотерапії новонароджених з РВІ застосовували вітчизняний рекомбінантний a-2bІФН - “Лаферон” (реєстраційний №192/00-300200000) виробництва ПНІК “Біотехнолог” (м. Київ), ЗАТ “Біолек” (м. Харків, Україна).

Інтерфероногенні властивості інактивованого ротавірусу вивчали за умови розробки спеціальної методики інактивації. Продовжуючі дослідження професора Гиріна В.М., нами для інактивації ротавірусу з координаційних сполук металів використано комплексну похідну платини з поліаніоном дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДДП-ДНК), номенклатурна назва: {полі/гексакіс [хлороаміноакваплатина /П/]} - дезоксирибонуклеат: хімічна формула {[PtCl (NH3)]6 (H2O)6}n-DNA-m, де DNA-m=(С39Н49О32N15P4)n; n=2100±100; m=6. (Производные платины (П) с полианионом дезоксирибонуклеиновой кислоты, способ их получения и лекарственный препарат противоопухолевого действия на их основе /Международная Заявка РСТ WO 89/11861, от 14.12.89. Европейский Патент ЕР 0374267 А1/. Вакцина ротавирусная инактивированная для иммунизации животных /Патент 2095083, Россия, Бюлл. ИСМ, 1997.- №31, ч.2.- С. 271/. Вакцина ротавірусна інактивована для імунізації тварин /Патент № 24024, Україна, МПК6, А61К 39/15-Бюл. Промислова власність України.-1998.- №4.-31.08.98).

Розчин ДДП-ДНК містив 1,53 мг/мл активної речовини у фармацевтичному розріджувачі, включаючи 0,015 М натрію хлориду і 0,0015 М натрію цитрату у воді, а також ДДП -- цис-дихлородіамінплатину /П/ в аналогічному фармацевтичному розріджувачі. ДДП одержували з лабораторії координаційної хімії Інституту фізичної хімії ім. Л.В.Пісаржевського НАН України. Надалі ця сполука отримала назву макромолекулярний комплекс платини (МКП).

Інтерфероногенні властивості ротавірусів вивчали в умовах експерименту in vivo на 460 білих нелінійних мишах. Дослідження виконані в три етапи у відповідності до методичних рекомендацій “Вивчення антивірусної дії потенційних лікарських засобів” (Щербінська А.М., Дяченко Н.С., Рибалко С.Л. та співавт., 2000 р.). Використані 5 актуальних штамів ротавірусів людини (HRV-134) і тварин (SA-11, Лінкольн, Тіверваль, К).

Інтерфероногенну активність оцінювали за двома показниками: індукуюча інтерферон доза мінімальна (ІІД_мін) та показник активності індуктора (ПАІ). Інтерфероногенну дію визначали в динаміці через 2, 4, 8, 12 і 24 год після введення. Після попереднього ефірного наркозу проводили розтин тварин та відбирали кров. ІФН сироватки крові титрували в культурі клітин L-929 мікрометодом. Антивірусну активність ІФН визначали за пригніченням ЦПД 100 ТЦД₅₀/0,1мл тест-віруса ВВС (Од/мл).

На маркери РВІ обстежено 168 новонароджених дітей. Обстеження проведені за розробленим та затвердженим МОЗ України діагностичним алгоритмом. Кратність обстеження становила від 1 до 8 разів. Проведення та облік результатів в ІФА здійснювали на апаратурі фірми “Labsystems” (Фінляндія).

Функціональний стан системи ІФН у новонароджених з РВІ визначено в динаміці, за умов комплексного використання трьох показників, об'єднаних в групу оціночних тестів під назвою “ІФН статус”. ІФН статус в динаміці проаналізовано у 153 новонароджених (26 здорових новонароджених дітей та 127 новонароджених з клінічно вираженою та безсимптомною РВІ). Визначення показників ІФН статусу (рівень циркулюючого ІФН в сироватці крові, здатність лейкоцитів периферійної крові до продукції a-ІФН та y-ІФН) в умовах in vitro проводили за модифікованим нами мікрометодом.

Визначення антивірусної активності ІФН в досліджуваному матеріалі здійснювали в культурі клітин HEp-2. Активність ІФН оцінювали за пригніченням ЦПД 100 ТЦД₅₀/0,1мл ВВС. За титр ІФН вважали розведення проби, при якому спостерігався захист 50% моношарів клітин від ЦПД 100 ТЦД₅₀/0,1мл ВВС. Активність ІФН виражали в МО/мл або в зворотніх log₂ розведень (титр).

Клінічні обстеження новонароджених були здійснені спільно із співробітниками кафедри неонатології КМАПО ім. П.Л.Шупика (зав. кафедри д.м.н., проф. Шунько Є.Є.) і включали оцінку гестаційного віку, стану дітей при народженні за шкалою Апгар та показників фізичного розвитку з подальшою реєстрацією симптомів перебігу РВІ.

При статистичній обробці отриманих результатів використовували загальновідомі методи варіаційної статистики. Оскільки отримані дані були розподілені гаусово, ми застосовували параметричний метод оцінки відмінностей середніх двох вибірок за критерієм Ст'юдента (t), використовуючи програмно-математичний комплекс для ПК МS Excel 97 та пакет прикладних програм “Statistica” (USA). Розраховували середнє арифметичне (або середньологарифмічне) (М), стандартну похибку (m) та вірогідність відмінностей між окремими показниками у групах (р).

Результати досліджень та їх обговорення

В роботі представлені дослідження, проведені по трьом напрямкам, які враховували особливості вивчення системи ІФН при РВІ в залежності від трьох ключових компонентів: вірусу та його здатності індукувати ІФН в організмі, відповіді клітини-хазяїна, що оцінювалась за допомогою оціночних тестів під назвою “ІФН статус”, та вивчення впливу екзогенного ІФН на клінічний перебіг, функціональний стан системи ІФН, репродукцію та елімінацію збудника з організму.

Визначення інтерфероногенних властивостей ротавірусів в експерименті in vivo. На першому етапі досліджень було з'ясовано, що всі інфекційно активні штами ротавірусів людини і тварин здатні індукувати в умовах in vivo утворення ендогенного ІФН. Найбільш високу інтерфероногенну активність виявляв через 8 годин ротавірус штаму SA-11 - 640 Од/мл, при цьому його ІІДмін становила 105ТЦД₅₀/мл (рис. 1). Показник активності індуктора, розрахований для цього штаму ротавірусу, складав 156,25.

Рис. 1. Динаміка інтерфероноутворення ротавірусу штаму SA-11 в умовах експерименту in vivo.

Вивчення інтерфероногенної активності інактивованого ротавірусу штаму SA-11, за допомогою МКП, проведено за розробленою нами методикою, проведення якої призводило до повної інактивації ротавірусу. Методика включала в себе: солюбілізацію неочищеної вірусвмістної культуральної рідини неіонним детергентом Тритоном Х-100 в діапазоні рН 7,4-7,6 впродовж 15 хв при 37С; внесення сполуки цис-дихлородіамінплатини із ДНК (МКП) у вигляді цитратно-сольового розчину; інкубацію впродовж 90 хв при температурі 37С; освітлювання культуральної рідини центрифугуванням при 3000 об/хв впродовж 10 хв; визначення залишкової інфекційної активності ротавірусів.

Інтерфероногенна активність інактивованого вірусу була у 100 разів вищою у порівнянні з інфекційно активним вірусом (рис. 2). Розрахунок ПАІ показав високу активність інактивованого ротавірусу, як індуктора інтерфероноутворення (ПАІ = 5800 мкг/кг : 64 000 Од/мл = 0,091).

Рис. 2. Рівень ендогенного ІФН в сироватці крові мишей

Проведення порівняльного аналізу інтерфероногенних властивостей інфекційно активного та інактивованого ротавірусів з аналогічними властивостями відомих індукторів ІФН дало змогу встановити, що інфекційно активні ротавіруси мають слабкі інтерфероногенні властивості в організмі, що характеризує їх як слабкі інтерфероногени. Інактивація ротавірусу SA-11 МКП за запропонованою нами методикою призводила до підвищення інтерфероногенних властивостей ротавірусів у 100 разів (табл. 1).

Таблиця 1. Показники інтерфероніндукуючої дії інфекційно активного та інактивованого ротавірусів

Ротавірусна інфекція у новонароджених дітей. Лабораторна діагностика РВІ за запропонованим нами та затвердженим МОЗ України алгоритмом дала змогу виявити у 20,9% немовлят ротавірусний антиген (у діагностичних титрах 1:16 - 1:128) в першу добу з моменту госпіталізації, що свідчило про те, що вони були інфікованні в пологових будинках та поступили з проявами РВІ. Протягом лікування і виходжування немовлят з РВІ в стаціонарі ми реєстрували госпітальне поширення ротавірусів, на що вказувало підвищення в 3,1 разів частоти визначення збудника у дітей. Тобто, протягом знаходження в стаціонарі, ротавіруси знайдено у 65,1% немовлят, що розцінено нами як нозокомеальне інфікування. У 34,9% немовлят наявність ротавірусного антигену в пробах фекалій не виявили.

Згідно власних досліджень частота інфікування ротавірусами новонароджених з перинатальною патологією в умовах спеціалізованих неонатологічних відділень може сягати 80%, що вимагає удосконалення існуючої системи моніторингу за внутрішньолікарняними інфекціями.

Тому, для своєчасної діагностики, цілеспрямованого лікування та запобігання нозокомеального поширення ротавірусів, нами запропоновано проведення моніторингу РВІ у новонароджених з перинатальною патологією. Визначені адекватні методи дослідження, діагностичні тест-системи, матеріал для дослідженння, умови його відбору, терміни проведення обстеження та контингент обстежених (інформаційний лист “Моніторинг ротавірусної інфекції у новонароджених з перинатальною патологією” №71-2002 р.).

Частота визначення ротавірусів у фекаліях обстежених немовлят була пов'язана з терміном перебування їх в стаціонарі, при цьому пік інфікування новонароджених ротавірусами припадав на другий тиждень знаходження у стаціонарі. Ротавірусні антигени у фекаліях хворих дітей визначались у титрах 1:32 - 1:128, з підвищенням титру у кількох дітей до 1:1024.

Клінічний перебіг РВІ у новонароджених характеризувався гострим початком, проявами загальної інтоксикації, наявністю катаральних явищ з боку слизових оболонок ВДШ. На другу добу з'являлись гастроінтестинальні розлади: зригування молоком, здуття живота, часті випороження водянистої консистенції з домішками слизу. Ці клінічні прояви супроводжувались виявленням ротавірусного антигену у фекаліях в динаміці в 100% випадків.

Аналіз клінічних показників постнатальної адаптації новонароджених встановив достовірну (р<0,05) різницю між показниками фізичного розвитку немовлят, максимальної втрати маси тіла, терміну прикладання до грудей матері, середнім рівнем білірубіну і тривалістю жовтяниці у дітей, хворих на РВІ, та у немовлят, не інфікованих ротавірусами.

Визначення інтерферонового статусу у новонароджених дітей з ротавірусною інфекцією. Згідно отриманих даних у здорових новонароджених дітей в сироватці крові рівень ендогенного ІФН складав 1,95±0,18 log₂МО/мл. Здатність лейкоцитів крові здорової новонародженої дитини до продукції a- та y-ІФН в умовах in vitro становила відповідно 3,72±0,18 log₂МО/мл та 2,25±0,16 log₂МО/мл.

Дослідження показників ІФН статусу, проведені в динаміці впродовж перебування в стаціонарі новонароджених з безсимптомним клінічним перебігом інфекції показало, що вони достовірно не відрізнялися (р>0,05) від аналогічних показників, визначених у здорових немовлят (табл. 2).

Таблиця 2. Показники ІФН статусу у здорових новонароджених і новонароджених з безсимптомним клінічним перебігом РВІ

Дослідження динаміки інтерфероноутворення у новонароджених з клінічними проявами РВІ показало, що в гострому періоді інфекції в сироватці крові новонароджених дітей спостерігалося достовірне підвищення (р<0,01) рівня сироваткого ІФН (3,47±0,16 log₂МО/мл), що характеризувало всі випадки клінічновираженої РВІ в гострому періоді. Аналіз динаміки утворення a- та y-ІФН лейкоцитами периферійної крові засвідчив достовірний спад (р<0,01) рівнів a-ІФН до 2,14±0,14 log₂МО/мл та y-ІФН до 1,36±0,10 log₂МО/мл, який ми реєстрували у 100% випадків в гострому періоді РВІ (табл. 3).

Таблиця 3. Показники ІФН статусу у здорових і хворих на РВІ новонароджених дітей

Отже, порівняльна оцінка показників ІФН статусу у здорових новонароджених та у немовлят з РВІ засвідчила достовірне (р<0,01) підвищення кількості сироваткового ІФН та пригнічення здатності лейкоцитів периферійної крові до продукції a- та y-ІФН при відповідній їх індукції в умовах in vitro у новонароджених дітей в гострому періоді РВІ (рис. 3).

Рис. 3. Показники ІФН статусу у здорових та хворих на РВІ новонароджених дітей

В періоді реконвалесценції після проведенної патогенетичної терапії, інтерферонпродукуюча здатність лейкоцитів крові новонароджених дітей з РВІ не досягала рівнів, визначених для здорових немовлят, і складала 2,52±0,26 log₂МО/мл для a-ІФН та 1,43±0,01 log₂МО/мл для y-ІФН.

Особливості ІФН статусу у новонароджених дітей з ротавірусною інфекцією при застосуванні в комплексному лікуванні препаратів рекомбінантних a₂-ІФН. Для з'ясування ефективності лікувального комплексу із застосуванням препаратів рекомбінантних a₂-ІФН хворі новонароджені за допомогою методу рандомізації були розподілені на 2 групи: основну та контрольну. Діти контрольної групи отримували базисну патогенетичну терапію. Діти основної групи на фоні цього отримували вітчизняний препарат рекомбінантного a-2bІФН - “Лаферон”, який вводили ректально на фізіологічному розчині за допомогою мікроклізм. Добова доза становила 50 000-100 000 МО/кг маси тіла, курс лікування тривав 3-5 днів. Паралельно призначали вітаміни С і Е. Ускладнень при лікуванні “Лафероном” не спостерігалось (інформаційний лист “Використання лаферону в комплексній терапії ротавірусної інфекції у новонароджених” №13-2004 р.).

Аналіз динаміки зворотнього розвитку основних клінічних синдромів показав, що їх вираженість наприкінці лікування “Лафероном” достовірно зменшилась, при цьому застосування “Лаферону” характеризувалось і достовірно більш швидшим зворотнім розвитком клінічних проявів захворювання (табл. 4).

Таблиця 4. Динаміка клінічних проявів захворювання у новонароджених дітей залежно від комплексу застосованої терапії

Для з'ясування ефективності лікувального комплексу з ректальним застосуванням “Лаферону” нами були проаналізовані показники ІФН статусу. Аналіз показників ІФН статусу у новонароджених обох груп в гострому періоді інфекції засвідчив, що вони достовірно не відрізнялися (р>0,05) між собою. Після проведення відповідного лікування кількість ІФН в сироватці крові у немовлят основної та контрольної груп достовірно знижувалася (р<0,01). Проте, активація процесів інтерфероногенезу в імунокомпетентних клітинах in vitro та статистично достовірне підвищення рівнів a- та y-ІФН спостерігалося лише у немовлят, в комплексній терапії яких був застосований “Лаферон”. Іх значення достовірно не відрізнялися (р>0,05) від аналогічних показників, визначених у здорових немовлят, і складали 3,12±0,25 log₂МО/мл та 2,13±0,20 log₂МО/мл відповідно (табл. 5).

Таблиця 5. Показники ІФН статусу у здорових новонароджених та у новонароджених після застосування різних терапевтичних комплексів

Графічне зображення показників ІФН статусу у новонароджених дітей після лікування різними терапевтичними комплексами подано на рис. 4.

Рис. 4. Порівняння показників ІФН статусу у новонароджених після лікування різними терапевтичними комплексами

Спираючись на результати власних досліджень, зроблено висновок про те, що “Лаферон” сприяє швидшій інволюції клінічних проявів захворювання та чинить модулювальну дію на процеси інтерфероногенезу у новонароджених.

Застосування препаратів рекомбінантного a2-ІФН в комплексній терапії РВІ у новонароджених дітей необхідно здійснювати під контролем за показниками ІФН статусу та вірусологічним контролем за елімінацією збудника, що дасть змогу об'єктивно прогнозувати перебіг захворювання та ефективність проведеного лікування.

Висновки

У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове розв'язання наукового завдання, що виявляється у визначенні функціонального стану системи ІФН через комплекс оціночних тестів, об'єднаних поняттям “інтерфероновий статус” у новонароджених з гострою ротавірусною інфекцією та оцінці інтерфероногенних властивостей збудника для наукового обгрунтування застосування вітчизняних препаратів рекомбінантного a₂-ІФН в комплексній терапії ротавірусної інфекції у новонароджених дітей.

1. Встановлено, що у новонароджених дітей віком від 5 до 30 доби життя з масою тіла при народжені 0,8-3,2 кг в гострому періоді ротавірусної інфекції спостерігається достовірне (р<0,01) підвищення рівня сироваткового ІФН (3,47±0,16 log₂МО/мл), пригнічення здатності лейкоцитів крові до продукції a-(2,14±0,14 log2МО/мл) та y-ІФН (1,36±0,10 log₂МО/мл). В періоді реконвалесценції на 7-8 добу рівень ІФН в сироватці крові достовірно (р<0,01) знижувався до 2,43±0,26 log₂МО/мл, при цьому інтерферонпродукуюча здатність лейкоцитів крові не досягала рівнів, визначених для здорових новонароджених дітей, і становила для a-ІФН2,52±0,26log₂МО/мл, а для y-ІФН -- 1,43±0,01 log₂МО/мл.

2. Доведено клінічну ефективність та позитивний вплив інтерферонотерапії препаратами рекомбінантного a₂-ІФН в добовій дозі 50 000-100 000 МО/кг маси тіла упродовж 3-5 днів при ректальному введенні на перебіг ротавірусної інфекції у новонароджених та нормалізацію показників ІФН статусу. Встановлено, що тривалість інтоксикації зменшилася в 1,8 разів; гастроінтестинальні розлади -- в 1,5 разів; діарея -- в 1,4 разів; частота розвитку некротичного ентероколіту -- в 1,7 разів; тривалість перебування в стаціонарі -- в 1,6 разів. Встановлено достовірне (р<0,01) підвищення продукції a-ІФН (3,12±0,25 log₂МО/мл) та y-ІФН (2,13±0,20 log₂МО/мл) і нормалізація цих показників до рівнів у здорових немовлят.

3. Показано, що комплексна терапія ротавірусної інфекції у новонароджених дітей повинна здійснюватись під контролем оціночних тестів ІФН статусу, вірусологічним контролем за виділенням ротавірусів для об'єктивної оцінки клінічної ефективності проведеного лікування.

4. Запропоновані діагностичний алгоритм із застосуванням експресних, специфічних та чутливих методів дослідження, вірусологічний моніторинг за ротавірусною інфекцією, модифікація мікрометоду визначення ІФН статусу у новонароджених дітей.

5. Отримані новітні данні в експерименті in vivo на мишах про інтерфероногенні властивості інфекційно активного та інактивованого ротавірусів людини (штам HRV-134) і тварин (штамів SA-11, Лінкольн, Тіверваль, К). Встановлено, що всі інфекційно активні ротавіруси мають слабкі інтерфероногенні властивості в організмі, що характеризує їх як слабкі інтерфероногени. Визначено, що інтерфероногенні властивості інактивованого ротавірусу були достовірно (р<0,05) вищими, ніж у інфекційного вірусу.

6. Pозроблено новий метод інактивації ротавірусів макромолекулярним комплексом платини. Інактивація в такий спосіб призводила до підвищення інтерфероногенних властивостей ротавірусів у 100 разів. Одержані результати відкривають перспективи направленого синтезу нової групи індукторів інтерферонів за участю макромолекулярного комплексу платини.

Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Шунько Є.Є., Дзюблик І.В., Тунда І.П., Барбова Г.І., Ковалюк О.В. Ротавірусна інфекція в пологовому будинку за даними вірусологічних обстежень //Український медичний часопис.- 2000.- № 5/19.- С.72-76.

2. Благодатный В.Н., Дзюблик И.В., Шунько Е.Е., Тунда И.П., Ковалюк Е.В. ДВС-синдром при ротавирусной инфекции //Збірник наукових праць співробітників КМАПО.- 2000.- Вып. 9.- Кн.-4.- С.1096-1104.

3. Дзюблик І.В., Шунько Є.Є., Ковалюк О.В., Каніболоцька М.Б. Інтерфероновий статус та особливості клінічного перебігу ротавірусної інфекції у новонароджених //Збірник наукових праць співробітників КМАПО.- 2001.- Вип.10.- Кн.-2.- С.36-41.

4. Ковалюк О.В., Дзюблик І.В., Вернер О.М. Епідеміологічні та клінічні особливості ротавірусної інфекції у новонароджених //Збірник наукових праць співробітників КМАПО.- 2001.- Вип. 10.- Кн.-3.- С.1118-1127.

5. Дзюблик І.В., Кривохатська Л.Д., Трохименко О.П., Ковалюк О.В. Мікрометод визначення інтерферонового статусу людини у пробах цільної крові //Лабораторна діагностика.- 2001.- №1.- С.34-37.

6. Дзюблик І.В., Трохименко О.П., Ковалюк О.В. Експериментальні дослідження інтерфероногенних властивостей ротавірусів //Збірник наукових праць співробітників КМАПО.- 2002.- Вип. 11.- Кн.-3.- С.685-694.

7. Дзюблик І.В., Трохименко О.П., Ковалюк О.В., Вороненко С.Г. Принципи та методи лабораторної діагностики ротавірусної інфекції //Український хіміотерапевтичний журнал.- 2003.- №1.- С.54-60.

8. Дзюблик І.В., Трохименко О.П., Ковалюк О.В. Інтерфероногенні властивості ротавірусів: живого та інактивованого макромолекулярними комплексами платини //Тези ІІІ-ї Міжнародної конференції “Біоресурси та віруси”.- Київ.-2001.- С.41.

9. Гирін В.М., Дзюблик І.В., Вороненко С.Г., Ковалишин Г.Г., Порохниць-кий В.Г., Бойко І.І., Трохименко О.П., Ковалюк О.В. Досвід організації та проведення практичних занять з лабораторної діагностики вірусних інфекцій //Проблеми підготовки медичних та фармацевтичних кадрів в Україні.- Дніпропетровськ.-2001.- С.373-374.

10. Дзюблик І.В., Порохницький В.Г., Вороненко С.Г., Ковалишин Г.Г., Трохименко О.П., Бойко І.І., Ковалюк О.В., Плугатир В.М. Лабораторна діагностика ротавірусної інфекції //Матеріали наради-семінару з актуальних питань роботи епідеміологічних відділів і вірусологічних лабораторій установ державної санепідслужби МОЗ України.- Дніпропетровськ.- 2002.- С.73-74.

11. Girin V.N., Dzyublik I.V., Trorhimenko E.P., Kovalyuk E.V., Bilotcach E.M. Searcn and creation of immunopotentiating components for rotavirus antigenes //International conference “New technologies of isolation and application of biologically active substances (Abstracts).- Alushta.- 2002.- P.106-107.

Анотація

Ковалюк О.В. Інтерфероногенні властивості ротавірусів та стан системи інтерферону у новонароджених дітей при ротавірусній інфекції.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.06 -- вірусологія.- Національний медичний університет імені О. О. Богомольця, Київ, 2004.

Дисертація присвячена вивченню функціонального стану системи ІФН за допомогою комплексу оціночних тестів, об'єднаних поняттям “ІФН статус” у новонароджених дітей з ротавірусною інфекцією та визначенню інтерфероногенних властивостей збудника.

Надано відомості про ІФН статус у новонароджених з клінічно вираженою та безсимптомною ротавірусною інфекцією. Визначена динаміка циркуляції ендогеного ІФН, здатність лейкоцитів крові новонароджених продукувати a- та g-ІФН залежно від періоду захворювання.

Встановлено, що у новонароджених в гострому періоді ротавірусної інфекції спостерігається підвищення рівня сироваткового ІФН, пригнічення здатності лейкоцитів крові до продукції a- та y-ІФН. В періоді реконвалесценції рівень ІФН в сироватці крові знижувався, інтерферонпродукуюча здатність лейкоцитів крові не досягала рівнів, визначених для здорових новонароджених.

Обгрунтовано застосування препаратів рекомбінантного a₂-ІФН в комплексній терапії ротавірусної інфекції у новонароджених.

Одержані дані про інтерфероногенні властивості ротавірусів в експерименті in vivo. Встановлена наявність слабких інтерфероногенних властивостей у інфекційно активних ротавірусів. Інактивація ротавірусу штаму SA-11 макромолекулярним комплексом платини, сприяла підвищенню його інтерфероногенних властивостей.

Ключові слова: ротавіруси, ротавірусна інфекція, рекомбінантний a₂-ІФН, інтерфероновий статус, інтерфероногенні властивості, макромолекулярний комплекс платини, новонароджені.

Аннотация

Ковалюк Е.В. Интерфероногенные свойства ротавирусов и состояние системы интерферона у новорожденных детей при ротавирусной инфекции.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 03.00.06 -- вирусология.- Национальный медицинский университет имени А. А. Богомольца, Киев, 2004.

Диссертация посвящена изучению функционального состояния системы ИФН с помощью комплекса оценочных тестов, объединенных понятием “интерфероновый статус” (ИФН статус) у новорожденных детей с острой ротавирусной инфекцией и определению интерфероногенных свойств возбудителя.

Представлены сведения о состоянии системы ИФН через комплекс оценочных тестов “ИФН статус” у новорожденных детей с клинически выраженной и безсимптомной ротавирусной инфекцией. Определена динамика циркуляции эндогенного ИФН и способность лейкоцитов периферической крови новорожденных к продукции a- и y-ИФН in vitro в зависимости от периода заболевания.

Исследования показателей ИФН статуса, проведенные в динамике, у новорожденных с бессимптомным течением ротавирусной инфекции показали, что они достоверно не отличались (p>0,05) от аналогичных показателей, определенных у здоровых новорожденных детей.

Установлено, что у новорожденных детей в остром периоде ротавирусной инфекции отмечается повышение уровня сывороточного ИФН и угнетение способности лейкоцитов крови к продукции a- и y-ИФН. В периоде реконвалесценции (после базисного патогенетического лечения) уровень сывороточного ИФН снижался, однако, интерферонпродуцирующая способность лейкоцитов крови не достигала уровня, установленного для здорових новорожденных.

Дана оценка клинической ефективности лечения “Лафероном”, сопровождающаяся показателями ИФН статуса, которые в период реабилитации по своим количественным показателям соответствовали уровню ИФН статуса здоровых новорожденных детей.

Научно обосновано ректальное применение отечественных препаратов рекомбинантного a₂-ІФН в комплексной терапии ротавирусной инфекции у новорожденных детей. Комплексная терапия должна проводиться под контролем оценочных тестов ИФН статуса и вирусологическим контролем за элиминацией возбудителя, что даст возможность объективно прогнозировать течение заболевания и эффективность проведенного лечения.

Разработан диагностический алгоритм лабораторной диагностики ротавирусной инфекции у новорожденных детей с использованием экспрессных, специфических и чувствительных методов исследования. Модифицирован микрометод определения ИФН статуса в пробах цельной крови. С целью своевременной диагностики, соответствующего лечения и предотвращения нозокомеального распространения ротавирусов предложено проведение мониторинга ротавирусной инфекции у новорожденных с перинатальной патологией.

Получены данные об интерфероногенных свойствах ротавирусов человека (штамм HRV-134) и животных (штаммы SA-11, Линкольн, Тиверваль, К) в эксперименте in vivo. Изучена динамика и дозазависимый еффект индукции ИФН 5 штаммов ротавирусов in vivo в эксперименте на мышах. Для индукции ИФН in vivo определена оптимальная доза ротавируса -- 5-6 lg ID₅₀. Установлено наличие слабых интерфероногенных свойств у инфекционно активных ротавирусов, которые были значительно ниже, чем у инактивированного ротавируса и известных индукторов ИФН (вируса болезни Ньюкастла, полигуацила, пирогенала).

Интерфероногенные свойства инактивированного ротавируса изучали при условии разработки специальной методики инактивации с участием макромолекулярного комплекса платины. Инактивация ротавируса штамма SA-11 с помощью макромолекулярного комплекса платины, сопровождающаяся образованием мультимерного комплекса, способствовала достоверному (p<0,05) увеличению в 100 раз его интерфероногенных свойств. Результаты проведенных исследований открывают новое направление создания индукторов интерферонообразования с использованием макромолекулярного комплекса платины и инактивированного ротавируса.

Ключевые слова: ротавирусы, ротавирусная инфекция, рекомбинантный a₂-ІФН, интерфероновый статус, интерфероногенные свойства, макромолекулярный комплекс платины, новорожденные.

Summary

Kovalyuk O.V. Interferonogenic rotavirus properties and condition of interferon system in newborns with rotavirus infection.- Manuscript.

Thesis for the degree of Candidate of Medical Science in speciality 03.00.06 -- virolo-gy.- National Medical University named after O. O. Bogomolets, Kyiv, 2004.

The thesis is devoted to the study of IFN system functional condition by means of a complex of evaluating tests, integrated by a notion “IFN status” in newborns with rotavirus infection and to interferonogenic properties of the agent.

The data on IFN status in newborns with clinically marked and asymptomatic rotavirus infection have been presented. The dynamics of endogenic IFN circulation and the ability of newborns blood leukocytes to production of a- and y-IFN depending on the disease period has been determined.

It has been established that in an acute period, newborns have an increase in serum IFN level and an inhibition of bloods leukocytes capacity to a- and y-IFN production. In the period of reconvalescence, the level of serum IFN was decreased, blood leukocytes interferon producing capacity did not reached the level, established for healthy newborns.

It was substantiated the use of recombination a₂-ІFN drugs in complex therapy of rotavirus infection in newborns.

Data on interferon properties of rotaviruses in experiment in vivo were received. It was determined that the presence of week interferonogenic properties in infectious active rotaviruses. Inactivation rotavirus SA-11 strain by macromolecular platinum complex, contributed to its increased interferonogenic features.

Key words: rotaviruses, rotavirus infection, recombination a₂-ІFN, interferon status, interferonogenic properties, platinum macromolecular complex, newborns.

Размещено на Allbest.ru