Фармакологічний аналіз центральних нейромедіаторних механізмів дії протисудомних препаратів

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень. Експериментальні дослідження проведені на 260 статевозрілих нелінійних білих щурах масою 160-220 г та на 680 нелінійних білих мишах масою 18-28 г обох статей, які були розведені у віварії Інституту фармакології та токсикології АМН України. Тварин утримували на стандартному водно-харчовому раціоні при вільному доступі до води та їжі. З метою проведення біохімічних досліджень щурів декапітували, евтаназія інших тварин здійснювалась передозуванням ефірного наркозу (Ю.М. Кожем'якін та співавт., 2002), згідно вимогам етичної комісії Інституту, щодо досліджень на лабораторних тваринах.

Дослідження нейромедіаторних механізмів дії досліджуваних протисудомних препаратів (фенобарбіталу, карбамазепіну, вальпроєвої кислоти, ламотриджину, фелбамату, топірамату) проведено за допомогою аналізаторів функціонування ГАМК-, гліцин-, глутамат-, адрен-, дофамін-, серотонін- та холінергічної нейромедіаторних систем (табл. 1).

Усі досліджувані протиепілептичні препарати уводили інтрагастрально (і/г) в умовно-терапевтичній дозі (1/10 від ЛД 50) за 1 год. до фармакологічних аналізаторів синаптичної передачі.

Відповідно до досліджуваних систем оцінювали здатність препаратів запобігати розвитку:

1. Вплив протисудомних засобів на функціонування нейромедіаторних систем головного мозку. При проведенні фармакологічних досліджень з використанням аналізаторів функціонування нейромедіаторних систем було виявлено, що механізм протисудомної дії як базових препаратів (фенобарбіталу, карбамазепіну, депакіну), так і препаратів нової генерації (ламотриджину, фелбамату і топірамату) має поліфункціональний нейромедіаторний профіль (рис 1-6).

Так, фенобарбітал має найбільш різноманітний нейромедіаторний профіль дії (рис. 1). Цей препарат має виражений вплив на систему ГАМК, активізує гліцинергічну передачу і проявляє холінергічну дію. Крім цього, фенобарбітал знижує активність глутамат- і норадренергічної систем і підвищує активність серотонінергічної системи. Така різноманітність нейромедіаторних ефектів фенобарбіталу з одного боку може пояснювати його потужний протисудомний вплив, а з іншого - може бути причиною чисельних побічних і токсичних проявів при клінічному застосуванні.

У механізмі дії карбамазепіну насамперед виступає його агоністична дія на ГАМКА рецептори і активація гальмівної гліцинергічної системи (рис. 2).

Депакін проявляє властивості агоніста ГАМКА рецепторів та виразно потенціює антихолінестеразну дію езерину. Одночасно з цим депакін активізує гальмівну серотонінергічну систему, має певну адренергічну та холінолітичну дії (рис. 3).

Ламотриджин має виражений вплив на ГАМК-, гліцин- та дофамінергічну системи (рис. 4).

В механізмі дії фелбамату (рис. 5) домінує вплив на систему ГАМК та адренергічна дія. Певний вплив фелбамат має і на функціонування дофамін- і холінергічної систем.

Домінуючим в механізмі дії топірамату є його вплив ГАМКергічну систему (рис. 6) та потенціювання антихолінестеразної дії езерину. Крім цього, топірамат змінює функціонування адрен- і дофамінергічної систем.

Таблиця 2. Вплив протиепілептичних препаратів депакіну, фенобарбіталу, карбамазепіну, ламотриджину, топірамату, фелбамату на вміст нейромедіаторів норадреналіну та дофаміну в мозку щурів (M ± m, n=6)

Примітка. В цій та в табл. 3 * p<0,05 у порівнянні з контролем.

Таблиця 3. Вплив протиепілептичних препаратів депакіну, фенобарбіталу, карбамазепіну, ламотриджину, топірамату, фелбамату на вміст нейромедіаторів серотоніну та триптофану в мозку щурів (M ± m, n=6)

Отримані дані (табл. 2-3) свідчать про те, що найбільш активними щодо змін рівнів моноамінів мозку є фенобарбітал, депакін та топірамат. Так, фенобарбітал підвищував рівень норадреналіну і дофаміну в лівій півкулі та вірогідно підвищував рівень триптофану у лівій і правій півкулях, що є передумовою підсилення біосинтезу серотоніну. Депакін домінантно підвищував вміст дофаміну та серотоніну в правій півкулі.. Топірамат вірогідно підвищував рівень усіх досліджуваних моноамінів в правій півкулі мозку. Карбамазепін та ламотриджин проявляли домінантну дію щодо вмісту норадреналіну у правій півкулі. Фелбамат не приводив до статистично значимих змін рівнів досліджуваних моноамінів. Всі досліджувані прелати згладжували міжпівкульову асиметрію співвідношення НА/ДА.

Встановлена виражена латералізація дії протиепілептичних препаратів на вміст моноамінів у мозку дає змогу цілеспрямовано корегувати порушення нейромедіаторного балансу в залежності від локалізації епілептичного вогнища в лівій або правій півкулі та індивідуального домінування півкуль за сенсорними і руховими показниками у хворих епілепсією.

3. Дослідження ефективності цілеспрямованої комбінації протисудомних засобів. У випадках рефрактерної епілепсії клініцисти звертаються до комбінованої терапії - призначають два, або три протисудомних засоби. Але підбір комбінації протисудомних препаратів в таких випадках здійснюється, переважно, клініко-емпіричним шляхом. Отримані результати дають підстави вважати, що у випадках рефрактерної епілепсії, найімовірніше, не відбувається збіг нейромедіаторного профілю патогенезу конкретної клінічної форми захворювання з нейромедіаторними профілями механізмів дії антиепілептичних засобів. Виходячи з цього, можна вважати, що експериментально обґрунтованими оптимальними комбінаціями протисудомних засобів будуть ті препарати, які взаємно поповнюють бракуючі нейромедіаторні профілі дії кожного з них.

Аналіз отриманих результатів вказує, що такими комбінаціями можуть бути депакін з ламотриджином та карбамазепін з топіраматом. Вказані комбінації складаються з протиепілептичних препаратів першої лінії і протисудомних препаратів нового покоління. Це підтверджує і клінічна практика. протиепілептичний препарат нейромедіаторний протисудомний

Для дослідження протисудомної дії таких комбінацій були проведені судомні тести з використанням бікукуліну, коразолу, тіосемікарбазиду та стрихніну. Вказані препарати уводилися внутрішньошлунково в дозах у 2 рази менших (1/20 від ЛД 50), ніж умовно-терапевтичні (тобто 1/10 від ЛД 50). Така постановка дослідів щодо підбору доз була обумовлена необхідністю виявити можливість взаємопідсилюючої дії комбінацій депакін + ламотриджин і карбамазепін + топірамат.

Було встановлено, що запропоновані комбінації мають сильну протисудомну дію в досліді з тіосемікарбазидом (табл. 4).

Можна вважати, що ці комбінації будуть найбільш ефективними в тих випадках фармакотерапії епілепсії, де провідною ланкою патогенезу є порушення біосинтезу, метаболізму і функції ГАМК.

4. Квантовохімічне дослідження взаємодії протиепілептичних препаратів з ключовими амінокислотами ГАМК_А рецептора. З наших дослідів виявлено, що всі досліджувані протиепілептичні препарати опосередкують свою дію через систему ГАМК. Тому є важливим дослідження взаємозв'язку між протиепілептичною дією препаратів, їх електроною будовою та енергетичними характеристиками їх взаємодії з "ключовими" амінокислотами ГАМКА рецептора.

В табл. 5 приведені енергетичні характеристики граничних молекулярних орбіталей ГАМК та досліджуваних протиепилептичних препаратів (ЕВЗМО - енергія вищої заповненої молекулярної орбіталі та ЕНВМО - енергія нижчої вільної молекулярної орбіталі), що відповідно характеризують електронодонорні та електроноакцепторні властивості. Найкращі електронодонорні властивості мають ламотриджин та карбамазепін, тоді як електроноакцепторні - ламотриджин, топірамат та карбамазепін.

Аналіз рядів протисудомної активності препаратів та їх енергетичних характеристик показав, що задовільного узгодження між цими характеристиками не виявлено. Це дає підставу вважати, що протиепілептичну активність препаратів не можна пояснити їх взаємодією з молекулами антиконвульсантів. Вважаємо, що в таких системах протисудомна дія препаратів обумовлена конкуренцією між препаратами і конвульсантами за місця зв'язування з активними ділянками ГАМКА рецептора.

Таблиця 5. Квантовохімічні характеристики енергій молекул ГАМК, фенобарбіталу, карбамазепіну, вальпроєвої кислоти, ламотриджину, фелбамату, топірамату

Примітка. * - для квантовохімічного розрахунку взяли молекулу вальпроєвої кислоти, оскільки саме ця молекула є активним інгредієнтом депакіну.

Згідно літературних даних (D.A. Wagner, C. Czajkowski, 2001, A.K. Mehta, M.K. Ticku, 1999), ключовими амінокислотними послідовностями ГАМКА рецептору є: Ser¹⁵⁶-Tyr¹⁵⁷-Gly¹⁵⁸-Tyr¹⁵⁹-Thr¹⁶⁰-Thr¹⁶¹ (І) і Thr²⁰¹-Thr²⁰²-Gly²⁰³-Ala²⁰⁴-Tyr²⁰⁵-Pro²⁰⁶ (ІІ) в2 субодиниці, Val⁶⁴-Phe⁶⁵-Phe⁶⁶-Arg⁶⁷ (ІІІ), Thr²⁵⁵-Val²⁵⁶-Phe²⁵⁷ (ІV) і Val²⁶²-Leu²⁶³-Thr²⁶⁴ (V) б1 субодиниці, які згідно даних цілеспрямованого мутагенезу відіграють важливу роль у провідності каналів хлору ГАМКА рецептора.

Для визначення активних ділянок послідовностей (I-V) нами розраховані локальні (за амінокислотами) функції густини стану (атоми С, N, O) у кожній з амінокислот цих послідовностей. Встановлено, що кращими як електронодонорними, так і електроноакцепторними властивостями в амінокислотних послідовностях володіють: у (І) - Tyr¹⁵⁷ і Tyr¹⁵⁹; у (ІІ) - Tyr²⁰⁵; у (ІІІ) - Phe⁶⁵ і Phe⁶⁶; у (ІV) - Phe²⁵⁷; у (V) - Thr²⁶⁴. Одержані дані збігаються з експериментальними результатами цілеспрямованого мутагенезу (D.A. Wagner, C. Czajkowski, 2001, A.K. Mehta, M.K. Ticku, 1999), які свідчать, що участь саме цих амінокислот є визначальною у зв'язуванні ГАМК та регуляції провідності хлорних каналів ГАМКА рецептора. Аналіз локальних за атомами функцій густини станів показує, що найбільший вміст у електронодонорні та електроноакцепторні властивості активних ділянок амінокислотних послідовностей (I-V) вносять: у (I) і (II) атоми С і O, у (III) та (IV) атоми С; у (V) атоми С, N і О.

?Е = -1,3 х F - 0,9;

r = 0,974; n = 5.

n - кількість препаратів; r - коефіцієнт кореляції, F - критерій Фішера.

Таблиця 6. Квантовохімічні характеристики енергії взаємодії систем "амінокислотна послідовність II + препарат, ГАМК"

За даними літератури (D.A. Wagner, C. Czajkowski, 2001), саме послідовність ІІ згадується як ділянка, відповідальна за зв'язування ГАМК та її агоністів, і яка відіграє важливу роль у провідності іонів Cl^-.

Одержані результати можуть бути корисними для направленого пошуку протиепілептичних препаратів з більш вираженими протисудомними властивостями. Критерієм цього вибору може бути енергія взаємодії між антиконвульсантами та структурними одиницями рецепторів нейротрансмітерів, зокрема, з амінокислотною послідовністю Thr²⁰¹-Thr²⁰²-Gly²⁰³-Ala²⁰⁴-Tyr²⁰⁵-Pro²⁰⁶ ГАМКА рецептору.

- ГАМК- система - препарат знижує кількість тварин з тонічними судомами та зменшує летальність на 57 % у досліді з букукуліном, на 80 % та 60 % зменшує відповідні показники у досліді з тіосемікарбазидом та попереджує виникненню тонічних судом та летальності у досліді з коразолом (р<0,05);

- гліцинергічна система - у досліді зі стрихніном під впливом фенобарбіталу тонічні судоми та летальність зменшуються на 60 %;

- глутаматергічна система - препарат зменшує летальність в 3 рази в досліді з каїновою кислотою;

- адренергічна система - повністю попереджує рухову гіперактивність та гіпертермію, викликану введенням сиднокарбу;

- серотонінергічна система - препарат повністю запобігає резерпіновій гіпотермії;

- холінергічна система - фенобарбітал попереджує розвиток судомного синдрому, викликаного нікотином (р<0,05).

2. У функціональному плані карбамазепін змінює активність ГАМК- і гліцинергічної систем (попереджаючи тонічні судоми і знижуючи летальність на 57 % у досліді з бікукуліном, та знижуючи на 50 % тонічні судоми і на 70 % летальність у досліді зі стрихніном).

3. Депакін має властивості агоніста ГАМКА рецептора (попереджує тонічні судоми та летальність тварин при дії коразолу, р<0,05). Також препарат проявляє виражену антихолінестеразну дію (потенціює прояви, викликані езерином, р<0,05) та активізує гальмівну серотонінергічну систему (попереджує симптоми, викликані резерпіном).

4. Ламотриджин потенціює ГАМК та гліцинергічну системи (повністю попереджує тонічні судоми та знижує летальність на 60 % в досліді з тіосемікарбазидом і на 60 % знижує тонічні судоми та летальність у досліді зі стрихніном). Вплив препарату на дофамінергічну систему проявляється у збільшенні латентного періоду апоморфінової стереотипії у 2 рази та зменшенні тривалості стереотипії в 1,3 рази.

5. Фелбамат має виражений вплив на ГАМКергічну систему (попереджує тонічні судоми та летальність у досліді з бікукуліном (р<0,05), запобігає розвитку судомного синдрому в досліді з тіосемікарбазидом, попереджує розвиток тонічних судом (р<0,05) та на 50 % знижує летальність у досліді з коразолом). Фелбамат попереджує рухову гіперактивність та гіпертермію, викликані введенням сиднокарбу (р<0,05). Препарат потенціює гальмівну дофамінергічну систему (знижує прояви каталепсії, викликані галоперидолом та потенціює стереотипію, викликану апоморфіном (р<0,05)). Також препарат знижує активність адренергічної системи, попереджуючи розвиток тонічних судом та летальності, викликаних нікотином (р<0,05).

6. Для топірамату характерне потенціювання ГАМКергічної системи (повністю запобігає розвитку судомного синдрому, викликаного тіосемікарбазидом). Топірамат потенціює антихолінестеразну активність, викликаючи гіперсалівацію у 80 % тварин, та летальність у 50 % тварин при введенні езерину. Також препарат має вплив на адренергічну систему (попереджує розвиток гіпертермії, викликаної введенням сиднокарбу, р<0,05).

7. Виявлена домінантність дії досліджуваних протисудомних засобів на вміст моноамінів в тканинах лівої та правої півкуль головного мозку. Карбамазепін та ламотриджин підвищують рівень норадреналіну у правій півкулі в 1,9 рази, топірамат - у 1,7 рази. Фенобарбітал підвищує рівень норадреналіну в лівій півкулі в 1,5 рази.

Рівень дофаміну підвищується в правій півкулі під впливом депакіну у 1,4 рази, топірамату - у 1,5 рази, а в лівій - при дії фенобарбіталу (у 1,9 рази).

Рівень серотоніну підвищується в правій півкулі під впливом депакіну та топірамату у 2,1 рази. Рівень триптофану збільшується в 1,5 рази під впливом фенобарбіталу у правій та лівій півкулях. Топірамат підвищує рівень триптофану у 1,4 рази у правій півкулі.

8. Встановлена міжпівкульова асиметрія співвідношення вмісту норадреналін / дофамін (права півкуля 1/4, ліва - 1/2). Виявлено, що всі досліджувані протиепілептичні препарати згладжують міжпівкульову асиметрію співвідношення норадреналін / дофамін.

9. Обґрунтовано оптимальні комбінації антиепілептичних препаратів, а саме - депакін з ламотриджином та карбамазепін з топіраматом. Показано, що ці комбінації є найбільш ефективними у випадках, коли судомний синдром розвивається на фоні порушення метаболізму ГАМК.

10. Встановлено, що найбільш активні електронодонорні та електроноакцепторні ділянки амінокислотних послідовностей субодиниць ГАМКА рецепторів при їх взаємодії з дослідженими антиконвульсантами є Phe⁶⁵, Phe⁶⁶, Tyr¹⁵⁷, Tyr¹⁵⁹, Tyr²⁰⁵, Phe²⁵⁷, Thr²⁶⁴. Одержані результати підтверджують літературні дані цілеспрямованого мутагенезу щодо активності цих амінокислотних субодиниць у регуляції провідності каналів іонів хлору ГАМКА рецепторів.

11. На підставі вивчення протисудомної дії фенобарбіталу, карбамазепіну, депакіну, ламотриджину та фелбамату у дослідах з бікукуліном та розрахунку квантовохімічним методом енергетичних характеристик взаємодії цих препаратів з амінокислотною послідовністю Thr²⁰¹-Thr²⁰²-Gly²⁰³-Ala²⁰⁴-Tyr²⁰⁵-Pro²⁰⁶ ГАМКА рецептора, встановлена лінійна залежність між антисудомною активністю цих препаратів та їх енергією взаємодії Е з вказаною послідовністю, що дозволяє вести направлений пошук протисудомних засобів з більш вираженою антиконвульсантною активністю.

1. Євтушенко О.О. Нейромедіаторні механізми дії деяких протисудомних засобів // Ліки. - 2003. - №5-6. - С. 74-78.

2. Євтушенко О.О. Нейромедіаторний профіль дії протисудомних препаратів нового покоління Ламотриджину, Топірамату, Фелбамату // Клінічна фармація. - 2004. - Т.8, №2. - С. 47-50.

3. Євтушенко О.О. Особливості взаємодії протиепілептичних препаратів з амінокислотною послідовністю Thr²⁰¹ -Thr²⁰² - Gly²⁰³ - Ala²⁰⁴ - Tyr²⁰⁵ - Pro²⁰⁶ ГАМКА рецептора // Ліки. - 2004. - №3-4. - С. 94-97.

4. Євтушенко О.О. Асиметрична міжпівкульна дія протиепілептичних засобів на вміст моноамінів головного мозку // Журн. Акад. мед. наук України. - 2004. - Т.10, №3. - С. 563-568.

5. Громов Л.А., Евтушенко О.А., Куць В.С. Антиконвульсантная активность противоэпилептических препаратов и квантовохимическое моделирование их взаимодействия с рецептором ГАМКА // Укр. біохім. журнал. - 2004. - Т.76, №6. - С. 117-121. (Особистий внесок здобувача: проведення експериментів та комп'ютерних кванотовохімічних розрахунків, участь в аналізі та узагальненні отриманих даних).

6. Євтушенко О.О. Нейромедіаторні механізми протисудомної дії антиепілептичених засобів нового покоління (Топірамат, Фелбамат, Ламотриджин) // Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія: Тез. доп. - Харків, 2003. - Т. 2. - С. 74.

7. Євтушенко О.О. Особенности взаимодействия противоэпилептических препаратов с "ключевыми" аминокислотами ГАМКA рецептора // Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины: Материалы 5 молодеж. науч. конф. СО РАМН - Новосибирск, 2004. - С. 66-67.

8. Olga Yevtushenko, Leonid Gromov, Vladimyr Kouts. Quantum pharmacologic study of antiepileptic drugs and chemoconvulsants interaction with "key" amino acids of GABAA receptor // Journal of Psychopharmacology. - 2004. - Vol.18, №3, - P.A. 18.

9. Євтушенко О.О. Вплив протиепілептичних препаратів на вміст серотоніну, дофаміну, триптофану, норадреналіну в мозку щурів // Вчені майбутнього: Тез. доп. - Одеса, 2004. - С. 31.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.05 - фармакологія. - Інститут фармакології та токсикології АМН України, Київ, 2005.

В роботі теоретично обґрунтовується можливість індивідуального підбору протиепілептичних препаратів з урахуванням їх нейромедіаторного профілю дії. Встановлений індивідуальний профіль нейромедіаторної дії протиепілептичних препаратів першої лінії (фенобарбітал, карбамазепін, депакін) та нового покоління (ламотриджин, топірамат, фелбамат) на функціонування центральних нейромедіаторних систем. Показано, що по відношенню до моноамінів мозку, всі досліджувані протиепілептичні препарати, окрім фенобарбіталу, мають домінантний вплив на праву гемісферу. При цьому всі препарати згладжують міжпівкульову асиметрію співвідношення вмісту норадреналін / дофамін. На основі аналізу нейромедіаторних профілів дії досліджуваних протисудомних засобів обгрунтовані найбільш оптимальні комбінації антиепілептичних препаратів - депакін з ламотриджином та карбамазепін з топіраматом. Показано, що ці комбінації є найбільш ефективними у випадках, коли судомний синдром розвивається на фоні порушення метаболізму гамма-аміномасляної кислоти.

Методом квантової хімії виявлений зв'язок між антиконвульсантною активністю фенобарбіталу, карбамазепіну, депакіну, ламотриджину, фелбамату та енергетичними характеристиками взаємодії цих препаратів з амінокислотною послідовністю Thr²⁰¹-Thr²⁰²-Gly²⁰³-Ala²⁰⁴-Tyr²⁰⁵-Pro²⁰⁶ ГАМКА рецептора.