Размещено на http://www.allbest.ru/

ІНСТИТУТ МЕДИЦИНИ ПРАЦІ

АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

УДК 613.6 / 612.017:616.15:001.5

ПРОФІЛАКТИКА ПОРУШЕНЬ ІМУНОЛОГІЧНОЇ РЕАКТИВНОСТІ У ПРАЦІВНИКІВ ВИРОБНИЦТВА АЗОТНОЇ КИСЛОТИ ПРЕПАРАТАМИ ТРІОВІТ І НЕОСЕЛЕН

14.02.01-Гігієна

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

БІЛЬКО ТАМАРА ОЛЕКСАНДРІВНА

Київ - 2005



Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в лабораторії медико-біологічних критеріїв професійних впливів Інституту медицини праці АМН України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, академік НАН і АМН України, Кундієв Юрій Ілліч, Інститут медицини праці АМН України, директор

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор, Яворовський Олександр Петрович Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця МОЗ України, завідувач кафедри гігієни праці та профзахворювань, проректор з навчальної роботи

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Томашевська Людмила Анатоліївна, Інститут гігієни та медичної екології ім. О.М.Марзеєва АМН України, керівник лабораторії токсикології

Провідна установа: Інститут екогігієни та токсикології ім. Л.І.Медведя, відділ токсикології та медико-біологічних досліджень, МОЗ України, м. Київ

Захист відбудеться “8” вересня 2005 р. о 14.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д. 26.554.01 в Інституті медицини праці АМН України (01033, Київ-33, вул. Саксаганського, 75).

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту медицини праці АМН України (01033, Київ-33, вул. Саксаганського, 75).

Автореферат розісланий “20” липня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради А.В.Степаненко



АНОТАЦІЇ

Білько Т.О. Профілактика порушень імунологічної реактивності у працівників виробництва азотної кислоти препаратами Тріовіт і Неоселен. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.02.01 гігієна. - Інститут медицини праці АМН України, Київ, 2005. імунний азот тріовіт неоселен

Дисертаційна робота присвячена науковому обґрунтуванню доцільності застосування препаратів Тріовіт і Неоселен для профілактики порушень стану імунної системи на підставі дослідження імунного статусу працюючих в умовах дії низьких рівнів оксидів азоту.

Проведено гігієнічну оцінку умов праці та імунологічне обстеження працівників хімічного заводу, які зазнавали та не зазнавали в умовах виробництва впливу оксидів азоту (NО_х).

Виявлено переважання макрофогальної клітинної захисної реакції за рахунок помірно вираженого моноцитозу (зниження СНМ), а також аффекторної клітинної ланки в імунній відповіді організму (зниження СЛМ). Останнє може свідчити про можливу реалізацію аутоімунного процесу. А також, односпрямовані порушення стану імунологічної реактивності організму в обох групах працівників, що свідчить про наявність у них вторинного комбінованого імунодефіциту як наслідку комплексного впливу полютантів промислового походження. Найбільш суттєво це проявлялося у малостажованих групах робітників (до 1 року), у жінок порівняно з чоловіками та у осіб, що зазнавали у виробничих умовах впливу NО_х.

Виявленні порушення імунологічної реактивності організму працюючих з основної групи, слугували підставою для обґрунтування проведення у них профілактичних заходів. Застосування на протязі 6 тижнів препаратів Тріовіт і Неоселен працівниками цеху хімічного заводу з виробництва азотної кислоти, нормалізувало знижену активність внутрішньоклітинних ферментів в лейкоцитах крові при вторинному комбінованому імунодефіциті. Виявлена тенденція до нормалізації порушених співвідношень в клітинних реакціях імунного захисту організму, що засвідчувало про покращення його адаптаційних можливостей.

Ключові слова: працівники хімічного виробництва, оксиди азоту, імунологічна реактивність, Тріовіт, Неоселен.



АННОТАЦИЯ

Билько Т.А. Профилактика нарушений иммунологической реактивности у рабочих производства азотной кислоты препаратами Триовит и Неоселен. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.02.01 - гигиена. - Институт медицины труда АМН Украины, Киев, 2005.

Диссертационная работа посвящена научному обоснованию целесообразности применения препаратов Триовит и Неоселен для профилактики нарушений иммунологической реактивности на основании исследования иммунного статуса работающих в условиях воздействия низких уровней оксидов азота.

Химические вещества, среди которых немало токсических для организма, могут оказывать влияние практически на все ткани и органы человека. Одной из наиболее чувствительных систем организма, быстро реагирующей на самых ранних этапах с вредными факторами производственной и окружающей среды, является система иммунитета. Среди значительного количества полютантов, наиболее распространенными и наименее изученными с точки зрения оказываемых биологических эффектов на организм человека и в частности, его иммунную систему являются оксиды азота. Согласно данным немногочисленной литературы, они относятся к химическим соединениям, которые способны вызывать нарушения в клеточном и гуморальном звеньях иммунной систем, повышение восприимчивости организма к респираторным и вирусным инфекциям вследствие нарушения неспецифической его резистентности. Степень проявления этого неблагоприятного влияния оксидов азота зависит непосредственно от их концентрации во вдыхаемом воздухе. Сама по себе проблема долгосрочных модификаций регуляторных механизмов в иммунной системе организма человека при профессиональном и непрофессиональном токсическом воздействии различных химических веществ, в том числе и NO_x, является чрезвычайно актуальной. Поэтому необходимость исследования таких влияний и создание научно обоснованной стратегии коррекции и профилактики является важной задачей для специалистов в области медицины труда.

По данным гигиенического мониторинга, в динамике года, в цехе по производству слабо концентрированной азотной кислоты среднесменная концентрация NO₂ в воздухе рабочей зоны была в пределах 0,9-1,3 мг/м³ (ПДК 2,0 мг/м³), аммиака 4-11,3 мг/м³ (ПДК 20,0 мг/м³). Однократный суточный автоматический мониторинг воздуха рабочей зоны в цехе на рабочих местах основных профессий с помощью прибора Gaz analyzer (фирма АIM США) выявил в среднем 76,0 ppm NO₂ (0,5-135,0 ррm) с длительностью превышения ПДК до 10 минут и 150,0 ppm NO (0,5-615,0 ррm) с длительностью превышения ПДК до 3 минут (пиковые выбросы).

Выявлено преобладание макрофагальной клеточной защитной реакции за счет умеренно выраженного относительного моноцитоза (снижение ИСНМ) наиболее выраженное в основной группе, а также аффекторного клеточного звена в иммунном ответе организма (снижение ИСЛМ). Последнее может свидетельствовать о возможной реализации в их организме аутоиммунного процесса. Эти нарушения сочетались со снижением активности внутриклеточных ферментов, обеспечивающих энергетические процессы и функциональную активность данной популяции клеток (СДГ, Г-6-ФДГ). Последнее было более выражено у рабочих основных профессий, то есть в основной группе. На основании полученных результатов иммунологических исследований можно заключить, что у обследованных, как у контактирующих в производственных условиях с NОx (основная группа), так и у не имеющих профессионального контакта с ними (группа сравнения) выявлены однонаправленные нарушения иммунологической реактивности организма, свидетельствующие о сформировавшемся у них вторичном комбинированном иммунодефиците.

Выявленные нарушения иммунологической реактивности организма у обследованных из основной группы, послужили основанием для обоснования проведения у них профилактики препаратами Триовит и Неоселен.

Применение в течение 6 недель Триовита и Неоселена работниками цеха химического завода по производству азотной кислоты, нормализовало сниженную активность внутриклеточных ферментов в лейкоцитах крови при вторичном комбинированном иммунодефиците. Выявлена тенденция к нормализации нарушенных соотношений в клеточных реакциях иммунной защиты организма, что свидетельствовало об улучшении его адаптационных возможностей.

Ключевые слова: рабочие химического завода, оксиды азота, иммунологическая реактивность, Триовит, Неоселен.



SUMMARY

Bilko T.A. The prophylaxis of the immunological reactivity of violations among workers of the nitric acid productions by preparations of Triovite and Neoselen. - Manuscript.

The thesis in search of a scientific degree of Candidate of Biological Sciences on specialty 14.02.01-Hygiene - Institute for Occupational Health of Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kyiv, 2005.

The dissertation is devoted to scientific development of rational administration of preparation Triovite and Neoselen for the prophylaxis of violations in immune systems state on the basis of study of persons working under influence of low concentration of nitrogen oxides.

Hygienic evaluation of working conditions and immunologic examination workers of chemical plant was made. 57 workers were undergoing nitrogen oxides (NO_x) exposure and 57 workers were not.

That was a sing about predominance of macrophagal cellular defense reactions by monocytic (decrease of SNM) and also effect of affect cellular link in immune reaction of an organism (decrease of SLM). The last could be considered as realizations of autoimmune process in their organism. One-direction impairment of immunological reactivity state of workers organism in both groups was detected. It is testified presence in workers secondary combined immune deficit as consequence of complex effect of pollutants of industrial origin. Most essential it was manifested in subgroups of workers with small length of service (less then 1 year), in females comparatively with males and in persons, which were exposed to NO_x on workers place.

Revered violations of immunological reactivity of organism in workers of exposure group were a basis of development of the applied prophylaxis. On administration of Triovit and Neoselen during 6 weeks in workers of an nitric acid plant normalized decreased activity of intracellular enzymes in blood leucocytes at secondary combines immunodeficiency. A tendency for normalization of the broken cellular reactions of organism defense certified the improvement of his adaptation possibilities was revealed.

Key words: workers of chemical plant, nitrogen oxides, immune reaction, Triovite, Neoselen .



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вивчення впливу чинників виробничого середовища на здоров'я людини в даний час є важливим не тільки з погляду їх значення в розвитку професійних захворювань, але і з позиції визначення їх ролі у виникненні і перебігу ряду соматичних захворювань [Кундиев Ю.И., 2002, Трахтенберг И.М., 1991].

Хімічні речовини, серед яких немало токсичних для організму, можуть чинити вплив практично на всі тканини і органи людини [Кундиев Ю.И., 2000, Трахтенберг И.М., 2000]. Однією з найчутливіших систем організму, яка на ранніх етапах реагує на дію шкідливих чинників навколишнього і виробничого середовища, є імунна система. Багато авторів вважають [Хаітов Р.М., 1995, Дранник Г.Н., 2003, Сидоренко Г.Н., 1989, Виноградов Г.И.,1984, Передерий В.Г., Земсков А.М.,Бычкова Н.Г., 1995, Лисицина Т.С.,1991], що виявлення найбільш ранніх змін в організмі, на який постійно впливають шкідливі фактори малої інтенсивності виробничого середовища, сприяє підвищенню ефективності застосування комплексу профілактичних заходів, що спрямовані на попередження розвитку професійних та хронічних соматичних захворювань у працівників хімічних підприємств. Відомо, що з дією хімічних речовин пов'язано адаптаційне напруження імунорегуляторних механізмів, розвиток алергічних, аутоімунних та онкологічних захворювань. Отже, вивчення стану імунологічної реактивності організму працюючих в умовах дії хімічного виробничого фактору є актуальним завданням. Важливість його продиктована також необхідністю розробки науково обґрунтованої стратегії профілактики професійної патології, що виникає на фоні вторинних імунодефіцитних станів.

Серед значної кількості полютантів, найпоширеніших і мало вивчених з погляду проявів біологічних ефектів стану імунної системи людини є оксиди азоту [Устиненко А.Н., 1991, Соколов С.М., 1986, Румянцева Г.Н., 1994]. За даними поодиноких джерел, NОx відносяться до хімічних сполук, здатних викликати порушення в клітинній та гуморальній ланках імунітету, підвищену схильність організму до респіраторних захворювань, внаслідок порушення його неспецифічної резистентності. Ступінь прояву цього несприятливого впливу оксидів азоту залежить безпосередньо від їх концентрації в повітрі робочої зони [Kosmider S.T., Maigetter R.Z., Frampton M.W., 1991, Сидоренко Г.І., 1989]. На цей час недостатньо вивчені особливості імунологічної реактивності організму працюючих, що зазнають хронічного впливу низьких рівнів NОx з виробничого середовища.

Виходячи з вище викладеного, проблема змін імунологічної реактивності організму людини при професійній і непрофесійній токсичній дії оксидів азоту (NОx), заслуговує подальшого поглибленого вивчення, а розробка заходів профілактики є надзвичайно важливим завданням фахівців в галузі гігієни праці.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в рамках науково-дослідної роботи (№ держреєстрації 0100U002243) “Дослідження деяких механізмів токсичної дії сполук оксидів азоту на організм людини в умовах виробництва азотної кислоти” та за фінансової підтримки Європейської Комісії за Грантом ERB-IC15-CT98-0336 (Inco-copernicus), 1999-2001 рр.

Мета роботи. Науково обґрунтувати доцільність застосування препаратів Тріовіт і Неоселен для профілактики порушень імунологічної реактивності у працівників виробництва азотної кислоти.

Для досягнення зазначеної мети були поставлені такі завдання:

1. Провести гігієнічний моніторинг стану виробничого середовища за показниками вмісту NО_x та інших індикаторних полютантів в повітрі робочої зони; оцінити умови праці працівників цеху по виробництву слабо концентрованої азотної кислоти хімічного заводу.

2. Відібрати учасників обстеження з числа працівників основних професій цеху по виробництву слабо концентрованої азотної кислоти (основна група) і серед працівників інших цехів за спеціально розробленими критеріями з використанням анкети.

3. Дослідити функціональний стан імунної системи працюючих за показниками неспецифічної резистентності і імунологічної реактивності організму.

4. На підставі результатів дослідження імунного статусу організму обстежених працівників обґрунтувати доцільність застосування препаратів Тріовіт і Неоселен для профілактики виявлених порушень.

5. Оцінити ефективність застосування препаратів Тріовіт і Неоселен для профілактики порушень стану імунної системи, які пов'язані з впливом NO_x на організм людини у виробничих умовах.

6. Узагальнити одержані результати і розробити рекомендації щодо профілактики несприятливого впливу низьких рівнів NO_x на організм людини в сучасних виробничих умовах хімічного заводу.

Об'єкт дослідження - умови праці, працюючі на хімічному заводі.

Предмет дослідження - шкідливі чинники хімічного заводу, показники імунологічної реактивності організму працюючих.

Методи дослідження - гігієнічні, гематологічні, цитохімічні, імунологічні і математико-статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Встановлені та суттєво доповнені існуючі уявлення щодо патогенезу хронічної дії низьких рівнів оксидів азоту на працюючих в умовах виробництва азотної кислоти і особливості їх впливу на імунну систему. Виявлені однотипні порушення стану неспецифічної резистентності та імунологічної реактивності організму, властиві для вторинного (набутого) комбінованого імунодефіциту з ознаками формування імунокомплексного процесу.

Вперше доведена ефективність профілактики виявлених порушень імунологічної реактивності у працюючих в умовах хронічної дії оксидів азоту і науково обґрунтовано використання препаратів Неоселен (селеніт натрію) та селен-вміщуючого вітамінно-мінерального комплексу Тріовіт.

Практичне значення отриманих результатів.

Результати роботи можуть бути використані для підвищення ефективності профілактичних заходів, направлених на попередження розвитку хронічних захворювань у працюючих в умовах впливу оксидів азоту з виробничого середовища, в медико-санітарних частинах підприємств хімічної промисловості, клініках професійних захворювань. На основі отриманих даних видано один інформаційний листок “Спосіб фармакологічної корекції гомеостазу у осіб, які зазнають впливу оксидів азоту з виробничого і навколишнього середовища та у побуті” (№008-04).

Особистий внесок здобувача. Здобувачем самостійно обґрунтовані та визначені мета і задачі роботи та підібрані адекватні методичні рішення. Проведені інформаційний пошук та аналіз наукової літератури з даної проблеми, гематологічні та імунологічні дослідження, статистична обробка отриманих результатів, відповідний аналіз та висновки. Самостійно здійснено визначення закономірностей впливу низьких рівнів оксидів азоту на досліджуваному хімічному виробництві як провідного фактору ризику порушень імунної системи. Сформульовані основні положення щодо заходів профілактики шкідливого впливу низьких концентрацій оксидів азоту та розроблені конкретні практичні рекомендації для використання їх в медико-санітарних частинах підприємств хімічної промисловості, клініках профзахворювань. Гігієнічні дослідження було проведено спільно з к.м.н. С.П. Палійчуком, частково імунологічні та цитохімічні спільно з співробітниками лабораторії медико-біологічних критеріїв професійних впливів (зав. - к.м.н. В.А. Стежка) к.б.н. Н.М. Дмитрухою, к.б.н. Т.М. Покровською.

Апробація результатів дисертації. Основні результати та положення дисертаційної роботи представлені та обговорені на конгресах, конференціях, симпозіумах:

- Конференціях молодих вчених Інституту медицини праці АМН України (2000 р., 2001 р., 2003 р.)

- Міжнародній науково-практичній конференції “Харчування як фактор формування здоров'я населення ”, 15-16 травня, 2003 г., Київ.

- Міжнародній науковій конференції “Етичні проблеми медицини праці та гігієни довкілля”, 9-10 грудня, 2003 р., Київ.

- XIII annual International Occupational Ergonomics and Safety Conference, May 19-22, 2004, USA, Houston.

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 8 наукових робіт, у тому числі 4 статті у фахових наукових виданнях, що входять до переліку ВАК України. Видано 1 інформаційний листок.

Структура та обсяг дисертації. Робота складається із вступу, аналітичного огляду літератури, опису методів дослідження, трьох розділів власних досліджень, заключення, науково-практичних рекомендацій, висновків, списку літератури. Загальний обсяг дисертації становить 138 сторінок комп'ютерного друку. Дисертація містить 27 таблиць, 3 рисунки. Бібліографія включає 144 джерела.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Для досягнення поставленої в дисертації мети і реалізації її задач обстежено 114 працюючих хімічного заводу по виробництву слабо концентрованої азотної кислоти, які були розподілені на 2 групи. Перша - група порівняння (57 чоловік), куди ввійшли особи, що не контактують з оксидами азоту в умовах виробництва (працюючі господарського цеху) і друга група працюючих (57 чоловік), що мають виробничий контакт з NО_x (цех по виробництву слабо концентрованої азотної кислоти - апаратники, оператори, машиністи компресорних установок, слюсарі-ремонтники). Обидві групи були змішаними (чоловіки, жінки) і стандартизовані за статтю: у групі порівняння - 36,8% жінок і 63,3% чоловіків; у основній групі - 33,3% жінок і 66,7% чоловіків. Контрольну групу склали 30 здорових донорів, що не мають контакту з шкідливими виробничими чинниками. У роботі, використані гігієнічні, гематологічні, імунологічні, цитохімічні, статистичні методи досліджень.

Дослідження проведені з урахуванням біоетичних вимог. Учасниками обстеження були підписані документи, що роз'яснюють: суть дослідження, необхідність його проведення, структуру, тривалість і безпечність для учасників, переваги учасників дослідження, відповідальність організаторів дослідження та установи, яку вони представляють, у разі виникнення можливих ускладнень; права і обов'язки учасників дослідження ( у тому числі добровільність участі і можливість її припинення за бажанням); гарантують конфіденційність у відношеннях між організаторами та учасниками дослідження (“Інформована згода”, “Декларація прав”, “Згода на участь у дослідженні”). Проект досліджень було розглянуто та затверджено Комісією з етики Інституту медицини праці АМН України.

Гігієнічні дослідження включали:

1. Дослідження наявності хімічних речовин в повітрі робочої зони проводили відповідно до ГОСТ 12.1.005.88 "Загальні санітарно-гігієнічні вимоги до повітря робочої зони"; При цьому визначали: вміст аміаку (NН₃) - згідно з МУ № 1637 - 77, двоокису азоту (NO₂) - згідно з МУ № 1638 - 77.

2. Визначення параметрів мікроклімату на робочих місцях виконано згідно з ГОСТ 12.1.005.88 "Загальні санітарно-гігієнічні вимоги до повітря робочої зони", ДСН 3.3.6.042-99.

3. Дослідження рівнів шуму на робочих місцях проводили відповідно до ГОСТ 12.1.050-86 "ССБТ. Методи вимірювання шуму на робочих місцях". Санітарні норми допустимих рівнів шуму на робочих місцях , ДСН 3.3.6.037-99.

4. Дослідження і оцінку загальної вібрації на робочих місцях проводили відповідно до ГОСТ 12.1.012-90 "ССБТ. Вібраційна безпека. Загальні вимоги", Санітарні норми вібрації робочих місць ДСН 3.3.6.039-99.

Проведено загальний аналіз крові з підрахунком лейкоцитарної формули. Як додаткові тести для оцінки клітинних реакцій неспецифічного і специфічного захисту організму, а також для вивчення механізмів її порушення обчислювали ряд індексів співвідношень популяцій лейкоцитів. Останні включали співвідношення нейтрофілів і лімфоцитів (СНЛ), лімфоцитів і моноцитів (СЛМ), лімфоцитів і еозинофілів (СЛЕ), нейтрофілів і моноцитів (СНМ), згідно А.Я.Осину і ін. Окрім цього в популяціях лімфоцитів і нейтрофілів периферичної крові цитохімічно визначали активність внутріклітинних ферментів сукцинатдегідрогенази (СДГ), глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г-6-ФДГ) і пероксидази (ПК) [Меншиков В.В., 1987].

Дослідження імунного статусу складалось з аналізу неспецифічної резистентності, клітинної та гуморальної ланок імунної системи. Неспецифічна резистентність організму досліджена за показниками фагоцитарної активності нейтрофілів (ФАН) периферичної крові, з визначенням: фагоцитарного індексу (ФІ) - число активних нейтрофілів, що беруть участь в акті фагоцитозу; фагоцитарного числа (ФЧ) - середня кількість частинок латексу, поглинених одним фагоцитом. Інтенсивність окисно-відновних процесів в нейтрофілах, їх функціонально-метаболічні резерви вивчали за допомогою постановки тесту відновлення нітросинього тетразолію (НСТ-тест) в двох варіантах його постановки - спонтанному і активованому E.Coli. Даний тест заснований на відновленні в активованому нейтрофілі НСТ в не розчинний у воді діформазан, що відкладається у вигляді синіх гранул в нейтрофілах. Утворення діформазану виявляли мікроскопією в мазках крові, підраховувавши число клітин, що містять його у відсотках [Пастер Е.У. та інш., 1981]. Активність комплементу визначали в сироватці крові за 50% гемолізом еритроцитів барану. Для оцінки стану клітинної ланки імунної системи організму робітників визначали відносний вміст Т-лімфоцитів, включаючи субпопуляції теофілін-резистентних і теофілін-чутливих лімфоцитів з підрахуванням імунорегуляторного індексу (їх співвідношення), і В-лімфоцитів в периферичній крові методам розеткоутворення, згідно методичних вказівок Р.В. Петрова.

Показниками стану гуморального імунітету, зокрема В-клітин, є співвідношення сироваткових імуноглобулінів. Концентрацію основних класів сироваткових імуноглобулінів (IgG, IgA, IgM) визначали методом радіальної імунодиффузії в агарі по G. Mancini. Здатність антитіл утворювати імунні комплекси з екзо- і ендогенними антигенами, порушення механізмів їх елімінації може стати причиною системної або органної патології. Тому виявлення циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) в периферичній крові є одним з важливих діагностичних тестів. У даній роботі ЦІК визначали фотометричним методом, суть якого полягає в преципітації циркулюючих в кров'яному руслі імунних комплексів за допомогою поліетіленгліколю М=6000 і зміною оптичної густини розчину. Про кількісний вміст ЦІК судили по різниці оптичної густини розчину з поліетіленгліколем і без нього.

Для профілактики порушень імунологічної реактивності у обстежених нами працівників з цеху по виробництву слабо концентрованої азотної кислоти, використовували два препарати - харчова мінеральна добавка Neoselenium (Неоселен) і вітамінно-мінеральний комплекс Тріовіт. Загальним для цих двох препаратів було те, що вони обидва містили селен: в Неоселені у вигляді розчину селеніту натрію (1мг/мл), в одній капсулі Тріовіта - 50 мкг. Крім того, до складу капсули Тріовіту входять: провітамін А - бета-каротин (10 міліграм) , токоферола ацетат - вітамін Е (40 міліграм), аскорбінова кислота - вітамін С (100 міліграм).

У дослідженні взяли участь 34 працівники цеху (змішана група - чоловіки, жінки), які були розбиті на 2 групи. Кожна з них складалася з 2 підгруп. Першу групу склали 15 чоловік, у яких в результаті попередніх досліджень виявлено знижений вміст селену в крові (58.203.64 мкг/л проти середньо популяційного рівня 72.311.28, p<0.05). Частина з них (7 чоловік) щодня одержували 100 мкг Неоселену, а друга підгрупа (8 чоловік) - плацебо. Друга група складалася з 19 чоловік. З них 9 чоловік щодня приймали по 2 капсули Тріовіту, а 10 чоловік - плацебо. Таким чином, обидві групи обстежених, які приймали препарати, одержували однакову добову дозу селену (100 мкг) і розрізнялися по його вмісту в крові. Обидва препарати (Неоселен, Тріовіт) і плацебо приймалися учасниками обстеження перед початком робочої зміни.

Дослідження проведені в березні-травні місяці в період максимального сезонного навантаження виробничих факторів на працюючих цеху по виробництву слабо концентрованої азотної кислоти. Результати досліджень впливу Тріовіту та Неоселену на стан імунологічної реактивності організму учасників обстеження порівнювали з гематологічними, цитохімічними та імунологічними показниками у вихідному стані та у динаміці через 2,4,6 тижнів основного їх етапу та через 6 тижнів після припинення прийому препаратів.

Результати проведених досліджень оброблені статистично з обчисленням t-критерію Стьюдента [С.Гланц, 1999].

Результати та їх обговорення. Гігієнічними дослідженнями умов праці встановлена наявність впливу NO₂ на працівників цеху з виробництва слабо концентрованої азотної кислоти (апаратники, оператори, машиністи компресорних установок, слюсарі-ремонтники) на низьких рівнях - середньо змінні концентрації протягом року в межах 0,9-1,3 мг/м³ (ГДК - 2,0 мг/м³ ). Однократний добовий автоматичний моніторинг повітря робочої зони в цеху за допомогою прибору Gaz analyzer (фірма АІМ, США) виявив короткочасні пікові викиди NO_x ( 76,0 ppm з тривалістю перевищення ГДК до 10 хвилин і 150,0 ppm з тривалістю перевищення ГДК до 3 хвилин). Аналогічний моніторинг атмосферного повітря на території заводу не виявив значимого збільшення концентрації NO_x. Мікрокліматичні умови в цеху в холодний і перехідний сезони року зберігались в межах норми, а в теплий сезон року в жаркі дні температура повітря перевищувала норматив на 2⁰С. Відносна вологість повітря, швидкість його руху була в межах нормативів. Рівні загальної вібрації в цеху не перевищували ГДР. В деяких зонах цеху (відділ компресії) рівні виробничого шуму склали 87-99 дБА (ГДР 80 дБА), але на відповідних робочих місцях встановлені шумозахисні кабіни, рівень шуму в яких в межах норми.

На території міста, де розташований хімічний завод в атмосферному повітрі встановлено перевищення гігієнічних нормативів для ряду хімічних речовин (NO₂, формальдегіду, монооксиду вуглецю), що в сукупності з іншими забруднювачами формує несприятливу екологічну ситуацію на 62,5% його території.

За гематологічними показниками виявлено переважання макрофагальної клітинної захисної реакції за рахунок помірно вираженого відносного моноцитозу (зниження індексу співвідношення нейтрофілів та моноцитів (8,5±0,2 проти контролю 21,8±0,3) більш виражене в основній групі, а також включення афекторної клітинної ланки в імунній відповіді організму (зниження індексу співвідношення лімфоцитів та моноцитів (5,2±0,2 проти контролю 12,3±0,3).Останнє може засвідчувати про реалізацію аутоімунного процесу в організмі.

У обстежених працюючих обох груп знайдене порушення ФАН периферичної крові, яке характеризувалося зменшенням відносної кількості активних фагоцитів (ФІ) і збільшенням середнього числа поглинених одним фагоцитом часточок латексу (ФЧ) (табл.1). При цьому інтенсивність окисно-відновних процесів в нейтрофілах (спонтанний НСТ-тест) була істотно збільшеною (3,6-3,9 рази), а їх функціонально-метаболічні резерви (по різниці між спонтанним і стимульованим НСТ-тестом) виявлялися різко зниженими - до 2,7 і 4,2 проти 7,8 у донорів. Дані порушення поєднувалися із зниженням активності внутріклітинних ферментів, що забезпечують енергетичну і функціональну активність даної популяції клітин (СДГ, Г-6-ФДГ). Останнє було більш виражене у працюючих основних професій.

Активність комплементу сироватки крові у працюючих обох груп була зниженою на 34,8-37,0%, вміст низькомолекулярних ЦІК - на 7,5-12,5%, тоді як вміст високомолекулярних ЦІК в сироватці, навпаки, був збільшеним на 85,7-92,8%.

Отже, комплекс чинників виробничого середовища однонаправлено впливав на стан неспецифічної резистентності організму, але кількісно більш виражено в основній групі.

У обстежених обох груп виявлені також однонаправлені порушення в клітинній ланці імунної системи. Вони виявлялися вираженим однаковою мірою зниженням відносного вмісту популяцій Т- і В-лімфоцитів і субпопуляції теофілін-резистентних Т-лімфоцитів (Т-лімфоцити-хелпери) в периферичній крові в порівнянні з групою донорів.

Відносний вміст в крові субпопуляції Т-лімфоцитів-супресорів у працюючих обох груп не змінювався. При цьому у них істотно знижувався іммунорегуляторний індекс - у працюючих з групи порівняння до 1,7, в основній групі - до 2,2 в порівнянні з групою донорів (3,8). У сироватці крові обстежених виявлені підвищені рівні IgG і IgM, тоді як концентрація IgA, навпаки, була зниженою.

Приведені дані свідчать про те, що в обох групах працівників спостерігався комбінований вторинний (придбаний) імунодефіцит по Т- і В-клітинному типу, який супроводжувався порушенням синтезу сироваткових імуноглобулінів основних класів. Слід зазначити, що у працюючих основних професій спостерігалася тенденція до збільшення концентрації IgM в сироватці крові в порівнянні з працівниками групи порівняння, що вказувало на наявність у них більш вираженого екзогенного подразника на імунну систему.

Аналіз стану імунологічної резистентності організму залежно від статі обстежених показав, що імунна система жінок більш чутлива до дії комплексу виробничих чинників хімічного заводу в порівнянні з чоловіками. У них виявлено зниження активності ферментів СДГ і Г-6-ФДГ в нейтрофілах, нижча інтенсивність окисно-відновних процесів в по результатам НСТ-теста та комплементу в сироватці крові, а також високий вміст високомолекулярних ЦІК.

У працівників хімічного заводу з виробництва азотної кислоти спостерігались якісні і кількісні зміни у відповідь реакції організму, які відображали особливості його пристосованої реакції при дії NO_x в залежності від стажу. Виявлені порушення неспецифічної резистентності організму в вигляді стимуляції окисно-відновної реакції в фагоцитах, зниження рівня комплементу в сироватці крові (50,4±0,4 відповідно 92,0±1,0) і імунологічної реактивності - зниження Т-лімфоцитів (52,6±7,9 та 53,3±6,7 проти контрольних значень 72,3±0,8%), Тh (28,7±6,9 та 30,8±10,1 відповідно 57,2±1,5%), підвищення рівня IgM і IgG, зниження IgА, розвиток лейкопенії, були характерними для працюючих в стажевій підгруппі до 1 року. Розвивалась еозинофілія як ознака подразнення еозинофільного ростка кістковомозкового кровотворення ) при стажі роботи більш 10 років.

На підставі результатів проведених імунологічних досліджень можна зробити висновок, що у обстежених працівників хімічного заводу, як у контактуючих у виробничих умовах з оксидами азоту (основна група), так і у тих, що не мають професійного контакту з NОx (група порівняння) виявлені однонаправлені порушення імунологічної реактивності організму, що свідчать про формування вторинного комбінованого імунодефіциту. Вони характеризувалися порушенням стану неспецифічної резистентності організму, що виявлялося зменшенням кількості активних відносно фагоцитозу нейтрофілів в периферичній крові, збільшенням їх поглинаючої здатності, стимуляцією внутріклітинних окислювально-відновних процесів на фоні зниження функціонально-метаболічних резервів даного пулу клітин і дезорганізації гуморальних впливів, регулюючих фагоцитоз (зниженням титру комплементу, вмістом низькомолекулярних і збільшенням високомолекулярних ЦІК в сироватці крові); зниженням відносного вмісту в периферичній крові Т- і В-лімфоцитів і субпопуляції Т-клітин з хелперною активністю; збільшеним вмістом в сироватці крові IgG, IgM і зниженим IgA.

Слід зазначити, що вміст в крові ЦІК є одним з компонентів нормальної імунної відповіді, що закінчується нейтралізацією і елімінацією з організму надлишку циркулюючого антигену або аутоантигену. Проте, при виявленому нами у обстежених обох груп порушенні фагоцитарної функції в умовах надлишку антигену циркулюючі імунні комплекси (особливо низькомолекулярні, рівень яких понижений в крові обстежених) можуть фіксуватися в судинах і базальних мембранах деяких внутрішніх органів (наприклад, нирок) і викликати запальну реакцію, а також сприяти аутосенсибілізаціі, приводити до порушення мікроциркуляції і іншим патологічним і імунопатологічним процесам. На користь можливості реалізації такого патологічного процесу також свідчить зниження рівня комплементу в сироватці крові обстежених, що може вказувати на підвищене його зв'язування в ЦІК.

Таким чином, імунологічними дослідженнями підтверджені результати гігієнічного моніторингу умов праці в цеху по виробництву слабо концентрованої азотної кислоти і моніторингу стану атмосферного повітря на території міста, в межі якого розташований хімічний завод, що свідчили про несприятливий вплив промислових забруднювачів на імунологічну реактивність організму обох груп обстежених.

У обох групах обстежених працівників найбільш виражені порушення стану неспецифічної резистентності і імунологічної реактивності організму спостерігалися в малостажованій групі (до 1 року), а також у жінок в порівнянні з чоловіками. Деякі з виявлених порушень імунологічної реактивності були більш вираженими у працівників цеху з виробництва слабо концентрованої азотної кислоти, ніж у працівників з групи порівняння. До них слід віднести:

- пригнічення активності внутрішньоклітинних ферментів в нейтрофілах периферичної крові, які забезпечують метаболізм глюкози;

- збільшення концентрації IgM в сироватці крові, що свідчить про наявність більш вираженого екзогенного дратівливого впливу на імунну систему;

- істотніше пригнічення ФАН периферичної крові у чоловіків і активності ферментів метаболізму глюкози (СДГ, Г-6-ФДГ) в нейтрофілах у жінок в порівнянні з донорами;

- зниження відносного вмісту в крові Т-лімфоцитів - супресорів і пов'язане з ним зменшення супресорних регуляторних впливів в імунній системі в стажевих підгрупах більше 2 років;

- більш виражене зниження відносного вмісту в крові В-лімфоцитів в стажевих підгрупах більше 2 років.

Виявлені зміни пов'язані з тим, що працівники основних професій зазнавали впливу на робочих місцях додатковій постійній дії NО_x в низьких концентраціях, а також короткочасним (піковим) викидам NО₂ і NО з повітря робочої зони в концентраціях, що значно перевищують ГДК (до 30 разів).

За даними літератури [Чернушенко Е.Ф., 1978.], зниження відносного вмісту Т-і В- лімфоцитів, а також Т-клітин з супресорною функцією в периферичній крові, зменшення рівня сироваткового IgA, а також збільшення концентрації IgG, IgM в сироватці крові, особливо на фоні порушення показників неспецифічного захисту організму, приводить до підвищення його чутливості до збудників інфекційних захворювань і поєднується з розвитком хронічних неспецифічних захворювань легенів, зокрема хронічного бронхіту. Тому, ґрунтуючись на літературних даних і одержаних нами результатах досліджень працівників хімічного заводу, особливо зайнятих на виробництві слабо концентрованої азотної кислоти, що зазнають впливу NО_x, слід віднести до групи ризику розвитку бронхолегеневої патології, зокрема, хронічного бронхіту.

В цілому, підводячи підсумок проведеним гематологічним і імунологічним дослідженням, слід підкреслити наступну обставину. Першими і специфічними реакціями організму на екзогенну дію різної природи є клітинні реакції, пов'язані з перерозподілом кількісного вмісту окремих популяцій клітин в периферичній крові і порушенням їх внутрішньоклітинного гомеостазу. Тоді як глибші порушення імунологічної реактивності, завжди наступають пізніше і в більшій мірі характеризуються в своїх проявах рисами неспецифічності і деякою типовістю, властивою для вторинних імунопатологічних реакцій - один з варіантів придбаного імунодефіциту, аутоіммунного або імунокомплексного патологічного процесу, оскільки реалізуються з участю однотипових патогенетичних механізмів. Підтвердженням цьому в наших дослідженнях є виявлені відносно специфічні за даними літератури для дії оксидів азоту порушення в стані гема, лейкограми і активності деяких ключових ферментів в лейкоцитах периферичної крові у обстежених працівників основної групи. Тоді як виявлені порушення імунобіологічної реактивності організму за показниками стану неспецифічної резистентності організму, клітинної і гуморальної ланок імунітету характеризувалися певною однонаправленістю і розрізнялися тільки кількісно у осіб як основної групи, так і групи порівняння.

Як відомо, попередження захворювань, будь-яких порушень здоров'я є більш гуманнішим, ефективним і, на кінець, більш економічним у порівнянні з найсучаснішими засобами лікування хворих. Отже, визначальним етичним принципом у медицині є пріоритет профілактики [Кундиев Ю.И., 2003].

Виявленні порушення імунологічної реактивності організму працюючих з основної групи, послужили підставою для обґрунтування проведення у них профілактики препаратами Тріовіт і Неоселен.

Суттєвий вплив препаратів на стан імунологічної реактивності спостерігався через 4 - 6 тижнів їх застосування. Деякі ефекти зберігалися і через 6 тижнів після їх відміни. Тому ми наводимо тільки дані, одержані через 6 тижнів застосування препаратів і через 6 тижнів після їх відміни. Доцільність проведення та ефективність профілактики виявлених порушень імунологічної реактивності організму працюючих цеху з виробництва азотної кислоти хімічного підприємства підтверджена наступними даними:

- чіткою тенденцією до нормалізації порушених клітинних захисних реакцій організму, що засвідчувало про покращення його адаптаційних можливостей. Зокрема, співвідношень між мікрофагальною та макрофагальною реакціями захисту (СНМ - 12,0±1,8) та еффекторною і аффекторною ланками імунної відповіді (нормалізація СЛМ - 9,1±1,3), за відсутності суттєвого впливу на основні показники стану периферичної крові та структуру лейкограми;

- активацією через 6 тижнів пригнічених у вихідному стані процесів енергозабезпечення в популяціях лейкоцитів периферичної крові (нейтрофіли, лімфоцити, моноцити, еозинофіли). Особливо аеробного гліколізу за рахунок активізуючого впливу на мітохондріальні окисно-відновні і дихальні метаболічні процеси (фермент сукцинатдегідрогеназа), та підсилення їхніх окислювальних і бактерицидних властивостей (фермент мієлопероксидаза). Меншою мірою Неоселен впливав на позамітохондріальні шляхи енергозабезпечення, пов'язані з інактивацією активних форм кисню у фагоцитах та реалізацією ними специфічних клітинних функцій, зокрема фагоцитарною активності (фермент глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа). При цьому виявлялася суттєво більша ефективність застосування Тріовіту у порівнянні з Неоселеном.

- ефективність проведеної профілактики імунологічної реактивності підтверджувалася також нормалізацією (27,1±4,0) зниженого (10,3±1,0%) вмісту у периферичній крові Т-лімфоцитів-супресорів до їхнього рівня у донорів, що сприяло відновленню зниженого імунорегуляторного індексу до 1,8-2,4, про це свідчила нормалізація хелперно-супресорного співвідношення в периферичній крові. Це засвідчувало в цілому покращення регуляторних процесів в імунній системі.

- підвищенням вмісту селену у крові селен-дефіцитних осіб до середньо популяційного рівня за відсутності суттєвого впливу на його рівень у осіб з нормальним вмістом.

Таким чином, використання мінеральної добавки Неоселен та вітамінного комплексу Тріовіт у осіб, що зазнають хронічного впливу низьких рівнів NO_х, сприяє відновленню порушених регуляторних механізмів в імунній системі та покращенню адаптаційних можливостей організму. Пропонований спосіб профілактики імунного гомеостазу дозволяє зменшити вираженість несприятливого впливу NO_х, з виробничого середовища.

Доцільне курсове застосування Не оселену та Тріовіту протягом 1,5-2 місяців, особливо у весняно-літній та осінньо-зимовий сезони року, працівниками основних та допоміжних професій хімічних заводів, які зазнають впливу оксидів азоту з виробничого середовища.



ВИСНОВКИ

1. Науково обґрунтована необхідність застосування фармакологічних препаратів для профілактики порушень імунної системи при хронічній дії низьких концентрацій оксидів азоту і встановлена ефективність використання мінеральної харчової добавки Неоселен і вітамінно-мінерального комплексу Тріовіт, на підставі результатів гігієнічного моніторингу стану виробничого середовища, умов праці працівників цеху з виробництва слабо концентрованої азотної кислоти і виявлених порушень імунологічної реактивності організму.

2. Гігієнічний моніторинг якості повітря робочої зони на робочих місцях основних професій цеху з виробництва слабо концентрованої азотної кислоти показав, що обстежені основної групи зазнають хронічного впливу низьких рівнів оксидів азоту (0,9-1,3мг/м3), середньозмінні концентрації не перевищували гігієнічні нормативи, за винятком короткочасних пікових викидів ( 76,0 ppm з тривалістю перевищення ГДК до 10 хвилин і 150,0 ppm з тривалістю перевищення ГДК до 3 хвилин).

3. Виявлені порушення імунологічної реактивності в основній групі обстежених, які відрізнялися від контрольної групи і групи порівняння за наступними показниками: пригнічення активності внутріклітинних ферментів, що забезпечують мітохондріальний і позамітохондріальний метаболізм глюкози в нейтрофілах; збільшення концентрації IgM в сироватці крові, що свідчить про наявність більш вираженого екзогенного впливу на імунну систему; пригнічення ФАН периферичної крові, зниження відносного змісту Т- і В-лімфоцитів, а також Т-клітин з супресорною функцією, що в цілому розширює уявлення про механізм хронічної біологічної дії низьких (нижчих ГДК) рівнів NО_х.

4. Виявлені порушення імунологічної реактивності у обстежених основних професій підтверджені особливостями порушення клітинного складу крові: лімфоцитоз і нейтрофілопенія, що свідчать про наявність подразнення, відповідно, лімфоцитарного і нейтрофільного ростків кістковомозкового кровотворення; переважання макрофогальної клітинної захисної реакції за рахунок помірно вираженого моноцитозу (зниження СНМ), а також аффекторної клітинної ланки в імунній відповіді організму (зниження СЛМ). Останнє може свідчити про можливу реалізацію аутоімунного процесу.

5. Для осіб в стажевій підгрупі до 1 року були характерними більш виражені порушення стану неспецифічної резистентності організму (стимуляція окисно-відновних реакцій у фагоцитах, зниження рівня комплементу в сироватці крові) і імунологічної реактивності (зниження Т-лімфоцитів, Тh, IgА, підвищення IgM і IgG), розвиток лейкопенії. Еозінофілія при більшому стажі роботи може бути ознакою подразнення еозінофільного ростка кістковомозкового кровотворення.

6. Імунна система жінок більш чутлива до дії комплексу виробничих чинників хімічного заводу, включаючи NО_х, в порівнянні з чоловіками: підвищена активність ферментів СДГ і Г-6-ФДГ в нейтрофілах і комплементу в сироватці крові, вміст високомолекулярних ЦІК в сироватці крові значно вище і нижча інтенсивність окисно-відновних процесів в нейтрофілах.

7. Застосування профілактики порушень імунної системи з використанням харчової мінеральної добавки Неоселен і вітамінного комплексу Тріовіт виявила сприятливий їх вплив на організм обстежених, яке виявлялося у чіткій тенденції до нормалізації порушених співвідношень в клітинних реакціях імунного захисту організму, що засвідчувало про покращення його адаптаційних можливостей; активації процесів енергозабезпечення в лейкоцитах периферичної крові, особливо аеробного гліколізу, посиленні окисно-відновних і бактерицидних властивостей лейкоцитів; збільшенням кількості Т-лімфоцитов-супресорів, яке сприяло нормалізації зниженого імунорегуляторного індексу і засвідчувало покращення регуляторних процесів в імунній системі. При використанні для профілактики препарату Неоселен відбувалося підвищення вмісту селену в крові (73,71мкг/л) у селен-дефіцитних осіб до середньо популяційного рівня (87,57 мкг/л).

8. На підставі проведених досліджень для профілактики і корекції порушень стану імунологічної реактивності організму рекомендоване курсове, протягом 1,5-2 місяців, застосування Неоселена і Тріовіта працівникам основних та допоміжних професій хімічних заводів, які зазнають впливу оксидів азоту з виробничого середовища.



СПИСОК ОПУБЛУКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.Стежка В.А., Дмитруха Н.Н., Покровськая Т.Н., Билько Т.А., Палийчук С.П., Терещенко В.Г. Влияние оксидов азота на иммунологическую реактивность организма рабочих химического завода // Довкілля та здоров'я . -2003. - №1(24). - С.31-37. (Дисертантом проведені експериментальні дослідження та статистична обробка результатів).

2. Билько Т.А. Влияние оксидов азота на состояние периферической крови у рабочих производства азотной кислоты // Гигиена труда. - 2004.- Сборник 35.-С.71-80.

3. Bilko T.A., Dmytrukha N.M. Effect of air pollutants on immune system state of chemical factory workers. XVIII Annual International Occupational Ergonomics and Safety Conference, Houston, USA, May 19-22, 2004. P. 254-257

4. Билько Т.А. Влияние витаминного комплекса Триовит на клеточный состав периферической крови у рабочих производства азотной кислоты // Експериментальна та клінічна медицина. - 2005. - №1.-С. 158-161.

5. Стежка В.А., Витте П.Н., Дмитруха Н.Н., Билько Т.А., Кириченко Е.Е. Соблюдение принципов биоэтики при изучении влияния на организм человека промышленных загрязнителей городского воздуха // Матеріали міжнародної наукової конференції “ Етичні проблеми медицини праці та гігієни довкілля”, 9-10 грудня 2003р - Київ. - С.63-65. (Дисертантом проведено аналіз сучасної наукової літератури, проведені гематологічні та імунологічні дослідження).

6. Стежка В.А., Леоненко О.Б., Дмитруха Н.М., Покровська Т.М., Діденко М.М., Палійчук С.П., Білько Т.О., Мельник Ю.П., Зінченко В.М. Досвід застосування фармакологічної корекції гомеостазу при токсичних порушеннях. Етичні принципи // Матеріали міжнародної наукової конференції “ Етичні проблеми медицини праці та гігієни довкілля”, 9-10 грудня 2003р - Київ. - С.51-55. (Дисертантом проведено аналіз сучасної наукової літератури та імунологічні дослідження).

7. Стежка В.А., Леоненко О.Б., Дмитруха Н.М., Білько Т.О., Покровська Т.М., Мельник Ю.П., Зінченко В.М. Застосування з лікувально-профілактичною ціллю фармакологічної корекції стану гомеостазу у працівників хімічного виробництва // Збірка тез доповідей / Міжнародна науково-практична конференція “ Харчування як фактор формування здоров'я населення”, 15-16 травня 2003 р.- Київ. - С.80-81 (дисертантом проведені імунологічні дослідження та статистична обробка результатів).

8. Стежка В.А., Білько Т.О., Леоненко О.Б., Дмитруха Н.М., Покровська Т.М., Палійчук С.П., Мельник Ю.П., Зінченко В.М. Спосіб фармакологічної корекції гомеостазу у осіб, які зазнають впливу оксидів азоту з виробничого і навколишнього середовища та у побуті // Інформаційний листок Міністерства освіти і науки України, №008-04, 2004 - Київ.

Размещено на Allbest.ru

...