Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ`Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

УДК: 615.322.:582.734.4.

ФАРМАКОГНОСТИЧНЕ ВИВЧЕННЯ ПАГОНІВ ОЖИНИ СИЗОЇ ТА СТВОРЕННЯ НА ЇЇ ОСНОВІ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ

15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Гісцева Ольга Аркадіївна

Харків - 2005

АНОТАЦІЯ

Гісцева Ольга Аркадіївна. “Фармакогностичне дослідження пагонів ожини сизої та створення на її основі лікарських засобів”. - Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата фармацевтичних наук за фахом 15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія. Національний фармацевтичний університет, Харків, 2005.

Вперше проведено систематичне фітохімічне і фармакологічне вивчення пагонів ожини сизої флори України. Визначено присутність вуглеводів, амінокислот, аскорбінової кислоти, фенольних сполук: гідроксиксикоричних та гідроксибензойних кислот, флавоноїдів, дубильних речовин. Досліджено якісний склад та кількісний вміст різних груп БАР у сировині та лікарських засобах.

З пагонів ожини сизої виділено та встановлена структура 16 індивідуальних сполук: 2- похідні гідроксибензоїної кислоти, 6- похідні гідроксикоричної кислоти, 8- похідні флавоноїдів (3- аглікони флавоноїдів та 5- глікозиди флавоноїдів), а також визначено 16 амінокислот, 6 жирних кислот, 22 мікро - та макроелементів.

Вперше проведена динаміка накопичення БАР: суми флавоноїдів, окиснювальних поліфенолів, аскорбінової кислоти. Визначений термін заготівлі сировини.

Вперше досліджено капілярозміцнювальна, мембраностабілізувальна та гемостатична дії настою з пагонів ожини сизої (1:10), кровоспинного збору, сухого екстракту. Ліпофільний екстракт має помірно виражену бактеріостатичну активність у відношенні до грампозитивних та грамнегативних мікроорганізмів

Ключові слова: ожини сиза, фармакогностичне вивчення, гідроксикоричні кислоти, флавоноїди, амінокислоти, жирні кислоти, мінеральні речовини, капілярозміцнювальна, мембраностабілізувальна, гемостатична активність.

Гисцева Ольга Аркадьевна. “Фармакогностическое исследование побегов ежевики сизой и создание на ее основе лекарственных средств”. - Рукопись.

Диссертация на получение ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия. Национальный фармацевтический университет, Харьков, 2005.

Впервые проведено систематизированное фитохимическое и фармакологическое изучение побегов ежевики сизой флоры Украины. Установлено наличие разных групп БАВ: углеводов, аминокислот, аскорбиновой кислоты, фенолкарбоновых кислот, гидроксикоричных кислот, дубильных веществ, флавоноидов. Методом колоночной хроматографии на полиамиде, бумажной, тонкослойной и препаративной хроматографии выделено и установлена структура 16 веществ: 2 - производные гидроксибензойной кислоты, 6 - производные гидроксикоричной кислоты, 8 - производные флавоноидов.

Впервые определено количественное содержание гидроксикоричных кислот, аминокислот, жирных кислот, окисляемых полифенолов, флавоноидов, аскорбиновой кислоты, макро - и микроелементов, а также их содержание по фазам вегетации, которые позволили определить благоприятный период для сбора сырья. Полученные данные использованы в разработке АНД на “Побеги ежевики сизой”, “Сухой экстракт”, “Кровоостанавливающий сбор”.

Впервые определен элементный состав побегов ежевики сизой - 22 микро- и макроэлементов, среди эссенциальных элементов найдены Mn, Cu, Pb, Ni, Co, Mo, Zn, Sr, Fe, Sn, Ag, Cd, As, Hg, Cr. Впервые изучен аминокислотный состав, определено количественное содержание 16 аминокислот. В побегах ежевики сизой преобладают следующие аминокислоты: пролин (1,48% - 3,37%), глутаминовая кислота (1,22% - 1,39%) и аспарагиновая кислота (0,71% - 1,19%). Общее содержание аминокислот в побегах ежевики сизой колебается в пределах 10,25% - 12,04%, содержание незаменимых аминокислот составляет 4,2% - 4,43%, заменимых аминокислот 5,82% - 7,84%.

Впервые изучен жирнокислотный состав побегов ежевики сизой. Определено количественное содержание ненасыщенных жирных кислот - 57,94 %, среди которых значительную часть составляет -линоленовая кислота - 40,82%. Содержание насыщенных жирних кислот - 31,99%, большая часть которой приходится на лауриновую кислоту-15,95% и миристиновую кислоту-16,04%.

Впервые проведены морфолого-анатомические исследования надземных органов ежевики сизой и выявлены основные диагностические признаки сырья, которые использованы в разработках АНД.

Проведенный фармакологический скрининг настоя побегов ежевики сизой (1:10) показал, что он обладает гемостатическими капилляроукрепляющими, мембраностабилизирующими свойствами. Впервые проведен микробиологический скрининг липофильного экстракта из побегов ежевики сизой, выявлена умеренно бактериостатическая активность экстракта по отношение к грамм - положительным и грамм - отрицательным микроорганизмам.

Разработана технология получения сухого экстракта и проведена его стандартизация. Для сухого экстракта было определено количественное содержание групп БАВ: для БПСК составил 2,6%, полифенолов - 5,4%, для флавоноидов 0,84%. Определена фармакологическая активность сухого экстракта. Выявлено, что экстракт в дозе 7 мл/кг оказывает умеренно выраженную гемостатическую активность. Разработана технология получения и состав кровоостанавливающего сбора, определены технологические параметры сырья, входящие в сбор, определены основные группы БАВ для водного извлечения сбора. Получен декларационный патент Украины на изобретение “Лечебное средство с капилляроукрепляющим, мембраностабилизирующим и кровоостанавливающим действием” (№ 58820А від 15.08.2003р.)

По результатам исследований разработаны 3 проекта АНД на “Побеги ежевики сизой”,

“Сухой экстракт” “Сбор кровоостанавливающий”. Результаты исследований внедрены в учебный процесс Национального фармацевтического университета, Института повышения квалификации спецалистов фармации НфаУ, Запорожского государственного медицинского университета, Винницкого национального медицинского университета им. М.И.Пирогова.

Ключевые слова: ежевика сизая, фармакогностическое изучение, гидроксикоричные кислоты, флавоноиды, аминокислоты, жирные кислоты, минеральные вещества, капилляроукрепляющая, мембраностабилизирующая, гемостатическая активность.

Gisceva Olga Arkadievna. Pharmacognostic study of Rubus caesius leaves and formulation of medicines on its basis. - Manuscript.

Thesis for the candidate of pharmaceutical science Degree in specialty 15.00.02 - pharmaceutical chemistry and pharmacognosy. National University of Pharmacy, Kharkiv, 2005.

For the first time the systematic photochemical and pharmacological study of the blackberry of the Ukraine flora was made. The presence of carbohydrates, amino acids, ascorbic acid phenol compounds: hydroxycinnamine and hydroxycarbolic acids, flavonoids, tannins was determined. The qualitative composition and quantitative content of the BAS of different groups in the raw material and medicines.

16 individual compounds (2 derivatives of hydroxybenzoic acid, 6 derivatives of hydroxycinnamine acid, 8 - derivatives of flavonoids and 5 derivatives of flavonoid glycosides) were isolated from the leaves of the blackberry and their structure was determined; 16 amino acids, 6 fat acids, 22 macro- and microelements were determined as well.

For the first time the dynamics of BAS accumulation was studied: flavonoids in total, oxidizing polyphenols, ascorbic acid. The terms of raw materials stocking are determined.

For the first time the capillary-strengthening, membrane stabilizing and haemostatic action of Rubus caesius leaves infusion (1:10) is studied, as well as haemostatic composition and dry extract. The lipophilic extract displays moderately expressed bacteriostatic activity with respect to gram-positive and gram-negative bacteria.

Keywords: Rubus caesius, pharmacognostic study, hydroxycinnamine acids, flavonoids, amino acids, fat acids, mineral substances, capillary-strengthening, membrane stabilizing and haemostatic activity.

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі фармакогнозії Національного фармацевтичного університету Міністерства охорони здоров'я України.

Науковий керівник: доктор фармацевтичних наук, професор КОВАЛЬОВ ВОЛОДИМИР МИКОЛАЙОВИЧ Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри фармакогнозії.

Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, професор СЕРБІН АНАТОЛІЙ ГАВРИЛОВИЧ Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри медичної ботаніки;

доктор фармацевтичних наук, професор ДОЛЯ ВІКТОР СЕМЕНОВИЧ Запорізький державний медичний університет, завідувач кафедри фармакогнозії

Провідна установа: Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика, Кафедра фармацевтичної хімії та фармакогнозії

Захист відбудеться “_25” листопада 2005 року о 12⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої Вченої ради Д64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002 м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).

Автореферат розісланий “22” жовтня 2005 року.

Вчений секретар спеціалізованої Вченої ради, д. біол. н.,проф. Л.М Малоштан .

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Пошук та створення лікарських препаратів рослинного походження - одна з найважливіших задач фармацевтичної науки. Цілеспрямований пошук природних біологічно активних субстанцій, вивчення їх фізико-хімічних та фармакологічних характеристик є головним напрямком вирішення цієї проблеми. Використання лікарських рослин у вигляді настоїв та відварів для лікування і профілактики хронічних захворювань у людей похилого віку особливо актуально в зв'язку зі змінами вікової структури населення. За прогнозами ВООЗ до кінця 2005 року 45% населення будуть складати жінки в періоді менопаузи. В клімактерії, в період переходу від зрілості до похилого віку, на фоні змін в організмі виникає необхідність прийому фітопрепаратів, які діють м'яко, не викликають побічних дій та підтримують стійкий фармакологічний ефект. Частим ускладненням клімаксу є ациклічні маткові кровотечі. Пошук альтернативних методів лікування клімактеричних розладів проводиться постійно. У рослинах біологічно активні речовини (БАР) знаходяться у оптимальних співвідношеннях, що створювалися в процесі еволюції при взаємодії організму з навколишнім середовищем.

Основний фармакологічний ефект може потенціюватися речовинами первинного біосинтезу - вуглеводами, білками та ліпідами, - а також продуктами вторинного біосинтезу. До них належать різні хімічні групи: фенольні сполуки, терпеноїди, які беруть участь у процесах обміну речовин та виконують важливі для рослин функції.

З літературних даних відомо, що рослини роду Rubus містять дубильні речовини, фенолкарбонові кислоти та флавоноїди, які мають широкий спектр фармакологічної активності. Флавоноїди та поліфеноли мають тенденцію до накопичення у значних кількостях, що дає можливість розглядати рослини як джерело цих речовин.

Необхідність комплексного використання рослин та наявність достатньої сировинної бази пояснює зацікавленість до вивчення дикоростучих рослин, а також недостатнє хімічне та фармакологічне вивчення надземної частини стали підставою для проведення наших досліджень. У зв'язку з цим як об'єкт дослідження нами була обрана рослина - Ожина сиза (Rubus caesius L.) родини розових (Rosaceae).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планом науково-дослідних робіт Національного фармацевтичного університету за темою “Створення нових лікарських препаратів на основі рослинної та природної сировини, зокрема продуктів бджільництва, для дорослих і дітей” (№ державної реєстрації 0198U007008) і проблемної комісії “Фармація” МОЗ України.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було вивчення біологічно активних речовин пагонів ожини сизої та створення на їх основі лікарського засобу кровоспинної дії.

Для досягнення цієї мети були поставлені наступні задачі:

· проаналізувати та узагальнити сучасні дані літератури з питань лікування маткових кровотеч в період менопаузи;

· провести аналіз асортименту фітопрепаратів для профілактики та лікування ускладнень в клімактеричний період;

провести фітохімічне вивчення якісного складу і визначити кількісний вміст основних груп БАР в пагонах ожини сизої;

виділити індивідуальні природні сполуки та встановити їх структуру;

одержати природні комплекси з пагонів ожини сизої та вивчити їх біологічну активність;

визначити амінокислотний та мікроелементний склад досліджуваної сировини;

встановити морфолого-анатомічні ознаки пагонів ожини сизої;

розробити збір з досліджуваної сировини, методи його ідентифікації та аналізу, вивчити його фармакологічну активність;

розробити проекти АНД на сировину пагонів ожини сизої, сухий екстракт та збір кровоспинний.

Об'єкти дослідження. Рослинний комплекс з пагонів ожини сизої, фітозасоби на її основі. лікування кровотеча менопауза фітопрепарат

Предмет дослідження. Вивчення хімічного складу та фізико - хімічних властивостей БАР, визначення фармакологічної активності природних комплексів БАР у водних витягів з сировини; встановлення морфолого-анатомічних ознак пагонів ожини сизої.

Методи дослідження. Якісний і кількісний вміст БАР визначали фармакопейними методами, використовували тонкошарову хроматографію (ТШХ) і паперову хроматографію

(ПХ), застосовували специфічні якісні реакції. Для розділення БАР використовували коло-ночну хроматографію на поліамідному сорбенті і препаративну хроматографію на папері. Хімічну будову виділених сполук встановлювали на основі їх хімічних перетворень, а також з використанням даних УФ- та ІЧ-спектрів. Фармакологічні дослідження проводили in vivo. Анатомічне вивчення та фотографування зрізів вегетативних органів досліджуваної сировини проводили під мікроскопом МБІ-6 з подальшим фотографуванням фотоапаратом “ФЕД-5В” на плівці “Мікрат-200”, “Мікрат-300”.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено систематичне фітохімічне і фармакологічне вивчення пагонів ожини сизої флори України. Визначено присутність вуглеводів, амінокислот, аскорбінової кислоти, фенольних сполук: гідроксикоричних та фенолкарбонових кислот, флавоноїдів, дубильних речовин.

В індивідуальному стані з вегетативних органів ожини сизої виділено 16 речовин, які відносяться до похідних гідроксибензойної кислоти (2), гідроксикоричних кислот (6), флавоноїдів (8).

Вперше визначений кількісний вміст БПСК, хлорофілів, амінокислот, жирних кислот, аскорбінової кислоти, мікро- та макроелементів, гідроксикоричних та гідроксибензойних кислот, суми поліфенолів, що окиснюються, флавоноїдів у пагонах ожини сизої.

Вперше проведено вивчення вмісту основних груп біологічно активних речовин пагонів ожини сизої в залежності від строку заготівлі і місця зростання рослини. Встановлені основні анатомо-діагностичні ознаки пагонів ожини сизої.

Розроблена технологія одержання фармакологічних комплексів з пагонів ожини сизої - сухого екстракту та кровоспинного збору, проведено визначення в них кількісного вмісту деяких груп БАР. Вивчена капілярозміцнювальна, мембраностабілізувальна та гемостатична дія in vivo водних витягів сировини та збору. Новизна досліджнь підтверджена та захищена деклараційним патентом України на винахід № 58820А від 15.08.2003р. (Бюл. №8).

Практичне значення отриманих результатів. Одержані фітохімічні та фармакологічні дані вказують на можливість застосування пагонів ожини сизої, сухого екстракту і збору для лікування і профілактики клімактеричних ускладнень.

За результатами вивчення накопичення біологічно активних речовин розроблена інструкція із заготівлі та сушці сировини.

За результатами проведених досліджень розроблені проекти АНД на “Пагони ожини сизої”, “Сухий екстракт” та “Кровоспинний збір”.

Результати досліджень впроваджені в навчальний процес Національного фармацевтичного університету на кафедрах медичної ботаніки, хімії природних сполук; Інституту підвищення кваліфікації спеціалістів фармації НФаУ на кафедрі якості, стандартизації та сертифікації ліків; фармацевтичних факультетів Запорізького державного медичного університета, Вінницького національного медичного університету ім. М.І.Пирогова.

Особистий внесок здобувача:

проведений аналіз літературних даних по розповсюдженню, хімічному складу та використанню пагонів ожини сизої;

виділені та визначені основні групи БАР: амінокислоти, гідроксикоричні та фенолкарбонові кислоти, флавоноїди, дубильні речовини, визначена динаміка накопичення флавоноїдів, аскорбінової кислоти та поліфенолів, що окиснюються;

встановлено кількісний вміст білково-полісахаридного комплексу, амінокислот, хлорофілів. аскорбінової кислоти, гідроксикоричних кислот, дубильних речовин, флавоноїдів.

ідентифікована та встановлена будова 16 речовин фенольної природи;

вивчена морфолого-анатомічна будова вегетативних органів ожини сизої

визначена динаміка накопичення основних груп БАР у сировині

отримано та проаналізовано сухий екстракт з цієї сировини;

розроблено кровоспинний збір з пагонами ожини сизої;

розроблені проекти АНД на “Пагони ожини сизої”, “Сухий екстракт”, “Кровоспинний збір”.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи викладені та обговорені на науково-практичній конференції “Досягнення сучасної фармації та перспективи її розвитку у новому тисячолітті”, матеріали V національного з'їзду фармацевтів України (Харків, 1999), “Вчені України - вітчизняній фармації” (Харків, 2000), Всеукраїнській науково-практичній конференції “Фармація ХХІ століття” (Харків, 2002), Науковій конференції студентів та молодих вчених з міжнародною участю (Вінниця, 2004), Міжнародній науковій конференції, присвяченій 100- річчю створення фармацевтичного факультету Запорізького державного медичного університету “Історія та перспективи розвитку фармацевтичної науки і освіти” (Запоріжжя, 2004), науково - практичній конференції “Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономіка лікарських засобів та біологічно активних добавок” (Тернопіль, 2004), матеріали VI національного з'їзду фармацевтів України (Харків, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 наукових праць, в тому числі 4 статті у фахових наукових виданнях та 6 тез доповідей, 1 патент.

Структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 148 сторінках друкованого тексту і складається зі вступу, 3 розділів власних досліджень, загальних висновків, списку використаних літературних джерел, додатків. Робота ілюстровано 39 таблицями, 3 схемами, 39 рисунками. Бібліографія включає 188 джерел літератури, у тому числі 49 іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Ботанічна характеристика, хімічний склад і застосування у науковій і народній медицині ожини сизої.

Проведений аналіз літературних даних свідчить, що хімічний склад вегетативних органів ожини сизої (Rubus caesius L.) флори України практично не вивчений, не визначено оптимальні терміни заготівлі ЛРС. Пагони ожии сизої використовують в народній медицині як кровоспинний, антисептичний засіб. Найбільше інформації існує про хімічний склад плодів ожини, які використовують як харчовий та дієтичний продукт. Фармакогностичне вивчення цієї сировини з метою створення лікарських засобів має теоретичний та практичний інтерес.

Використання зборів з ЛРС є перспективним напрямком у лікуванні та профілактиці маткових кровотеч у клімактеричний період. Актуальною проблемою є розробка методів аналізу та стандартизації сировини та кровоспинних зборів .

Попереднє визначення, виділення та хімічне вивчення біологічно активних речовин ожини сизої

Об'єктом наших досліджень були пагони ожини сизої, які заготовлені у різних регіонах України: Харківська область, Карпати, Крим протягом 1999 - 2004 р.р.

За результатами фітохімічного аналізу в пагонах ожини сизої флори України встановлена наявність каротиноїдів (9), серед яких 5 належить до похідних в-каротиноїдів та 4 до похідних ксантофілу, хлорофілів (2), гідроксикоричних кислот (6), вільних амінокислот (16), вільних (6) та зв'язаних цукрів (4), гідроксибензойних кислот (2), флавоноїдів(8).

Для виділення БАР і розділення їх на індивідуальні сполуки використовували методи рідинної екстракції, колонкової хроматографії на силікагелі, поліаміді, паперову, тонкошарову та препаративну хроматографію. Виділено і встановлена будова 16 речовин: 2- похідні гідроксибензойної кислоти, 6- похідні гідроксикоричної кислоти, 8- похідні флавоноїдів

Фізико-хімічні властивості виділених речовин наведені у табл.. 1.

Таблиця 1

Фізико-хімічні властивості речовин, виділених з пагонів ожини сизої

№ п/п	Речовини	Загальна формула	ТТОПЛ 0С	Молекулярна маса	Система	Rf
1	2	3	4	5	6	7
1	2.12. Галова кислота (3,4,5-тригідроксибензойна кислота)	С7Н6О5	253-255	170,20	А В	0,65 0,44
2	2.13. Елагова кислота (ділактон гексагідроксидифенової кислоти)	С14Н6О5	360-362	302,20	А В	0,33 0,82
3	2.14. Кавова кислота (3,4- дигідроксикорична кислота)	С9Н8О4	195- 197	199,40	А В	0,81 0,32
4	2.15. Ферулова кислота (3-метокси-4-гідроксикорична кислота)	С10Н10О4	168- 170	194,50	А В	0,88 0,55
5	2.16. Хлорогенова кислота (5-0-кофеїл-D-хінна кислота)	С16Н18О9	203- 205	353,20	А В	0,62 0,70
6	2.17. Неохлорогенова кислота (3-0-кофеїл-D-хінна кислота)	С16Н18О9	Аморф	354,31	А В	0,54 0,75
7	2.18 Ізохлорогенова кислота(4-0-кофеїл-D-хінна кислота).	С16Н18О9	Аморф	516,50	А В	0,50 0,55
8	2.19. n-кумарова кислота (4-гідроксикорична кислота)	С9Н6О3	212- 213	180,50	А В	0,90 0,60
9	2.20. Кемпферол (3,5,7,4'-тетраоксифлавон)	С15Н10О6	274- 276	453,23	А Б	0,79 0,10
Продовження табл.1
10	2.21. Лютеолин (5,7,3',4'-тетрагідроксифлавон)	С15Н10О6	232- 241	286,22	А Б	0,67 0,41
11	2.22.Кверцетин (3,5,7,3',4-пентагідроксифлавон)	С15Н10О6	309- 311	302,22	А Б	0,71 0,44
12	2.23. Ізокверцитрин (кверцетин-3-0-в-D-глікопіранозид )	С21Н20О12	238-241	465,40	А Б	0,63 0,39
13	2.24. Астрагалін (кемпферол - 3-0-в-D-глюкопіранозид)	С21Н20О11	173-176	448,23	А Б	0,81 0,38
14	2.25.Кемпферол-3-арабінозид (кемпферол - 3-0-б-L-арабофуранозид )	С15Н10О6	227-229	415,80	А Б	0,87 0,43
15	2.26.Гіперозид (кверцетин -3-0-в-D-галактопіранозид	С21Н20О12	244- 246	464,38	А Б	0,68 0,23
16	2.27. Рутин (кверцетин-3-0-в-D-рутинозид)	С27Н30О16	191- 192	610,53	А Б	0,55 0,43

*Системи розчинників: А-н-бутанол-оцтова кислота-вода (4:1:2); Б-15%-оцтова кислота; В-2% оцтова кислота.

Структуру виділених речовин встановлено на підставі фізичних, фізико-хімічних та хімічних методів аналізу

Гідроксибензойні кислоти. Речовини 2.12 та 2.13 за допомогою якісних реакцій, даних хроматографічного аналізу, хімічних перетворень віднесені до похідних галової кислоти, що підтверджується даними УФ - спектрів. На підставі фізико-хімічних досліджень ідентифікували речовину 2.12 як 3,4,5 - тригідроксибензойну кислоту або галову кислоту, речовину 2.13 як ділактон гексагідроксидифенової кислоти або елагову кислоту.

Похідні гідроксикоричної кислоти. Речовини 2.14-2.19 дають позитивну реакцію з розчином хлориду заліза (ІІІ), що свідчить про їх фенольну природу. При хроматографуванні речовини 2.14 - 2.19 мають в УФ-світлі блакитне забарвлення різної інтенсивності, яке змінюється в зелене-блакитне під дією парів аміаку, що характерно для похідних гідроксикоричної кислоти. Належність цих речовин до гідроксикоричних сполук підтверджена даними спектральних досліджень в УФ-області з характерними для цієї групи максимумами поглинання у діапазоні хвиль при 310-325 та 228-245 нм.

В продуктах лужної деструкції речовин 2.14 (кофейна кислота), 2.16 (хлорогенова кислота), 2.17 (неохлорогенова кислота), 2.18 (ізохлорогенова кислота) знайдено 3,4-діоксибензойна (протокатехова) кислота, речовини 2.15 (ферулова кислота) - ванілінова кислота, речовини 2.19 (n-кумарова кислота) - n -гідроксибензойна кислота. Лужний гідроліз речовин 2.16, 2.17, 2.18 приводить до утворення еквімолекулярних кількостей кофейної і D-хінної кислот. Місце приєднання кофейної кислоти до D-хінної кислоти встановлено лактонізацією речовин 2.16, 2.17, 2.18.

На підставі проведених досліджень і результатів порівняння з вірогідними зразками речовина 2.14 ідентифікована як 3,4-дигідроксикорична кислота (кавова кислота), 2.15 - ідентифікована як 3-метокси -4 - гідроксикорична кислота (ферулова кислота), речовина 2.16 - ідентифікована як 5-0-кофеїл-D-хінна кислота ( хлорогенова кислота), речовина 2.17 - 3-0- кофеїл-D-хінна кислота (неохлорогенова кислота), речовина 2.18 - 4-0-кофеїл-D-хінна кислота (ізохлорогенова кислота), речовина 2.19 - 4 - гідроксикорична кислота (n - кумарова кислота).

Похідні флавоноїдів. Флавоноїдна природа речовин 2.20-2.27 підтверджується ІЧ - спектрами, у яких відмічені смуги поглинання в області 3370-3200 см-1(фенольні гідроксигрупи), 1659 - 1665 см-1 (карбонільна група г - пірону) 1615,1600,1568 і 1510 см-1(валентні коливання ароматичних кілець).

Результати якісних реакцій та УФ - спектроскопії свідчать про належність досліджуваних речовин до похідних флавоноїдів.

За рухомістю на хроматограмах в різних системах розчинників та за результатами ціанідінової проби за Бріантом речовини 2.20 - 2.22 віднесені до агліконів, речовини 2.23-2.27 - до глікозидів. Схема хімічних перетворень на прикладі речовини 2.25 представлена на рис.1.

Рис 1. Схема хімічних перетворень моноглікозидів флавонолу на прикладі кемпферол-3-0-б-L-арабофуранозиду (речовина 2.25)

Таким чином, за даними фізико - хімічних досліджень, УФ - та ІЧ - спектроскопії, аналізу продуктів лужної деструкції, кислотного гідролізу, ацетилювання, метилювання ідентифіковано в порівнянні з вірогідними зразками: речовину 2.20 як 3,5,7,4'-тетраоксифлавон (кемпферол), речовину 2.21 як 5,7,3',4'-тетраоксифлавон (лютеолін), речовину 2.22 як 3,5,7,3',4'-пентаоксифлавон (кверцетин), речовину 2.23 як кверцетин-3-0-в-D-глюкопіранозид (ізокверцитрин), речовину 2.24 як кемпферол - 3-0-в-D-глюкопіранозид (астрагалін), речовину 2.25 як кемпферол - 3-0-б-L-арабофуранозид, речовину 2.26 як кверцетин-3-0-в-D-галактопіранозид (гіперозид), а речовину 2.27 як кверцетин-3-0-в-D-рутинозид (рутин). Вперше з виду Rubus caesius виділені речовини 2.20-2.27.

Визначення кількісного вмісту деяких груп біологічно активних речовин в пагонах ожини сизої

Вперше визначений кількісний вміст БПСК, амінокислот, аскорбінової кислоти, хлорофілу, гідроксикоричних кислот, суми поліфенолів, що окиснюються, флавоноїдів.

Визначено кількісний вміст 16 амінокислот у 3 зразках сировини. Результати досліджень наведені в таблиці 2.

Таблиця 2

Кількісний вміст амінокислот у пагонах ожини сизої.

№ п/п	Назва амінокислоти	Формула	Rf БОВ (4:1:2)	Вміст на суху масу , %
				Зразок № 1	Зразок № 2	Зразок №3
1.	Аспарагінова кислота	C4H3O2N2	0,09	1,190	0,921	0,716
2	Треонін	C4H9O2N	0,18	0,554	0,534	0,546
3	Серін	C3H7O3N	0,15	0,821	0,590	0,620
4	Глутамінова кислота	C5H9O2N	0,13	1,387	1,221	1,227
5	Пролін	C5H9O2N	0,24	2,835	1,485	3,376
6	Гліцин	C2H5O2N	0,21	0,528	0,502	0,514
7	Аланін	C4H3O3N2	0,20	0,755	0,736	0,665
8	Валін	C5H11O2N	0,43	0,538	0,632	0,520
9	Метіонін	C5H11O2NS	0,39	0,291	0,291	0,287
10	Ізолейцин	C6H13O2N	0,72	0,385	0,446	0,407
11	Лейцин	C6H13O2N	0,64	0,823	0,826	0,819
12	Тирозин	C9H11O3N	0,57	0,319	0,360	0,346
13	Фенілаланін	C9H11O2N	0,32	0,522	0,540	0,530
14	Гістидин	C6H9O2N3	0,10	0,227	0,216	0,222
15	Лізин	C6H13O2N	0,05	0,476	0,482	0,502
16	Аргінін	C6H13O2N	0,04	0,387	0,465	0,505
Загальний вміст амінокислот	12,04	10,25	11,80
Незамінних амінокислот	4,20	4,43	4,34
Замінних амінокислот	7,84	5,82	7,46

Як видно з таблиці 2, домінуючи амінокислоти для пагонів ожини сизої у 3 зразках є пролін (1,48% - 3,37%), глутамінова кислота (1,22% - 1,39%) та аспарагінова кислота (0,71% - 1,19%).

Загальний вміст амінокислот в пагонах ожини сизої коливається від 10,25% до 12,04%, вміст незамінних амінокислот 4,2% - 4,43%, замінних амінокислот 5,82% - 7,84%.

Методом атомно - абсорбційної спектроскопії визначений якісний склад та кількісний вміст мінеральних сполук в пагонах ожини сизої. Встановлений вміст - 22 мікро - та макроелементів. Дані аналізу наведені в таблиці 3

Серед ессенціальних елементів у сировині було визначено присутність: Mn, Cu, Pb, Ni, Co, Mo, Zn, Sr, Fe, Sn, Ag, Cd, As, Hg, Cr. Як видно з таблиці 3, вміст заліза коливається від 260 до 320мкг/кг. Найбільший вміст заліза зафіксовано у сировині, що була заготовлена в Криму. Вміст марганцю склав від 60 до 70 мг/кг. Вміст цинку - від 35 до 40 мг/кг; вміст стронцію - від 25 до 30 мг/кг, вміст міді - 16-20 мг/кг. В слідових кількостях знайдено кобальт, сурму, срібло, кадмій, ртуть та миш'як. У незначній кількості знайдено свинець (0,5 - 1 мг/кг), нікель (до 1 мг/кг), молібден (0,2 - 0,3 мг/кг) та хром (1 - 1,2 мг/кг).

Таблиця 3.

Елементний склад пагонів ожини сизої.

Елемент	Вміст елементу, мг/кг
	№ 1	№ 2	№ 3
Mn	60,0	70,0	65,0
Cu	16,0	20,0	18,0
Pb	0,5	1,0	0,7
Ni	1,0	1,0	1,0
Co	0,5	0,5	0,5
Mo	0,3	0,2	0,28
Zn	40,0	40,0	35,0
V	0,3	0,4	0,4
Sr	30,0	30,0	25,0
Ti	25,0	30,0	28,0
Sn	0,3	0,3	0,3
Ga	1,0	1,0	1,2
Ag	0,05	0,05	0,05
Fe	260,0	300,0	320,0
Al	100,0	100,0	120,0
Cd	0,1	0,1	0,1
As	0,2	0,2	0,2
Hg	0,01	0,01	0,01
Sb	0,5	0,5	0,5
Cr	1,0	1,0	1,2
Bi	0,2	0,2	0,2
Ge	0,1	0,1	0,1

Примітка: зразок №1 - Харківська область, зразок №2 - Карпати, зразок №3 - Крим.

Вперше встановлено якісний склад та кількісний вміст жирних кислот пагонів ожини сизої. Дані аналізу наведені в таблиці 4

Таблиця 4

Склад жирних кислот ліпофільного комплексу з пагонів ожини сизої.

№	Назва кислоти	Індекс	Кількісний вміст, %
1	Лауринова	С 12:0	15,95
2	Міристинова	С 14:0	16,04
3	Олеїнова	С 18:1	1,97
4	Лінолева	С 18:2	9,68
5	- ліноленова	С 18:3	40,82
6	Арахідонова	С20:0	5,47
	Сума насичених кислот		31,99
	Сума ненасичених кислот		57,94

Встановлено, що переважає кількісний вміст ненасичених жирних кислот - 57,94 %, серед яких значну частину складає - ліноленова кислота - 40,82%. На вміст ненасичених жирних кислот олеїнової та лінолевої припадає 1,97% та 9,68% відповідно. Серед насичених жирних кислот найбільша кількість припадає на лауринову кислоту-15,95% та міристинову кислоту - 16,04%.

Визначено кількісний вміст БАР у пагонах ожини сизої. Встановлено, що вміст цих сполук залежить від району заготівлі та відмінності кліматичних умов. Результати дослідження наведені у табл. 5

Таблиця 5

Кількісний вміст груп БАР у пагонах ожини сизої

Пагони ожини сизої	Кількісний вміст, %
	Групи БАР
	БПСК	Хлоро-філи	Аміно кислоти	Поліфеноли, що окиснюються	Флаво-ноїди	Аскорбі нова кислота	Гідрокси- коричні кислоти
Метод кількісного визначення
	Гравіметр-ичний	Фотоелектроколориметричний	Аміно-кислотний аналізатор	Метод Левенталя	Комплексонометричний	Спектрофотометричний	Титриметричний	Спектрофотометричний
	х ± ?х, % n =5
Зразок №1*	3,2± 0,02	4,63± 0,01	12,04± 0,02	7,40± 0.01	6,8± 0,01	1,72± 0,01	0,92± 0,02	0,53± 0,01
Зразок №2	2,9± 0,01	4,12± 0,01	10,25± 0,01	6,9± 0,02	6,25± 0,02	1,68± 0,01	0,83± 0,01	0,59± 0,01
Зразок №3	2,85± 0,02	4,17± 0,02	11,80± 0,01	7,14± 0,01	6,11± 0,01	1,59± 0,02	0,87± 0,02	0,65± 0,02

Примітка: *зразок №1 - Харківська область, зразок №2 - Карпати, зразок №3 - Крим.

Як видно з таблиці 5, незначні коливання БАР в пагонах ожини сизої різних регіонв України незначно відрізняються одін від одного, тому для заготівлі сировини можна використовувати пагони з різних міст проізростання.

Одержані результати включені нами в проекти АНД “Пагони ожини сизої”, “Сухий екстракт”, “Кровоспинний збір”.

Вперше проведений аналіз динаміки накопичення флавоноїдів, аскорбінової кислоти та поліфенолів, що окиснюються у пагонах ожини сизої за період вегетації (рис. 2). Вміст аскорбінової кислоти коливався від 0,63 до 0,97%; вміст флавоноїдів коливався від 1,5%, досягаючи у липні найбільшого показника 1,83% і потім знижувався до кінця вегетації до 1,62%; вміст дубильних речовин коливався від 11,55% до 18,16%. Таким чином, виявлена залежність накопичення аскорбінової кислоти, поліфенолів, що окиснюються, та флавоноїдів від періоду збору сировини пагонів ожини сизої у Харківський області. Визначено оптимальні строки заготівлі сировини за найбільшим вмістом фенольних сполук - липень.

Отримані дані використані для розробки проекту АНД на сировину та інструкції із заготівлі та сушці пагонів ожини сизої.

Морфолого-анатомічні дослідження пагонів ожини сизої

Вперше проведені анатомічні дослідження надземних частин ожини сизої, які дозволили встановити діагностичні ознаки для вивчаємої сировини.

Для стебла характерний перехідний тип будови. Стебло округле за формою у верхній і пятикутньо округле в нижній частині, з великими веретеноподібними пучками у кутах. Багатогранна, дрібноклітинна з потовщеною кутикулою епідерма, що має рідкі аномоцитного типу продихи без визначеної орієнтації, які розташовані над хлорофілоносними ділянками, кутовопластинчата коленхіма з розташованими в ній хлорофілоносними ділянками корової паренхіми, добре визначена ендодерма первинної кори, переривчасте у верхній і зєднане склереїдами у середній і нижній частинах перициклічне склеренхімне кільце, чашоподібної форми вторинна флоема у пучках, яка складається з великих ситовидних трубок і дрібноклітинної луб'яної паренхіми, великі пористі судини і дрібні трахеальні елементи вторинної ксилеми, зірчастої форми серцевина орієнтована округлими променями на ребра, що складаються з 2 видів клітин - великих тонкостінних і малих товстостінних, які тягнуться ланцюжками вздовж стебла.

Для листка характерне своєрідне розгалуження провідних пучків по довжині рахісу і черешків, а також наявність біля рахісу нитковидних прилистків, які густо вкриті трихомами. Верхня епідерма листка злегка звивистостінна, товстостінна, без продихів, з рідкими трихомами, нижня епідерма звивистостінна, дуже тонкостінна, з великими аномоцитного типу продихами, повстисто опушена пучковозірчастими волосками і залозками переважно по жилках.

Шипи характерно покриті епідермою з прозенхімних клітин, під якою знаходиться шар з склеренхіми, який оточує товстостінну паренхіму, прості довгі товстостінні гострокінцеві одноклітинні волоски, які часто об'єднуються у 2 - 8 клітинні пучкові довгопроменеві зірки, залозки, що складаються з двохрядної багатоклітинної ніжки і округлої або видовженої багатоклітинної головки. Паренхіма стебла і рахісу складається з 3 видів клітин: дрібних хлорофілоносних, великих тонкостінних і дрібних товстостінних. Є також друзи різної форми, поодинокі кристали оксалату кальцію.

Результати досліджень використані для розробки проекту АНД “Пагони ожини сизої”.

Одержання природних комплексів з пагонів ожини сизої та вивчення їх біологічної активності

Для одержання водного настою використовували пагони ожини сизої у співвідношенні 1:10, нагрівали на водяній бані протягом 15 хвилин з наступним охолодженням протягом 45 хвилин.

Дослідження фармакологічної активності настою проводили в Центральній науково-дослідній лабораторії (ЦНДЛ) НФаУ під керівництвом професора Яковлевої Л.В.

Визначена гостра токсичність настою пагонів ожини сизої. Результати проведеного експерименту дозволяють зробити висновок, що по класифікації токсичності речовин

К.К Сидорова, він належить до відносно нешкідливих речовин і може бути рекомендований для застосування в клініці.

Дослідження кровоспинної активності настою з пагонів ожини сизої проводили in vivo на щурах. Тваринам дослідної групи щоденно вводили перорально настій в дозі 12 мл/кг.

Результати проведеного дослідження фармакологічної активності настою пагонів ожини сизої (1:10) у дозі 12мл/кг свідчать про властивість препарату прискорювати процес згортання крові, а також про його капілярозміцнювальну, мембраностабілізувальну дії.

Дослідження мікробіологічної активності ліпофільного екстракту з пагонів ожини сизої проводили на кафедрі мікробіології НФаУ під керівництвом професора Дикого І. Л.

Результати мікробіологічного скринінгу ліпофільного екстракту пагонів ожини сизої показали, що ліпофільна фракція має помірно виражену бактеріостатичну активність по відношенню до грампозитивних та грамнегативних мікроорганізмів. По відношенню до стафілококів S. aureus, B. subtilis та кишкової палички E. coli дію слід відмітити як фоново-позитивну. На синегнійну паличку P. aeruginosa відмічено помірно виражену бактеріостатичну дію. Проведені мікробіологічні та фармакологічні дослідження свідчать про можливість використання настою з пагонів ожини сизої (1:10) у гінекологічній практиці як кровоспинного, капілярозміцнювального, мембраностабілізувального засобу з бактеріостатичною дією.

Одержання та аналіз сухого екстракту з пагонів ожини сизої

Для одержання сухого екстракту використовували зразок №1 (Харківська область). В результаті проведених експериментів встановлено, що 50% етанол є оптимальним екстрагентом для вилучення біологічно активних речовин. Вихід склав 5,03% від маси повітряно-сухої сировини. Для сухого екстракту було визначено кількісний вміст груп БАР: для БПСК він склав 2,52%, поліфенолів - 5,39%, для флавоноїдів - 0,8%

Дослідження кровоспинної активності сухого екстракту з пагонів ожини сизої проводили на кафедрі фізіології НФаУ під керівництвом професора Малоштан Л.М.

Дослідження проводили in vivo на мурчаках в дозі 7 мл/кг. Як контроль використовували дистильовану воду. Як препарат порівняння був обраний рідкий екстракт грициків звичайних у дозі 1,2 мл/кг. Використовували метод визначення згортання крові по Альтгаузену. Екстракт ожини сизої в дозі 7 мл/кг у порівнянні з референс - препаратом виявляє помірну гемостатичну дію.

Розробка та аналіз кровоспинного збору

З метою розширення асортименту кровоспинних засобів рослинного походження розроблено 3 серії зборів: п'ятикомпонентний, чотирикомпонентний та трикомпонентний. Критерієм включення до збору лікарської рослинної сировини була розповсюдженість та доступність сировини в Україні. Раціональну рецептуру збору було розроблено в ході попередніх скринінгових експеріментів. До збору №1 входили Cormus Rubi caesii, Herba Polygoni hydropiperis, Herba Bursae pastoris, Folia Urticae dioicae, Herba Achilleae millefolii), до збору №2 входили Cormus Rubi caesii, Herba Polygoni hydropiperis, Herba Bursae pastoris, Folia Urticae dioicae, до збору №3 входили Cormus Rubi caesii, Herba Polygoni hydropiperis, Herba Bursae pastoris. Збори виявляли мембраностабілізувальну, кровоспинну, капілярозміцнювальну дію. На 10 день збір №1 та №2 почав викликати алергійну реакцію у щурів, що проявлялося у вигляді набряків слизових оболонок. Тому далі досліджувався збір №3, до складу якого входить 3 види лікарської рослинної сировини у співвідношенні 3:2:2. Визначені технологічні аспекти приготування та аналізу збору. Узагальнені відомості про хімічний склад та фармакологічну активність компонентів збору з точки зору використання лікування клімактеричних кровотеч. Трикомпонентний збір оказав гемостатичну, капілярозміцнювальну та мембраностабілізувальну дію. Визначені числові показники вологості, вмісту золи, подрібненості. Розроблені показники ідентифікації збору за зовнішніми та мікроскопічними ознаками.

За результатами якісних реакцій визначені групи БАР для водного витягу збору: флавоноїди, глікозиди, окислювальні поліфеноли. За якісними реакціями та хроматографічним аналізом встановлено, що групою діючих речовин, яка має перевагу, є комплекс фенольних сполук. Суму поліфенольних сполук визначали у спиртовій витяжці збору (50% етанол) перманганатометричним методом (9,36%). Визначення кількісного вмісту флавоноїдів проводили спектрофотометричним методом (7,23%) у перерахунку на рутин.

Фармакологічну активність кровоспинного збору вивчали у ЦНДЛ НФаУ під керівництвом професора Яковлевої Л.В.

Гемостатичну активність збору проводили на кролях, мембраностабілізувальну активність - на щурах. Дозу для досліджень розраховували з використанням коефіцієнта видової стійкості Риболовлева Ю.П. Встановлено, що щоденна доза збору, виготовленого в співвідношенні 1:10, складає для кроликів 11 мл/кг, для щурів - 12 мл/кг.

Результати дослідження гемостатичної активності рослинного збору з пагонів ожини сизої, грициків звичайних та гірчака перцевого свідчать про здатність препарату прискорювати процес згортання крові, що дозволяє рекомендувати його для профілактики і лікування внутрішніх кровотеч (маткових, кишкових, легеневих)

ВИСНОВКИ

Проаналізовані та узагальнені дані літератури про клімактеричний період жінок, етіологію, патогенез та сучасні тенденції фітотерапії в профілактиці та лікуванні маткових кровотеч як одного з ускладнень цього періоду.

Вперше проведено систематичне фітохімічне і фармакологічне вивчення пагонів ожини сизої флори України. На підставі проведених фізико - хімічних методів аналізу (УФ-, ІЧ-спектрів, різних хроматографічних методів аналізу), хімічних перетворень речовин для виду Rubus caesius вперше виділено та встановлена структура 16 речовин, в тому числі: 2- похідні гідроксибензойної кислоти, 6- похідні гідроксикоричної кислоти, 8- похідні флавоноїдів, серед яких 3- аглікони флавоноїдів, 5- глікозиди флавоноїдів. Виділені сполуки ідентифіковані як: галова кислота (2.12), елагова кислота (2.13), кавова кислота (2.14), ферулова кислота (2.15), хлорогенова (2.16), неохлорогенова (2.17), ізохлорогенова (2.18), n-кумарова кислота (2.19), кемпферол (2.20), лютеолін (2.21), кверцетин (2.22), ізокверцитрин (2.23), астрагалін (2.24), кемпферол-3-арабінозид (2.25), гіперозид (2.26), рутин (2.27).

3.Вперше визначений кількісний вміст БПСК, хлорофілу, аскорбінової кислоти гідроксикоричних та вільних амінокислот, суми поліфенолів, що окиснюються, флавоноїдів. У ліпофільній фракції визначений вміст каротиноїдів та хлорофілів. Вперше визначений кількісний вміст 16 амінокислот у 3 зразках сировини. Домінуючи амінокислоти для пагонів ожини сизої у 3 зразках склали пролін (1,48% - 3,37%), глутамінова кислота (1,22% - 1,39%) та аспарагінова кислота (0,71% - 1,19%). Загальний вміст амінокислот в пагонах ожини сизої коливається від 10,25% до 12,04%, вміст незамінних амінокислот 4,2% - 4,43%, замінних амінокислот 5,82% - 7,84%. Вперше встановлений вміст 22 мікро - та макроелементів. Серед ессенціальних елементів у сировині було визначено присутність: Mn, Cu, Pb, Ni, Co, Mo, Zn, Sr, Fe, Sn, Ag, Cd, As, Hg, Cr.

Вперше вивчено жирнокислотний склад пагонів ожини сизої. Встановлено, що кількісний вміст ненасичених жирних кислот - 57,94 %, серед яких значну частину складає -ліноленова кислота - 40,82%. Насичених жирних кислот - 31.99%, найбільша кількість припадає на лауринову кислоту-15,95% та мірістинову кислоту-16,04%.

Вперше проведений аналіз динаміки накопичення основних груп БАР: флавоноїдів, аскорбінової кислоти та поліфенолів, що окиснюються, які дозволили визначити сприятливий період збору сировини - липень. Отримані дані використані для розробки проекту АНД на сировину. Виявлена зале...