Залежність життєздатності та тривалості життя від особливостей раннього онтогенезу

Київ - 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті геронтології АМН України.

Науковий консультант: доктор медичних наук, професор, Войтенко Володимир Платонович,

Інститут геронтології АМН України, завідувач лабораторії математичного моделювання процесів старіння

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Об'єкти і методи досліджень: У популяційній частині дослідженні використані архівні записи ЗАГСів м. Києва. Всі особи, що включені до вибірки, були поділені на групи в залежності від причин смерті: захворювання органів системи кровообігу, злоякісні новоутворення, нещасні випадки/самогубства, інфекційні захворювання, захворювання органів дихання, захворювання органів травлення, захворювання сечостатевої системи, захворювання нервової системи, інші причини.

Експериментальна частина досліджень проведена на Drosophila melanogaster аутбредних лабораторних популяцій ліній Oregon-R і Canton-S. Виживаність комах на передімагінальних стадіях визначали як частку мух, які пройшли повний цикл розвитку (від яйця до імаго). Тривалість розвитку мух визначали як час (у годинах) від відкладання яєць до вильоту 50 % осіб у кожній з ємностей, де відбувався розвиток комах. Для визначення імагінальної тривалості життя використовували по 100-200 комах у кожній з експериментальних груп. Для кожної групи розраховували середню тривалість життя (СТЖ) і максимальну тривалість життя (МТЖ). З метою модифікації розвитку комах з подальшим вивченням впливу цих модифікацій на тривалість життя імаго використовували:

різні комбінації щільності личинкової популяції (< 500 личинок або > 2000 личинок у банці об'ємом 1,0 л) та імагінальної популяції (20 або 40 комах у склянці);

різні температури розвитку: 21, 23, 25, 27 і 29 ^oС;

нітрат алюмінію (Al(NO₃)_3*9H2O) у концентрації 1 г на 1 літр корму;

низькочастотні коливання атмосферного тиску (НЧКАТ).

Рентгенівське опромінення здійснювали на стадії яйця (у дозах 0,25, 0,50, 0,75, 1, 2 і 4 Гр) та личинки (у дозах 1,2, 2,1, 4,2, 7,5 та 17,1 Гр). Для оцінки життєздатності мух у кожній з експериментальних груп визначали:

масу тіла;

інтенсивність метаболізму;

індуковану локомоторну активність (фототаксис і геотаксис);

стійкість до голодування;

стійкість до теплового шоку;

репродуктивну активність самок (фекандильність і фертильність).

Біологічний вік комах визначали за допомогою набору тестів, до складу якого входили такі характеристики: індукована локомоторна активність, стійкість до теплового шоку та стійкість до голодування.

Для визначення впливу рентгенівського опромінення на стадії яйця на структурно-функціональні особливості геному імаго здійснювали електрофорез обробленої S1-нуклеазою ДНК. Об'єктом аналізу індукованих опроміненням реактивних ультраструктурних змін були тканини медіальної частини мозку, що межує з оком (lamina ganglionaris), а також центральної частини мозку, що входить до складу так званих “грибовидних тіл”.

Для статистичної обробки одержаних результатів використовували варіаційний, кореляційний і дисперсійний методи статистичного аналізу. З метою моделювання демографічних тенденцій D. melanogaster використано факторний аналіз, а також модель Гомперця. Визначення інтегральної життєздатності мух здійснювали за допомогою моделі біологічного віку, що була розроблена на основі методу множинної лінійної регресії.

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Залежність тривалості життя людей від місяця їх народження. У ряді досліджень, які були здійснені за останні роки, показано, що схильність до вікових захворювань та тривалість життя людей можуть залежати від умов раннього розвитку, зокрема, кліматичних факторів, що пов'язані із щорічними змінами сезонів. Для визначення впливу кліматичних факторів у ранньому онтогенезі на перебіг старіння та тривалість життя людей було здійснене вивчення залежності віку смерті мешканців м. Києва, які померли у період 1990-2000 років, від місяця їхнього народження. Досліджувана вибірка включала 101 634 особу (51 503 чоловіка і 50 131 жінку). За допомогою однофакторного дисперсійного аналізу (незалежна змінна - місяць народження), виявлено, що вік смерті значною мірою залежить від кліматичних факторів (чоловіки: F = 8,975, жінки: F = 9,662, p < 0,0001 в обох випадках ). Вік смерті у осіб, що народилися в середині року (квітень - липень) був значно меншим (табл. 1), ніж у народжених на початку і наприкінці року (жовтень - березень). Відмінності між мінімальними і максимальними значеннями середньомісячного віку смерті складали 2,6 роки для чоловіків і 2,3 роки для жінок.

Таблиця 1

Середній вік смерті (СВС) жителів Києва, які народилися у різні місяці року

Примітка. * - p < 0,02, ** - p < 0,001 у порівнянні з мінімальним рівнем (липень - для чоловіків і травень - для жінок).

Вплив факторів сезонної природи у ранньому онтогенезі на структуру вікової смертності. З-поміж усіх причин смерті, значимі розходження серед осіб, які народжені у різні місяці року, виявлені тільки щодо смертності від нещасних випадків і суїциду (табл. 2). Серед чоловіків, які народилися в другому кварталі року, частка осіб, що померли від цієї причини, становила 13,88 %, а в четвертому - 12,49 % від загальної кількості померлих (² = 10,24, p < 0,001); аналогічні показники в жінок складали 4,87 % серед народжених у другому кварталі і 3,81 % - у четвертому (² = 16,33, p < 0,001). Таким чином, особи, які народилися в четвертому кварталі, рідше гинули від нещасних випадків чи кінчали життя самогубством, ніж народжені в другому кварталі.

Таблиця 2

Частка померлих від окремих причин (%) від загальної кількості осіб, народжених у різні місяці року

Примітки: ІЗ - інфекційні захворювання, ЗН - злоякісні новоутворення, ЗОТ - захворювання органів травлення, ЗОД - захворювання органів дихання, ЗОК - захворювання органів кровообігу, ЗСС - захворювання сечостатевої системи, ЗНС - захворювання нервової системи, НВ/С - нещасні випадки/самогубства, ІП - інші причини.

Практично у всіх випадках (для всіх причин смерті), як у чоловіків, так і у жінок у дослідженій вибірці найбільшим виявився середній вік смерті людей, які народилися в IV кварталі року. Результати дослідження свідчать про те, що чинники кліматичної природи у ранньому онтогенезі “програмують” не схильність до певних вікових захворювань, а загальний рівень життєздатності і потенціал довгожительства як такий.

Зміни рівня смертності протягом індивідуального річного циклу. У дослідженій виборці виявлено так званий “ефект дня народження” - перевищення кількості померлих у день народження і у прилеглі до нього дні у порівнянні з середнім рівнем смертності у інші дні індивідуального річного циклу. Динаміка змін кількості померлих у різні місяці індивідуального річного циклу мала, як у чоловіків, так і у жінок, подібний “синусоїдальний” характер із приблизно піврічним періодом: піки смертності в чоловіків і жінок приходилися на кінець і початок індивідуального річного циклу (1-й і 12-й місяці), а також на середину індивідуального річного циклу (6-й місяць у чоловіків і 8-й - у жінок). Рівень смертності значною мірою залежав від місяця індивідуального річного циклу (чоловіки: F = 2,08, p < 0,05; жінки: F = 1,85, p < 0,05). Особливо вираженим було збільшення смертності в місяці перед і після дня народження.

“Ефект дня народження” був відсутній у осіб, які вмерли до 60-літнього віку (чоловіки: F = 0,87, p > 0,05; жінки: F = 0,57, p > 0,05), але є чітко виражений у людей, які прожили більш 60-ти років (чоловіки: F = 2,31, p < 0,01; жінки: F = 2,40, p < 0,01). Аналіз одержаних даних дозволяє припустити, що ймовірною причиною “ефекту дня народження” можуть бути періодичні зміни рівня здоров'я і стрес-реактивності у людей протягом індивідуального річного циклу, що пов'язані з імпринтуванням “стресу народження” у структурі біологічних ритмів організму.

Вплив експериментальних модифікацій розвитку на біологічний вік та тривалість життя імаго Drosophila melanogaster

Залежність тривалості розвитку та тривалості життя комах від температури розвитку. Відомо, що тривалість розвитку мух значною мірою залежить від температури. У нашому дослідженні збільшення температури у діапазоні від 21 до 29 ^oС призвело до зменшення тривалості розвитку і скорочення імагінальної тривалості життя самок ліній Oregon-R (OR) і Canton-S (CS) Факторний аналіз показника l_x (кількості осіб, що доживали до віку х) при різній температурі розвитку показав, що виживаність на ранніх і проміжних етапах життя

імаго сягала максимальних значень, якщо розвиток комах здійснювали в діапазоні температур 23-27 ^oС; найменш сприятливою для виживаності на ранніх і проміжних етапах життя імаго була температура 29 ^oС, а найбільш сприятливою для пізньої виживаності - 21 ^oС. З тривалістю розвитку корелював на рівні статистичної значимості тільки фактор пізньої виживаності (для лінії OR r = 0,58, для лінії CS r = 0,59, в обох випадках p < 0,01).

Вплив щільності популяції на личинковій і імагінальній стадіях онтогенезу на тривалість життя мух. Неодноразово продемонстровано, що тривалість життя D. melanogaster значною мірою залежить від щільності популяції (ЩП) на личинковій і імагінальній стадіях. У нашому дослідженні тривалість розвитку мух, що розвивалися в умовах перенаселення, була на 20-25 годин (тобто, на 8-10 %) більшою, ніж в умовах розвитку при нормальній ЩП. Збільшення ЩП на стадії імаго призводило до статистично достовірного зниження тривалості життя у комах, розвиток яких проходив в умовах низької ЩП на личинковій стадії. Збільшення ЩП на личинковій стадії призвело до збільшення тривалості життя мух, особливо вираженого у тому разі, коли комахи жили в умовах високої ЩП на імагінальній стадії. Такий результат може пояснюватися тим, що "стрес перенаселення" на личинковій стадії збільшує резистентність мух до наступного стресу аналогічної природи на стадії імаго. Результати дослідження свідчать про те, що індуковане "стресом перенаселення" на личинковій стадії збільшення резистентності до наступних стресів (і такого "неспецифічного стрес-синдрому", як старіння) є більш вираженим в умовах, що відрізняються від екологічного оптимуму (у даній ситуації - при підвищеній ЩП у імаго).

Вплив нітрату алюмінію на біологічний вік та тривалість життя імаго Drosophila melanogaster. Відомо, що використання чинників, які пошкоджують організм, у малих дозах може призводити до ефекту парадоксального стимулювання (гормезису). У нашому дослідженні горметичний ефект було виявлено при додаванні в корм комахам на передімагінальних стадіях нітрату алюмінію (за даними деяких досліджень, геропромотору) у дозі 1 грам на літр корму. Додавання у корм нітрату алюмінію призвело до збільшення середньої тривалості життя та максимальної тривалості життя комах. Виживання збільшувалося у самок насамперед на середніх (приблизно з 30 до 50 доби), а у самців на пізніх (після 50 доби) стадіях життя імаго. У комах обох статей виявлено суттєве збільшення максимальної тривалості життя у порівнянні з контролем. Як за окремими показниками життєздатності (до складу яких входили індукована локомоторна активність, стійкість до голодування та теплового шоку), так і за розрахованим на їх основі інтегральним показником біологічного віку, покращення показників після додавання у корм нітрату алюмінію спостерігалося у порівнянні з контролем перш за все на пізніх етапах життя комах. Отже, у комах, яким у корм на передімагінальних стадіях онтогенезу додавали нітрат алюмінію, відбувалися довгострокові адаптаційні зміни, які призводили до того, що вони не тільки жили довше, а й довше зберігали високу життєздатність, ніж інтактні мухи, причому у найбільшій мірі ефект парадоксальної стимуляції був виражений на пізніх етапах онтогенезу.

Вплив низькочастотних коливань атмосферного тиску на тривалість життя імаго Drosophila melanogaster у нормі та після теплового шоку. Застосування теплового шоку (60, 90 та 120 хв при 40 °С) на стадії яйця або практично не впливало на імагінальну тривалість життя, або дещо знижувало середню тривалість життя мух у порівнянні з контролем. При застосуванні після теплового шоку низькочастотних коливань атмосферного тиску у самців, навпаки, виявлено достовірне збільшення середньої тривалості життя у порівнянні з контролем. Це може свідчити про те, що ці коливання відіграють нормалізуючу роль у дезадаптованому організмі.

Вплив рентгенівського опромінення на стадії личинки на тривалість життя імаго Drosophila melanogaster. Рентгенівське опромінення на стадії личинки у дозах 1,2, 2,1, 4,2, 7,5 та 17,1 Гр призвело до зменшення середньої тривалості життя (СТЖ) комах, причому СТЖ зменшувалася у тим більшій мірі, чим більшою була доза опромінення (табл. 3). Достовірні відмінності від контролю (неопромінених комах) виявлені у самців починаючи з дози 7,5 Гр, а у самок - з дози 1,2 Гр. Максимальна тривалість життя (МТЖ) зменшувалася тільки у самців, які були опромінені в дозі 17,1 Гр, а при опроміненні самців у дозах 1,2, 2,1 та 4,2 Гр та самок у дозах 1,2 та 17,1 Гр виявлено статистично достовірне збільшення МТЖ у порівнянні з контролем. У опромінених комах, незалежно від дози опромінення, виявлено збільшення інтенсивності вікової смертності на ранніх стадіях онтогенезу імаго та зменшення - на пізніх у порівнянні з інтактними (неопроміненими) контрольними мухами.

Таблиця 3

Тривалість життя самок та самців Drosophila melanogaster після рентгенівського опромінення у різних дозах на стадії личинки, діб

Примітка: * - p < 0,01; ** - p < 0,001.

Можна припустити, що рентгенівське опромінення на стадії личинки призводило до протилежних ефектів у субпопуляціях комах з різним адаптаційним рівнем. З одного боку, для мух, що належали до “слабкої” субпопуляції, опромінення могло бути “дистресом”, внаслідок якого їх життєздатність зменшувалася і вони, хоча й проходили повний цикл розвитку, вимирали у більш ранні строки, ніж контрольні комахи. З іншого боку, для мух, які належали до “сильної” субпопуляції, опромінення у застосованих дозах могло бути “еустресом”, що призводило до довгострокових позитивних наслідків на імагінальній стадії.

Вплив рентгенівського опромінення на стадії яйця на життєздатність та тривалість життя імаго Drosophila melanogaster та їх нащадків. Рентгенівське опромінення в дозах 0,25 - 0,75 Гр призвело до зменшення маси тіла і підвищення індукованої локомоторної активності імаго. При опроміненні в дозі 0,5 Гр у самців виявлене збільшення стійкості до голодування і теплового шоку. Опромінення в дозах 0,25, 0,5 і 1 Гр призвело до збільшення середньої тривалості життя самців і в дозі 0,25 Гр - максимальної тривалості життя самок. Подібні тенденції виявлені й у поколінні F1: нащадки опромінених на стадії яйця батьків мали меншу масу тіла і більшу локомоторну активність, ніж нащадки неопромінених батьків. У ряді випадків у нащадків опромінених батьків у поколінні F1 виявлений гормезис за стрес-резистентністю і тривалістю життя. Біологічний вік у самців при опроміненні у дозах 0,25 та 0,50 Гр покращувався (зменшувався), а у самок при опроміненні у дозах 0,25, 0,75 та 1,00 Гр погіршувався (збільшувався). У поколінні F1 біологічний вік у самців і самок, опромінених у дозах 0,25 та 1,00 Гр покращувався у порівнянні з контролем. Одержані дані дозволяють припустити, що існує ймовірність довгострокового збереження індукованих стресом у ранньому онтогенезі змін спектра адаптивних реакцій.

Структурно-функціональні зміни ДНК імаго Drosophila melanogaster після рентгенівського опромінення на стадії яйця

Для вивчення асоційованих з довгостроковим гормезисним (стимулюючим) ефектом змін на молекулярному рівні вивчено структурно-функціональні зміни ДНК, що індуковані рентгенівським опроміненням на стадії яйця у дозах 0,25, 0,50, 0,75, 1,0, 2,0 і 4,0 Гр. При опроміненні у цьому дозовому діапазоні зниження тривалості життя імаго спостерігали тільки після опромінення у найбільшій дозі - 4 Гр. У ряді випадків виявлений гормезис за тривалістю життя: у самців опромінення в дозах 0,25, 0,75 і 1 Гр привело до достовірного збільшення середньої тривалості життя, в дозах 0,25 і 0,5 Гр - максимальної тривалості життя, у самок опромінення у дозах 0,25, 0,75 і 2 Гр збільшило максимальну тривалість життя. Аліквоти ДНК, що ізольовані з 5-6-добових імаго, обробляли S1-нуклеазою. Денситометричний аналіз електрофореграм ДНК продемонстрував, що в контролі дія S1-нуклеази призвела до зниження частки високомолекулярної ДНК на 39,2 %. ДНК опромінених мух виявилася значно більш стійка до дії ферменту, що, як і гормезис за тривалістю життя, могло бути наслідком активізації репараційної системи або зниження транскрипційної активності в клітинах опромінених комах.

Ультраструктурні модифікації клітин нервової системи імаго D. melanogaster після рентгенівського опромінення на стадії яйця

Про наявність змін у транскрипційній активності можуть свідчити зміни на клітинному (ультраструктурному) рівні. З метою аналізу таких змін було проведене електронно-мікроскопічне дослідження клітин мозку інтактних та опромінених на стадії яйця у дозі 0,75 Гр (де було виявлено найбільш виразний гормезисний ефект) комах. Зміни, що індуковані рентгенівським опроміненням у цій дозі у нейронах комах, свідчать про функціональне напруження клітин. Це виражається, насамперед, у гіперплазії основних елементів білоксинтезуючої системи клітин - канальців гранулярного ендоплазматичного ретикулуму та рибосом. У ряді клітин ступінь гіперплазії рибосом виявилась особливо значною, що створює враження переповнення цитоплазми цими органелами, внаслідок чого клітина здається електроннотемною.

Таким чином, аналіз змін на молекулярному та ультраструктурному рівнях дозволяє висловити припущення, що рентгенівське опромінення у ранньому онтогенезі у діапазоні малих доз призводило до активізації біосинтетичної активності у клітинах імаго, отже, найбільш вірогідною причиною виявленого горметичного ефекту може бути пролонгована активізація репараційної системи.

Розбіжності у прояві гетерозису між реципрокними міжлінійними гібридами Drosophila melanogaster

При реципрокних схрещуваннях Drosophila melanogaster трьох інбредних ліній: Oregon-R (OR), Canton-S (CS) і Умань (Ум), які відрізняються за тривалістю життя, виявлені розбіжності у прояві гетерозису між міжлінійними гібридами (табл. 4). Чіткий гетерозисний ефект як за середньою тривалістю життя (СТЖ), так і за максимальною тривалістю життя (МТЖ) був виявлений у більшості одержаних гібридів. Або в обох гібридів (при прямому і реципрокному схрещуванні інбредних ліній OR і CS, а також CS і Ум), або в одного з них (при схрещуванні ліній OR і Ум) виживаність була вищою, ніж в обох інбредних предків (в усіх варіантах схрещування першими позначені самки). У гібридів, одержаних при прямому і реципрокному схрещуваннях ліній Canton-S і Умань, а також Oregon-R і Умань, виявлено виражений материнський ефект відносно середньої тривалості життя: більш довгоживучими були ті гібридні комбінації, в яких більш довгоживучими були матері. Наявність подібних розбіжностей між реципрокними гібридами може свідчити про залежність гетерозисного ефекту від факторів нехромосомної природи.

Таблиця 4

Тривалість життя самців і самок інбредних ліній і гібридів Drosophila melanogaster, діб

Взаємозв'язок між репродуктивною активністю і тривалістю життя самок Drosophila melanogaster

Результати дослідження взаємозв'язків між показниками, які характеризують репродуктивну активність самок Drosophila melanogaster на різних етапах життя та їх тривалістю життя свідчать про відсутність очікуваних у відповідності до гіпотез усуваної соми та антагоністичної плейотропії негативних кореляцій між показниками, які характеризують ранню репродуктивну активність мух, та строками їх імагінального життя. Виявлено, що, якщо у загальній виборці комах збільшення репродуктивої активності самок асоціюється зі збільшенням індивідуальної тривалості життя (ІТЖ), то у комах, ІТЖ яких перевищує 80 діб - зі зменшенням ІТЖ. Така різка зміна тенденцій у довгоживучих комах у порівнянні з загальною виборкою може свідчити про те, що вони належать до специфічної субпопуляції мух. До віку 30 діб середня добова фертильність (СДФ) у комах з різними значеннями ІТЖ практично не відрізнялася, але потім зниження СДФ відбувалося набагато швидшими темпами у мух з меншими значеннями показника ІТЖ. Таким чином, аналіз показників, які характеризують репродуктивний потенціал комах, дозволяє припустити, що мухи з великими значеннями показника ІТЖ ("довгожителі") відрізняються від мух з малими значеннями показника ІТЖ ("короткожителів") не меншою (або більшою) репродуктивною активністю у певні періоди життя, а різною динамікою її вікових змін.

смертність діабет захворювання

У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення проблеми залежності життєздатності та тривалості життя від чинників раннього розвитку, здійснене вивчення молекулярних та клітинних механізмів, які зумовлюють асоціацію між ранніми та пізніми етапами онтогенезу організму.

Вік смерті в осіб, що народилися на початку і наприкінці року (жовтень - березень) значно перевищує відповідні показники у людей, що народилися в середині року (квітень - липень). Відмінності між мінімальними і максимальними середньомісячними значеннями віку смерті складають 2,6 роки для чоловіків і 2,3 роки для жінок.

Суттєвих відмінностей у структурі смертності серед людей, що народилися у різні місяці року, не виявлено; практично у всіх випадках (для всіх причин смерті), як у чоловіків, так і у жінок найбільшим виявився середній вік смерті людей, що народилися у IV кварталі року.

Рівень смертності характеризується періодичними змінами протягом індивідуального річного циклу; найвищим є рівень смертності у період, що межує з днем народження людей.

Розвиток Drosophila melanogaster в умовах підвищеної щільності личинкової популяції приводить до подовження тривалості життя імаго, особливо вираженого у тому разі, якщо комахи живуть в умовах високої щільності популяції на імагінальній стадії.

Вайсерман А.М., Кошель Н.М., Войтенко В.П. Взаимосвязь репродуктивной активности и продолжительности жизни Drosophila melanogaster // Пробл. старения и долголетия.- 2001.- 10, № 1.- 11-21 (Дисертанту належить розробка робочої схеми експерименту, дані щодо репродуктивної активності та тривалості життя самок Drosophila melanogaster, аналіз і узагальнення результатів досліджень, написано текст статті).

Вайсерман А.М., Кошель Н.М., Белая И.И., Войтенко В.П. Продолжительность жизни людей зависит от месяца их рождения // Пробл. старения и долголетия.- 2001.- 10, № 4.- 360-367 (Дисертанту належить розробка робочої схеми дослідження, демографічні дані щодо смертності людей, аналіз і узагальнення результатів досліджень, написано текст статті).

Кошель Н.М., Вайсерман О.М., Савінова В.А., Войтенко В.П. Температурні модифікації радіаційного ефекту у Drosophila melanogaster // Вісник Черкаського ун-ту. Біол. науки.- 2002.- вип. 32.- С. 92-97 (Дисертанту належить участь у плануванні і проведенні експерименту, аналіз і узагальнення результатів досліджень, написання тексту статті).

Вайсерман А.М. Влияние месяца рождения на структуру смертности жителей Киева (1990-2000 гг.) // Пробл. старения и...