Донецьк - 2005

Дисертацією є рукопис. глюкоза кров щур

Робота виконана в Одеському державному медичному університеті Міністерства охорони здоров'я України.

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор Демидов Володимир Михайлович, Одеський державний медичний університет МОЗ України, професор кафедри загальної хірургії

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Бородін Олексій Дмитрович, Донецький державний медичний університет ім. М. Горького МОЗ України, професор кафедри акушерства, гінекології та перинатології ФПО

доктор медичних наук, професор Абрамов Андрій Володимирович, Запорізький державний медичний університет МОЗ України, професор кафедри патологічної фізіології

Провідна установа:

Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П.Комісаренка АМН України (м. Київ)

Захист відбудеться 16 вересня 2005 р. об 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 11.600.02 при Донецькому державному медичному університеті ім. М.Горького МОЗ України (83003, м. Донецьк, проспект Ілліча, 16).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Донецького державного медичного університету ім. М.Горького МОЗ України (83003, м. Донецьк, проспект Ілліча, 16).

Автореферат дисертації розісланий 18 липня 2005 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор медичних наук, професор Г.А. Ігнатенко

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Поширеність цукрового діабету (ЦД) в світі наростає з кожним роком (Балаболкин М.И., 1998; Ефимов А.С., Скробонская Н.А., 1998; Балаболкин М.И., Креминская В.М., 2000; Hedding-Eckerich M., Eckert M.W., 2000). Сьогодні фахівці, що працюють в області ендокринології та суміжних галузях медичної науки, констатують тривожний факт: захворювання на ЦД носить характер пандемії. Наприклад, тільки в такій забезпеченій і соціально захищеній країні, як США, щорічно реєструються 600000 нових випадків захворювання (Heitzer T. et al., 2001; Hounsom L. et al., 2001; Coppey L.J. et al., 2002). Вважається, що число хворих на ЦД становить 10% числа людей в популяції. В Україні до категорії хворих на ЦД відносять за статистичними даними на 2000 рік приблизно 5 млн. чоловік (Зелинский Б.А., Зелинский А.А., 1996; Ефимов А.С., Скробонская Н.А., 1998; Павловський М.П., Маркевич Ю.О., 2001; Щербак О.В., 2001).

ЦД - надзвичайно поширене захворювання, якому супутні зменшення тривалості життя, зниження її якості, висока та рання інвалідизація, а також висока вартість багаторічних лікувально-діагностичних заходів. Це ще раз примушує повернутися до детального дослідження і ширшого вивчення та обговорення питань, пов'язаних з терапією даного захворювання. Очевидно, що при складанні схем лікування ЦД необхідно враховувати патогенетичні механізми захворювання.

Пацієнти з ЦД зазнають на страждання не стільки від самого захворювання, скільки від його ускладнень, до яких слід віднести діабетичну периферичну полінейропатію (ДПП). Патогенетичні механізми даного стану різні, однак, переважним є патологічний вплив гіперглікемії та оксидативного стресу, а також стрес-обумовлені ураження невральної та периневральної тканин (Строков И.А. і соавт., 2000; Clemens А. et al., 1999; Androne L. et al., 2000; Cakatay U. et al., 2000; Biessels G.J. et al., 2001; Hounsom L. et al., 2001). В патогенезі ДПП важливу роль відіграють метаболічні порушення на ендотеліальному рівні, які згодом сприяють формуванню порушень перфузії нерва (Khamaisi M. et al., 1999; Evans J.L., Goldfine I.D., 2000; Haak E. et al., 2000). Це, у свою чергу, сприяє розвитку ішемії нерва; порівнянні дані в експериментальних та клінічних дослідженнях у тварин і пацієнтів з ЦД були одержані Stevens M.J. et al. (2000) та Packer L. et al. (2001).

Результати проведених досліджень дозволяють висловити гіпотезу про наявність раніше невідомої ланки в патогенезі ЦД - йдеться про залучення до розвитку даного захворювання та його ускладнень NO (NO) (Ивашкин В.Т., Драпкина О.М., 2000; Sasaki T. et al., 1998; Cho C.H., 2001). Зокрема, показано, що кількість NOS-позитивних нейронів в спинальних гангліях щурів із стрептозотоцин (СТЗ)-індукованим ЦД істотно зменшена (Sasaki T. et al., 1998).

Ці дані свідчать про можливу участь NO у формуванні периферичних полінейропатій. Відомою є роль NO у формуванні запальних реакцій (Wildhirt S.M. et al., 1995); показано, що NO продукується активованими макрофагами (Hibbs J.B. et al., 1988). При цьому цитостатичні та цитотоксичні ефекти макрофагів при запаленні реалізуються значною мірою через систему NO - шляхом активації NO-синтази, яка перетворює аргінін в NO (Недоспаев А.А., 1998; Cho C.H., 2001). Синтезований NO при гострому запаленні сприяє розвитку вазодилятації (найчастіше локальної), локальному пошкодженню паренхіми органу, що піддався запаленню, та його подальшої ішемізації (Satoh А. et al., 1994). Вказані ефекти NO сприяють також розвитку гострого запального ураження паренхіми підшлункової залози (ПЗ); загальновідомо, що такий ланцюговий процес попереджує формуванню ЦД, будучи одним з найважливіших патогенетичних чинників даного захворювання.

Враховуючи вищевикладене, акутальним є вивчення ролі NO та його метаболітів в патогенезі ДПП при СТЗ-індукованому ЦД. В ході такого дослідження ми використовували блокування активності NO-синтази за допомогою використання NG-нітро-L-аргініну та цилостазолу, а також вивчали фармакотерапевтичні ефекти пентоксифіліну та -ліпоєвої кислоти (ЛК), беручи до уваги роль численних судинних і оксидативних порушень в механізмах формування ДПП.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційні дослідження виконувалися в межах НДР кафедри загальної хірургії Одеського державного медичного університету (ОДМУ) по дослідженню регуляторних гормональних систем та їх природних метаболітів, а також впровадженню їх синтетичних аналогів як лікарських препаратів, (теми, затвердженої МОЗ України: “Розробка патогенетично обґрунтованих методів корекції ендотоксикозу і змін дифузної ендокринної системі у хворих з гострими захворюваннями черевної порожнини і запальними захворюваннями м'яких тканин”; № держреєстрації 0196U001839), Договору про наукову співпрацю між ОДМУ, інститутом фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України і Державним підприємством НДІ Фармакології Російської АМН “Принципы и методы фармакологической коррекции нарушений функций нервной системы в пред- и послеоперационном периоде у больных с острыми заболеваниями брюшной полости”, а також Договору про науково-технічну співпрацю між Управлінням охорони здоров'я Одеської обласної державної адміністрації, Управлінням охорони здоров'я м. Одеси та ОДМУ.

Дисертант є співвиконавцем вказаних НДР і договорів.

Мета дослідження. Вивчити патогенетичну роль NO в умовах СТЗ-індукованої діабетичної полінейропатії, а також розробити заходи експериментальної корекції діабетичної полінейропатії за допомогою використання препаратів, що блокують синтез NO.

Задачі дослідження.

1. Вивчити динаміку зміни концентрації глюкози в крові та маси тіла щурів за умов експериментальної діабетичної периферичної полінейропатії (ЕДПП) та вплив на ці показники речовин, що сприяють гальмуванню синтезу NO.

2. Дослідити динаміку зміни швидкості проведення збудження (ШПЗ) по периферичному нерву у щурів в умовах ЕДПП та вплив на даний показник речовин, що сприяють гальмуванню синтезу NO.

3. Дослідити зміни концентрації метаболітів NO - нітриту (NO2-) і нітратів
(NO3-) - в крові щурів на моделі ЕДПП, а також вплив на досліджувані показники речовин, що сприяють гальмуванню синтезу NO.

4. Дослідити зміни виразності процесів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) та антиоксидантного захисту в крові та тканині підшлункової залози (ПЗ) у щурів в умовах ЕДПП і вплив на досліджувані показники речовин, що сприяють гальмуванню синтезу NO.

5. Обґрунтувати механізми використання з профілактичною та лікувальною метою речовин, що сприяють гальмуванню синтезу NO, в умовах ЕДПП.

Об'єкт дослідження - щури з ЕДПП, викликаною введенням СТЗ.

Предмет дослідження - патогенетичні механізми ЕДПП, концентрація глюкози в крові; маса тіла; вміст метаболітів NO в крові; показники, які характеризують вираженість процесів ПОЛ та антиоксидантного захисту в крові та тканині ПЗ; ШПЗ по периферичному нерву та їх зміни в умовах блокади синтезу ендогенного NO з лікувальною та профілактичною метою у інтактних і експериментальних щурів за умов СТЗ-індукованої ЕДПП.

Методи дослідження - для досягнення поставленої мети були використані патофізіологічні, біохімічні, електрофізіологічні та статистичні методи.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше показано, що перебіг СТЗ-індукованої ЕДПП характеризується прогресивним збільшенням концентрації в крові метаболітів NO - нітратів та нітритів. При цьому встановлено, що у щурів за модельних умов відмічено прогресивне зростання концентрації глюкози крові, зменшення маси тіла та показників ШПЗ по хвостовому нерву тварин, збільшення концентрації в крові та тканині ПЗ проміжних продуктів ПОЛ, а також зниження активності антиоксидатних ферментів в крові та тканині ПЗ.

Автор вперше показав, що блокування синтезу NO на моделі СТЗ-індукованої ЕДПП за допомогою прямого інгібітору синтезу NO-синтази - NG-нітро-L-аргініну та інгібітору фосфодіестерази цАМФ - цилостазолу за умов лікувальної та профілактичної схем дії характеризується відновленням концентрації глюкози крові, нормалізацією маси тіла, показників ШПЗ по хвостовому нерву тварин, а також концентрації проміжних продуктів ліпопероксидації та активності антиокисидантних ферментів в крові та тканині ПЗ щурів. Лікувальна та профілактична ефективність NG-нітро-L-аргініну та цилостазолу відносно досліджуваних показників приблизно однакова.

Протягом виконання експериментальних досліджень вперше встановлено, що блокування синтезу NO в умовах СТЗ-індукованої ЕДПП за допомогою інгібітору фосфодіестерази цАМФ пентоксифіліну та ліпоєвої кислоти (ЛК) забезпечує нормалізацію досліджуваних показників. Лікувальна ефективність пентоксифіліну та ЛК відносно досліджуваних показників приблизно однакова, а профілактична ефективність пентоксифіліна перевершує таку у ЛК.

Практичне значення отриманих результатів. Одержані дані розширюють уявлення про патогенез СТЗ-індукованої ЕДПП в аспекті патогенетичної ролі в ній системи ендогенного азоту.

Вперше автором показано, що виражена лікувальна та профілактична ефективність використання речовин, які блокують синтез NO і нівелюють основні прояви СТЗ-індукованої ЕДПП, є експериментальним обґрунтовуванням доцільності їх включення в комплекс лікувальних та профілактичних заходів при діабетичній полінейропатії та ЦД в клініці.

На підставі одержаних результатів розроблені оригінальні рекомендації по лікуванню і профілактиці діабетичної полінейропатії. Результати досліджень впроваджені в практику роботи обласних Управлінь Охорони здоров'я України, Управлінь Охорони здоров'я міст Києва та Севастополя, а також Одеської обласної клінічної лікарні, Одеського обласного ендокринологічного диспансеру, Одеського обласного госпіталю інвалідів ВВВ, МКЛ №№ 1, 2, 10, 11 та 12 м. Одеси. Результати роботи включені в учбовий процес на кафедрах загальної і клінічної патофізіології та загальної хірургії ОДМУ.

Особистий внесок здобувача. Вибір напряму, об'єму та методів дослідження виконаний спільно з науковим керівником. Дисертант самостійно провів патентно-інформаційний пошук за темою наукового дослідження, сформулював цілі та задачі дослідження, провів експериментальні дослідження і виконав статистичну обробку одержаних результатів, виконав науковий аналіз, узагальнив отримані результати та сформулював основні положення і висновки дисертації.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи докладалися та отримали позитивну оцінку фахівців на Всеукраїнській науково-практичній конференції “Гнійно-септичні ускладнення в хірургії. Нові технології в хірургії XXI століття” (Яремча, 2002), VI міжнародному медичному конгресі студентів і молодих учених (Тернопіль, 2002), XLV Міжрегіональної науково-практичної конференції “Здобутки клінічної і експериментальної медицини” (Тернопіль, 2002), IV республіканської науково-практичної конференції з міжнародною участю “Нове у клінічній фармакології та фармакотерапії захворювань внутрішніх органів” (Харків, 2002), ІІ Всеукраїнської конференції “Актуальні питання невідкладної і відновної медицини” (Ялта, 2002), Всеукраїнській науково-практичній конференції “Актуальні питання теоретичної та практичної медичини” (Суми, 2002), науково-практичної конференції “Сучасні тенденції в хірургії XXI століття” (Київ, 2002), науково-практичної конференції “Сучасні напрямки розвитку ендокринології (Другі Данілевські читання)” (Харків, 2003), науково-практичної конференції, присвяченої 80-річчю з дня народження заслуженого діяча науки і техніки України професора А.Ф.Греджева “Хирургия гепатопанкреатодуоденальной зоны” (Донецьк, 2003).

Публікації. За матеріалами досліджень опубліковано 16 наукових робіт, зокрема 5 статей в профільних журналах, затверджених ВАК України, решта робіт - у збірниках конференцій та симпозіумів та тези. Надруковані практичні рекомендації, інформаційний лист, одержано 3 патенти України на винахід.

Структура і обсяг дисертації. Робота представлена на 164 сторінках машинописного тексту. Складається з введення, огляду літератури, списку матеріалів і методів досліджень, п'яти глав опису результатів власних досліджень, аналізу та узагальненню результатів, висновків і списку використаної літератури. Дисертація ілюстрована 32 таблицями та 7 рисунками. Список літератури містить 288 джерел, з них 216 - на іноземних мовах.

Основний зміст роботи

Матеріали і методи досліджень. Експериментальні дослідження були виконані в умовах хронічного експерименту на 510 статевозрілих щурах лінії Вістар масою 180-250 г; досліди виконували згідно положень, викладених у “Основних методах вивчення токсичності потенційних фармакологічних препаратів” (Фармкомітет України, Київ, 2000). Роботу з лабораторними тваринами проводили, додержуючись норм проведення дослідів, прийнятих комісією з етики проведення експериментальних досліджень ОДМУ, та правил, що передбачені Європейською комісією з нагляду за проведенням лабораторних та інших дослідів з участю експериментальних тварин різних видів.

Експериментальний цукровий діабет (ЕЦД) відтворювали у щурів при в/очер введенні СТЗ (60 мг/кг; “Serva”, Німеччина), який розчиняли в натрієвому цитратному буфері (рН=4,5). Введення СТЗ призводить до вибіркової загибелі -клітин ПЗ (Biessels G.J. et al., 2001). Окрім цього, в паренхімі ПЗ морфологічно відзначається некроз та загибель 67-80% -клітин, у решти клітин відмічався незначний набряк із збереженнням функціональної активності. Формування ЕЦД перевіряли на 2 добу після введення СТЗ шляхом визначення концентрації глюкози в крові щурів, отриманої з хвостової вени, за допомогою індикаторної тест-смужки ('One Touch', Німеччина; погрішність методу становила ±1 %). Для подальших експериментів обиралися лише ті щури, концентрація глюкози в крові яких перевищувала 15 ммоль/л. Ефективність моделювання ЕЦД становила 92-95 %. За щурами спостерігали 6 тижнів без лікування (цей часовий інтервал є достатнім для формування ЕДПП; Vinik A.I. et al., 2001), після чого розпочинали лікування.

Формування ЕДПП підтверджували морфологічним дослідженням хвостового нерву. Для проведення морфологічних досліджень кожний тиждень умертвляли по 2-3 тварини з кожної з груп, у щурів вилучали хвостовий нерв, промивали ізотонічним розчином NaCl і клали у 5 % розчин формаліну. Вилучені нерви піддавали дії спиртів зі зростаючою концентрацією, потім їх заливали у целуїдін. З блоків готували зрізи завтовшки 7-9 мкм, забарвлювали гематоксиліном, еозином і тіоніном за Нісслем. Якісні морфологічні зміни оцінювали за допомогою світлового мікроскопу МБІ-15. При морфологічному дослідженні хвостового нерву у щурів відзначалися набряк та дегенерація шванівських клітин, а також сегментарна демієлінізація, які мали периаксональний характер. До кінця 6 тижнів з момента введення СТЗ відмічалися набряк ядра шванівських клітин та поява жирових крапель в їх цитоплазмі. Мієлінова оболонка периферичного нерва втратила правильні контури. Прекапілярні артеріоли хвостового нерва переважно спазмовані, відмічаються в полі зору зі втратою внутрішньоклітинних органел.

Препарати з лікувальною метою щурам з ЕДПП вводили, починаючи з 7 тижня протягом подальших 4 тижнів (до 10 тижнів досліду) одноразово, внутрішньоочеревинно (в/очер), двічі на тиждень (на 2 та 5 добу). З профілактичною метою препарати вводили одноразово двічі в тиждень з 1 по 6 тижні досліду (на 2 та 5 добу).

Експерименти виконували в наступних групах тварин: 1 група - інтактні щури (контроль); 2 група - щури з ЕДПП; 3 група - щури з ЕДПП, яким вводили пентоксифілін (100 мг/кг, в/очер) з лікувальною метою; 4 група - щури з ЕДПП, яким вводили пентоксифілін (100 мг/кг, в/очер) з профілактичною метою; 5 група - щури з ЕДПП, яким вводили ЛК (50 мг/кг, в/очер) з лікувальною метою; 6 група - щури з ЕДПП, яким вводили ЛК (50 мг/кг, в/очер) з профілактичною метою; 7 група - щури з ЕДПП, яким вводили цилостазол (5,0 мг/кг, в/очер) з лікувальною метою; 8 група - щури з ЕДПП, яким вводили цилостазол (5,0 мг/кг, в/очер) з профілактичною метою; 9 група - щури з ЕДПП, яким вводили NG-нітро-L-аргінін (20 мг/кг, в/очер) з лікувальною метою; 10 група - щури з ЕДПП, яким вводили NG-нітро-L-аргінін (20 мг/кг, в/очер) з профілактичною метою.

До кожної з названих груп надходило не менше 10 тварин (виняток становили експерименти по дослідженню швидкості проведення збудження (ШПЗ) по периферичному нерву; при цьому в кожній групі було по 6 щурів).

З профілактичною метою тестували ефекти досліджуваних препаратів протягом 1-6 тижнів з моменту введення СТЗ.

Масу тіла щурів визначали за допомогою механічних лабораторних терезів; погрішність зважування складала ±1 г.

В окремих спостереженнях у щурів визначали ШПЗ (м/с) по хвостовому нерву Дана частина роботи виконувалася на базі НДІ Фізіології імені О.О.Богомольця НАН України. за методикою Biessels G.J. et al. (2001). Для цього у наркотизованих етаміналом натрію (30 мг/кг) щурів подразнювали монополярно крізь голковий електрод прямокутними поштовхами струму 400-450 мкА (тривалість 0,1 мс); викликаний масовий потенціал дії (хвилю збудження) відводили аналогічним електродом на відстані 8-14 см від місця подразнення. Референтний електрод знаходився в прямій кишці. Реєстрацію здійснювали за допомогою електронного осцилографа та фотореєстратора (ФОР-2).

В окремій серії експериментів після евтаназії (надмірною дозою етамінала натрію, 100 мг/кг) у тварин збирали кров, в якій визначали суму метаболітів NO - нітриту (NO2-) та нітратів (NO3-). Враховуючи нестійкість NO2- та його легку здатність окислюватися до NO3-, нітрат-іон відновлювали до нітрит-іона за допомогою металевого кадмію, імпрегнованого міддю; концентрацію NO2- визначали за допомогою реактиву Грейса (Green L.C. et al., 1982).

У крові та гомогенатах ПЗ щурів загальноприйнятими методами визначали концентрацію малонового диальдегіду (МДА), дієнових кон'югатів (ДК) (Коган В.С. и соавт., 1988; Андреева Л.И. и соавт., 1998), а також активність антиоксидантних ферментів. Активність каталази оцінювали колориметрично, СОД вимірювали за ступенем її інгібірування відновлення нітросинього тетразолія у присутності NADH та феназін-метасульфата (Дубинина Е.Е. и соавт., 1983), глутатіонпероксидази - за швидкістю окислення глутатіону у присутності гідроперекису третинного бутилу (Моин В.М., 1986), а NADРH-глутатіонредуктази - за швидкістю відновлення окисленого глутатіону у присутності NADРH (Власова С.Н. и соавт., 1990). Вміст відновленого глутатіону визначали за методикою Прохорової М.І. (1982). З природних антиоксидантів, що відносяться до неферментної системи антиоксидантного захисту, досліджували концентрацію -токоферолу за методом Кисилевич Р.Ш., Скварко С.И. (1972) в модифікації Рудакової-Шиліної Н.К., Матюхової Н.П. (1982). Метод заснований на здатності -токоферолу давати кольорову реакцію у присутності 2,2-діпіріділу та іонів трьохвалентого заліза. Інтенсивність розвинутого в ході реакції забарвлення реєстрували спектрофотометрично при довжині хвилі 520 нм.

Всі одержані результати обробляли за допомогою загальноприйнятих в медико-біологічних дослідженнях параметричних і непараметричних методів статистичного аналізу. Статистичну обробку проводили за допомогою комп'ютерної програми статистичного аналізу "Statgraph". Міжгрупові розбіжності вважали вірогідними при P<0,05.

Результати власних досліджень і їх обговорення. Перебіг ЕДПП характеризувався вираженою гіперглікемією, показники якої на 6 тиждень дослідження перевищували первинні дані в середньому в 3,5-3,8 рази (P<0,001) та продовжували наростати до кінця спостережень (табл. 1). При введенні цилостазолу з лікувальною метою концентрація глюкози у щурів на 8 тиждень дослідження складала 8,4±0,7 ммоль/л, що було в 2 рази менше відповідного показника в цій групі щурів на 6 тиждень дослідження до введення препарату (P<0,001). При введенні NG-нітро-L-аргініну та пентоксифіліна відмічалися схожі ефекти (зниження рівня глюкози) на 8 тиждень спостереження, які були більш виразні в разі введення NG-нітро-L-аргініну. В кінці дослідження (на 10 тиждень) введення ЛК сприяло зниженню концентрації глюкози крові щурів в порівнянні з таким до початку її введення на 42 % (P<0,001; табл. 1).

При вивченні профілактичної дії препаратів, що досліджувалися, на динаміку концентрації глюкози в крові при ЕДПП з'ясувалося, що виражений гіпоглікемічний ефект був властивий тільки NG-нітро-L-аргініну та цилостазолу.

Таблиця 1 Вплив введення з лікувальною метою препаратів, сприяючих гальмуванню синтезу NO, на зміни концентрації глюкози крові щурів за умов СТЗ-індукованої ЕДПП